DAMGO által hyperpolarizált substantia gelatinosa neuronok különbözõ mértékû

-opioid-receptor-1 expressziója patkány gerincvelõben�

Kozsurek Márk, Puskár Zita , Marosfõi László, Gerber Gábor és Réthelyi Miklós

Szentágothai Laboratórium, Anatómiai, Szövet- és Fejlõdéstani Intézet, Semmelweis Egyetem, Budapest

A gerincvelõ hátsó szarvában a substantia gelatinosa (SG, lamina II) meghatározó szerepet játszik a fájdalomérzés és -továbbítás spinális szintû folyamataiban. Itt végzõdik a nociceptív C-rostok többsége, és a µ-opioid-receptor (MOR-1 receptor)agonisták, az ópiát fájdalomcsillapítók is elsõsorban itt fejtik ki hatásukat.A II. laminában a MOR-1 receptor ellenes antitest egy olyan sejtcsoportot tesz láthatóvá, amelynek mind a sejttestét, mind adendritjeit kirajzolják a sejtmembránban sûrûn elhelyezkedõ receptorok. Optikai disszektor eljárással a lamina II teljesneuronpopulációjának kb. 10%-a bizonyul MOR-1 immunoreaktívnak (Spike és munkatársai, 2001). Ugyanakkor in- vitro whole-

cell patch-clamp kísérletek szerint a -opioid-receptor szelektív agonista [D-Ala2,N-Me-Phe4,Gly5-ol]-enkephalin (DAMGO) a II.lamina véletlenszerûen kiválsztott sejtjeinek mintegy 50%-ában okoz hyperpolarizációt (Eckert és munkatársai, 2003).Kombináltelektrofiziológiai, farmakológiai ill. immunhisztokémiai technikákkal kíséreltük meg ezt az ellentmondást feloldani.

�

Anyagok és módszerek:

Következtetések:

Elektrofiziológia

Immunhisztokémia

Vizsgálatainkat 20-28 napos Wistar patkányokból származó gerincvelõ-szeleteken végeztük a whole-cell patch-clamp technikaalkalmazásával. Az állatokat intraperitonealis urethán injekcióval altattuk el, majd eltávolítottuk a lumbalis gerincvelõ szakaszt.Vibratommal 600-700 µm vastag transzverzális gerincvelõ-szeleteket készítettünk, lehetõség szerint megtartva a belépõ hátsógyökereket is. A mérõkamrába helyezett szeleteket 33°C-os, oxigenizált (90% O ,5% CO ) mesterséges cerebrospinális

folyadékkal (mM-ban: NaCl 128,0; KCl 1,9; KH PO 1,2; MgSO 1,3; NaHCO 26,0; CaCl 2,4; glükóz 10; pH=7,4 ), 4-5 ml/perc

sebességgel áramoltattuk át. A 8-15 M ellenállású patch-elektródok feltöltéséhez K-glukonát alapú intracelluláris oldatothasználtunk, melyhez a fizilógiailag vizsgált sejtek késõbbi morfológiai elemzése érdekében 0.1% biocytint adtunk. A sejtekkiválasztása vakon vagy vizuális kontroll mellett történt. Az excitatórikus posztszinaptikus potenciálokat (EPSP) a hátsó gyökerszívóelektródás ingerlésével váltottuk ki. A mérésekhez Axoclamp-2A erõsítõt (Axon Instruments), az adatok rögzítéséhez éskiértékeléséhez a pCLAMP 9.0 szoftvert (Axon Instruments) használtuk.

Az elektrofiziológiai méréseket követõen a szeleteket 4%-os paraformaldehidbe helyeztük, és 3-5 napon át 4°C-on fixáltuk. Eztkövetõen a transzverzális szeleteket 10%-os Agarba ágyaztuk, és a sagittális síkban Vibratommal 50 µm-es metszeteketkészítetünk. Alkoholos feltárás után a metszeteket normál szérumos oldatban blokkoltuk. Ezt követõen tengerimalacban termelt

-opioid-receptor ellenes, nyúlban termelt protein-kináz C -alegység (PKC ellenes és kecskében termelt nitrogén-monoxid-szintetáz ellenes antitest koktélban egy éjszakán át inkubáltuk, melyet másnap fluoreszcens festékkel konjugált állatspecifikusszekunder antitestelegy követett. Végül a sejtbe jutott biocytint fluoreszcens streptavidinnel tettük láthatóvá. A lefedettmetszeteket Bio-Rad Radiance 2100 Rainbow konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk.

2 2

2 4 4 3 2

�

� � ��

A DAMGO-ra válaszoló, biocytinnel jelölt sejtek morfológiája ésMOR-1 receptor expressziója

Bevezetés:

2. ábra. A DAMGO-ra hyperpolarizációval válaszoló sejtek közül öt esetében váltottunk ki hátsó gyökér ingerléssel EPSP-t.

A regisztrátum minden esetben monoszinaptikus bemenetet igazolt. Egy EPSP-t akkor tekintettünk monoszinaptikusnak,

ha a 10Hz-es ingerlés minden egyes impulzusa kiváltotta és a válasz állandó látenciát mutatott. A felsõ sor egyetlen ingerrel

kiváltott EPSP-ket mutat. Az alsó sorban sorozatingerléssel kiváltott EPSP-k láthatók. A bal oldali oszlopban egy kis,

a középsõben egy közepes, a jobb oldaliban egy nagy hyperpolarizációval válaszoló sejtbõl elvezetett EPSP-k láthatók.

A nyílhegyek a hátsó gyökér elektromos ingerlésének idõpontját mutatják.

(10Hz)

3. ábra. a):

b): c):

DAMGO-ra kisfokú hyperpolarizációval válaszoló, sziget (islet) típusú sejt konfokális optikai sorozatmetszetek

összevetítésével készült képe. Ugyanazon sejt immunfestett környezetében, sorozatmetszetekbõl összevetítve. A b) kép

egyetlen optikai metszetbõl álló kinagyított részlete.

( a sejt axonelágazódásai; MOR-1 receptorok; *: klasszikus MOR-1 immunreaktív neuronok; biocytinnel

töltött sejt; PKC ; MOR-1 immunfestés. Mérték: 20 m)

nyilak: nyílhegyek: piros:

kék: zöld:� �

4. ábra. a):

b): c):

Közepes mértékû hiperpolarizációval válaszoló, kisantenna típusú sejt és immunfestett környezete konfokális optikai

sorozatmetszetek összevetítésével nyert képe. A biocytinnel feltöltött sejt összevetített képe. A sejt axonjának egy darabja

egyetlen optikai metszeten, amint szorosan összefekszik PKC immunreaktív dendritekkel.

( a sejt axonja; *: klasszikus MOR-1 immunreaktív neuronok; biocytinnel töltött sejt; PKC ; MOR-1

immunfestés. Mérték: 20 m)

�

�nyilak: piros: kék: zöld:

�

5. ábra. a) :

b), c), d):

DAMGO-ra nagymértékû hyperpolarizációval válaszoló, biocytinnel feltöltött sziget (islet) tipusú sejt konfokális optikai

sorozatmetszetek összevetítésével készült képe. A fentiekhez hasonló immunfestéssel készült gerincvelõszelet különbözõ

optikai síkjai.

( a sejt axonja; MOR-1 receptorok; *: klasszikus MOR-1 immunreaktív neuronok; biocytinnel töltött sejt;

PKC ; MOR-1 immunfestés. Mérték: 20 m)

nyilak: nyílhegyek: piros: kék:

zöld:� �

Hátsó gyökér ingerléssel kiváltott monoszinaptikus EPSP-k aDAMGO-érzékeny neuronokban

DAMGO által kiváltott hyperpolarizáció mértéke a válaszoló SGneuronokban

1. ábra. A grafikon a whole-cell patch-clamp technikával vizsgált 42 SG neuron közül azt a 23-mat tartalmazza, amely DAMGO-ra

válaszolt. Az oszlopok az egyes sejtekhez tartozó, DAMGO által kiváltott hyperpolarizáció amplitúdóját mutatják. A grafikon felett egy kis-,

egy közepes és egy nagyfokú hyperpolarizációt mutató neuron típusos regisztrátumát tüntettük fel. Ezeket a membránpotenciál-

változásokat a piros oszloppal jelölt sejtekben mértük. (DAMGO koncentráció: 1 M, az alkalmazás idõtartama: 1 perc).�

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

050106_cell3

041229_cell4

050103_cell1

041105

cell1

041228_cell3

041203

sl2

cell1

041230_cell4

041229_cell1

041228_cell1

041229_cell2

041229_cell3

041228_cell2

041201

sl1

cell2

050104_cell2

041228_cell4

050107_cell4

041214

sl2

cell1

041201

sl2

cell1

050107_cell3

041230_cell1

050104_cell1

041228_cell5

050103_cell2

Sejt kódja

Hy

pe

rpo

lari

zá

ció

(mV

)

Sejt kódja

Hyperp

ola

rizáció

(mV

)

DAMGO

2mV

0,5min

50ms

2mV

1.

2.

3.

4.

5.

Vizsgálataink szerint - az irodalmi adatokhoz hasonlóan - a substantia gelatinosa elektrofiziológiailag vizsgált neuronjainak60 %-a válaszolt DAMGO-ra különbözõ mértékû hyperpolarizációval.Minden olyan DAMGO-ra válaszoló sejt, melynél hátsó gyökér ingerléssel EPSP-t lehetett kiváltani, primer afferensbemenettel rendelkezett.A DAMGO-ra hyperpolarizációval válaszoló sejtek változatos morfológiai megjelenést mutattak, közülük csupán kettõhasonlított a klasszikus MOR-1 sejthez. A lamina II MOR-1 receptorok által jól kirajzolt sávján belül is találtunk DAMGO-rakismértékben vagy egyátalán nem válaszoló neuronokat, ugyanakkor egyes sejteknél, melyek ezen a rétegen kívüli somávalrendelkeztek, nagymértékû hyperpolarizációt mértünk.A sejtek többségén elszórva találtunk csak a MOR-1 antitest által kimutatott receptort.

A DAMGO-ra válaszoló sejtek axonjainak többsége PKC struktúrákkal mutatott szoros összefekvéseket.�

a

c

b