Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí · Jiří Homola Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí 16. června 2015 Ústav fotoniky a elektroniky

www.ufe.cz

Jiří Homola

Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí

16. června 2015

Ústav fotoniky a elektroniky AV ČR, v. v. i.

Optické biosenzory: cíl výzkumu

Cílem našeho výzkumu je vyvinout nové optické biosenzory

pro studium biomolekul a jejich interakcí a pro kvantifikaci

biologických a chemických látek.

Oblasti využití biosenzorů:

1. Biologický výzkum

2. Bioanalytika

Rychlá a citlivá detekce biologických a chemických látek je

potřebná v řadě oblastí:

■ medicinální diagnostika,

■ monitorovaní životního prostředí,

■ kontrola kvality potravin,

■ ochrana proti chemickému a biologickému terorismu.

Pochopení komplexních biologických procesů (například

molekulárních procesů souvisejících se vznikem a rozvojem

chorob) umožní přesnější diagnostiku a účinnější léčbu.

2 J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí

Optické afinitní biosenzory

3

Optické afinitní biosenzory jsou optická zařízení, která se skládají z

molekulárních receptorů a optického systému, který transformuje interakci

mezi detekovanou biomolekulou a receptorem na výstupní signál.

J. Homola: Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí

4

Hlavní typy optických afinitních biosenzorů

Senzory založené na spektroskopii vedených vln kovově-

dielektrických vlnovodů - senzory s povrchovými

plasmony.

Senzory založené na fluorescenčních značkách a měření

fluorescence.

1. Afinitní optické biosenzory využívající molekulární značky

2. Bezznačkové optické afinitní biosenzory

Interferometrické senzory (Mach-Zehnderův integrovaně-

optický interferometr, Fabry-Perotův interferometr).

Senzory založené na spektroskopii vedených vln

dielektrických vlnovodů (mřížkový vazební člen,

rezonanční zrcadlo).


Povrchové plasmony

Šířící se povrchové plasmony

(ŠPP)

Lokalizované povrchové plasmony

(LPP)

Pole nanoděr.

Pole nanotyček.

Hloubka vniku pole:

Ldiel = 150 - 400 nm

Hloubka vniku pole:

Ldiel = 10 - 40 nm

m d

m d

ε εωβ=

c ε +ε

Kov Dielektrikum

Konstanta šíření:

Pole nanopyramid.

E-pole

Oblak e -

Kovováčástice

+++

- - - +++

- - -


6

Princip činnosti optických senzorů s povrchovými

plasmony

Optický hranol

Vrstva kovu

Optické záření

Dielektrikum

600 700 800 9000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Odra

ziv

ost

Vlnová délka [nm]

Povrchový plasmon předává optické vlně informaci o změnách indexu lomu prostředí.

Změna parametrů optického

záření: intenzita, fáze,

polarizace

Změna konstanty

šíření povrchového

plasmonu

Změna

indexu

lomu

Senzory založené na rezonanci povrchových plasmonů (Surface Plasmon

Resonance - SPR).


vol

dn

dn

cK

Princip činnosti optického afinitního biosenzoru s povrchovými plasmony.

II. Interakce I. Před interakcí Povrchová

koncentrace Změna indexu

lomu

Změna parametrů

optického záření

Změna konstanty

šíření povrchového

plasmonu

7

Index lom

u

Čas

Optická excitace povrchových plasmonů


Optický systém senzoru Čip s

ukotvenými

receptory

Systém pro

přípravu a

distribuci

vzorku

Biosenzory s povrchovými plasmony: hlavní

technologické komponenty


Plasmonické

nanostruktury

Funkční

molekulární

pokrytí

Mikrofluidní

systémy

Biologické

aplikace

Optické

senzorické

systémy

Optické biosenzory: hlavní směry výzkumu v ÚFE

Simulace

a design Příprava

Realizace Simulace

9

Příprava Charakterizace

Simulace

a design Realizace

-500 0 500 1000 1500

0.0

0.1

0.2

0.3

Studium

biomolekul.

interakcí

Biodetekce


Plasmonické nanostruktury: teorie, design, realizace

TEORIE

PŘÍPRAVA Interfereční UV litografie

Litografie elektronovým svazkem (EBL)

Nanoobrábění iontovým svazkem (FIB)

Kolodiní litografie

Boční pohled

Pohled shora

Dimer

nanočástic

Metody konečných diferencí v časové oblasti

(FDTD)

Zobecněná multičásticová Mie teorie

Rigorózní metoda vázaných vln (RCWA)

Integrální řešení Maxwellových rovnic


Optické systémy pro plasmonické biosenzory

Vysoce paralelizovaný senzor založený na zobrazení povrchových plasmonů a polarizačním kontrastu.

Laboratorní 6-kanálový senzor založený na spektroskopii povrchových plasmonů.

Mobilní kanálový senzor založený na spektroskopii povrchových plasmonů a multiplexování vlnových délek.

Kompaktní 6-kanálový senzor založený na nové metodě spektroskopie povrchových plasmonů (SPRCD).


12

Laboratorní senzor s povrchovými plasmony

Polychromaticradiation

Prism

Channel A Channel B

SP 1 SP 2

Metal layer

Sample

4-kanálový laboratní senzor s povrchovými plasmony (nahoře)

Detail SPR čipu (vpravo)

CITLIVOST:

7000 nm/RIU

ROZLIŠENÍ:

< 2×10-7 RIU

ROZSAH:

1.32-1.45 RIU

Excitace povrchových

plasmonů pomocí

optického hranolu.

Modulace vlnové délky.

Čtyři nezávislé optické

a mikrofluidní kanály.

Teplotní stabilizace.


13

Laboratorní senzor založený na zobrazování SPR

pro současnou detekci velkého počtu látek

Laboratorní prototyp zobrazovacího SPR senzoru.

ROZLIŠENÍ:

2x10-7 RIU

VELIKOST DETEKČNÍ

OBLASTI:

~ 150μm

POČET DETEKČNÍCH

KANÁLŮ:

100-300

M. Piliarik, M. Bocková, J. Homola, Biosensors and Bioelectronics, 26, 1656–1661 (2010).

CCD kamera

Kolimátor

Hranol a průtoková cela


14

Senzor založený na lokalizovaných plasmonech

(LSPR) a zobrazování v polarizačním kontrastu

600 700 800 900 1000

0

20

40

60

80

100

120

Op

era

tin

g w

ave

len

gth

of S

PR

im

ag

ing

Experiment

Wavelength [nm]

Po

lari

ton

(a) (b)

600 700 800 900 1000

0

20

40

60

80

100

120

1.33

Glass

xy

z

x

y40nm × 110nm

30 nm

1.33

1.43

Theory

Po

lari

za

tio

n c

on

tra

st [a

.u.]

Wavelength [nm]

Koncept optického senzoru založeného na excitaci povrchových plasmonů na poli zlatých nanotyček pomocí úplného vnitřního odrazu v

polarizačním kontrastu.

Spektrum odraženého světla v polarizačním

kontrastu (FDTD).

600 700 800 900 1000

0

20

40

60

80

100

120

Op

era

tin

g w

ave

len

gth

of S

PR

im

ag

ing

Experiment

Wavelength [nm]

Pola

rito

n

(a) (b)

600 700 800 900 1000

0

20

40

60

80

100

120

1.33

Glass

xy

z

x

y40nm × 110nm

30 nm

1.33

1.43

Theory

Pola

riza

tio

n c

on

tra

st [a

.u.]

Wavelength [nm]

Pole zlatých nanotyček na skleněné podložce

Rozměry nanotyček: 40 × 110 × 30 nm Perioda: 250 nm

M. Piliarik, H. Šípová, P. Kvasnička, N. Galler, J. R. Krenn, J. Homola, Optics Express, 20, 672 (2012).


6 8 10 12 14 16

0

10

20

30

40

50

60

70

0

2

4

6

8

10

12

Sensor

response [

DN

A/p

art

icle

]

Time [min]

100nM

10nM

5nM

1nM

0.5nM

Buffer

DNA

Buffer

Se

nso

r re

sp

on

se

[p

g/m

m2]

Minimální rozlišitelné pokrytí povrchu:

35 fg/mm2 <1 DNA/nanorod

Odezva LSPR senzoru na různé koncentrace krátkých oligonukleotidů.

Detekční limit: ~200 pg/ml

LSPR senzor

Detekční limit: ~100 pg/ml

SPR senzor

M. Piliarik, H. Šípová, P. Kvasnička, N. Galler, J. R. Krenn, J. Homola, Optics Express, 20, 672 (2012).

Senzor založený na lokalizovaných plasmonech

(LSPR) a zobrazování v polarizačním kontrastu


Mikro-SPR systém:

Detekovaný počet biomolekul může být snížen minimalizací

detekční oblasti.

P. Kvasnička, K. Chadt, M. Vala, M. Bocková , J. Homola, Optics Letters, 37, 163–165 (2012).

SPR senzor s minimalizovanou detekční oblastí pro

detekci malého počtu molekul

SPR senzory měří změny povrchového pokrytí ~ 0.1 pg/mm2, 105 proteinů.


17

SPR senzor s minimalizovanou detekční oblastí

pro detekci malého počtu molekul

40 50 60 70 80 90 100

755.5

756.0

756.5

757.0

SP

R d

ip p

ositio

n (

nm

)

Time (min)

Streptavidin50 μg/mL

Buffer

220 222 224 226 228 230

756.684

756.685

756.686

Pozorování vzniku monovrstvy tvořené molekulami streptavidinu.

Detekční oblast:

4 x 16 = 64 μm2

Rozlišení indexu lomu:

5 x 10-7 RIU

Rozlišení povrchového pokrytí:

0.7 pg/mm2

450 molekul

Časová odezva SPR senzoru na formování streptavidinové monovrstvy.

P. Kvasnička, K. Chadt, M. Vala, M. Bocková, J. Homola, Optics Letters, 37, 163–165 (2012).


18

Kompaktní SPR senzory: nová metoda

spektroskopie povrchových plasmonů

SPRCD (Surface Plasmon Resonance Coupler and Dispenser) excituje

povrchový plasmon druhým difrakčním řádem a spektrálně rozkládá

světlo difragované do prvního řádu na prostorově citlivý detektor.

O. Telezhnikova, J. Homola, Optics Letters 31, 3339-3341 (2006).

J. Homola, O. Telezhnikova, J. Dostálek, US Patent # 7,973,933 (2011).

820 830 840 850 860 870 880 890

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

n=1.34n=1.32

Účin

nost v 1

. řá

du

(T

M/T

E)

Vlnová délka [nm]

Povrchovýplasmon

SPRCD

Polychromatickézáření

Detektor

1. difrakční řádVýhody:

Kompaktní a jednoduchý.

Čipy připravitelné postupy

sériové výroby.


19

Kompaktní 6-kanálový senzor založený na principu SPRCD.

Licencováno Phenogenomics, Inc. (USA)

O. Telezhnikova, M. Piliarik, M. Vala, I. Tichý, J. Homola, Biosensors & Bioelectronics, 24, 3430 (2009).

J. Homola, M. Piliarik, I. Tichý, M. Vala, P. Adam, J. Hepnar, US Patent # 8,094,316 (2012).

Kompaktní SPR senzor

ROZLIŠENÍ:

< 3×10-7 RIU

ROZSAH:

1.33-1.35 RIU


Transport molekul

Disperze vzorku

Adsorpce na stěnách

Odezva biosenzoru s konvenčním a bezdisperzním mikrofluidním systémem.

Mikrofluidní systémy pro SPR biosenzory

0 5 10 15 20 25

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Pufr

Pufr

Analyt

Od

ezva

se

nzo

ru [

nm

]

Čas [min]

Prototyp průtočné komory pro bezdisperzní mikrofluidní systém.

Výzvy:

Průtočná komora s mísícími strukturami pro zvýšení transportu molekul analytu.

Simulace difuzního toku analytu.


21

Hlavní požadavky:

Samoorganizující se monomolekulární vrstva alkanthiolů s funkčními skupinami.

Biomolekulární receptory používané v biosenzorech s povrchovými

plasmony zahrnují: protilátky, peptidy, proteiny, DNA, RNA,....

Volba metody pro imobilizaci biomo-

lekulárních receptorů závisí na:

typu receptoru a detekované látky a

detekčních podmínkách.

■ Vysoká hustota receptorů.

■ Vhodná orientace receptorů.

■ Zachování struktury a funkčních vlastností receptorů.

■ Minimální nespecifická interakce vzorku s povrchem.

Funkční molekulární pokrytí: molekulární receptory a jejich imobilizace


22

Imobilizace molekulárních receptorů na povrchu senzoru

Metody imobilizace:

Kovalentní vazba

Elektrostatická vazba

Affinitní interakce

• Protein A, Protein G

• Streptavidin – biotin

• Komplementární

oligonukleotidy

Nukleové kyseliny zakončené biotinem a jejich vazba na povrch prostřednictvím interakce

biotin-streptavidin.


Hlavní postupy při imobilizaci receptorů

23

Čištění povrchu zlata Vytvoření samoorganizující vrstvy alkanethiolů

Aktivace karboxylových skupin (NHS/EDC)

Navázání proteinů

Upravený povrch (dextran, lyzin)

Adsorbované proteiny

II. Fyzikální adsorpce III. Ukotvení pomocí proteinů A a G

I. Kovalentní uchycení na samoorganizující monovrstvy (SAM)


24

I. Konvenční vrstvy minimalizující nespecifickou adsorpci

Poly(ethylene glycol) (PEG) a jeho deriváty

+ jednoduchá příprava

+ různorodost dostupných funkčních skupin

- 2D struktura limituje počet vazebných míst

II. Pokročilé funkční vrstvy

Zwitterionické polymery, hydrogely nebo

polymerní kartáče

+ vyšší odolnost proti nespecifické adsorpci

+ 3D struktury s vysokým počtem vazeb. míst

- složitější příprava

- požadovaná minimální tloušťka (10-15 nm)

Potlačení nespecifické adsorpce pomocí pokročilých

funkčních vrstev


Potlačení nespecifické adsorpce pomocí pokročilých

funkčních vrstev

25

0

500

1000

1500

PolyHEMAAT-SAM

Povrc

hové p

okry

tí [

pg

/mm

2]

PolyCBAA

Nespecifická adsorpce ze 100% lidské krevní plazmy na tři různé povrchy funkcionalizované protilátkami (anti-E.coli, anti-Salm).

H. Vaisocherová et al., Biosensors and Bioelectronics, 51, 150–157 (2014).

(polyHEMA)

Hydroxy-funkční poly(2-

hydroxyethyl methacrylate)

(polyCBAA)

Karboxy-funkční zwitterionic

poly(carboxybetaine acrylamide)


Prostorově rozlišená funkcionalizace pro SPR

senzory s vysokým počtem kanálů

26

Sensor surface

Sensor surface

flow

SPR snímek odpovídající oblasti 2×1 mm2.

• Matice ~ 100 detekčních kanálů

• Rozměry kanálů: 150 x 150 µm

• Koncentrace DNA: (3-8) x 1012 DNA/cm2

M. Piliarik, J. Ladd, T. Allen, M. Piliarik, J. Homola, S. Jiang, Anal. Chem., 80, 4231 (2008).

Vlastnosti:


Oblasti využití biosenzorů s povrchovými plasmony

27


Studium molekul a jejich interakcí v reálném čase.

Stanovení interakčních modelů, kinetických rychlostí,

rovnovážných konstant, termodynamických konstant,

mapování vazebných míst, atd.


Analýza biomolekul a biomolekulárních interakcí

28

BkBRCkt

BdTa

)(

Kinetická rovnice:

Sensorgram ukazující typický průběh odezvy na molekulární interakci na povrchu senzoru.

0 500 1000 1500-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Odezva

sen

zo

ru [n

m]

Čas [s]

ka = 2 x 10

4 M

-1s

-1

kd = 3.5 x 10

-3 s

-1

KD = 175 nM

Prostor rychlostních konstant (ka – kd) pokrytý biosenzory s povrchovými plasmony.

10 fM 100 fM 1 pM 10 pM 100 pM

1 nM

10 nM

100 nM

1 M

10 M

100 M

1 0-6

1 0-5

10-4

10- 3

10-2

10- 1

100

103

104

105

106

107

108

109

1 010

ka

[M-1

s-1

]k

d[s

-1]


29

0

1

2

3

4

0

1

2

3

4

0

1

2

3

4

0

1

2

3

4

100 120 140

0

1

2

3

4

100 120 140 100 120 140 100 120 140 100 120 140 100 120 140

1.

2. 3. 4. 5.

7.

8. 9. 10. 11. 12.

6.

13.

Sen

so

r re

sp

on

se [

nm

]

14. 15. 16. 17. 18.

19. 20. 21. 22. 23. 24.

25.

26.

27.

Time [min]

28. 29.

30.

Přirozené

dT15

Čas [min]

Odezva

senzoru

[nm

]

Analýza vlastností modifikovaných oligonukleotidů


Oblasti využití biosenzorů s povrchovými plasmony

30


2. Bioanalytika

Rychlá a citlivá detekce biologických a chemických

látek :

■ medicinální diagnostika (biomarkery onemocnění a zdraví),

■ monitorovaní životního prostředí (kontaminanty),

■ kontrola kvality a bezpečnosti potravin (patogenní bakterie a toxiny).

Studium molekul a jejich interakcí v reálném čase.

Stanovení interakčních modelů, kinetických rychlostí,

rovnovážných konstant, termodynamických konstant,

mapování vazebných míst, atd.


Markery poškození orgánů Micro RNA Anal Chem 10110 (2010)

Genové mutace antisensní ON, jednobodové mutace v genu TP53 Anal Bioanal Chem 2343 (2011) Biopolymers 394 (2006)

Enzymatická aktivita HIV integráza, Ribonukleáza H Biosens Bioel 1605 (2010) Anal Bioanal Chem 1165 (2009)

Bakterie v potravinách (Escherichia coli , Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni Sensors Actuat B 59 (2009) Biosens Bioel 752 (2006)

Malé org. molekuly

NHN

Cl Cl

OHOH

OO

O

Nukleové kyseliny

Proteinové biomarkery

Patogenní bakterie

10 – 1000 pg/mL mléko, med, odpadní vody

0.2 - 2 pM

vzorky tkání

Alzheimerova choroba Amyloid β, protein Tau Sensors Actuat B 69 (2009) Curr Alzheimer Res 10 (2013)

Rakovina CEA, ALCAM, hCG

Anal Bioanal Chem 2869 (2012) Biosen Bioel 1656 (2010) Anal Bioanal Chem 2869 (2012)

Myelodysplastický syndrom VEGFR Anal Bioanal Chem 381 (2012)

Mononukleóza Protilátky proti EB viru Biosen Bioel 1020 (2007)

0.1 – 100 ng/mL mozkomíšní mok, krevní

plasma

10 - cfu/ml mléko, džus, maso,

okurka

31

Bioanalytické aplikace optických biosenzorů s

povrchovými plasmony


32

Monitorování životního prostředí: detekce

bisphenolu A

I. Inkubace

II. Detekce

Kompetiční detekční formát.

0 5 10 15 20 25 30

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

5 ng/ml

1 ng/ml

0.1 ng/ml

0 ng/ml

Od

ezva

se

nzo

ru [

nm

]

Čas [min]

Detekce BpA s využitím kompetičního detekčního formátu.

Protilátka

Detekovaná látka

Bisphenol A se užívá při výrobě polykarbonátových plastů.

Bisphenol A narušuje činnost žláz s vnitřní sekrecí.


33

0.1 1 10 100 1000

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

LOD = 0.14 ng/ml

Koncentrace BpA [ng/ml]

Norm

aliz

ovaná o

dezva s

enzoru

Kalibrační křivka pro BpA v odpadní vodě. Stanovení BpA v odpadní vodě pomocí SPR biosenzoru, HPLC a ELISA.

K. Hegnerová, M. Piliarik, M. Šteinbachová, Z. Flegelová, H. Černohorská, J. Homola, Analytical & Bioanalytical Chemistry, 398, 1963–1966 (2010).

0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 100000

0.01

0.1

1

10

100

1000

10000

100000

LOD = 0.14 ng/ml

LOD = 10 ng/ml

LOD = 16 ng/ml

Urč

en

á k

on

ce

ntr

ace

Bp

A [

ng

/ml]

Koncentrace BpA [ng/ml]0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 100000

0.01

0.1

1

10

100

1000

10000

100000

Monitorování životního prostředí: detekce

bisphenolu A v pitné a odpadní vodě

140 pg/ml (odpadní voda)

40 pg/ml (pitná voda)

Detekční limity:

SPR HPLC ELISA


Bezpečnost potravin: detekce reziduí veterinárních

léčiv v mléce

34

• Používání veterinárních léčiv může vést k jejich přenosu

do potravního řetězce.

• Rezidua léčiv negativně ovlivňují kvalitu potravinářských

produktů i zdraví spotřebitelů. Channels 1-2

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

0

25

50

75

100

Milk 1/5

PBSCa

[ERFX] / g L-1

%sig

nal

Channels 5-6

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

0

25

50

75

100 PBSCa

Milk 1/5

[CAP] / g L-1

% s

ign

al

Detekční limity v mléce (20%):

Enrofloxacin (ERFX), Sulfapyridine (SPY), Chloramphenicol (CAP) < 300 pg/ml

Kalibrační křivky pro ERFX, SPY a CAP v pufru a ve vzorcích mléka.

Channel 2-3

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

0

25

50

75

100

[SPY] / g L-1

PBSCa

Milk 1/5

% s

ign

al

F. Fernández, K. Hegnerová, M. Piliarik, F. S. Baeza, J. Homola, M.-Pilar Marco, Biosensors & Bioelectronics, 26, 1231–1238 (2010).


35

Medicinální diagnostika: detekce mikroRNA

• MikroRNA hrají důležitou roli v řadě biologických procesů.

• Hladiny mikroRNA mohou odrážet závažné choroby

(srdeční choroby a rakoviny).

Druhá fáze detekce mikroRNA – detekce protilátky.

II. Zesílení signálu protilátkou

I. Detekce miRNA-122


36

Medicinální diagnostika: detekce miRNA ve vzorcích

tkání

Odezva senzoru na vzorky z tkání. Stanovení koncentrace mikroRNA.

Vzorky tkání: RNA extrahovaná z jaterních tkání myší.

H. Šípová, S. Zhang, A. M. Dudley, D. Galas, K. Wang, J. Homola, Anal. Chem. 82, 10110 (2010).

SPR qPCR

Vzorek s poškozením jater: 1.2 nM 1.46 nM

Kontrolní vzorek: 0.85 nM 1.05 nM


37

0 5 10 15

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Pufr

200 ng/ml

1000 ng/ml

500 ng/ml

50 ng/ml

10 ng/mL

Odezva s

enzoru

[m

RIU

]

Čas [min]

ALCAM

Pufr

10 100 1000

0.00325

0.00550.00775

0.01

0.0325

0.0550.0775

0.1

0.325 ALCAM

hCG

Sensor

response

[m

RIU

]

Koncentrace [ng/mL]

LOD

Odezva senzoru na různé koncentrace biomarkeru ALCAM v pufru.

Detekce biomarkerů ALCAM a hCG: kalibrační křivka.


Detekční limity (v pufru)

ALCAM: 7 ng/ml hCG : 13 ng/ml

ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) a hCG (human chorionic

gonadotropin) mají vztah k nádorovým onemocněním (např. rakovině prsu).

Medicinální diagnostika: detekce proteinových

biomarkerů



biomarkerů

38

Detekce ALCAM a hCG v krevní plazmě.

0 5 10 15 20

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Pufr

1000 ng/mL

500 ng/mL

200 ng/mL

Odezva s

enzoru

[m

RIU

]

Time [min]

50 ng/mL

Zm

ěn

a R

I

Pufr

ALCAM

(10% plasma)

Zm

ěn

a R

I

10 100 1000

0.00325

0.00550.00775

0.01

0.0325

0.0550.0775

0.1

ALCAM

hCG

Sensor

respo

nse

[m

RIU

]

Koncentrace [ng/mL]

ALCAM LOD

hCG LOD

Odezva senzoru na různé koncentrace biomarkeru ALCAM v krevní plazmě (10%).

Detekce biomarkerů ALCAM a hCG: kalibrační křivka v krevní plazmě (10%).


Detekční limity (v plazmě)

ALCAM: 45 ng/ml hCG: 100 ng/ml



biomarkerů

Detekce karcino-embryonálního antigenu (CEA) v krevní plazmě.

Detekce biomarkeru CEA: kalibrační křivka v krevní plazmě (50%).

T. Špringer, J. Homola, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 404, 2869-2875 (2012).

0.1 1 10 100 1000

0.01

0.1

1

10

Od

ezva

se

nzo

ru [

nm

]

Koncentrace [ng/ml]

LOD ~ 100 pg/ml

LOD ~ 8 ng/ml

Au-NP zesílená detece

(50 % plazma)Přímá detekce

(pufr)

Detekční limit: 100 pg/ml

Zesílení odezvy: x 200

Vrstva kovu

Au

Streptavidin

Au

Primární protilátka

Biotinylovaná

protilátka

Abumin

Zlatá

nanočástice

CEA biomarker


Bezpečnost potravin: detekce bakteriálních

patogenů - E.Coli a Salmonella

40

230 240 250 260 270

0

10

20

30

40

50

60

Time [min]

Buffer

Buffer

Detection

Reference

S-AuNPs

III.~250x

Odezva SPR senzoru na E. coli O157:H7 (7.5x105 cfu/mL).

200 210 220 230

0

1

2

3

Time [min]

Buffer

Buffer

II.

Ab2

~13x

0 10 20 30

0

2

4

6

8

Time [min]

Buffer

Sensor

response [

nm

]

I.

Buffer

Hamburger

with E.coli

• Z hlediska bezpečnosti potravin jsou ze všech

mikroorganismů bakterie tou největší hrozbou.

• V některých potravinách, se bakterie mohou

snadno namnožit z poměrně nízkých a

neškodných hladin do hladin způsobujících

závažná onemocnění.

• Některé bakterie mohou vytvářet toxiny.

Detekční formát:


180 190 200 210 220

0

10

20

30

40

50

60

Pufr S-AuNPs

Pufr

Od

ezva

se

nzo

ru [

nm

]

Čas [min]

E. coli koncentrace [cfu/mL]

1.5x101

1.5x102

1.5x103

1.5x104

1.5x105

7.5x105

1.5x106

1.5x107

41

101

102

103

104

105

106

107

108

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Odezva s

enzoru

[nm

]

Koncentrace (cfu/mL)

E.coli v hamburgeru

E.coli v okurce

Salmonella sp. v okurce

Detekce E.coli O157:H7 ve vzorku okurky. Odezva senzoru na funkční zlaté nanočástice.

Kalibrační křivky pro E.coli O157:H7 a Salmonellu ve vzorcích hamburgeru a okurky.

Detekční limity:

Hamburger: E. coli O157:H7: 24 cfu/ml

Salmonella sp.: 7.5x103 cfu/ml

Okurka: E. coli O157:H7: 31 cfu/ml

Salmonella sp.: 1.5x103 cfu/ml

Bezpečnost potravin: detekce bakteriálních

patogenů ve vzorcích potravin


Závěr

42

jsou schopné detekovat malé a středně velké molekuly s detekčním limitem 10 pg/ml - 100 ng/ml.

představují vyspělý nástroj pro pozorování a kvantifikaci molekulárních interakcí v reálném čase.

Propojení mikrofluidních a plasmonických struktur pro management/zpracování vzorku přímo na čipu.

Nanobiosenzory pro lokalizovanou analýzu extrémně malých objemů.

mohou detekovat široké spektrum molekul a uplatnit se proto v řadě oblastí (medicinální diagnostika, monitorování životního prostředí, kontrola kvality potravin, atd.).

SOUČASNOST Biosenzory s povrchovými plasmony:

BUDOUCNOST Vyšší výkon, nové vlastnosti a aplikace:

(i) Studium komplexních biomolekulárních procesů a molekulárních

interakcí v nativním prostředí.

(ii) Detekce biomolekul a jejich komplexů v reálných vzorcích.


Poděkování: hlavní výzkumní partneři

■ Matematicko-fyzikální fakulta UK

■ Fakulta jaderná a fyzikálně inženýrská ČVUT

■ Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.

■ Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.

■ Ústav hematologie a krevní transfuze

■ Národní ústav duševního zdraví (Psychiatrické centrum Praha)

■ VIDIA, spol. s r.o.

■ University of Washington, Seattle, USA

■ Austrian Institute of Technology, Vídeň, Rakousko

■ Imperial College, Londýn, Velká Británie

■ Ewha Womans University, Soul, Jižní Korea

■ University of Graz, Graz, Rakousko

■ CNR-National Institute of Optics, Neapol, Itálie

■ ESF Research Network PLASMON-BIONANOSENSE


www.ufe.cz

www.ufe.cz

Děkuji za pozornost.

Documents

Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí · Jiří Homola Optické biosenzory pro studium biomolekul a jejich interakcí 16. června 2015 Ústav fotoniky a elektroniky