CONRAD ET AL. / EBERT ET AL. ~r:"\____________________________ ~~I~--s».c

Transplantation Proceedings 1, 403-407Balner, B., Eysvoogel, V. P and Cleton, F. J.

(1968). Testing of anti-human lymphocytesera in chimpanzees and lower primates.Lancet 1, 19-22.

Balner, H., Dersjant, H. and van Bekkum, D.W. (1969). Testing of antihuman lympho-cyte sera in chimpanzees and lower prima-tes. Transplantation 8, 281-290.

Bonnefoy-Berard, N., Genestier, L., Flacher,M., Rouault, J. P, Lizard, G., Mutin, M.and Revillard, J. P. (1994). Apoptosis indu-ced by polyclonal antilymphocyte globu-lins in human B-celllines. Blood 83, 1051-1059.

Bonnefoy-Berard, N. and Revillard, J. P.(1996). Mechanisms of immunosuppress i-on induced by antithymocyte globulins andOKT3. [Review] [52 refs]. Journal.of.Heart& Lung Transplantation 15, 435-442.

Bunn, D., Lea, C. K., Bevan, D. J., Higgins,R. M. and Hendry, B. M. (1996). The phar-macokinetics of anti-thymocyte globulin(ATG) following intravenous infusion inman. Clinical Nephrology 45, 29-32.

Dreikom, K., Horsch, R., Rohl, L., Rossler,W. and Olschweski, M. (1985). A rando-mized trial with different immunosuppres-sive regimens after renal transplantation.Transplantation Proceedings 17, 2663-2665.

Genestier, L., Fournel, S., Flacher, M., Assos-sou, 0., Revillard, J. P. and Bonnefoy-Ber-ard, N. (1998). Induction of Fas (Apo-I,CD95)-mediated apoptosis of activatedlymphocytes by polyclonal anti thymocyte

globulins. Blood 91,2360-2368.Grosse-Wilde, H., Jakubowski, H. D., Eigler,

W. and Kuwert, F. K. (1981). In vitro im-munounresponsivness in recipients of cada-veric renal allografts during ATG therapy.Proc.EDTA 18, 481-485.

Johnson, K., Niblack, G., Richie, R., MacDo-nell, R., Nylander, w.,Walker, P, Sterling,W., Ross, G., Humphries, A. and Peterson,D. (1989). Multicenter comparison of re-jection reversal: rabbit anti-human lympho-cyte serum (ATS) versus horse anti-humanlymphocyte globulin (ATGAM). Trans-plantation Proceedings 21, 1734-1735.

Kaden, J., May, G., Schonernann, c, Groth,J., Seeger, w., Seibt, F., Henkert, M. andLippert, J. (1992). Effect of ATG prophyla-xis in sensitized and non-sensitized kidneygraft recipients. Transplant. International5,75-78.

Kormos, R. L., Armitage, J. M., Dummer, J.S., Miyamoto, Y, Griffith, B. P. and Har-desty, R. L. (1990). Optimal perioperativeimmunosuppression in cardiac transplanta-tion using rabbit antithymocyte globulin.Transplantation 49, 306-311.

Marsh, J. C. w., Hows, J. M., Bryett, K. A.,Al-Hashimi, S., Fairhead, S. M. and Gor-don-Smith, E. C. (1987). Survival after an-tilymphocyte globulin therapy for aplasticanemia depends on disease severity. Bood70, 1046-1052.

Platanias, L., Gascon, P, Bielory, L., Griffith,P.,Nienhuis, A. and Young, N. (1987). Lym-phocyte phenotype and Iymphokines fol-lowing anti-thymocyte globulin therapy in

patients with aplastic anaemia. British Jour-nal of Haematology 66, 437

Teramura, M., Kobayashi, S., Iwabe, K., Yo-shinaga, K. and Mizoguchi, H. (1997).Mechanism of action of antithymocyte glo-bulin in the treatment of aplastic anaemia:in vitro evidence for the presence of im-munosuppressive mechanism. British lour-nal of Haematology 96, 80-84.

Thomas, F., Thomas, J., Flora, R., Mendez-Picon, G., Peace, K. and Lee, H. M. (1977).Effect of antilymphocyte globulin potencyon survival of cadaver renal transplants.Lancet 2,671-674.

Touraine, J. L., LeFrancois, N., Dubemard, J.M., Garnier, J. L., Eygonnet, J. P,Gibelin,N., Betuel, H. and Traeger, J. (1987). Placeof antilymphocyte globulins in the im-munosuppressive regimen for kidney trans-plantation. Transplantation Proceedings 19,1881-1881.

DanksagungDas Projekt wird gefordert durch dasBMBF (Projekt BE0121 0311238).

KorrespondenzadresseDipl.-Biol. Christoph ConradPaul-Ehrlich- InstitutAbteilung ImmunologiePaul-Ehrlich-Strafle 51-59D-63225 LangenFax: +49-6103 77 1253Tel.: +49-6103 77 5100/5104E-mail: Ch.Conrad@em.uni-frankfurt.de

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Optimierung und Etablierung YOnserologischenMethoden fiir die Wirksamkeitspriifung yonImmunglobulinen gegen Clostridium tetani-ToxoidElvira Ebert', Annett Abu Karim', Tanja Kayser', Renate Wenig', Karin Weilser', Maria Wirz", GiulioPisani', Gabriele Schaffner! und Klaus Cufiler'1 Paul-Ehrlich-Institut, D-Langen, 2 Istituto Superiore di Sanita, I-Roma

ZusammenfassungDie Wirksamkeitspriifung von Tetanus-Immunglobulin (Ig)-Priipara-tenfor den Menschen wird nach Monographie 398 der EuropaischenPharmakopoe (Ph Eur.) in einem Toxin-Neutralisations-Test inMdusen (MNT) oder Meerschweinchen durchgefohrt. DieseMonographie erlaubt jedoch auch den Einsat; serologischerMethoden, sofern deren Eignung zuvor belegt werden konnte.Nach den ersten Untersuchungsergebnissen dieser Studie kanngezeigt werden, daj3 sowohl ein indirekter Enzyme-Linked-

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Immunosorbent-Assay (ELISA), eine Rocket-Immunelektrophore-se (RIE) als auch ein Toxin-Bindungs-Inhibitionstest (ToB1) alsmogliche Altemativmethoden zum in vivo MNT einsetzbar sind.Die Reproduzierbarkeit der in vitro Methoden kann derzeit milinter-assay- Variationskoejfizienten von 2 bis 27% angegebenwerden. Der ELISA ist mit einer Nachweisgrenze von 0,005 Ili/mlam sensitivsten, gefolgt vom ToBI (Nachweisgrenze van 0,04 lEiml) und der RIE (Nachweisgrenze von 5,0 IElml). Bislang konntedie Transferierbarkeit des ELISA-Systems in andere Laboratorien

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___ ~ E_B_ER_T_E_T_A_L.

~~~

eindeutig gezeigt werden. Die Ubertragbarkeit der RIE und desToBI- Tests muj3 noch nachgewiesen werden.

ty. The first results of our study verify that an indirect enzymelinked immunosorbeni assay (EliSA). a rocket immunelectropho-resis (RIE) and a toxin binding inhibition test (ToB!) could beused as serological altemativ methods to the MNT. Studies on thereproducibility of the in vitro methods resulted inter-assaycoefficients of variation between 2 and 27%. The EliSA is moresensitive (limit of detectability: 0,005 IElm!) than the ToBI (0,04IElml) and the RIE (5 IElml). The transferability of the EliSA toother labs is proofed. The transferability of the RIE and the ToBIwill be tested in the near future.

Summary: Optimisation and establishing of serological methods forthe potency testing of immunglobulins against Clostridium tetani-toxinThe quality control of human tetanus immunglobulin requiresanimal experiments according to European Pharmacopoeiamonograph 398. The potency estimation has to be done in a toxinneutralisation test in mice (MNT) or guinea pigs. Immunoassayscould also be used if they show a suitable sensitivity and specifici-

1 Einleitung

Keywords: human tetanus immunglobulin, potency, alternative methods, ELISA, RIE, ToBI

Fur die Wirksamkeitsprtifung bei der Char-genkontrolle von Tetanus-Immunglobuli-nen (Ig) werden jahrlich allein in Deutsch-land mehr als 1000 Mause in Neutralisati-onstests (MNT) eingesetzt (Weisser undHechler, 1997). Bei dem nach Ph. Eur. Mo-nographie "human tetanus immunglobulin"

durehgeftihrten Tierversueh wird Mauseneine Misehung aus dem zu tiberprtifendenPraparat in unterschiedlichen Verdtinnun-gen mit einer hestimmten Menge Tetanus-Toxin verabreieht. Lahmungserscheinungender Tiere sind bei 96 stiindigen Beobach-tungen das Auswertungskriterium. Nacheinem zusatzlich aufgenommenen Absatzin dieser Monographie ist es aueh erJaubt,serologische Methoden fur die Wirksam-keitsprufung einzusetzen. Die Eignung die-ser Ersatzmethoden mub zuvor in Form vonSpezifitats- und Sensitivitatsuntersuchun-gen belegt werden.

In der vorgestellten Studie wurden dreiunterschiedliche serologische Methodenfur den quantitativen Nachweis Yon Teta-nus-Ig etabliert und optimiert. In einer er-sten Vergleichsstudie wurde ihre Eignung

untereinander sowie im Vergleich zumTierversuch untersucht. Das Ziel dieserUntersuchungen ist es, der Arzneibuch-kommission ein geeignetes Testsystem alsserologische Referenzmethode fur denErsatz des MNT vorschlagen zu konnen,

2 Material und Methode

Urn die Vergleichbarkeit der eingesetz-ten in vitro Methoden gewahrleisten zukonnen, wurde sowohl ein einheitlichesTetanus-Toxoid (TEFT, 1000 Lf pro Am-puUe) als auch ein Tetanus-Ig-Standard(Human Tetanus Ig, 120 IU pro Ampul-Ie), beides biological reference prepara-tions (BRPs) der WHO, eingesetzt.

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2.1 Aufbau des indirekten enzymelinked immunosorbent assay (ELISA)96-well Mikrotiterplatten werden zu-nachst uber 16 h mit dem Tetanus-Toxoidbeschichtet. In diesen Kavitaten werdendie zu testenden Praparate sowie die Stan-dardlosung austitriert und uber 2 h inku-biert. Die gegen Tetanus-Toxoid gerich-teten Ig aus derTest- und StandardlOsungbinden spezifiseh an dem Toxoid und wer-den im folgenden durch einen enzymmar-kierten, gegen Human-IgG gerichtetenZweitantikorper detektiert. Die Auswer-tung erfolgt uber einen parallel-line-as-say, bei dem die Dosis- Wirkungs- Kurvender Testpraparate und des Standards aufein und derselben Mikrotiterplatte zuein-ander in Bezug gesetzt werden.

2.2 Aufbau der Rocket Immunelek-trophorese (RIE)Fliissiges Agarosegel, dem Tetanus- Toxo-id zugefligt ist, wird auf eine Glasplattegegossen. In ausgestanzte Depots werdendanach in mindestens 4 Verdtinnungsstu-fen die Standardlosung sowie jeweils ineiner Verdtinnungsstufe die zu testendenPraparate gegeben. Unter Anlegen einerSpannung findet uber 5 h eine elektropho-retische Wanderung der Ig aus den De-pots in das toxoidhaltige Agarosegel statt.Dabei bilden sich spezifische Immunpra-zipitate aus, deren Flache proportional zudem Antigen/ Antikorper- Verhaltnis ist.Die Hohe der angefarbten Prazipitate ausden Proben wird mit denen der Standard-losung uber Regressionsanalyse direkt inBeziehung gesetzt.

2.3 Aufbau des Toxin BindungsInhibition Testes (ToBI)Sowohl die zu priifenden Praparate alsauch die Standardlosung werden in einer96-well Mikrotiterplatte austitriert und16 h mit einer konstanten Tetanus-Toxo-

id Menge inkubiert. Jede dieser Mischun-gen wird in eine zweite, mit anti -Tetanus-Toxoid besehichtete Mikrotiterplatte uber-flihrt. Ungebundenes (nicht .neutralisier-tes") Tetanus- Toxoid aus den zugeflihrtenMischungen bindet an diese Fangantikor-per und wird uber einen zweiten zugefug-ten enzymmarkierten anti-Tetanus-Toxo-id-Antikorper detektiert. Die Auswertungerfolgt wie beim indirekten ELISA ubereinen parallel-tine-assay.

3 Ergebnisse

Die Nachweisgrenze fur den indirektenELISA kann mit 0,005 intemationalen Ein-heiten pro Milliliter (IE/ml), fur den ToBImit 0,04 IE/ml und fur die RIB mit 5 IE/mlangegeben werden. Naeh der Optimierungaller drei Methoden wurden acht Ig-Prapa-rate parallel in den in vitro Methoden wie-derholt auf ihren spezifischen Tetanus-Ig-Gehalt tiberpriift. In Abbildung 1 sind diejeweiligen arithmetischen Mittelwerte ausdrei Bestimmungen der in vitro Methoden,im Vergleich zu den Tierversuchsdaten ausdem MNT, in IE/ml aufgetragen. Die Buch-staben (A bis D) stehen fur die HerstellerlPraparate, die Zahlen (1 und 2) fur unter-schiedliche Chargen. Die unter Al bis B2aufgefiihrten Proben sind Tetanus-Ig-Pra-parate mit einem produktspezifischenGrenzwert yon ~ 250 IE/ml. Die tibrigenvier Prodnkte sind Ig-Praparate, die ledig-lich einen geringen Tetanus-Ig-Anteil be-sitzen. Fur Praparat D sind keine MNT-Daten in der Abbildung aufgeflihrt, da sichhier derTetanus-Ig-Gehalt zwischen 5 und10 IE/ml bewegt.AIle drei in vitro Methoden sind in der

Lage, die ersten vier Testprodukte als Teta-nus- Ig-Praparate mit hohen spezifischen Ig-Mengen von den letzten vier allgemein Ig-Praparaten mit niedrigen Tetanus-Ig-Men-gen zu unterscheiden. Mittels RIE konnten

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in Produkt D keine Tetanus-Ig bestirnmtwerden. Der indirekte ELISA bewertet dieTetanus-Ig-Praparate (AI bis B2) niedrigerals der Tierversuch, die RJE hingegen stetsetwas hoher, Der ToBI liegt mit seiner Be-wertung der Tetanus-Ig-Praparate in dreivon vier Proben sehr eng am MNT. Nachden Ergebnissen dieser Studie kann dieReproduzierbarkeit der in vitro Methodenmit den in Tabelie 1 aufgefuhrten inter-as-say-Variationskoeffizienten angegeben wer-den. Diese bewegen sich je nach Methodeund Testpraparat zwischen 2 und 27%.

4 Diskussion und Aussicht

Es konnte gezeigt werden, daB aIle dreiuntersuchten in vitro Methoden in der Lagesind, Ig-Praparate mit hohen spezifischenanti-Tetanus Mengen von allgemeinen Ig-Produkten zu unterscheiden. Nach der Ph.Eur. Monographie 398 mlissen gultige Te-tanus-Ig-Produkte mindestens 100 IE/mlenthalten. In Bezug auf diesen Grenzwertkonnte mittels aller drei Methoden die Wirk-sarnkeit der vier entsprechenden Praparate(AI bis B2) bestatigt werden. Es ist alier-dings zu bedenken, daB der produktspezifi-sche Grenzwert der untersuchten "giiltigen"Produkte bei ;:::250 IEJmllag. In Bezug aufdiesen Grenzwert konnte jedoch lediglichmittels RIE und ToBI diese Spezifikationfur die Praparate A und B bestatigt werden.Produkt D konnte nur mittels ELISA undToBI bestirnmt werden, da die Nachweis-grenze der RIE mit 5 !E/ml zu hoch ist, urndiese geringen Tetanus-Ig-Mengen nochdetektieren zu konnen. Es muB jedoch be-dacht werden, daB es bei der Wirksarnkeits-priifung von Tetanus-Ig-Praparaten uner-heblich ist, ob eine Methode soleh niedrigeMengen noch zu detektieren vermag. Vie1wesentlicher ist es, zwischen Produktenunterscheiden zu konnen, deren Tetanus-Ig-Menge iiber bzw. unter der geforderten"Mindestmenge" von 100 IE/mlliegt. DieReproduzierbarkeit der in vitro Methodenliegt nach den ermittelten Variationskoeffi-zienten der Literatur entsprechend in einemakzeptablen Bereich fur RIE und ToBI, soll-te aber insbesonders fur den ELISA verbes-sert werden (TIJSSEN 1988, KEMENY1994, DAB 10). An dieser Stelle muB aucherwahnt werden, daB fur den MNT Vertrau-ensgrenzen zwischen 80 und 125% nachArz-neibuch akzeptiert sind. Dies entspricht einemVariationskoeffizienten von 25%, dervon zweiin vitro Methoden unterboten wird.

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450400350300!:'

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62 C2

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Abbildung 1: Vergleichende in vivo und in vitro Bestimmung von Tetanus-Ig. Die Pro-dukte A und B sind Tetanus-Ig-Priiparate, Produkte C und D allgemein Ig-Praparate,wobei die Zahlen unterschiedliche Chargen kennzeichnen. Angegeben sind die ermit-telten in vitroErgebnisse als arithmetische Mittelwerte mit Standardabweichungen (aus3-fach Bestimmungen) sowie die in vivo Daten nach Herstellerangaben.

Tabelle 1: Sensitivitiit und Reproduzierbarkeit der in vitroMethoden

Methode Nachweisgrenze Inter-assay-Variationskoeffizient

ELISA 0,0005 !E/m! 8 - 27 % (meist > 15 %)

RIE 5,0 IElm! 3 - 17% (meist < 15%)

ToBI 0,04 !E/m! 2 - 21 % (meist < 5 %)

Standardarbeitsanweisungen und aJlebenotigten Materialien fur die Durchfiih-rung von ELISA und RIE wurden an einzweites Labor verschickt. Acht Tetanus- Ig-Praparate wurden mehrfach im Entwick-lungs- und im Testlabor parallel untersuchtund verglichen. Die Variationen der ermit-telten Daten im ELISA lagen zwischen denLabors durchweg unter 10%. In! Vergleichzum MNT wurden mittels ELISA in bei-den Labors die Produkte stets niedriger be-wertet. Die Ubertragbarkeitsstudie fur dieRIE ist derzeit noch nicht abgeschlossen.Untersuchungen zur Transferierbarkeit desToBI stehen noch aus.

Aile drei in vitro Methoden sollen kiinf-tig mit einem Testpanel, das insbesondersauch grenzwertige Produkte enthalt, in ei-ner Pravalidierungsstudie liberpriift werden,urn danach die am besten geeignete Metho-de als serologische Referenzmethode fur dieWirksarnkeitspriifung von Tetanus-Ig vor-zuschlagen.

Literatur

Deutsches Arzneibuch, 10. Auflage (1996).Kommentar: zu Kapitel V.2.1.1OImmunche-

mische Methoden. Stuttgart: Deutscher Apo-theker Verlag.Frankfurt: Govi-VerlagGmbH.

European Pharmacopoeia (1995).Kemeny, D. M. (1994). EliSA: Anwendung des

enzyme linked immunosorbent assay im biolo-gisch/medizinischeri Labor.Nach der amerika-nischenAuflage vonHans Luppa (1991).Stutt-gart, Jena, New York:GustavFischerVerlag.

Tijssen, P. (1988). Laboratory techniques inbiochemistry and molecular biology. Prac-tice and theory of enzyme immunoassays.Amsterdam, New York, Oxford: ElsevierScience Publishers B.Y..

WeiBer, K. and Hechler, U. (1997). AnimalWelfareAspects in the Quality Control of Im-munobiologicals. A Critical Evaluation ofthe Animal Tests in Pharmacopoeia Mono-graphs. Nottingham: FRAME.

DanksagungDie Arbeit wird mit der Unterstlitzung vonECVAM durchgeflihrt.

KorrespondenzadresseDipl.-Biol. Elvira EbertPaul-Ehrlich- InstitutAbteilung VeterinarmedizinPaul-Ehrlich-Strasse 51-59D-63225 Langen

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