Optimització de colors per anàlisi en citometriade flux

Normes:

1. Seleccionar els fluorocroms d'acord a l'instrument que es farà servir

2. Adequar la brillantor dels fluorocroms al nivell d'expressió de l'antigen.

• Fluorcroms brillants - Antígens poc expressats

• Fluorcroms dèbils - Antígens molt expressats

3. Minimitzar els solapament d'espectres entre fluorocroms que s'expressen en la

mateixa cèl·lula.

4. Evitar combinacions que generin falsos positius en el cas que es degradi el

fluorocrom.

5. Intentar, sempre que sigui possible, usar fluorocroms excitats pel LASER vermell

amb antígens que s'expressin en cèl·lules amb alta autofluorescència.

Fluorocroms - Característiques

1. Brillantor

2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms

3. Estabilitat.

4. Senyal d’unió inespecífica.

5. Mida.

Fluorocroms - Característiques

1. Brillantor

2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms

3. Estabilitat.

4. Senyal d’unió inespecífica.

5. Mida.

La brillantor depèn de:

• La brillantor relativa

• Número de fluorocroms per anticòs

• Sistema òptic de l’equip

i es defineix per l’índex de tinció SI (Stain Index). L’SI depèn del sistema òptic de l’equip i per tant pot variar d’un equip a un altre.

Fluorocroms - Característiques

1. Brillantor

SIFluorocrom

305PE

263APC

198PE-Cy5

184AF 647

122PE-Cy7

99PerCp-Cy5.5

68AF 488

65BD Horizon V450

64AF 700

43Fitc

37AmCyan

36APC-Cy7

30PerCp

27BD HV500

25APC-H7

Intensitat

+

-

Fluorocroms - Característiques

1. Brillantor

2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms

3. Estabilitat.

4. Senyal d’unió inespecífica.

5. Mida.

Els espectres d’emissió dels fluorocroms abarquen tot un rang de longituds d’ona. La senyal que detectem en els diferents detectors de l’equip ve determinada per uns filtres que deixen passar llum d’una longitud d’ona o una altra. Hi ha fluorocroms que els detectem en el detector que no volem i per tant cal compensar aquesta senyal.

El solapament d’espectres depèn, doncs, de la configuració òptica de l’equip.

Fluorocroms - Característiques

PE-Cy7

APC-Cy7

BD APC-H7

PerCp-Cy5.5

PerCp

PE-Cy5

AF 647

APC

PE

FITC

AF 488

AmCyan

BD Horizon V500

BD Horizon V450

PE-Cy7

APC-Cy7

BD APC-H7

PerCp-Cy5.5

PerCp

PE-Cy5

AF 647

APCPEFITC

AF 488

AmCyan

BD Horizon V500

BD Horizon V450

Per exemple, en un FacsCanto amb una configuració 4-2-2 tindríem aquesta taula de solapament d’espectres.

No es poden combinar

Se solapen els espectres <5%

Se solapen els espectres 5%><20%

Se solapen els espectres >20%

Fluorocroms - Característiques

1. Brillantor

2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms

3. Estabilitat.

4. Senyal d’unió inespecífica.

5. Mida.

Així doncs, cal combinar fluorocroms que estiguin en verd. Si cal combinar fluorocroms que estan en groc o taronja evitar que estiguin en la mateixa cèl·lula i si no ho podem evitar procurar que sigui en marcadors que s’expressin en gran quantitat.

Si dos fluorocroms que se solapen es troben a la mateixa cèl·lula, quan compensem les senyals es produirà una dispersió de les dades que comprometràla resolució.

Fluorocroms - Característiques

1. Brillantor

2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms

3. Estabilitat.

4. Senyal d’unió inespecífica.

5. Mida.

Cal evitar combinacions que permetin falsos positius en cas de degradació dels fluorocroms.

Els fluorocroms poden ser inestables degut a la llum, als agents fixadors o a altres agents. Això es tradueix en:

• Canvis en els valors de compensació

• Reducció en la intensitat de la senyal

• Dissociació dels tándems donant lloc a marcatge de les cèl·lules amb el fluorocrom parental (PE ò APC) que no podrà ser distingit del marcatge de PE ò APC original. Possibilitat de dobles positius.

Fluorocroms - Característiques

- +Estabilitat

Llum: APC-Cy7 << PE-Cy5 << PE-Cy7 << PerCp-Cy5.5 << BD APC-H7

Fixadors: APC-Cy7 << PE-Cy7 << PE-Cy5 << AmCyan

Temperatura: A Temperatura Ambient estable durants uns quants dies. Mirar condicions d’enviament. A 37ºC estable durant hores. Mai congelar un anticòs conjugat a un fluorocrom.

PH: 7,4 Òptim. La majoria són sensibles a canvis de pH (excepte els Alexa). Els buffers ja estan ajustats.

1. Brillantor

2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms

3. Estabilitat.

4. Senyal d’unió inespecífica.

5. Mida.

Fluorocroms - Característiques

1. Brillantor

2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms

3. Estabilitat.

4. Senyal d’unió inespecífica.

5. Mida.

Els receptors Fc expressats per les cèl·lules B, els monòcits i les cèl·lules dendrítiques poden unir-se fortament al PE-Cy5 (al Cy5 del PE).

Així doncs, si volem fer servir el PE-Cy5 en immunofenotipatge cal tenir en consideració:

• Cèl·lules de Rata o Ratolí: Usar bloquejadors de Fc comercials

• Cèl·lules humanes: Cocktails d’IgGs, sèrum humà.

L’afinitat dels receptors FC pel PE-TexasRed és baixa.

L’afinitat dels receptors FC pel PerCP-Cy5.5 i pel PE-Cy7 és pràcticament nula.

Fluorocroms - Característiques

1. Brillantor

2. Solapament de l’espectre d’emissió amb altres fluorocroms

3. Estabilitat.

4. Senyal d’unió inespecífica.

5. Mida.

No influeix en els resultats de marcatges intracel·lulars. Això si, es recomana fluorocroms intensos per detecció de molècules intracel·lulars perquè la senyal dels fluorocroms es veuràdisminuïda.