opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de · i Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis .............................................................................................................................i

Identifizierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors für TRAIL

(mTRAIL-R)

Dissertation zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Anne Große-Wilde

aus Aachen

Würzburg 2001

Eingereicht am: ___________________

Mitglieder der Promotionskommission:

Vorsitzender: Prof. Dr. R. Hedrich

Gutachter: Prof. Dr. P.H. Krammer

Gutachter: Prof. Dr. G. Pflugfelder

Tag des Promotionskolloquiums: ___________________

Doktorurkunde ausgehändigt am: ___________________

i

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................................. i

Zusammenfassung / Summary........................................................................................................ iv

Danksagung..................................................................................................................................... vi

I Einleitung............................................................................................................................... 1

1 Mechanismen des Zelltods ..................................................................................................... 1 1.1 Die Apoptose und die Nekrose ........................................................................................ 1 1.2 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Apoptose................................ 2

2 Signaltransduktionsmechanismen der Apoptose.................................................................... 4 2.1 Initiierung der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose...................................................... 4 2.2 Caspasen .......................................................................................................................... 8 2.3 Der mitochondriale Apoptoseweg ................................................................................... 9

3 Die physiologische Rolle der Todesrezeptor-Systeme......................................................... 10 3.1 Das TNF-System............................................................................................................ 12 3.2 Das CD95-System.......................................................................................................... 13

4 Das TRAIL/TRAIL-Rezeptor-System ................................................................................. 14 4.1 Die TRAIL-Rezeptoren ................................................................................................. 14 4.2 Strukturanalyse der TRAIL/TRAIL-R-Komplexe......................................................... 15 4.3 Die Signaltransduktion bei TRAIL-induzierter Apoptose............................................. 16 4.4 Was ist die physiologische Rolle des TRAIL-Systems?................................................ 17 4.5 Evidenzen für die Funktion von TRAIL als Tumorsuppressor ..................................... 18

5 Ziel der Arbeit ...................................................................................................................... 20

ii

II Material und Methoden....................................................................................................... 21

1 Material................................................................................................................................. 21 1.1 Biologisches Material .................................................................................................... 21 1.2 Chemikalien ................................................................................................................... 23 1.3 Molekularbiologische und proteinbiochemische Materialien........................................ 23 1.4 Puffer, Lösungen und Medien........................................................................................ 27 1.5 Verbrauchsmaterial ........................................................................................................ 31 1.6 Computerprogramme ..................................................................................................... 32 1.7 Firmen ............................................................................................................................ 33

2 Methoden.............................................................................................................................. 34 2.1 Molekularbiologische Methoden ................................................................................... 34 2.2 Proteinbiochemische Methoden..................................................................................... 43 2.3 Arbeiten mit eukaryontischen Zellen............................................................................. 49 2.4 Blastozysteninjektion von ES-Zellen............................................................................. 55 2.5 Immunbiologische Methoden ........................................................................................ 56

III Ergebnisse............................................................................................................................ 59

1 Klonierung eines murinen Homologs der humanen TRAIL-Todesrezeptoren .................... 59 1.1 Biochemische Charakterisierung von TRAIL-bindenden Oberflächenproteinen.......... 59 1.2 Die Sequenz des murinen TRAIL-Rezeptors mTRAIL-R............................................. 66

2 Funktionelle Analyse von mTRAIL-R................................................................................. 69 2.1 mTRAIL-R besitzt eine funktionelle Todesdomäne...................................................... 69 2.2 mTRAIL-R ist ein funktioneller TRAIL-Rezeptor........................................................ 71

3 Biochemische Charakterisierung von mTRAIL-R............................................................... 72 3.1 Identifizierung von mTRAIL-R als p54 ........................................................................ 72 3.2 Biochemische Untersuchungen zur Orthologie von p54_mTRAIL-R .......................... 73

4 Expressionsanalyse von p54_mTRAIL-R............................................................................ 75

5 Konditionale Inaktivierung des für mTRAIL-R kodierenden Gens tar ............................... 76 5.1 Klonierung und Charakterisierung von tar .................................................................... 77 5.2 Herstellung des Targeting-Vektors ................................................................................ 78 5.3 Erzeugung und Charakterisierung homolog rekombinierter ES-Zell-Klone ................. 84 5.4 Generieren der konditionalen und konstitutiven mTRAIL-R-defizienten ES-Zellen.... 85 5.5 Blastozysteninjektion und Mauszucht ........................................................................... 87

iii

IV Diskussion............................................................................................................................ 90

1 Identifizierung eines TRAIL-Todesrezeptors in der Maus .................................................. 90 1.1 Biochemische Charakterisierung muriner TRAIL-Rezeptoren ..................................... 90 1.2 Funktionelle Analyse und Expressionsanalyse von p54_mTRAIL-R ........................... 93 1.3 Untersuchung der Orthologie von p54_mTRAIL-R...................................................... 96

2 Generieren von konditionalen TRAIL-R defizienten Mäusen ............................................. 98 2.1 Möglichkeiten zur Erforschung der in vivo-Funktion von TRAIL und seiner

Rezeptoren ..................................................................................................................... 98 2.2 Die Knockoutstrategie ................................................................................................... 99 2.3 Das Cre/loxP-System..................................................................................................... 99

3 Ausblick- was ist die physiologische Rolle des TRAIL-Systems? .................................... 100 3.1 Potentielle Funktionen des TRAIL-Systems ............................................................... 101 3.2 Untersuchungen zur Rolle von mTRAIL-R als Tumorsuppressor .............................. 102 3.3 Untersuchungen zur Rolle von TRAIL bei der Virusabwehr ...................................... 105

V Literaturverzeichnis........................................................................................................... 106

VI Abkürzungen...................................................................................................................... 119

VII Lebenslauf.......................................................................................................................... 122

iv

Zusammenfassung

TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein

Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei

humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-

Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von

Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In

präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische

Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an

dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von

TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt.

Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-

Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der

beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden.

Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen

identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner

TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts

p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von

p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den

humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R

ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie

die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von

p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches

p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und

in vitro verwendet werden kann.

Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten

mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R

kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die

Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu

vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale

p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt.

Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc

Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für

die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und

dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.

v

Summary

TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) is an

apoptosis-inducing member of the tumor necrosis factor superfamily (TNF-SF). Currently

two human death receptors, namely TRAIL-R1 and TRAIL-2, belonging to the TNF receptor

superfamily (TNFR-SF) are known to bind TRAIL. Interestingly, TRAIL has been shown to

induce apoptosis in a variety of tumor cell lines whereas most primary cells were resistant. In

addition, preclinical studies with mice and nonhuman primates have indicated that TRAIL

does not induce substantial systemic toxicity. These observations have raised considerable

interest in the use of TRAIL in tumor therapy. Yet little is known about the physiological

function of TRAIL.

In order to examine the physiological function of TRAIL in vivo, the aim of this work was to

establish tools to study the apoptosis-inducing TRAIL system in mice. First the murine

homologue/s of the two death-inducing TRAIL receptors needed to be identified.

Therefore the first aim was to biochemically identify murine TRAIL-binding proteins via 2D-

gel analysis. With the help of the information from an EST sequence contained in a public

database a murine TRAIL receptor was cloned, which was termed p54_mTRAIL-R due to its

molecular weight as determined by biochemical analysis. Sequence comparison and

functional analysis of p54_mTRAIL-R revealed that mTRAIL-R is homologous to both

human TRAIL death receptors. Like its human counterparts p54_mTRAIL-R was capable of

inducing apoptosis in a caspase-dependent fashion upon overexpression. As transcripts of the

human TRAIL death receptors, also transcripts of p54_mTRAIL-R could be detected in all

tissues examined. A soluble p54_mTRAIL-R:Fc-protein was generated, which could be used

to block TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo.

To be able to study the physiological role of the p54_mTRAIL-R in vivo TRAIL-R deficient

mice were generated. For modification of the tar-locus coding for p54_mTRAIL the gene was

cloned and characterized. In order to avoid lethality or secondary complementing effects the

Cre/loxP system and Flp/FRT system was used to generate conditional p54_mTRAIL-R

deficient mice.

The tools generated in this work as soluble p54_mTRAIL-R:Fc fusion protein and conditional

p54_mTRAIL-R deficient mice can now be used in vivo to deduce the physiological role of

the TRAIL system and to determine its potential and limitations for cancer therapy.

vi

Danksagung

Dr. Henning Walczak danke ich für die Betreuung dieser Arbeit, Bereitstellung dieses Themas und seine Unterstützung.

Prof. Dr. Peter H. Krammer danke ich für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe und die Betreuung dieser Arbeit.

Priv. Doz. Dr. Gert Pflugfelder danke ich für die Bereitschaft, diese Arbeit als Gutachter zu betreuen.

Dr. Erich Greiner danke ich für die stets gewährte Hilfsbereitschaft in allen Fragen der Molekularbiologie und der Betreuung, Planung und Klonierung des Targeting-Vektors.

Danke vor allen Dingen allen ehemaligen und aktuellen Mitgliedern des „WEST“-Labs (Dr. Henning Walczak, Dr. Markus Weigand, Axel Bouchon, Eva Rieser, Heiko Stahl, Dr. Tom Ganten, Martin Sprick, Silke Maier, Michaela Rapp, Daniela Willen, Carl Leonard, Manuela Schader, Alan Punnoose und meinen Azubis Christine Schlösser, Markus (Malex) Stauch, Kerstin Sels, Kai Doberstein und Claudia Rappl) für die freundschaftliche Arbeitsatmosphäre, die die Arbeit oft bis spät in die Nacht und auch die Zeit außerhalb des Labors sehr angenehm gemacht hat.

Danke den ehemaligen und aktuellen Mitgliedern der Abteilung Krammer, insbesondere Dr. Sabine Kirchhoff, Dr. Ana Martin-Villalba, Elena Ritsou, Dr. Ingo Schmitz, Dr. Carsten Scaffidi, Dr. Kerstin Herzer, Dr. Susanne Müerköster, Frederick Igney und Sven Baumann für ihre stete Diskussions- und Kooperationsbereitschaft.

Prof. Dr. Günther Schütz danke ich für die Möglichkeit, in enger Kooperation mit seinen Mitarbeitern die Knockoutmäuse herzustellen und zu züchten. Insbesondere danke ich den Mitarbeitern der Abteilung Schütz, vor allem Dr. Erich Greiner. Tim Wintermantel danke ich für seine stete Hilfs- und Diskussionsbereitschaft in allen Fragen rund um die Maus, Heidrun Kern und Sandra Fehsenfeld für die große Hilfe bei der ES-Zellkultur, Annette Kleve-Nebenius und Frank van der Hofen für die Blastozysteninjektionen.

Dr. Johannes Coy (Abteilung Poustka, DKFZ) danke ich für seine Hilfe und Kooperation bei den Screens der cDNA- und genomischen Phagenbibliotheken. Dr. Antoaneta Mincheva und Prof. Dr. Peter Lichter (DKFZ) danke ich für die Kooperation zur chromosomalen Lokalisierung von tar mittels FISH-Analyse, Dr. Stefan Wolf (Abteilung Lichter, DKFZ) danke ich für die Hilfe bei den RACE-PCRs. Dr. Andrej Shevchenko und Anna Shevchenko (EMBL, Heidelberg) danke ich für die Kooperation bei der massenspektrometrischen Analyse der TRAIL-bindenden Proteine. Urs Rohrer-Hoffmann (Abteilung Grummt, DKFZ) danke ich für seine Hilfsbereitschaft zu Fragen der Molekularbiologie.

Ich möchte Silke, Tom, Bernd, Urs, Erich, Tim, Daniela, Kerstin, Esat, Ana, Martin, Markus, Carl und Manu für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken.

Schließlich danke ich meinen Eltern für ihre permanente Unterstützung- ihnen möchte ich diese Arbeit widmen.

I Einleitung 1

I Einleitung

1 Mechanismen des Zelltods

1.1 Die Apoptose und die Nekrose

Der Tod aller eukaryontischer Zellen kann zwei unterschiedlichen Mechanismen zugeordnet

werden, der Apoptose oder der Nekrose. Diese beiden Mechanismen können nach

morphologischen und biochemischen Gesichtspunkten voneinander unterschieden werden

(Kerr et al., 1972; Wyllie et al., 1980). Die Apoptose kann durch eine Reihe intra- und

extrazellulärer physiologischer Stimuli induziert werden. Diese umfassen die Aktivierung

sogenannter „Todesrezeptoren“, die zur Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-Superfamilie

(TNFR-SF) gehören, UV- und Gammastrahlung, Chemotherapeutika, Entzug von

Wachstumsfaktoren und Überexpression bestimmter Tumorsuppressorgene (Krammer, 1999).

Dagegen erfolgt Nekrose häufig nach irreversiblen Zellschädigungen, wie Einwirkung von

Toxinen oder Verletzungen.

Typische Merkmale der Apoptose sind u.a. Chromatinkondensation und internukleosomäre

Degradation der DNA, die in der charakteristischen „DNA-Leiter“ durch Einwirken spezieller

Endonukleasen resultiert (Wyllie et al., 1980). Desweiteren werden in apoptotischen Zellen

Veränderungen an der Plasmamembran festgestellt. So führt ein Verlust der

Membranstabilität zu blasenförmigen Ausstülpungen der Zelle (Zeiose), was schließlich im

Abschnüren sogenannter „apoptotischer Körperchen“ und in einer Verringerung des

Zellvolumens resultiert (Kerr et al., 1974). Parallel dazu wird ein Verlust der

Membranasymmetrie beobachtet, was zur Exposition von Phosphatidylserin an der

Zelloberfläche führt. Dieses Lipid kann durch Nachbarzellen oder Makrophagen erkannt

werden, die dann diese apoptotischen Zellen aufnehmen und abbauen (Duvall et al., 1985;

Fadok et al., 1992; Savill et al., 1990). Durch diesen Mechanismus kommt es bei der

Apoptose nicht zur Freisetzung von Bestandteilen des Zytoplasmas. Die Apoptose wird daher

nicht von Entzündungsreaktionen begleitet.

Bei der Nekrose dagegen wird durch Oncose, einem Anschwellen der Zelle, die

Plasmamembran zerstört und schließlich das Zytosol samt Zellorganellen freigesetzt. Dies

führt zu einer inflammatorischen Reaktion, die weitere Gewebsschädigungen zur Folge hat

(Trump et al., 1997).

I Einleitung 2

1.2 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Apoptose

Wachstum und Teilung von Einzellern wird lediglich durch das Nährstoffangebot limitiert. Im

Gegensatz dazu ist das Wachstum von Zellen eines Vielzellers durch komplexe Mechanismen

reguliert, die sich entwickelt haben, um die optimale Größe, Funktion und das

Zusammenspiel von diversen Organen zu gewährleisten. Die Möglichkeit zur Apoptose, dem

Programm des „geregelten Selbstmords“, trägt daher jede Zelle eines Vielzellers zum Wohl

des Gesamtorganismus in sich. Jedoch können somatische Zellen durch Mutationen die

Fähigkeit zur Apoptose verlieren. Solche entarteten Zellen kehren zu einem weitestgehend

Nährstoff-begrenzten Wachstum zurück. Daraus kann, wenn die mutationsbedingte Entartung

durch das Immunsystem nicht erkannt wird, ein Tumor entstehen.

Die Apoptose ist für die Entwicklung und Funktion eines Organismus so wichtig wie

Zellteilung, Zellwanderung und Differenzierung. So ist die Apoptose als „programmierter

Zelltod“ ein essentieller biologischer Vorgang für die Eliminierung von gealterten und

schädlichen Zellen wie z.B. mutierten und virusinfizierten Zellen sowie autoreaktiven

Lymphozyten. Die fundamentale Bedeutung der Apoptose wird durch den hohen Grad an

Konservierung der an der Apoptose beteiligten Proteine während der Evolution unterstrichen.

So besitzen bereits Protostomier wie der Nematode C. elegans und die Fruchtfliege

D. melanogaster Elemente der apoptotischen Maschinerie von Vertebraten.

Im Immunsystem ist die Apoptose besonders gut charakterisiert. Das Immunsystem stellt eine

Gemeinschaft von interagierenden Zellen dar, bestehend u.a. aus T- und B-Lymphozyten,

natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), Makrophagen und dendritischen Zellen. Es zeichnet

sich durch zwei zentrale, durch Apoptose regulierte Eigenschaften aus: Spezifität und

Homöostase (Krammer, 2000). So erlaubt die Spezifität des enormen Repertoires aus T-

Zellrezeptoren und Antikörpern der B-Zellen einerseits die Erkennung einer Vielzahl von

Antigenen. Andererseits besteht die Gefahr der Autoimmunität (Sebzda et al., 1999). Um die

Homöostase im Immunsystem zu gewährleisten, muss während einer Immunantwort nach der

klonalen Expansion die Zahl der antigenspezifischen Lymphozyten durch Apoptose wieder

reduziert werden (Berzins et al., 1999).

Das im Thymus ausgebildete T-Zell-Repertoire ist das Resultat des konzentrierten

Zusammenspiels von Apoptose und Überlebenssignalen. Zelluläre Marker für die T-Zell-

Entwicklung sind neben dem T-Zell-Rezeptor (TCR) die Korezeptoren CD4 und CD8. Naive

doppelt negative (CD4-/CD8-) Thymozyten wandern vom Knochenmark in den Thymus. Dort

reifen sie zu doppelt positiven (CD4+/CD8+) Thymozyten heran und durchlaufen dann eine

I Einleitung 3

„positive“ und „negative Selektion“. Nur den Thymozyten, die einen T-Zell-Rezeptor

exprimieren und der von körpereigenen MHC-Molekülen (Major Histocompatibility

Complex) präsentierte Antigene erkennen kann, wird in der positiven Selektion durch

Hochregulation antiapoptotischer Gene das Überleben ermöglicht. Ist jedoch die Affinität des

TCRs zu einem körpereigenen, MHC-gebundenen Antigen zu hoch, werden die

entsprechenden Zellen in der negativen Selektion durch Apoptose eliminiert. Dies sichert

Toleranz gegenüber körpereigenen Proteinen und verhindert Autoimmunität (Nossal, 1994).

Anschließend reifen die Thymozyten noch im Thymus zu CD4+-T-Helfer-Zellen oder CD8+-

Killer-T-Zellen heran. Nur mit funktionellem TCR ist es den Thymozyten möglich, den

Thymus zu verlassen und die sekundären lymphoiden Organe zu besiedeln (Sebzda et al.,

1999).

Zu wenig oder zu viel Apoptose ist die Ursache einer Vielzahl schwerer Erkrankungen

(Krammer, 2000). Neben Krankheiten wie Krebs und Autoimmunität, bei denen zu wenig

Apoptose stattfindet, gibt es auch Krankheiten, bei denen ein Übermaß an Apoptose eine

pathologische Situation herbeiführt. Dies ist z.B. bei AIDS und neurodegenerativen

Erkrankungen der Fall.

AIDS ist charakterisiert durch eine Depletion von CD4+-T-Helferzellen, obwohl die Zahl der

tatsächlich infizierten CD4+-T-Zellen sehr gering ist. Durch regulatorische virale

Genprodukte (wie HIV-Tat) können nichtinfizierte T-Zellen für Apoptose sensitiviert werden.

Diese kann z.B. ausgelöst werden durch Todesliganden wie CD95L oder TRAIL (Debatin et

al., 1994; Jeremias et al., 1998; Katsikis et al., 1997; Katsikis et al., 1995; McCloskey et al.,

1995; Westendorp et al., 1995) oder durch Bindung von HIV-gp120 an CD4 (Berndt et al.,

1998).

Massive Apoptose von Neuronen ist für die Entwicklung des Gehirns sehr wichtig. Dies

wurde u.a. durch das Studium von Mäusen verdeutlicht, die gendefizient sind für Caspasen,

welche für die Exekution der Apoptose wichtig sind (Tab. I.2). Übermäßige pathologische

Apoptose kann jedoch zu einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen führen. Bei

Krankheiten wie Morbus Alzheimer, Parkinson und Chorea Huntington begehen spezifische

Neuronen aufgrund einer Toxizität von anomalen Proteinstrukturen oder Proteinaggregaten

Apoptose. Dies resultiert z.B. in irreversiblem Gedächtnisverlust, unkontrollierten muskulären

Bewegungen und Depressionen. Nach neuronalen Verletzungen wie z.B. bei Ischämie kann

man ebenfalls eine gesteigerte Apoptose beobachten (Linnik et al., 1993; Martin-Villalba et

al., 2001; Yuan und Yankner, 2000).

I Einleitung 4

2 Signaltransduktionsmechanismen der Apoptose

2.1 Initiierung der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose

2.1.1 Todesrezeptoren und ihre Liganden

Mit der Entdeckung von CD95 (APO-1/Fas) war es zum ersten Mal gelungen, ein

Oberflächenmolekül zu identifizieren, das in der Lage ist, nach Kreuzvernetzung direkt

Apoptose in der betreffenden Zelle auszulösen (Itoh et al., 1991; Oehm et al., 1992; Trauth et

al., 1989; Yonehara et al., 1989). CD95 ist ein glykosyliertes Typ I-Transmembranprotein

und gehört zur Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor Superfamilie (TNFR-SF, siehe Abb. I.1 und

Tab. I.1) (Baker und Reddy, 1996; Idriss und Naismith, 2000; Smith et al., 1994).

TNFαLTβLTα

CD95L

RANK

OPG

OPGLRANKL

TRANCE

TRAIL-R3DcR1LIT

TRID

TRAIL-R4DcR2

TRUNDDTRAIL-R1

DR4APO-2

TRAIL-R2DR5

KILLERTRICK2

TRAILAPO-2L

APO-1Fas

CD95

TRAMPAPO-3

WslDR-3LARD

TNF-R1

TNF-R2

?

DR6

?LTα

LTβ-RTNFRRP

Abb. I.1 Die Todesrezeptor-Liganden-Systeme Gezeigt ist der für die Apoptoseauslösung relevante Ausschnitt aus TNF- und TNFR-SF. Neben den Todesrezeptoren und –liganden sind weitere, mit diesen interagierende Familienmitglieder gezeigt, die selbst keine Apoptose auslösen können. Die Untergruppe der Todesrezeptoren und ihrer respektiven Liganden ist rot umrandet, die Todesdomäne wird durch ein rotes Rechteck, die cysteinreichen Domänen durch gelbe Rauten markiert.

I Einleitung 5

Rezeptor

TNFR-SF

Alternative

Bezeich-nung

Referenz Ligand

TNF-SF

Alternative Bezeich-nung

Referenz

CD95 Fas APO-1

Itoh et al., 1991 Oehm et al., 1992

CD95L FasL Apo-1L

Suda et al., 1993

TNF-R1 CD120a Loetscher et al., 1990 Schall et al., 1990 Smith et al., 1990

TNFα LTα

Wang et al., 1985

TNF-R2 CD120b Dembic et al., 1990 LTα TNFα

TNFβ Gray et al., 1984

EDAR Headon und Overbeek, 1999

EDA EDA1 Yan et al., 2000

TRAIL-R1 DR4

Pan et al., 1997

TRAIL APO2L Wiley et al., 1995 Pitti et al., 1996

TRAIL-R2 DR5 TRICK2 KILLER

Walczak et al., 1997 MacFarlane et al., 1997 Pan et al., 1997 Screaton et al., 1997 Sheridan et al., 1997 Wu et al., 2000

TRAIL

TRAIL-R3 DcR1 TRID LIT

Degli-Esposti et al., 1997 Pan et al., 1997 Sheridan et al., 1997 MacFarlane et al., 1997

TRAIL

TRAIL-R4 DcR2 TRUNDD

Degli-Esposti et al., 1997 Marsters et al., 1997 Pan et al., 1998

TRAIL

OPG OCIF, TR1 Simonet et al., 1997 Emery et al., 1998

RANKL TRAIL

OPGL TRANCE ODF

Anderson et al., 1997 ; Lacey et al., 1998 ; Takahashi et al., 1999 Emery et al., 1998

RANK TRANCE-R Wong et al., 1997 Anderson et al., 1997

RANKL OPGL TRANCE ODF

Anderson et al., 1997 ; Lacey et al., 1998 ; Takahashi et al., 1999

DR6 TR7 Pan et al., 1998 nicht bekannt

TRAMP DR3 WSL-1 Apo-3 LARD

Chinnaiyan et al., 1996 Bodmer et al., 1997 Kitson et al., 1996 Marsters et al., 1996 Screaton et al., 1997

nicht bekannt

Tabelle I.1 Die Interaktionen zwischen der TNF-Todesrezeptor-Familie und ihren respektiven Liganden der TNF-Familie.

Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch die Anwesenheit von zwei bis sechs

cysteinreichen extrazellulären Subdomänen (cystein rich domain, CRD) aus, die vom N-

Terminus her durchnummeriert werden. Diese etwa 40 Aminosäuren langen Subdomänen

enthalten typischerweise drei Intraketten-Disulfide, die durch sechs hochkonservierte

Cysteine ausgebildet werden. Mittels dieses Gerüsts von Disulfidbrücken erlangen die

Rezeptoren eine gestreckte Form.

I Einleitung 6

Die biologischen Effekte, die durch Rezeptoren dieser Familie vermittelt werden, umfassen so

vielfältige Ereignisse wie Differenzierung, Proliferation, Aktivierung und Apoptose. Die

meisten TNFR-SF-Proteine werden im Immunsystem exprimiert, wo ihre Fähigkeit zu

schneller und effizienter Signalübermittlung entscheidend für die Koordination der

Proliferation und den Schutz durch pathogenreaktive Zellen ist (Locksley et al., 2001; Smith

et al., 1994).

Aufgrund der Fähigkeit Apoptose auszulösen, werden die TNFR-Familienmitglieder CD95,

TNF-R1, TRAMP, TRAIL-R1, TRAIL-R2 und DR6 zur Untergruppe der „Todesrezeptoren“

zusammengefasst (Peter et al., 1999). Diese zeichnen sich durch eine ca. 80 Aminosäuren

lange, zwischen diesen sechs Rezeptoren stark homologe Domäne im intrazellulären Bereich

aus, die als Todesdomäne (death domain, DD) bezeichnet wird. Die DD ist essentiell für die

Apoptoseinduktion (Itoh und Nagata, 1993; Tartaglia et al., 1993).

Die Aktivierung der Todesrezeptoren wird durch die Bindung spezifischer Liganden

induziert. Ähnlich wie die Rezeptoren bilden auch die Liganden eine Proteinfamilie, die

TNF-Superfamilie (TNF-SF) genannt wird. Einige der TNF-SF-Mitglieder sind in Abbildung

I.1 zusammen mit ihren respektiven Rezeptoren dargestellt. Mitglieder dieser Familie wie

CD95L und TRAIL sind Typ II Transmembranproteine und werden sowohl

membrangebunden als auch in löslicher Form gefunden (Kayagaki et al., 1995; Mariani et al.,

1995; Tanaka et al., 1995). Die Interaktionen zwischen den Mitgliedern der TNFR-SF und

den Liganden der TNF-SF überschneiden sich teilweise und bilden ein regelrechtes Netzwerk

(siehe Abb. I.1). So kann z.B. der Ligand TRAIL an fünf verschiedene Rezeptoren binden.

Der lösliche Rezeptor OPG (Osteoprotegerin), einer dieser TRAIL-Rezeptoren, kann zudem

mit OPGL/RANKL interagieren, welcher wiederum auch an RANK bindet. Ebenso besitzt

z.B. TNF-R1 mit TNFα, dem LTα-Homomer und dem LTα/β-Komplex mehrere Liganden.

Zusätzlich kann ein LTα/β-Heteromer sowohl an TNF-R1, TNF-R2 als auch an LTβ-R

binden.

2.2.2 Die Struktur der Rezeptor-Liganden-Komplexe

Erste Hinweise auf den Ursprung des von den Todesrezeptoren ausgehenden Signals brachten

Untersuchungen zur Struktur von TNFα oder LTα und TNF-R1. Es konnte gezeigt werden,

dass sowohl LTα als auch TNFα in einer trimeren Form kristallisieren (Eck und Sprang,

1989; Eck et al., 1992; Jones et al., 1989). Desweiteren ergab die Strukturanalyse des TNF-

R1 im Komplex mit LTα, dass auch der Rezeptor nach Bindung des Liganden trimerisiert,

wodurch das Signal in das Zellinnere weitergeleitet werden kann (Banner et al., 1993).

I Einleitung 7

Auch die Struktur des ungebundenen TNF-R1 konnte dargestellt werden (Naismith et al.,

1995). Der Rezeptor trat in Form zweier verschiedener Dimere auf, welcher im 3:3-Komplex

des Liganden-Rezeptor-Komplexes nicht auftrat. Es wurde vorgeschlagen, dass die

Rezeptoren möglicherweise in Abwesenheit des Liganden als Dimere vorliegen. So wurde

neuerdings eine konservierte Domäne in der extrazellulären Region von TNF-R1, TNF-R2,

CD95, TRAIL-R1 und CD40 identifiziert, die verantwortlich für die ligandenunabhängige

Rezeptordimerisierung sein soll und daher als PLAD (pre-ligand-binding assembly domain)

bezeichnet wurde (Chan et al., 2000). Die PLAD befindet sich in der CRD1 und ist notwendig

für die Zusammenführung von TNF-Rezeptor/Liganden-Komplexen, die das Signal in die

Zelle weiterleiten, so dass Rezeptoren bereits vor der Ligandenbindung oligomerisieren. Nach

diesem Modell muss man davon ausgehen, dass entweder intrazelluläre Apoptosehemmer

vorliegen, die, wie z.B. SODD (silencer of death domains) im TNF-Signalweg, die

ligandenunabhängige Apoptoseauslösung verhindern, oder dass Ligandenbindung eine

aktivierende Konformationsänderung der intrazellulären Domänen bewirkt (Chan et al., 2000;

Siegel et al., 2000).

2.1.3 Auslösung des Todesrezeptorsignals

Funktionelle Studien des CD95-Systems und des TNF-Systems ergaben, dass ein CD95-

Dimer keine Apoptose auslösen kann, wohingegen ein multimerisierter Rezeptor in der Lage

ist, das apoptotische Signal in die Zelle weiterzuleiten (Dhein et al., 1992). Daraus konnte

gefolgert werden, dass das erste Signal zur Apoptoseinduktion durch CD95 eine

Trimerisierung oder Multimerisierung der Rezeptoren darstellt. Dies kann entweder durch

Bindung des Liganden oder Bindung eines agonistischen Antikörpers wie z.B. anti-APO-1

ausgelöst werden (Trauth et al., 1989). Außerdem kann auch durch Überexpression von

Rezeptoren mit Todesdomänen Apoptose induziert werden (Bodmer et al., 1997; Boldin et

al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996; Marsters et al., 1996; Muzio et al., 1996).

Für die Übermittlung des apoptotischen Signals ist die Todesdomäne essentiell (Itoh und

Nagata, 1993). Diesbezüglich ist die Signaltransduktion des CD95-Rezeptors am besten

untersucht. Nach antikörper- oder ligandenvermittelter Kreuzvernetzung des Rezeptors

kommt es intrazellulär zu einer Rekrutierung von Adaptermolekülen (Kischkel et al., 1995).

Der Komplex zwischen aktiviertem CD95-Rezeptor und den assoziierten Signalmolekülen

wurde „Tod-induzierender Signalkomplex“ genannt (death inducing signalling complex,

DISC). Unter anderem durch massenspektrometrische Analyse konnten die im CD95-DISC

I Einleitung 8

enthaltenen Adaptermoleküle FADD/MORT (Boldin et al., 1995; Chinnaiyan et al., 1995;

Kischkel et al., 1995) und FLICE/Caspase-8 identifiziert werden (Muzio et al., 1996).

FADD besitzt wie die Todesrezeptoren eine Todesdomäne, die sich am C-Terminus des

Moleküls befindet. Über diese Domäne bindet FADD mittels hydrophober Wechselwirkungen

an die Todesdomäne des stimulierten Todesrezeptors. FADD selbst übt keinerlei

enzymatische Aktivität aus, sondern dient als Adapter für die Rekrutierung weiterer

Effektormoleküle wie Caspase 8 und Caspase 10 an den DISC (Kischkel et al., 2000;

Kischkel et al., 2001; Sprick et al., eingereicht). Dies geschieht mittels homophiler

Interaktion der N-terminalen Todeseffektordomäne (death effector domain, DED)

(Chinnaiyan et al., 1996). So konnte durch Mutationsanalysen gezeigt werden, dass die DD

von FADD ohne die DED in der Lage ist, durch Überexpression Zellen vor CD95-vermittelter

Apoptose zu schützen. Diese Mutante wurde FADD-DN (FADD dominant negativ) genannt

(Chinnaiyan et al., 1996). Dagegen kann allein durch Überexpression der DED Apoptose

induziert werden (Chinnaiyan et al., 1996).

2.2 Caspasen

Die im DISC des CD95-Rezeptors enthaltenen Procaspasen 8 und 10 sind Zymogene, also

inaktive Vorstufen von Proteasen, die für die Apoptose eine eminent wichtige Rolle spielen.

Die große Relevanz dieser zur Familie der sogenannten „Caspasen“ gehörigen Enzyme

spiegelt sich in der Tatsache ihrer hohen Konservierung während der Evolution wider. So

findet man sogar in der Hydra (Budihardjo et al., 1999) und in C. elegans (Yuan et al., 1993)

Homologe zu menschlichen Caspasen. Der Name Caspase leitet sich ab vom Cystein im

aktiven Zentrum und der besonderen Spezifität dieser Proteasen, nach einem Aspartat zu

spalten. Die Aktivierung der enzymatisch inaktiven Procaspasen geschieht durch

proteolytische Spaltung nach definierten Aspartatresten, was zur Freisetzung einer

Prodomäne, sowie einer großen (p20) und einer kleinen katalytischen Untereinheit (p10)

führt. Das reife katalytisch aktive Enzym besteht schließlich aus einem Heterotetramer aus

zwei p20- und zwei p10-Untereinheiten (Earnshaw et al., 1999).

Caspasen sind die primären Effektoren der Apoptose, was durch die Tatsache verdeutlicht

wird, dass Inhibition der Caspasen Apoptose blockieren kann (Hengartner, 2000). So besitzen

verschiedene Viren spezialisierte Proteine, die die Funktion der Caspasen inhibieren können.

Die bekanntesten Beispiele sind CrmA (cytokine response modifier A) des Kuhpockenvirus

und das p35-Protein des Baculovirus. Sowohl CrmA als auch BV-p35 können Todesrezeptor-

vermittelte Apoptose inhibieren (Beidler et al., 1995; Tewari et al., 1995). Ihr

I Einleitung 9

Wirkmechanismus ist ähnlich wie der von Serpinen (Schlangengiften), indem sie sich nach

Spaltung durch Proteasen stabil an das aktive Zentrum lagern und somit das Enzym

inaktivieren (Xue und Horwitz, 1995). CrmA inhibiert Aktivierung der Caspasen 1, 5, 8 und 9

(Garcia-Calvo et al., 1998), während BV-p35 ein wesentlich breiteres Wirkspektrum aufweist

(Miller, 1997). Eine andere Klasse von Caspase-Inhibitoren stellen Tri- oder Tetrapeptide dar,

die die Zielsequenz verschiedener Caspasen beinhalten und durch chemische Modifikationen

zu irreversiblen Inhibitoren werden. So blockiert z.B. der in der vorliegenden Arbeit

verwendete Inhibitor zVAD-fmk die Caspasen 3, 6, 7, 8, 9 und 10 (Villa et al., 1997).

Caspasen können nach ihren bevorzugten Substraten, Sequenzspezifitäten und strukturellen

Ähnlichkeiten in drei verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Gruppe I umfasst Caspasen 1,

4, 5, 11 und 13, die häufig bei Entzündungsprozessen aktiviert werden. In Gruppe II werden

Caspasen 2, 3 und 7 und in Gruppe III Caspasen 6, 8, 9 und 10 eingeteilt. In den beiden

letzteren sind sowohl Apoptoseinitiatoren wie auch Apoptoseeffektoren zu finden.

Apoptoseinitiatoren sind z.B. die durch CD95- und TRAIL-Rezeptor-Oligomerisierung

mittels ihrer DED an den DISC rekrutierten Caspasen 8 und 10. Diese wiederum können in

einer „Caspasenkaskade“ andere Caspasen wie z.B. die Effektorcaspase-3 aktivieren. Solche

Apoptoseeffektoren sind verantwortlich für die Vielzahl der morphologischen Veränderungen

der Zellen während der Apoptose. Zu deren Substraten gehören z.B. der Inhibitor ICAD der

Nuklease CAD/DFF (Nagata, 2000), Cytoskelettproteine wie Gelsolin (Kothakota et al.,

1997) und nukleäres Lamin A (Orth et al., 1996).

2.3 Der mitochondriale Apoptoseweg

Auch den Mitochondrien wird eine zentrale Funktion bei der Apoptose zugeschrieben

(Kroemer, 1998). Apoptotische Aktivierung der Mitochondrien kann durch Ligation von

Todesrezeptoren wie CD95 erfolgen, oder aber durch Behandlung mit Chemotherapeutika,

UV- und Gammastrahlung sowie durch reaktive Sauerstoff-Intermediate und eine Vielzahl

zellulärer Noxen ausgelöst werden. So kann während der Apoptose ein Abfall des

mitochondrialen Membranpotentials (∆Ψm) noch vor der DNA-Fragmentierung beobachtet

werden. Dieser Verlust von ∆Ψm ist nach nahezu allen apoptotischen Stimuli zu verzeichnen

und stellt daher ein universelles Ereignis dar (Kroemer et al., 1997). Dies wird durch einen

Vorgang verursacht, den man „Permeabilitätstransition“ nennt und der durch das Öffnen von

Poren der inneren Mitochondrienmembran gekennzeichnet ist (Bernardi et al., 1994). Dabei

werden verschiedene Faktoren wie Cytochrom c und AIF (apoptosis inducing factor) aus den

Mitochondrien freigesetzt. AIF gelangt schließlich in den Zellkern und verursacht Chromatin-

I Einleitung 10

Kondensierung und DNA-Fragmentierung (Lorenzo et al., 1999). Cytochrom c hat neben

seiner essentiellen Rolle in der mitochondrialen Atmungskette die Funktion, im Cytoplasma

mittels Bindung an das humane CED-4-Homolog Apaf-1, Caspasen zu aktivieren (Zou et al.,

1997).

Der Mechanismus der Freisetzung der proapoptotischen Faktoren aus den Mitochondrien ist

noch weitestgehend unklar, doch sind Bcl-2-Familienmitglieder an der Regulation beteiligt.

Bcl-2 wurde ursprünglich als Onkogen identifiziert (Tsujimoto et al., 1985) und ist das

kanonische Mitglied einer ganzen Familie pro- und antiapoptotischer Proteine. Die wichtige

Funktion der Bcl-2-Familienmitglieder wird dadurch unterstrichen, dass z.B. CED-9 aus

C. elegans und Bcl-2 homologe Proteine sind, die sogar funktionell austauschbar sind

(Hengartner, 1999). Alle Mitglieder dieser Familie besitzen mindestens eines von vier

konservierten Motiven, die als BH1- bis BH4-Domänen (für Bcl-2-Homologie-Domänen)

bezeichnet werden. Diese dienen als Unterscheidungsmerkmal der drei Subgruppen, nämlich

der antiapoptotischen Bcl-2-Subfamilie mit Bcl-2 und Bcl-xL und der proapoptotischen Bax-

Subfamilie (z.B. Bax, Bok) und BH3-Subfamilie (z.B. Bad, Bid) (Reed et al., 1996).

Bei der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose gibt es sogenannte „Typ II-Zellen“, die trotz

Anwesenheit des CD95-Rezeptors nur einen sehr schwachen DISC bilden. Dennoch kann

nach CD95-Kreuzvernetzung über den mitochondrialen Signalweg Aktivierung von Caspase-

9 und Caspase-3 erfolgen und Apoptose ausgelöst werden. In diesen Zellen werden nach

Stimulation des CD95-Rezeptors im Gegensatz zu „Typ I-Zellen“ nur geringe Mengen an

Caspase-8 aktiviert (Scaffidi et al., 1998), die aber ausreichen, um das proapoptotische BH3-

Subfamilienmitglied Bid zu spalten. Trunkiertes Bid (tBid) verursacht schließlich durch

Anlagerung an die Mitochondrienmembran den Verlust des Transmembranpotentials und

Freisetzung von Cytochrom c (Luo et al., 1998). Durch starke Überexpression von Bcl-2 oder

Bcl-xL kann in Typ II-Zellen CD95-induzierte Apoptose über die Mitochondrien inhibiert

werden (Scaffidi et al., 1998).

3 Die physiologische Rolle der Todesrezeptor-Systeme

Die physiologische Funktion von Genen wurde traditionellerweise durch Beobachtung von

spontanen Mutationen in ganzen Organismen untersucht, wie z.B. die lpr-Mutation bei

Mäusen, die kein CD95 besitzen (siehe unten). Die Entwicklung der Genklonierung und die

in vitro Mutagenese ermöglicht es nun, mittels gezielter Inaktivierung bestimmer Gene („gene

targeting“) Informationen zu erlangen, die dem Verständnis der physiologischen Rolle des

I Einleitung 11

vom inaktivierten Gen kodierten Proteins dienen. Mäuse, in denen gezielt Gene inaktiviert

werden, bezeichnet man als „Knockoutmäuse“. Zusammen mit der Analyse von murinen und

humanen Krankheiten haben Knockoutmäuse wesentlich zum Verständnis der Todesrezeptor-

vermittelten Apoptose beigetragen. Eine Zusammenfassung der Knockout-Modelle der

Rezeptoren, Liganden, einiger Signalmoleküle und der mit bekannten Todesrezeptoren

assoziierten Krankheiten ist in Tabelle I.2 aufgeführt. Durch die Tabelle wird verdeutlicht,

dass den TNF/TNFR-SF-Proteinen eine entscheidende Rolle im Immunsystem, aber auch bei

der Entwicklung, der Gewebshomöostase und im Nervensystem zukommt.

Knockout mit Mutationen assoziierter Phänotyp

CD95/APO-1/ Fas lpr-Mutante

Geringerer AICD in T-Zellen ; Lymphoproliferation, Autoimmunität (ALPS)

TNF-R1 Gestörte Abwehr bakterieller Pathogene; LPS-Resistenz; defekte Bildung der Peyerschen Plaques und der Keimzentren

TNF-R2 Erhöhte Sensitivität gegenüber bakteriellen Pathogenen, geringere Sensitivität für LPS; geringere Antigen induzierte T-Zell Apoptose

LTβR/TNF-RIII Abwesenheit von Lymphknoten; Defekt bei der Bildung von Keimzentren TRAMP/DR3 Beeinträchtigung der negativen Selektion und des αCD3 vermittelten Zelltods von

Thymozyten DR6 Erhöhte CD4+-Proliferation, erhöhte Cytokin-Produktion der Th2-Helferzellen RANK Osteopetrose; Abwesenheit von Osteoklasten und Lymphknoten; anomale B-Zell-

Entwicklung OPG Osteoporose; Arterienveralkung TRAIL Bisher kein Phänotyp beschrieben CD95L gld-Mutante

Geringerer AICD in T-Zellen; Lymphoproliferation, Autoimmunität (ALPS)

TNFα Defekt in Bildung der Keimzentren, erhöhte Empfindlichkeit für mikrobielle Pathogene LTα Abwesenheit von Peyerschen Plaques und Lymphknoten; deorganisierte Mikrostruktur der

Milz; Defekt in Bildung der Keimzentren LTβ Abwesenheit von Peyerschen Plaques und peripheren Lymphknoten; Defekt in Bildung der

Keimzentren OPGL/RANKL Osteopetrose; Abwesenheit von Osteoklasten und Lymphknoten; anomale B- und T-Zell-

Entwicklung FADD Tg FADD-DN

Embryonal letal ; gestörte Herzmuskelentwicklung und Proliferation von Thymozyten sowie peripheren T-Zellen in RAG2-/- Chimären, Embryonal letal ; Überleben der Thymozyten bei Abwesenheit des TCRs, gestörte Proliferation der Thymozyten zwischen doppelt negativem zu doppelt positivem Stadium, Entwicklung von Thymus-Lymphomen in RAG1 -/- Chimären

Caspase-3 Letal; neuronale Hyperplasie; partielle Resistenz reifer T-Lymphozyten für AICD Caspase-8 Embryonal letal ; gestörte Herzmuskelentwicklung; embryonale Fibroblasten resistent

gegenüber Todesrezeptor induzierter Apoptose, normale Sensitivität für UV, Staurosporin, Etoposid, Dexamethason und Serumentzug

Caspase-9 Letal: neuronale Hyperplasie Tabelle I.2 Phänotypen von TNF/TNFR-SF-Knockoutmäusen und Knockoutmäusen involvierter

Signalmoleküle (Locksley et al., 2001; Ranger et al., 2001).

Der große evolutive Vorteil des Immunsystems der Vertebraten beruht auf dem System der

adaptiven oder Antigen-gerichteten Immunität, in welchem TNF/TNFR-Familienmitglieder

I Einleitung 12

eine zentrale Rolle spielen. Diese basiert auf der Rekombination durch die Rekombinase-

aktivierenden Gene RAG-1 und RAG-2 sowie der Mutation der kombinatorischen T- und B-

Zell-Rezeptor-Gene, die eine grosse Zahl verschiedener Antigene erkennen können. Für die

Koordination der Immunantwort benötigen die Lymphozyten TNF/TNFR-SF-Proteine.

Vergleiche zwischen verschiedenen Spezies deuten darauf hin, dass die größte Expansion

neuer Superfamilienmitglieder während der Evolution der adaptiven Immunantwort geschah

(Locksley et al., 2001).

3.1 Das TNF-System

Die effektivsten Immunantworten geschehen innerhalb der sekundären lymphoiden Organe

wie z.B. den Peyerschen Plaques oder Lymphknoten. Diese sind Aggregate von Lymphozyten

und Antigen-präsentierenden Zellen. Mäuse ohne LTβ (Lymphotoxin β) entwickeln z.B.

keine sekundären lymphoiden Organe und haben eine gestörte humorale Immunität (Fu und

Chaplin, 1999). Der Architektur der lymphoiden Organe übergeordnete Strukturen sind

Follikel und Keimzentren. Diese sind zelluläre Aggregate hauptsächlich von B-Zellen, aber

auch von T-Zellen und follikulären antigenpräsentierenden dendritischen Zellen. Die

Interaktionen mit den dort reifenden B-Zellen zu Antikörper-sezernierenden Plasmazellen

stehen unter dem Einfluss der TNF-SF-Mitglieder TNFα, LTα, LTβ, TNF-R1 und LTβR. Für

diese Gene defiziente Mäuse haben schwere Defekte in Keimzentren und Lymphfollikeln (Fu

und Chaplin, 1999).

TNFα- und TNF-R1-defiziente Mäuse zeigen zudem Kontakthypersensitivität auf Irritationen

und eine erhöhte Empfänglichkeit für mikrobielle Pathogene (Erickson et al., 1994;

Pasparakis et al., 1996; Pfeffer et al., 1993; Rothe et al., 1993). TNFα hat somit eine zentrale

Rolle bei der Abwehr von Mikroorganismen inne. Diese beruht auf der schnellen

Rekrutierung vieler inflammatorischer Zelltypen zum Ort der Infektion. Sobald jedoch die

Infektionsgefahr gebannt ist, muss die Entzündung zurückgehen und normale

Gewebshomöostase eintreten. Schnelle Antwort und rasches Abklingen der Entzündung sind

entscheidend, um Schaden vom Wirt durch mikrobielle Infektion oder persistierende

Inflammation abzuwenden. TNF-Sekretion kann durch strukturelle, konservierte Elemente

von mikrobiellen Pathogenen wie LPS (Lipopolysaccharide) oder CpG Motiven bakterieller

DNA hervorgerufen werden (Aderem und Ulevitch, 2000). Der TNFα-Sekretion folgt eine

komplexe biologische Kaskade unter Involvierung von Chemokinen und Cytokinen, die

Aktivierung und Rekrutierung von Granulozyten, Makrophagen und Lymphozyten zum

I Einleitung 13

beschädigten oder infizierten Gewebe zur Folge hat. Lokale Injektion von TNFα rekapituliert

diese Vorgänge.

3.2 Das CD95-System

In der Maus sind mehrere Mutationen beschrieben, die das CD95-System betreffen und

dessen zentrale Rolle im Immunsystem verdeutlichen. Der Phänotyp solcher Mäuse beinhaltet

die unkontrollierte Akkumulation von doppelt negativen (CD4-/CD8-) Thymozyten, was zu

einer Vergrößerung von Milz und Lymphknoten führt und Autoimmunsymptome durch

Bildung von Autoantikörpern zur Folge hat. Die lpr-Mutation (Lymphproliferation) betrifft

den CD95-Rezeptor, dessen Expression durch die Insertion eines Transposons in das zweite

Intron des Gens stark reduziert wird (Adachi et al., 1993; Chu et al., 1993; Mariani et al.,

1994; Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Bei der lprcg-Mutation wird die Signaltransduktion

des CD95-Rezeptors durch eine Punktmutation im Bereich der Todesdomäne verhindert

(Matsuzawa et al., 1990). Bei gld-Mäusen (generalized lymphoproliferative disease) betrifft

der Defekt den CD95-Liganden (CD95L). Hier verhindert ein Aminosäureaustausch im

extrazellulären Bereich des Proteins die Rezeptorbindung (Takahashi et al., 1994). Auch beim

Menschen werden ähnliche Mutationen des CD95-Systems beschrieben (Fisher et al., 1995;

Rieux-Laucat et al., 1995). Sie können zur Ausbildung des Autoimmunlymphoproliferativen

Syndroms (ALPS) führen, welches sich durch massive Lymphadenopathie, der Akkumulation

von nicht-malignen T-Zellen, und Anzeichen von Autoimmunität auszeichnet. Diese

Krankheitsbilder verdeutlichen, dass das CD95-System maßgeblich an der Apoptose im

Immunsystem beteiligt ist. So konnte gezeigt werden, dass die Stimulation des TCRs auf

bereits aktivierten T-Zellen zu einer verstärkten Produktion des CD95-Liganden und damit zu

autokrinem Selbstmord der T-Zellen führt (Alderson et al., 1995; Brunner et al., 1995; Dhein

et al., 1995; Ju et al., 1995). Dieser sogenannte „Aktivierungs-induzierte Zelltod“ (AICD) ist

in vivo an der peripheren Deletion aktivierter T-Zellen nach einer Immunantwort beteiligt und

ist somit für die Homöostase des Immunsystems entscheidend.

Hinweise auf die Beteiligung weiterer Todesrezeptorsysteme bei der T-Zell-Entwicklung

kamen u.a. von FADD-Knockoutmäusen und Mäusen, die eine dominant negative Form von

FADD exprimieren (FADD-DN). FADD ist als DISC-Bestandteil essentieller Vermittler der

CD95- und TRAIL-vermittelten Apoptose (Bodmer et al., 2000; Chinnaiyan et al., 1995;

Kischkel et al., 1995; Kischkel et al., 2000; Sprick et al., 2000) und ist ebenfalls

Konvergenzpunkt der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose bei TNF-R1 und TRAMP

(Chinnaiyan et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996). T-Zellen durchlaufen während ihrer

I Einleitung 14

Entwicklung im Thymus mehrere Kontrollpunkte. Ein Scheitern an diesen Kontrollpunkten

resultiert in Apoptose. Zunächst wird durch die positive Selektion in denjenigen Thymozyten

Apoptose induziert, die ihre TCR-Gene nicht korrekt rearrangieren können. Diese

Thymozyten-Apoptose bleibt jedoch in solchen Mäusen aus, die kein funktionelles FADD

exprimieren (Newton et al., 2000). Überraschenderweise ist in diesen Mäusen ebenfalls die

Antigen-induzierte Proliferation von T-Zellen gestört. Ein weiterer Kontrollpunkt besteht in

der negativen Selektion, wobei in autoreaktiven Thymozyten Apoptose induziert wird.

Kürzlich konnte gezeigt werden, dass diese in TRAMP-Knockoutmäusen erheblich

beeinträchtigt ist (Wang et al., 2001). Weiterhin können eine Reihe immunologischer und

anderer physiologischer Zelltodprozesse nicht durch eine Beteiligung des TNF- oder des

CD95-Systems erklärt werden. Eine Beteiligung von Todesrezeptorsystemen ist jedoch durch

die Ergebnisse aus den FADD-DN transgenen Mäusen gezeigt. Daher ist die Untersuchung

der anderen Todesrezeptorsysteme notwendig, um die molekularen Mechanismen dieser

Prozesse aufzuklären.

4 Das TRAIL/TRAIL-Rezeptor-System

Mit TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) wurde 1995 aufgrund

seiner Sequenzhomologie zum CD95L ein weiteres Mitglied der TNF-SF gefunden (Wiley et

al., 1995). Interessanterweise induziert TRAIL Apoptose in mehr als 60 % aller

Tumorzelllinien, (Pitti et al., 1996; Thomas und Hersey, 1998; Wiley et al., 1995), nicht

jedoch in den meisten normalen primären Geweben (Walczak et al., 1999).

4.1 Die TRAIL-Rezeptoren

Um die Funktion und Regulation des humanen TRAIL-Apoptose-induzierenden Systems

verstehen zu können, musste zunächst der Rezeptor für TRAIL identifiziert werden (Walczak

und Krammer, 2000). Die Suche nach dem Rezeptor endete mit der überraschenden

Erkenntnis, dass TRAIL an fünf verschiedene Rezeptoren bindet. Damit ist TRAIL das TNF-

Familienmitglied mit den meisten Rezeptoren (Degli-Esposti, 1999).

TRAIL bindet an zwei membranständige Apoptose-induzierende Rezeptoren, TRAIL-R1

(DR4/Apo-2) (Pan et al., 1997) und TRAIL-R2 (DR5/Killer/TRICK2) (MacFarlane et al.,

1997; Pan et al., 1997a; Schneider et al., 1997; Screaton et al., 1997a; Walczak et al., 1997;

Wu et al., 1997), die beide eine Todesdomäne besitzen. Zwei zusätzliche zellgebundene

Rezeptoren TRAIL-R3 (TRID/LIT/DcR1) (Degli-Esposti et al., 1997; Mongkolsapaya et al.,

I Einleitung 15

1998; Pan et al., 1997; Schneider et al., 1997; Sheridan et al., 1997) und TRAIL-R4

(DcR2/TRUNDD) (Degli-Esposti et al., 1997; Marsters et al., 1997; Pan et al., 1998) sowie

ein löslicher Rezeptor OPG (Emery et al., 1998; Simonet et al., 1997) wurden beschrieben,

die keine Todesdomäne besitzen und daher kein apoptotisches Signal vermitteln können.

Zunächst wurde vermutet, dass die Existenz dieser als „Scheinrezeptoren“ (DcR für decoy

receptor) bezeichneten Rezeptoren eine Antwort auf die differentielle Sensitivität gegenüber

TRAIL unter normalen und transformierten Zellen liefern könnte, indem diese mit TRAIL-R1

und TRAIL-R2 um die Bindung an TRAIL konkurrieren (Pan et al., 1997; Sheridan et al.,

1997). Mit Hilfe monoklonaler Antikörper stellte sich jedoch später heraus, dass TRAIL-

Resistenz weniger auf der Ebene der TRAIL-R3- und TRAIL-R4-Expression reguliert wird

als vielmehr durch intrazelluläre Mechanismen. So korrelierte in Melanomzellen der Grad der

TRAIL-Rezeptor-Expression nicht mit einer Sensitivität gegenüber TRAIL (Griffith et al.,

1998; Zhang et al., 1999). Vielmehr ging z.B. in Keratinozyten die TRAIL-Resistenz mit

einer erhöhten Expression von c-FLIP einher (Leverkus et al., 2000), einem die Caspase-

Aktivierung am DISC verhindernden Protein (Krammer, 2000). Auch die in IL-2-stimulierten

primären T-Zellen nach Cycloheximid-Behandlung induzierbare Sensitivität gegenüber

TRAIL-induzierter Apoptose beruht nicht auf veränderter Expression der TRAIL-

Oberflächenrezeptoren (M.Weigand, persönliche Mitteilung).

4.2 Strukturanalyse der TRAIL/TRAIL-R-Komplexe

Die vier TRAIL-Rezeptoren TRAIL-R1 bis TRAIL-R4 besitzen zwei vollständige

membranproximale CRDs (CRD2 und CRD3) und eine nur zwei Cysteine enthaltende N-

terminale CRD (CRD1). Vor kurzem wurde die Kristallstruktur von TRAIL-R2 im Komplex

mit TRAIL aufgeklärt (Hymowitz et al., 1999; Mongkolsapaya et al., 1999). Trotz einer

geringen Sequenzhomologie von lediglich 30% innerhalb der Proteinfamilien ist die grobe

Struktur des TRAIL/TRAIL-R2-Komplexes dem von LTα/TNF-R1 sehr ähnlich. Es konnten

zwei Hauptkontaktstellen in diesem Komplex ausgemacht werden, die mit Patch A und

Patch B bezeichnet wurden. Ein Bereich der CRD2 von TRAIL-R2 wurde „50s-Schleife“

genannt und erwies sich als sehr homolog sowohl in der Struktur zum LTα/TNF-R1-Komplex

als auch in der Sequenz zu den anderen Todesrezeptormitgliedern. Es wurde vorgeschlagen,

dass die 50s-Schleife im Patch A einen Kontakt mit hydrophoben Resten des Liganden

herstellt. Die Spezifität für einen bestimmten Liganden würde dagegen von der sogenannten

„90s-Schleife“ im Patch B erzeugt. Die 90s-Schleife liegt in der CRD3 von TRAIL-R2 und

besitzt eine völlig andere Konformation als die entsprechende Schleife in TNF-R1. Diese

I Einleitung 16

Hypothese wird von der Beobachtung unterstützt, dass in der 90s-Schleife deutlich mehr

Reste der TRAIL-Rezeptoren TRAIL-R1 bis TRAIL-R4 und OPG miteinander

übereinstimmen als bei den anderen TNFR-Familienmitgliedern (Hymowitz et al., 1999).

Eine andere Arbeitsgruppe fand eine weitere nur für die TRAIL-Rezeptoren spezifische

Kontaktstelle zwischen TRAIL-R2 und TRAIL, für die die sogenannte AA‘‘-Schleife des

Liganden TRAIL verantwortlich sein soll. Dieses Segment bildet mit einigen Resten (Y-50,

E-70 und N-81) spezifische polare Interaktionen mit TRAIL-R2 aus, die in den anderen

TRAIL-Rezeptoren gleich oder homolog substituiert sind (Cha et al., 2000).

4.3 Die Signaltransduktion bei TRAIL-induzierter Apoptose

Um die komplizierte Regulation von Resistenz und Sensitivität gegenüber TRAIL verstehen

zu können, ist es notwendig, die intrazellulären Vorgänge der Signaltransduktion nach

TRAIL-Bindung an seine Rezeptoren zu verstehen.

Wie der CD95-induzierte DISC enthält auch der TRAIL-induzierte native DISC von TRAIL-

R1 und TRAIL-R2 das Adaptermolekül FADD, Procaspase-8 (Bodmer et al., 2000; Kischkel

et al., 2000; Sprick et al., 2000) sowie Procaspase-10 (Sprick et al., eingereicht). Dabei

können sowohl homomere als auch heteromere (Kischkel et al., 2000; Sprick et al., 2000)

Rezeptorkomplexe gebildet werden. Es wurde in einer dieser Studien gezeigt, dass FADD-

und Caspase-8- defiziente Jurkat-Zellen, die ausschließlich TRAIL-R2 auf ihrer

Zelloberfläche exprimieren, bei Rekonstitution mit den jeweils fehlenden Proteinen wieder

sensitiv für TRAIL-induzierte Apoptose werden (Sprick et al., 2000). Damit war der Beweis

für eine essentielle Beteiligung von FADD und Caspase-8 bei der TRAIL-R2 induzierten

Apoptose erbracht.

TRAIL-induzierte Apoptose führt in Jurkat-Zellen zunächst zu Aktivierung der Caspasen 8

und 3 und anschließend erst zum Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials.

Stabile Transfektion von Jurkat-Zellen mit den antiapoptotischen Molekülen Bcl-2 und Bcl-xL

kann TRAIL-induzierte Apoptose nicht wie CD95-vermittelte Apoptose verhindern. Jedoch

ist in diesen Zellen die durch das Chemotherapeutikum Etoposid induzierte Apoptose stark

reduziert. Damit ist TRAIL-vermittelte Apoptose in Jurkat-Zellen unabhängig von der

proapoptischen Maschinerie der Mitochondrien (Walczak et al., 2000). Im Gegensatz dazu

kann allerdings für Pankreas-Karzinomzellen eine protektive Rolle für das antiapoptotische

Bcl-2-Subfamilienmitglied Bcl-xL gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose gezeigt werden

(Hinz et al., 2000). Es existieren also, wie für CD95-induzierte Apoptose (Scaffidi et al.,

1998), auch für TRAIL-vermittelte Apoptose sowohl Typ I-Signalwege mit später

I Einleitung 17

Involvierung der Mitochondrien sowie auch Typ II-vermittelte mitochondriale Signalwege

(Suliman et al., 2001).

4.4 Was ist die physiologische Rolle des TRAIL-Systems?

Die Expression von funktionellem TRAIL wird an der Oberfläche von verschiedenen

Apoptose-induzierenden Zellen detektiert, deren Mechanismus zuvor unbekannt gewesen

war. Unter ihnen befinden sich Typ II-Interferon (IFNγ)-stimulierte Monozyten (Griffith et

al., 1999), Typ I-Interferon (IFNα und -β) oder TCR-aktivierte T-Zellen (Kayagaki et al.,

1999; Musgrave et al., 1999), Cytomegalie Virus (CMV)-infizierte Fibroblasten (Sedger et

al., 1999), Newcastle-Disease-Virus (NDV)-stimulierte Monocyten (Sennewald et al.,

eingereicht), CD4+-T-Zellen (Mariani und Krammer, 1998; Martinez-Lorenzo et al., 1999;

Thomas und Hersey, 1998), Interferon-stimulierte sowie virusinfizierte dendritische Zellen

(Vidalain et al., 2000) und IFN-, IL-2- und IL-15- stimulierte sowie unstimulierte NK-Zellen

(Johnsen et al., 1999; Kashii et al., 1999; Kayagaki et al., 1999; Zamai et al., 1998).

Interessanterweise wird die funktionelle Expression von TRAIL oft durch Stimulation mit

Interferonen hervorgerufen. In primären T-Zellen geht der IFNα-stimulierten Expression von

TRAIL eine transkriptionelle Induktion voraus. Der für die IFN-induzierte Aktivierung des

TRAIL-Promotors essentielle Promotorbereich konnte bereits identifiziert werden (Grosse-

Wilde et al., in Vorbereitung). Es ist wahrscheinlich, dass der bekannte antitumorale (Griffith

et al., 1999; Kayagaki et al., 1999) sowie antivirale (Sedger et al., 1999) Effekt der

Interferone zumindest teilweise auf TRAIL-vermittelte Apoptose zurückgeht.

Es gibt verschiedene Hinweise, dass TRAIL bei der Pathologie von AIDS eine Rolle spielen

könnte. HIV-Infektion induziert den graduellen Verlust von CD4+-T-Zellen durch Apoptose,

die hauptsächlich die nichtinfizierten CD4+-T-Zellen betrifft (Finkel et al., 1995). So wird

berichtet, dass TRAIL sowohl in den Aktivierungs-induzierten Zelltod (Jeremias et al., 1998;

Katsikis et al., 1997) als auch in den CD4/CXCR4-induzierten Zelltod (Ritsou et al., in

Vorbereitung) von CD4+-T-Zellen involviert ist. Schließlich konnte kürzlich in einem

Transplantations-Mausmodell für AIDS durch Inaktivierung von TRAIL die Apoptose von

nichtinfizierten humanen CD4+-T-Zellen inhibiert werden. (Miura et al., 2001).

Auch in Autoimmunerkrankungen scheint das TRAIL-System involviert zu sein. So wurde in

einem Kollagen-induzierten in vivo-Modell in Mäusen Autoimmun-Arthritis durch Blockade

von TRAIL verschlimmert, wohingegen intraartikulärer TRAIL-Gentransfer die Entzündung

linderte (Song et al., 2000). Dieselbe Gruppe konnte zeigen, dass in einem Tiermodell für

Multiple Sklerose in Mäusen, der experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE),

I Einleitung 18

durch Blockade von TRAIL die Entzündung verstärkt wurde (Hilliard et al., 2001). In beiden

Studien wurde nach Blockade von TRAIL eine verstärkte Proliferation von autoreaktiven

Lymphozyten, aber keine verringerte Apoptose in den entzündeten Bereichen beobachtet. Das

Autoimmun-Lymphoproliferative Syndrom (ALPS Typ II) ist charakterisiert durch

immunregulatorische Defekte und eine gestörte Homöostase von Lymphozyten und

dendritischen Zellen. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass einige ALPS Typ II-Patienten

Mutationen in der Caspase-10 aufweisen, die mit CD95L- und TRAIL-induzierter Apoptose

interferieren (Wang et al., 1999).

4.5 Evidenzen für die Funktion von TRAIL als Tumorsuppressor

TRAIL-induzierte Apoptose in Tumorzellen kann durch verschiedene Mechanismen blockiert

werden. Einer davon ist die Mutation der Primärstruktur von TRAIL-R2 (Lee et al., 1999; Pai

et al., 1998) und TRAIL-R1 (Fisher et al., 2001). Interessanterweise wurden Mutationen der

TRAIL-Todesrezeptoren in humanen Tumoren mit häufigen Deletionen des

Chromosomenabschnitts 8p22-21 gefunden, wo die Gene für TRAIL-R1 bis TRAIL-R4

lokalisiert sind. Allelischer Verlust von 8p22-21 wird unter anderem in Tumoren der Lunge,

Prostata, Colon, Brust, Kopf und Hals-Tumoren und hepatozellulären Karzinomen beobachtet

(Mitelman et al., 1997). Außerdem gibt es Hinweise, dass Todesrezeptormutationen sowie

allelischer Verlust der Chromosomen 8p22-21 auch bei der Pathogenese von humanen

Tumormetastasen involviert ist (Anbazhagan et al., 1998; Yaremko et al., 1996). So wurde in

Brustkrebsmetastasen eine signifikant höhere Mutationsrate in den Todesdomänen von

TRAIL-R1 und TRAIL-2 vorgefunden als in nichtmetastasierenden Tumoren (Shin et al.,

2001).

Weitere Hinweise auf eine Funktion von TRAIL-Todesrezeptoren als Tumorsuppressoren

gibt die Tatsache, dass sowohl TRAIL-R1 (Guan et al., 2001) als auch TRAIL-R2 (Wu et al.,

1997) durch den Tumorsuppressor und Transkriptionsfaktor p53 induziert werden. Das p53-

Gen ist das am häufigsten mutierte Gen in humanen Tumoren. Nach DNA-Schädigung führt

Aktivierung von p53 zu Zell-Zyklus-Arrest und zur Induktion von Apoptose (Levine, 1997).

Neben Induktion der proapoptotischen Proteine Bax (El-Deiry, 1998) und CD95 (Muller et

al., 1998) können also auch TRAIL-R1 und TRAIL-R2 als Bindeglied zwischen p53 und der

zu schneller Apoptoseinduktion führenden Caspasen-Kaskade dienen. Chemotherapeutika

und Strahlentherapie benötigen funktionelle Expression des p53-Tumorsuppressorgens.

Jedoch induzieren Todesliganden Apoptose unabhängig von p53 und könnten eine Ergänzung

zur konventionellen Tumortherapie darstellen.

I Einleitung 19

Kürzlich konnte in vivo eine Korrelation von NK-Zell-Aktivierung mit TRAIL-vermitteltem

antimetastatischem Effekt gezeigt werden. In diesen Studien wurden durch Behandlung von

Mäusen mit IFNγ-induzierenden NK-Zell-Aktivatoren Lebermetastasen durch die Induktion

TRAIL-vermittelter Apoptose verhindert (Smyth et al., 2001; Takeda et al., 2001).

Die tumorselektive Zytotoxizität von TRAIL in vitro (Wiley et al., 1995) eröffnete neue

Perspektiven für die Behandlung von Tumoren in vivo (Walczak et al., 1999). Im Gegensatz

zur systemischen Toxizität der Todesliganden TNF und CD95L (Nagata, 1997) ist systemisch

verabreichtes TRAIL weder in Mäusen (Walczak et al., 1999) noch in nichthumanen

Primaten (Ashkenazi et al., 1999) toxisch. Zudem führte wiederholte Behandlung von

Mäusen, die TRAIL-sensitive humane Tumoren besaßen, mit einer aktiven Form von TRAIL

zu aktiv unterdrücktem Tumorwachstum (Walczak et al., 1999). In weiteren Studien konnte

gezeigt werden, dass die beobachtete TRAIL-induzierte Tumorregression in vivo durch

zusätzliche Behandlung mit den Chemotherapeutika 5-FU (Ashkenazi et al., 1999) oder

Camptothecin (CPT-11) (Gliniak und Le, 1999) synergistisch verstärkt wird. Ebenfalls einen

synergistischen Effekt hatten Strahlentherapie und TRAIL bei der Regression etablierter

Brustkrebs-Xenotransplantate, vermutlich weil Brustkarzinomzellen durch Strahlentherapie

für TRAIL-induzierte Apoptose sensitiviert werden können (Chinnaiyan et al., 2000).

Weiterhin konnte TRAIL mittels eines adenoviralen Vektors in humanen Coloncarcinom-

Xenotransplantaten exprimiert werden, wo eine auf Apoptoseinduktion zurückzuführende

Tumorsuppression erreicht werden konnte (Kagawa et al., 2001). Außerdem konnte gezeigt

werden, dass systemische Administration eines rekombinanten Gens kodierend für ein

TRAIL-Fusionsprotein zur Regression eines in SCID-Mäusen etablierten humanen

Brusttumors führte (Wu et al., 2001).

I Einleitung 20

5 Ziel der Arbeit

Die spezifische Inaktivierung von TNF- oder TNFR-Familienmitgliedern in Mäusen hat

wesentlich zur Klärung der physiologischen Rolle der einzelnen Rezeptor-Liganden-Systeme

beigetragen. In Multirezeptorsystemen wie z.B. beim TNF-System mit TNF-R1 und TNF-R2

konnten durch Geninaktivierung der Rezeptoren in Mäusen die spezifischen Rollen der

jeweiligen Rezeptoren bestimmt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung

und Charakterisierung eines murinen TRAIL-Todesrezeptors sowie die Bereitstellung von

Tiermodellen, in denen dieser Rezeptor gezielt inaktiviert ist. Diese Tiermodelle sollen dazu

genutzt werden können, Einblick in die physiologischen Funktionen des TRAIL-

Todesrezeptorsystems zu erhalten.

Zunächst musste ein muriner TRAIL-Todesrezeptor identifiziert, molekular und funktionell

charakterisiert und dessen Orthologie zu den humanen Rezeptoren determiniert werden. Mit

Bestimmung dieses murinen Rezeptors sollte schließlich die Möglichkeit geschaffen werden,

eine gezielte Analyse der in vivo-Funktion des TRAIL-Systems in der Maus durchzuführen.

So sollten zur funktionellen Inaktivierung von TRAIL in vitro und in vivo lösliche murine

Rezeptoren hergestellt werden, die in der Lage sind, TRAIL zu neutralisieren.

Durch Identifizierung des für den murinen TRAIL-Todesrezeptor kodierenden Gens und

dessen gezielter Inaktivierung mittels homologer Rekombination sollten TRAIL-R-

Knockoutmäuse erzeugt werden. Die ubiquitäre, konstitutive Inaktivierung von Genen in

herkömmlichen Knockoutmäusen führt in einigen Fällen zu embryonaler Letalität oder zu

kompensatorischen Effekten während der Ontogenese. Durch eine organspezifische

Inaktivierung eines Gens kann die Bedeutung des kodierten Proteins für physiologische oder

pathophysiologische Prozesse bestimmt werden, die ein bestimmtes Organ betreffen. Mittels

des Cre/loxP-Systems können neben konstitutiven auch konditionale Knockoutmäuse

hergestellt werden, bei denen das jeweilige Gen gewebsspezifisch oder induzierbar inaktiviert

ist. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Mäuse generiert werden, bei denen mTRAIL-R mittels

des Cre/loxP-Systems entweder konstitutiv oder konditional inaktiviert werden kann. Die

Analyse der konstitutiven TRAIL-R-Knockoutmäuse wird Aufschluss über potentielle

entwicklungsbiologische und physiologische Funktionen dieses TRAIL-Todesrezeptors

geben. Die Untersuchung der konditionalen TRAIL-R-Knockoutmäuse ist im Hinblick auf die

für TRAIL angenommene Rolle bei der Tumorentstehung und dessen potentiellen Einsatz bei

der Tumortherapie von grosser Bedeutung.

II Material und Methoden 21

II Material und Methoden

1 Material

1.1 Biologisches Material

1.1.1 Eukaryontische Zellen

1.1.1.1 Zelllinien

Name Spezies Beschreibung Medium Wachstum Jurkat JA3 Mensch T-Lymphomzelllinie Iscove in Suspension Ag-8 Maus Myelom RPMI + β-ME* in Suspension DC27.1 Maus T-Zelllinie RPMI + β-ME* in Suspension EL4 Maus Lymphom RPMI + β-ME* in Suspension Esb-MP Maus T-Zell-Lymphom, metastasierend RPMI IC-21 Maus Peritoneale Makrophagen, SV40

transformiert RPMI + β-ME* adhärent

L929 Maus Fibroblasten RPMI + β-ME* adhärent L1210 Maus Lymphoblasten DMEM in Suspension P815 Maus Mastocytom DMEM adhärent WEHI Maus Lymphoblasten DMEM in Suspension Yac-1 Maus Lymphom RPMI + β-ME* adhärent CV-1/ EBNA

Affe Nierenepithel-Zellen aus afrikanischem grünen Affen

DMEM-F12 adhärent

* in Verdünnung 1: 2 000 000 (v/v)

1.1.1.2 Zellen für die ES-Zellkultur

ES-Zell-Linie E14/1

Die verwendete embryonale Stamm-(ES-)Zell-Linie ist eine Sublinie der E14-Linie (Kuhn et al., 1991), welche aus Blastozysten von Mäusen des Stammes 129/Ola (einer Sublinie von 129/Sv) stammt.

Feederzellen

Die ES-Zellen wurden auf einem Rasen von Feederzellen (mitotisch inaktiven Maus-Fibroblasten) in Kultur gehalten. Für die normale Kultivierung wurden Mausfibroblasten verwendet, die aus 14,5 Tage alten Embryonen des Stammes NMRI präpariert worden sind. Befanden sich die ES-Zellen jedoch unter G418-Selektion, so mussten Fibroblasten verwendet werden, die ein Allel des neo-Genes tragen und somit unter G418 Selektion nicht absterben. Die G418 resistenten Fibroblasten wurden aus Embryonen gewonnen, die aus der Verpaarung eines GR-/--Männchens mit einem NMRI-Weibchen stammten.

1.1.2 E.coli-Bakterienstämme

zur Vermehrung von Plasmid DNA NM 554 Stratagene XL1-Blue Stratagene


zum Absuchen der Phagenbibliotheken C600 MoBiTec BNN132 MoBiTec exprimiert die Cre-Rekombinase unter Kanamycin-Selektionsdruck

zur ET-Klonierung NM-ET

Dieser E.Coli - Stamm wurde für die Klonierung durch homologe Rekombination (ET-Klonierung) verwendet. Er ist von NM 554 abgeleitet und trägt das Plasmid pBADETγ (Zhang et al., 1998) mit einer Tetracyclinresistenz. Nach entsprechender Vorbehandlung (s.u.) lässt er sich durch Elektroporation mit Plasmid-DNA und amplifizierten DNA-Fragmenten transformieren.

MM 294-Flp und MM 294-Cre Diese E.Coli-Stämme tragen das Gen für die Flp- bzw Cre-Rekombinase unter einem autonomen Promotor im lac-Locus. Er kann durch die Hitzeschockmethode mit Plasmiden transformiert werden. Die exprimierte Flp-Rekombinase vermittelt in transformierten Plasmiden die Rekombination zwischen frt0 und frt3-Stellen. Die exprimierte Cre-Rekombinase katalysiert die Rekombination zwischen loxP-Stellen.

1.1.3 Phagenstämme und Genbibliotheken

genomische Bibliothek

PS02 (MoBiTec) stammt aus männlichen ES-Zellen des Mausstammes 129/Sv. Die Bibliothek liegt im λPS-Vektor-System vor. Der Vektor kann DNA von bis zu 20 kB beinhalten, er besitzt in linearer Form zwei loxP-Stellen in gleicher Orientierung, die ein Multi-Copy-Plasmid-Rückgrat und das Insert flankieren. Rekombination der loxP-Stellen wird durch die Cre-Rekombinase vermittelt, welche zur Exzision des Multi-Copy-Plasmids (inklusive des Inserts) aus dem Phagengenom führt. Dies kann durch Infektion des Phagen in den Cre-exprimierenden E.coli-Stamm BNN132 erreicht werden.

cDNA-Bibliothek

MEM15 in Phagenstamm λGT10 von embryonaler Maus, Tag 15 (Clontech)

1.1.4 verwendete Mausstämme

C57BL/6

Dieser Stamm kommt aus dem Jackson-Laboratorium und wird für die Blastozystengewinnung verwendet. Hierzu wurden Männchen und Weibchen miteinander verpaart und am nächsten Morgen auf die Anwesenheit eines vaginalen Pfropfes überprüft. Weibchen, die diesen Pfropf aufwiesen, wurden von den Männchen separiert und befanden sich definitionsgemäß am Tag 0,5 nach der Empfängnis (Tag 0,5 p.c.). Am Tag 3,5 p.c. wurden diese Weibchen für die Blastozystengewinnung getötet. Außerdem wurden Tiere dieses Stammes zum Rückkreuzen der erhaltenen Chimären, sowie ihrer Nachkommen verwendet (Fellfarbe schwarz). Auf diese Weise gelingt es, die Mausmutanten auf nahezu reinem C57BL/6 Hintergrund zu halten. Nach etwa vier Rückkreuzungen kann bereits von weitgehend isogenen Verhältnissen ausgegangen werden, nach 20 Generationen sind die Tiere per definitionem vollständig isogen.

129/Sv, 129/Ola und 129/SvEv

129/Ola ist ein Substamm von 129/Sv. Die verwendeten ES-Zellen stammten aus 129/Ola-Mäusen (Fellfarbe agouti).


B6D2F1

Hierbei handelt es sich um einen Hybridstamm aus C57BL/6 und D3H. Die Weibchen wurden in den pseudoschwangeren Zustand gebracht (durch Verpaarung mit vasektomierten Männchen) und als Leihmütter für die injizierten Blastozysten verwendet.

NMRI

Männchen dieses Stammes wurden vasektomiert und für die Verpaarung mit B6D2F1 Weibchen eingesetzt.

1.2 Chemikalien

Die verwendeten Chemikalien wurden von folgenden Herstellern bezogen: Fluka Roth Sigma Pierce AP-Biotech Zur radioaktiven Markierung von DNA-Sonden wurde verwendet: [α-32P]dCTP (3000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) (AP-Biotech)

1.3 Molekularbiologische und proteinbiochemische Materialien

1.3.1 Enzyme

Restriktionsendonucleasen wurden von den folgenden Herstellern bezogen: New England Biolabs Roche Molecular Biochemicals MBI Fermentas

Weitere Enzyme für die Molekularbiologie Advantage 2 PCR-Enzyme System Clontech Alkalische Phosphatase (SAP) Roche Diagnostics Expand-HighFidelity Roche Diagnostics Klenow- Fragment Roche Diagnostics MuLV Reverse Transcriptase PE-LifeScience Pfu-DNA-Polymerase Promega Pwo-DNA-Polymerase Roche Diagnostics PowerScript Reverse-Transcriptase Clontech Proteinase K Roth RNAse A Qiagen T4-DNA-Ligase Roche Diagnostics Taq-DNA-Polymerasen Roche Diagnostics AP-Biotech

Enzyme für die Proteinbiochemie N-Glykosidase F, rekombinant Roche Diagnostics


1.3.2 Reagenziensätze

BCA-Proteinbestimmungs-Kit Pierce Blue Stain Kit NOVEX/ Invitrogen Canine Pancreatic Microsomal Membranes Promega Chemolumineszenz-Kit SuperSignal West Dura Pierce Hybond –N+ AP-Biotech In vitro Translation TNT T7Kit Promega Microspin G50 Columns AP-Biotech QIAgen Maxiprep Kit Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen QIAquick PCR Purification Kit Qiagen QIAshredder Qiagen Redi Prime II-Kit AP-Biotech RNeasy Mini Kit Qiagen SMARTRACE cDNA Amplification Kit Clontech TA Cloning® Kit Invitrogen

1.3.3 Molekulargewichtsmarker

Proteinmarker SeeBlueTM Plus2 Pre-Stained Standards Invitrogen Mark 12 Invitrogen Rainbow Marker AP-Biotech

DNAmarker Smart Ladder von 200 Bp bis 10 kB Eurogentec Smart Ladder SF von 50 Bp bis 3 kB Eurogentec

1.3.4 Vektoren

pBluescript II SK+ Stratagene für Klonierungen genomischer Fragmente und Subklonieren von PCR-Fragmenten pCR 2.1 für TA cloning Invitrogen für „Hotshot-klonierungen“ genomischer Fragmente pcDNA3.1 Invitrogen

1.3.5 Plasmide

pfrt-PGKtkneo-frt (Quelle: Erich Greiner/ Francis Stewart) für Klonierung der 5‘-flankierenden loxP-Stelle im Targeting-Konstrukt, mit einer Ampicillinresistenz und einer Kanamycin-(bzw. Neomycin-)Resistenz. Letztere besitzt zwei Promotoren, den eukaryotischen PGK (Phosphoglyceratkinase)-Promotor und den prokaryontischen Tn5-Promotor.

pKaX (Quelle: Erich Greiner/ Francis Stewart) für Insertion der 3’-flankierenden loxP-Stelle im Targeting-Vektor, mit Ampicillin- und loxP-flankierter Kanamycinresistenz unter Kontrolle des Tn5-Promotors (tn5neo)

pSL301-DTA (Quelle: F. Hilberg/E. Wagner/Erich Greiner) zur Selektion auf homologe Rekombination des Targeting.Konstrukts. Das Genprodukt Diphterie-Toxin-alpha ist toxisch für ES-Zellen.


pBS-mTR_DD (diese Arbeit) Mit den Oligonukleotiden 5’mTR_DD-Hind3.for und 3’mTR_DD-EcoR1.rev wurde in einer RT-PCR von RNA von EL-4-Zellen und Esb-Zellen ein PCR Fragment hergestellt, welches mit den indizierten Restriktionsenzymen gespalten wurde und in den Vektor pBluescript II KS(-) ligiert wurde.

pcDNA3.1-mTRAIL-R (diese Arbeit) Mittels der Oligonukleotide 5‘mTR-Hind3.for und 3‘mTR-Not1.rev wurde in einer RT-PCR von RNA von EL-4-Zellen ein PCR-Fragment hergestellt, welches mit den indizierten Restriktionsenzymen gespalten wurde und in den Expressionsvektor pcDNA3.1 ligiert werden konnte.

pcDNA3.1-mTRAIL-R:Fc (diese Arbeit) Mit den Oligonukleotiden 5‘mTR-Sal1.for und 3‘mTR-BamH1.rev wurde ein PCR-Fragment hergestellt, das die extrazelluläre Domäne von mTRAIL enthielt. Dies wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI gespalten. Das Plasmid pcDNA3.1-TRAIL-R2:Fc wurde mit SalI und BglII aufgeschnitten, wobei das TRAIL-R2-spezifische Fragment herausfiel. Schließlich wurde das PCR-Fragment in den linearisierten Vektor eingesetzt.

pBS-mTR5‘-probe (diese Arbeit) Mit den Oligonukleotiden mTR5'-probe.for und mTR5'-probe.rev wurde mit GTR1 als Template ein PCR-Fragment generiert, welches direkt mit dem TA-cloning Kit in den Vektor pCR2.1 ligiert wurde.

pBS-mTR3‘-probe3 (diese Arbeit) Klonierung wie pBS-mTR5‘-probe, verwendete Oligonukleotide mTR3'-probe3.for und mTR3'-probe3.rev.

pBS-mTRint-Exon 2 (diese Arbeit) Klonierung wie pBS-mTR5‘-probe, verwendete Oligonukleotide mTRint-probe_ex2.for und mTRint-probe_ex2.rev.

1.3.6 Oligonukleotide

Oligonukleotide für die ET-Klonierungen (Fa. Interactiva) Name Sequenz KOa01

CTGGATCCAAGCTAGGGCCTCACTCATGGTAGACACGCACATTACCACTGAGCTATAGGCtgccaagctactcgcgaccatggt

KOb02(HindIII)

CGTAGGGCACCCAGAATTCACATAGTGAACAGTATCTGTAGCTGGGCTAGCAGAGCTGG gaagctt cactaacaaccggtacagttcgaa

KOc03(EcoRV)

GCAAGTGTATTTATCCACAGAGCCATCTTTTTAAGTCTTGACTGCATTTTTACAAACTGG gatatc aataggcgtatcacgaggccctgc

KOd04 CTGTCTTGTTTCCTGTGTGACCAATTAATCATGTGGGTGACTATTTCTGCCCCTTACCCaggaaacagctatgaccatgattac

Andere Oligonukleotide (Fa. ARK) Name Sequenz Zweck 5’mTR_DD-Hind3.for aaa gaa gct tgc tgg ttc cgg taa acg ga EST-Klonierung 3’mTR_DD-EcoR1.rev cat cga att cgg cgc cac ttg agc agc at EST-Klonierung mTR_85.for agc gca gac ttc tat ata gc Intronklonierung mTR_164.rev gct ggg tta gct gtt act g Intronklonierung mTR_184.for cta cag cgg ccg gag gag Intronklonierung mTR_271.rev ctc tct gca agg ctt gca gt Intronklonierung


mTR_288.for cca ttc caa cca ttc tct gg Intronklonierung mTR_389.rev cga cac acc gta ttt gtg gt Intronklonierung mTR_410.rev tca aag gtg cct ggt ttg ca Intronklonierung mTR_462.for gga aga gga act gac ttc ct Intronklonierung mTR_462.for gga aga gga act gac ttc ct Intronklonierung mTR_557.rev cct atc cag agg cct agc t Intronklonierung mTR_580.for ctg att gga gct ctg ctt gt Intronklonierung mTR_681.rev cac aga gtt cgc act ttc gg Intronklonierung mTR_689.for ctc tct tgg acc gac aga ca Intronklonierung mTR_766.for gga aag aag ttg ctg gtt cc Intronklonierung mTR_785.rev gg aac cag caa ctt ctt tcc Intronklonierung mTR_786.rev gg aac cag caa ctt ctt tcc Intronklonierung mTR_860.rev gag tca aag ggc act atg tc Intronklonierung β-Actin.for gcg acg agg ccc aga gca RT-PCR β-Actin.rev ccc ggc cag cca ggt cca g RT-PCR mTR-a.for gag cca tct ttt taa gtc ttg act g PCR-Knockout mTR-b.rev ga cga tta tgg gct ggg tta gct g PCR-Knockout mTR-c.rev gga act tcc tga cta ggg gag g PCR-Knockout mTR-d.rev cg aac aca gct ggt ttc cat gg PCR-Knockout 5‘mTR-Sal1.for catc gtcgac gcc acc atg gag cct cca gga RT-PCR 3‘mTR-BamH1.rev catc ggatcc ctt atg cca aga tgc cca ag RT-PCR 5‘mTR-Hind3.for cat caa gct tgc cac cat gga gcc tcc agg a RT-PCR 3‘mTR-Not1.rev catc gcggccgc tca aac gca ctg aga tcc tc RT-PCR mTR5'-probe.for cat aca cga tcg acc agt gtg Southern-Blot-Sonde mTR5'-probe.rev caa ggc cat aga cca tgc tg Southern-Blot-Sonde mTR3'-probe3.for ctg cac tga cgg gga aga Southern-Blot-Sonde mTR3'-probe3.rev gag gct aga ggc ttc cag Southern-Blot-Sonde mTRint-probe.ex2.for ggt aag ggg cag aaa tag tc Southern-Blot-Sonde mTRint-probe.ex2.rev tca gca aag aaa tgg gaa ctg Southern-Blot-Sonde GSP1b t gtg acc agt gtt tcg gct ttg acc at RACE GSP1c cga aga taa act tca ggt cgt cag ctg RACE GSP2b cag ctg acg acc tga agt tta tct tcg RACE NGSP1b acc agt gtt tcg gct ttg acc att tgg RACE NGSP1c gt cag ctg agt cgt ttc cgt tta ccg g RACE NGSP2b tcg agt att gtt cgg aca tag tgc cct RACE

1.3.7 Moleküle zur Proteindetektion

Primärantikörper Name Serum/Isotyp Zielstruktur Quelle/Referenz α mClusterin M-18 Ziege C-Terminus von

mClusterin Santa Cruz

αLZ-M15 IgG1 LeucinZipper Immunex αLZ-HS601 IgG1 LeucinZipper eigene Herstellung αFLAG-M2 IgG1 FLAG Sigma


Sekundärantikörper Name Serum Zielstruktur Quelle/Referenz αmIgG1-HRP Ziege m-IgG1 Biozol αmIgG2a-HRP Ziege m-IgG2a Biozol αmIgG2b-HRP Ziege m-IgG2b Biozol αZiegeIgG-HRP Kaninchen Ziege IgG Santa Cruz

gekoppelte Moleküle Basisprotein Farbstoff Zielstruktur Quelle/Referenz Streptavidin (SA) PE Biotin Pharmingen Streptavidin (SA) HRP Biotin Pharmingen

Beads Name Matrix Zielstruktur Quelle/Referenz C4-Agarose Agarose - Roche Diagnostics Protein-G-Agarose Agarose IgG Roche Diagnostics

1.4 Puffer, Lösungen und Medien

Im Folgenden sind nur die häufig benutzen Puffer und Medien der Standardtechniken aufgeführt, die spezielleren Puffer sind im jeweiligen Methodenabschnitt aufzufinden.

1.4.1 Puffer für die Molekularbiologie

1.4.1.1 Puffer und Medien für Bakterien

LB-Medium (Luria/Bertani) 10 g/L Trypton 5 g/L Hefeextrakt 5 g/L NaCl

mit NaOH auf pH = 7,0 einstellen und autoklavieren, Lagerung bei RT LB-Agar Platten und LB/Agar-Platten mit Antibiotika wurden nach einem Protokoll in

Sambrook et al. (1989) hergestellt. Antibiotika Kanamycin Stocklösung 25 mg/mL, Gebrauchskonzentration 25 µg/mL Ampicillin Stocklösung 100 mg/mL, Gebrauchskonzentration 50-100 µg/mL Tetracyclin Stocklösung 5 mg/mL, Gebrauchskonzentration 10 µg/mL

1.4.1.2 Puffer zur Isolierung und Aufbewahrung von DNA und RNA

TE-Puffer TE-Puffer pH 8 (für Plasmid-DNA) 10 mM Tris/HCl pH 8,0 1 mM EDTA, pH 8,0 TE-Puffer pH 7,4 (für genomische DNA) 10 mM Tris/HCl pH 7,4 1 mM EDTA, pH 8,0


Tail-Puffer: Lysepuffer zur Isolation genomischer DNA aus embryonalen Stammzellen 50 mM Tris/ HCl pH 8,0 100 mM EDTA 100 mM NaCl 1 % SDS 1 mg/mL Proteinase K

NID-Puffer: Lysepuffer zur Isolation genomischer DNA aus Schwanzspitzen und Zehen 50 mM KCl 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 2 mM MgCl2 0,1 mg/mL Gelatine 0,45 % NP-40 0,45 % Tween 0,2 mg/mL Proteinase K

Puffer für Miniprep zur Isolation von Plasmid-DNA im analytischen Maßstab Puffer P1/P2/P3 nach Anleitung aus Qiagen Maxiprep-Kit (s.u.) und nach dem

von Nelson und Krawetz (1992) beschr

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