เอกสารวชาการฉบบท ๖/๒๕๕๘ Technical Paper No. 6/2015

การสกดคอลลาเจนทละลายในกรดจากหนงปลานล Extraction of Acid-Soluble Collagen from Nile Tilapia

(Oreochromis niloticus) Skins

ปวเรศวร อนทเศรษฐ Pawared Inthuserdha นลนรตน จระเดชประไพ Nalinrat Chiradetprapai

กองวจยและพฒนาอตสาหกรรมสตวน า Fishery Technological Development Division กรมประมง Department of Fisheries กระทรวงเกษตรและสหกรณ Ministry of Agriculture and Cooperatives

เอกสารวชาการฉบบท ๖/๒๕๕๘ Technical Paper No. 6/2015

การสกดคอลลาเจนทละลายในกรดจากหนงปลานล Extraction of Acid-Soluble Collagen from Nile Tilapia

(Oreochromis niloticus) Skins

ปวเรศวร อนทเศรษฐ Pawared Inthuserdha นลนรตน จระเดชประไพ Nalinrat Chiradetprapai

กองวจยและพฒนาอตสาหกรรมสตวน า Fishery Technological Development Division กรมประมง Department of Fisheries กระทรวงเกษตรและสหกรณ Ministry of Agriculture and Cooperatives ๒๕๕๘ 2015

รหสทะเบยนวจย 54-0805-54058

สารบาญ

หนา บทคดยอ 1 Abstract 2 ค าน า 3 วตถประสงค 5 วธด าเนนการ 5 ผลการทดลองและวจารณผล 9 สรปผลการทดลอง 19 ขอเสนอแนะ 19 เอกสารอางอง 20 ภาคผนวก 23

สารบาญตาราง ตารางท หนา 1 องคประกอบทางเคมของหนงปลานล 9 2 ปรมาณรอยละของผลผลตคอลลาเจนทไดจากการสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ 10 3 ปรมาณกรดอะมโนของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ 12 4 คณสมบตของคอลลาเจนจากหนงปลาชนดตางๆ 18

สารบาญภาพ ภาพท หนา 1 ขนตอนการสกดคอลลาเจนจากหนงปลา 6 2 คอลลาเจนทสกดไดจากหนงปลานลหลงจากการท าแหงดวยเครอง freeze dryer 10 3 การดดกลนแสงยวของคอลลาเจนทสกดไดจากหนงปลานล 11 4 การละลายสมพทธของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 13 3 ระดบ ทความเขมขนของเกลอตางๆ 5 การละลายสมพทธของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 14 3 ระดบ ท pH ตางๆ 6 ความหนดสมพทธของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 15 3 ระดบ ทอณหภมตางๆ 7 รปแบบโปรตนของคอลลาเจนหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตก 3 ระดบความเขมขน 16 8 FTIR spectrum ของคอลลาเจนทสกดไดจากหนงปลานล 17 ภาพผนวกท

1 ขนตอนในการสกดคอลลาเจนจากหนงปลานล 23

การสกดคอลลาเจนทละลายในกรดจากหนงปลานล

ปวเรศวร อนทเศรษฐ* และ นลนรตน จระเดชประไพ

กองวจยและพฒนาอตสาหกรรมสตวน า กรมประมง

บทคดยอ

งานวจยน มวตถประสงคเพอสกดคอลลาเจนจากหนงปลานลโดยใชกรดอะซตกและแปรความเขมขน 3 ระดบ คอ 0.25, 0.5 และ 0.75 โมลาร พบวาการใชกรดอะซตกเขมขน 0.5 โมลาร ใหปรมาณผลผลตคอลลาเจนสงทสดคอ รอยละ 39.23 และผลการวเคราะหคณสมบตของคอลลาเจนทสกดไดจากการทดลอง พบวาคอลลาเจนจากหนงปลานลทกชดการทดลองมการดดกลนแสงยวสงสดทความยาวคลน 232 นาโนเมตร มปรมาณกรดอะมโน ไดแก ไกลซนสงทสด รองลงมาเปนโพรลน อะลานน และกรดกลตามก ตามลาดบ สามารถละลายไดดทความเขมขนของเกลอตากวารอยละ 2 และการละลายจะลดลงเมอความเขมขนของเกลอเพมข นถงรอยละ 4 และละลายไดดในสารละลายทมสภาวะเปนกรด (pH 1 - 4) โดยการละลายจะลดลงเมอ pH เพมข นจนไมละลายทสภาวะเปนกลาง (pH 7) ความหนดของสารละลายคอลลาเจนลดลงอยางตอเนองเมออณหภมเพมข นจาก 4 องศาเซลเซยส และคงทเมออณหภมสงกวา 40 องศาเซลเซยส ผลการศกษารปแบบและโครงสรางของโปรตนโดยการวเคราะห SDS-PAGE และ FTIR พบวาคอลลาเจนจากหนงปลานลเปนชนด Type I และมโครงสรางเปนแบบเกลยวสามสาย ค าส าคญ : คอลลาเจน ปลานล หนงปลา

* ผรบผดชอบ : เกษตรกลาง จตจกร กรงเทพฯ ๑๐๙๐๐ โทร. ๐-๒๙๔๐-๖๑๓๐-๔๕

e-mail: pawaredi@fisheries.go.th

2

Extraction of Acid-Soluble Collagen from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Skins

Pawared Inthuserdha* and Nalinrat Chiradetprapai

Fishery Technological Development Division, Department of Fisheries.

Abstract

This research was aim at collagen extraction from Nile tilapia skins by using 3 levels of acetic acid concentration as 0.25, 0.5 and 0.75 M. Collagen extraction by using 0.5 M acetic acid showed the highest yield of 39.23%. The properties of all obtained collagen were characterized. All samples exhibited a maximum UV absorbance at 232 nm. It was found that glycine was the major amino acid while proline, alanine and glutamic acid were observed in descending order. These collagens had good solubility at below 2% NaCl concentration. However, the solubility decreased with an increasing NaCl concentration up to 4%. These collagens also showed good solubility in acidic condition solution (pH 1 - 4) but this property decreased with an increasing of pH until neutral condition (pH 7). Moreover, the viscosity of

all samples decreased gradually with increasing temperature from 4C and became steady at

above 40C. The SDS-PAGE analysis can classified these collagen as Type I collagen and Fourier Transform Infrared spectra (FTIR) investigations revealed the existence of helical arrangements of collagen. Key words: Collagen, Nile tilapia, fish skins

* Corresponding author : Kaset-Klang, Chatuchak, Bangkok 10900, Tel. 0-2940-6130-45

e-mail: pawaredi@fisheries.go.th

3

ค าน า

คอลลาเจนเปนโปรตนทพบมากทสดในสตวโดยมประมาณรอยละ 30 ของโปรตนท งหมด (Bailey and Light, 1989) โดยคอลลาเจนพบไดในสวนตาง ๆ ของรางกาย ไดแก เอน ผวหนง กระดก เสนเลอด และเน อเยอเกยวพน (Foegeding et al., 1996) มการใชคอลลาเจนกนอยางกวางขวางในอตสาหกรรมเครองหนง ฟลมถายภาพ ยารกษาโรค เครองสาอาง และอาหาร ปกตแหลงของคอลลาเจนและเจลาตนทสาคมมาจากหนงและกระดกของววและหม อยางไรกตาม การระบาดของโรคววบา (Bovine Spongiform Encephalopathy: BSE) ทาใหเกดความกงวลใจสาหรบผใชคอลลาเจนและผลตภณฑจากคอลลาเจนทไดจากสตวบก เนองจากมความเสยงทจะไดรบสารดงกลาว นอกจากน คอลลาเจนจากหม ไมสามารถใชเปนสวนประกอบของอาหารสาหรบคนบางศาสนาได (Sadowska et al., 2003) ดงน นจงมความจาเปนทจะตองหาคอลลาเจนจากแหลงใหม เชน หนง และ กางปลา ซงเปนเศษเหลอจากอตสาหกรรมการแปรรปสตวน า

การแปรรปสตวน าทาใหมเศษเหลอประมาณรอยละ 50-70 ของวตถดบเรมตน ซงข นกบกระบวนการผลตทใชและชนดของผลตภณฑ โดยเศษเหลอเหลาน ประกอบไปดวยสวนหว ไสพง หนง และ กางปลา (Morrissey et al., 2000) ปกตเศษเหลอดงกลาวมกใชเปนอาหารสตวหรอปย ซงมมลคาตา (Nagai and Suzuki, 2000) ประมาณรอยละ 30 ของเศษเหลอเหลาน คอ หนง และ กางปลา ซงมปรมาณคอลลาเจนอยสง (Shahidi, 1994) ดงน นเศษเหลอจากการแปรรปสตวน า เชน หนง กาง เกลด และ ครบปลา จงสามารถใชเปนทางเลอกใหมสาหรบการสกดคอลลาเจนได

ทผานมามการศกษาการสกดคอลลาเจนจากหนงและกางปลา ซงสวนใหมเปนปลาทะเล เชน Skipjack tuna, Japanese sea-bass, Yellow sea bream, Bullhead shark และ Horse mackerel (Nagai and Suzuki, 2000) Baltic cod (Sadowska et al., 2003) Bigeye snapper (Kittiphattanabawon et al., 2005; Nalinanon et al., 2007) Brownstripe red snapper (Jongjareonrak et al., 2005) Walleye pollock (Yan et al., 2008) และ Yellowfin tuna (Woo et al., 2008) โดยมการศกษาการสกดคอลลาเจนจากหนงปลาน าจดนอยมาก เชน Nile perch (Muyonga et al., 2004) และ Grass carp (Zhang et al., 2007)

ปลานลเปนปลาน าจดทมความสาคมทางเศรษฐกจชนดหนงของประเทศไทย ในป 2548 มผลผลตจากปลานลถง 203,737 ตน คดเปนมลคา 5,883 ลานบาท หรอรอยละ 30 ของมลคาสตวน าจดท งหมดของไทย โดยมการสงออกปลานลประมาณรอยละ 30 ของผลผลตท งหมด ซงในป 2550 ประเทศไทยไดสงออกปลานลและผลตภณฑจากปลานลรวมท งส น 12,764 ตน คดเปนมลคา 670 ลานบาท โดยสงออกในรปของเน อปลาแลและเน อปลาบดประมาณรอยละ 13 ของปลานลและผลตภณฑทสงออกท งหมด คดเปน 1,659 ตน (กรมประมง, 2551) ดงน นจงเกดเศษเหลอจากการแปรรปปรมาณมาก ถาสามารถนาเศษเหลอดงกลาวมาใชประโยชน เชน ใชเปนวตถดบในการสกดคอลลาเจน จะเปนการเพมมลคาใหแกเศษเหลอเหลาน น และเปนทางเลอกใหมของแหลงวตถดบทใชในการสกดคอลลาเจนอกดวย

4

โครงสรางของคอลลาเจนมลกษณะเฉพาะคอ มโครงสรางเปนเกลยวสามสาย (triple-helix) ของโพลเปปไทด ซงแตละสายเรยกวา สายแอลฟา (α-chain) แตละสายจะมกรดอะมโนมากกวา 1000 ตวตอกน ลกษณะการเรยงตวของกรดอะมโนจะมลกษณะซ าๆ กนของ -Gly-X-Y- โดย X และ Y มกเปนโพรลนและ ไฮดรอกซโพรลนตามลาดบ

คอลลาเจนแบงออกเปน 13 ชนด โดยแบงตามลาดบของกรดอะมโน มวลโมเลกล สวนประกอบของหนวยยอย (subunit) ความยาวของสายฮลกซ คณสมบตและขนาดของสวนทไมเปนฮลกซ (non-helix portion) (Kucharz, 1992)

คอลลาเจน type I พบไดเปนสวนใหมในสตวช นสง ในสวนของหนง เอน และกระดก ซงประกอบดวย 3 สาย ไดแก สาย α 1 (I) จานวน 2 สาย และ α 2 (I) จานวน 1 สาย ซงสาย α 1 และ α 2 จะมสวนประกอบของกรดอะมโนทแตกตางกน นอกจากน ยงพบสาย α 1 (I) จานวน 3 สายซงพบไดนอยมาก คอลลาเจนชนดน จะพบกรดอะมโนชนดไกลซนประมาณ 1 ใน 3 ของกรดอะมโนท งหมด มจานวนกรดอะมโนประมาณ 1,050 ตว มสวนทไมบดเปนเกลยวส นประกอบดวยไทโรซนและฮสตดน โดยไมพบกรดอะมโนชนด ทรปโตเฟนและซสเตอนเลย

คอลลาเจน type II พบไดสวนใหมในกระดกออน ประกอบดวยสาย α 1 (II) จานวน 3 สาย ซงเชอกนวามลกษณะคลายสาย α 1 (I) มปรมาณของไฮดรอกซไลซนสงกวา type I ถง 3 เทา

คอลลาเจน type III พบไดปรมาณนอย (ประมาณรอยละ 10) สวนใหมพบในเสนเลอดซงพบวาคอลลาเจน type III จะจบกบคอลลาเจน type I ดงน น ในการสกดคอลลาเจนสวนใหมจะพบ type III ปนรวมกบคอลลาเจน type I เลกนอย (Piez, 1985)

คอลลาเจน type IV มความจาเพาะเจาะจงมาก ซงพบไดเฉพาะในรางแหของเสนใยฝอยทเกาะกนหลวมๆ ในเยอแผนบางๆ ทอยนอกเซลล

สาหรบคอลลาเจนชนดอนๆ จะพบในปรมาณทนอยมากและมการเชอมโยงกบโครงสรางทางชววทยาทจาเพาะ ในการศกษาสวนใหมนยมศกษาคอลลาเจน type I เนองจากมปรมาณมาก และมการนาไปใชประโยชนไดอยางกวางขวาง โดยเฉพาะทางการแพทย

การสกดคอลลาเจนมหลายวธ เชน การสกดดวยสารละลายกรด การสกดดวยสารละลายเกลอ หรอ การสกดดวยเอนไซมเปปซน เปนตน การสกดดวยสารละลายกรดเปนวธทนยมใชเนองจากมราคาไมแพงและมประสทธภาพในการสกดดกวาการใชสารละลายเกลอ สาหรบการสกดคอลลาเจนโดยใชเอนไซมเปปซนน น จะไดคอลลาเจนทมคณภาพดทสด มกนาไปใชประโยชนทางการแพทย อยางไรกตาม การใชเอนไซมกมราคาสงเชนกน (นนทพร, 2550)

คอลลาเจนถกใชประโยชนอยางกวางขวางในอตสาหกรรมอาหาร อตสาหกรรมยา เครองสาอางการถายภาพ ผลตภณฑอาหารเสรมเพอสขภาพ บารงผวพรรณและเลบใหแขงแรงและมสขภาพทดและลดรอยเหยวยน นอกจากน คอลลาเจนจากหนงสตวและเอนใชสาหรบทากาว สาหรบทางการแพทยคอลลาเจนถกใชในศลยกรรมเสรมความงาม โดยใชเปนผวหนงเทยม สาหรบแผลไฟไหมรนแรง ใชฉดเพอลดรอยตนกา ผวยนจากอายทมากข น

5

วตถประสงค

เพอศกษาความเขมขนของกรดทเหมาะสมทใชในการสกดคอลลาเจนจากหนงปลานล และศกษาคณสมบตของคอลลาเจนทสกดได

วธด าเนนการ

1. การเตรยมหนงปลานล

นาปลานลสดขนาด 2-3 ตวตอกโลกรม มาลาง ขอดเกลด แลเน อ และแลหนง จากน นนาหนงมาลางน า และตดเปนช นเลกๆ ขนาด 0.5 x 0.5 เซนตเมตร บรรจใสถงพลาสตก เกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยส เพอรอการสกดคอลลาเจนตอไป 2. การสกดคอลลาเจนจากหนงปลานล

ทาตามวธของ Jongjareonrak et al. (2005) ดงน ชงหนงปลาทเตรยมไว 10 กรม (ตอ 1 ชดการทดลอง) เตมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดเขมขน 0.1 นอรมอล โดยใชอตราสวนหนงปลาตอสารละลายดางเปน 1:30 (w/v) กวนเปนเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส จากน นลางดวยน าเยนจนกระทงคา pH ของน าลางเปนกลาง แลวแชในสารละลาย butyl alcohol เขมขน 10 เปอรเซนต โดยใชอตราสวนหนงปลาตอสารละลายเปน 1:30 (w/v) กวนเปนเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส จากน นลางดวยน าเยน แลวแชในสารละลายกรดอะซตกโดยแปรความเขมขนของสารละลายกรดอะซตกทใช 3 ระดบ คอ 0.25, 0.5 และ 0.75 โมลาร ใชอตราสวนหนงปลาตอกรดเปน 1:30 (w/v) กวนเปนเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส จากน นกรองดวยผาขาวบาง 2 ช น แลวเกบสวนของเหลวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส สวนกากทเหลอนามาสกดซ าดวยสารละลายกรดอะซตกทความเขมขนเดยวกบทสกดคร งแรกอกคร ง จากน นกรองดวยผาขาวบาง 2 ช น และรวมสวนของเหลวเขาดวยกน แลวทาการตกตะกอนโดยการเตม โซเดยมคลอไรดใหไดความเขมขนสดทายเปน 0.9 โมลาร จากน นเตมโซเดยมคลอไรดอกคร งใหไดความเขมขนสดทายเปน 2.6 โมลาร ในสารละลาย tris-HCl ความเขมขน 0.05 โมลาร ท pH 7.5 แลวปนเหวยงท 20,000 g เปนเวลา 1 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส จากน นละลายตะกอนดวยสารละลายกรดอะซตกเขมขน 0.5 โมลาร ปรมาตร 10 เทาของปรมาณตะกอน จากน นทาการ dialysis ในสารละลายกรดอะซตกเขมขน 0.1 โมลาร ปรมาตร 40 เทาของสารละลายตะกอน เปนเวลา 16 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส แลวทาการ dialysis ในน ากลน ปรมาตร 40 เทาของสารละลายตะกอน ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส พรอมกบเปลยนน ากลนจนกระทงคา pH ของน ากลนเปนกลาง จากน นทาการ freeze drying แลวเกบคอลลาเจนจากหนงปลานลทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เพอรอการทดสอบตอไป

6

ชงหนงปลา 10 กรม และเตมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด 0.1 นอรมอล อตราสวน 1:30 (w/v) กวนเปนเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

ลางดวยน าเยนจนกระทงคา pH ของน าลางเปนกลาง

แชในสารละลาย butyl alcohol เขมขนรอยละ 10 อตราสวน 1:30 (w/v)

กวนเปนเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

ลางดวยน าเยน

แชในสารละลายกรดอะซตก 0.25, 0.5 และ 0.75 โมลาร อตราสวน 1:30 (w/v) กวนเปนเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

กรองดวยผาขาวบาง แลวเกบสวนของเหลวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

สวนกากนามาสกดซ าดวยสารละลายกรดอะซตกทความเขมขนเดมอกคร ง

กรองดวยผาขาวบาง และนาสวนของเหลวรวมเขาดวยกน

เตมโซเดยมคลอไรดใหไดความเขมขนสดทายเปน 2.6 โมลาร

เหวยงท 20,000 g เปนเวลา 1 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

ละลายตะกอนดวยกรดอะซตก 0.5 โมลาร ปรมาตร 10 เทาของปรมาณตะกอน และทาการ dialysis

ในกรดอะซตก 0.1 โมลาร ปรมาตร 40 เทาของสารละลายตะกอน เปนเวลา 16 ชวโมง ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

ทาการ dialysis ในน ากลน ปรมาตร 40 เทาของสารละลายตะกอน ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปลยนน ากลนจนกระทงคา pH ของน ากลนเปนกลาง

ทาการ freeze drying และเกบคอลลาเจนจากหนงปลานลไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

เพอรอการทดสอบตอไป ภาพท 1 ข นตอนการสกดคอลลาเจนจากหนงปลา

7

3. ปรมาณรอยละของผลผลต (% yield)

คานวณจากสมการดงน ปรมาณรอยละของผลผลต (dry basis) = น าหนกคอลลาเจนหลงการทาแหง (กรม) × 100

น าหนกหนงปลาสดเรมตนทหกลบความช น (กรม) 4. การทดสอบคณสมบตของคอลลาเจนจากหนงปลานล

4.1 การดดกลนแสงยว (Ahmad and Benjakul, 2010) ชงตวอยางคอลลาเจน 0.01 กรม เตมกรดอะซตกเขมขน 0.5 โมลาร ปรมาตร 10 มลลลตร กวน

ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง หรอจนกระทงละลายหมด นาสารละลายคอลลาเจนทไดไปวดคาการดดกลนแสงยวทความยาวคลน 190 - 400 นาโนเมตร ดวยเครองสเปกโทรโฟโตมเตอร

4.2 ปรมาณกรดอะมโน (Nagai and Suzuki, 2000) ยอยคอลลาเจน 0.02 กรม ดวยกรดไฮโดรคลอรกเขมขน 6 โมลาร ปรมาตร 5 มลลลตร ภายใต

สภาวะลดความดน ทอณหภม 110 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง จากน นกรองผาน membrane filter ขนาด 0.45 ไมครอน ฉดเขาเครอง HPLC ทม on-line precolumn derivatization ดวย OPA ใชคอลมนชนด reversed-phase C18s (4.6x150 มลลเมตร) ใช fluorescence detector ต งคา excitation = 345 นาโนเมตร และ emission = 455 นาโนเมตร คานวณหาปรมาณกรดอะมโนหนวยเปนกรมตอน าหนก คอลลาเจน 100 กรม

4.3 การละลาย (Jongjareonrak et al., 2005) 4.3.1 ศกษาผลกระทบของปรมาณเกลอตอการละลายของคอลลาเจน ชงตวอยางคอลลาเจน 0.21 กรม เตมกรดอะซตกเขมขน 0.5 โมลาร ปรมาตร 35 มลลลตร

กวนทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 12 ชวโมง หรอจนกระทงละลายหมด ดดสารละลายคอลลาเจนปรมาตร 5 มลลลตร ใสบกเกอรขนาด 50 มลลลตร จานวน 7 ใบ เตมสารละลายโซเดยมคลอไรดเยนปรมาตร 5 มลลลตร ความเขมขน 0, 2, 4, 6, 8, 10 และ 12 เปอรเซนต (w/v) ในสารละลายกรดอะซตก 0.5 โมลาร กวนทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท จากน นเหวยงท 10,000 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท นาสวนใสมาวเคราะหปรมาณโปรตนตามวธของ Lowry et al. (1951) และ คานวณคา relative solubility เปนรอยละของปรมาณโปรตนทวดไดเทยบกบปรมาณโปรตนทวดไดสงสดทละลายในสารละลายโซเดยมคลอไรดความเขมขน 0 - 12 เปอรเซนต ดงน

คานวณคา Relative Solubility = ปรมาณโปรตนทวดได x 100

ปรมาณโปรตนทวดไดสงสด

8

4.3.2 ศกษาผลกระทบของ pH ตอการละลายของคอลลาเจน ชงตวอยางคอลลาเจน 0.24 กรม เตมกรดอะซตกเขมขน 0.5 โมลาร ปรมาตร 80 มลลลตร

กวนทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 12 ชวโมง หรอจนกระทงละลายหมด จากน นดดสารละลาย คอลลาเจนปรมาตร 8 มลลลตร ใสหลอดเหวยงขนาด 50 มลลลตร จานวน 10 หลอด ปรบ pH ดวยสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดเขมขน 6 นอรมอล หรอกรดไฮโดรคลอรกเขมขน 6 นอรมอล ใหไดคา pH 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 และ 10 จากน นปรบปรมาตรเปน 10 มลลลตร ดวยน ากลนทมคา pH ตามทปรบไว แลวเหวยงท 10,000 g ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท นาสวนใสมาวเคราะหปรมาณโปรตนตามวธของ Lowry et al. (1951) และ คานวณคา relative solubility เปนรอยละของปรมาณโปรตนทวดไดเทยบกบปรมาณโปรตนทวดไดสงสดทละลายในชวง pH 1 – 10 ดงน

คานวณคา Relative Solubility = ปรมาณโปรตนทวดได x 100

ปรมาณโปรตนทวดไดสงสด

4.4 ความหนด (Kittiphattanabawon et al., 2005) ชงตวอยางคอลลาเจน 0.15 กรม เตมกรดอะซตกเขมขน 0.1 โมลาร ปรมาตร 500 มลลลตร

กวนทอณหภม 4 องศาเซลเซยส จนกระทงละลายหมด จากน นวดความหนดโดยใชเครอง Brookfield viscometer ใชหววดเบอร 1 ความเรวรอบ 100 รอบตอนาท วดความหนดทอณหภม 15-50 องศาเซลเซยส โดยเรมตนวดทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท ใชอตราการเพมความรอน 4 องศาเซลเซยสตอนาท และคงอณหภม ณ จดทตองการวดเปนเวลา 30 นาท บนทกคาความหนด และคานวณคาความหนดสมพทธ (relative viscosity) ดงน

คานวณคา Relative Viscosity = ความหนดทอณหภมทตองการวด

ความหนดท 4 องศาเซลเซยส

4.5 รปแบบของโปรตนโดยวธ SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) (Laemmli, 1970)

ละลายคอลลาเจน 80 มลลกรม ใน 10 มลลลตร ของสารละลายโซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร 0.02 โมลาร pH 7.2 ทม SDS 1 เปอรเซนต (w/v) และยเรย 3.5 โมลาร กวนเบาๆ ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 12 ชวโมง จากน นเหวยงท 3,000 g เปนเวลา 3 นาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส แลวนาสวนใสมาผสมกบสารละลาย sample buffer ซงประกอบไปดวย Tris–HCl 0.5 โมลาร (pH 6.8), SDS 4 เปอรเซนต (w/v), glycerol 20 เปอรเซนต (v/v) และ β-mercaptoethnol 10 เปอรเซนต (v/v) ในอตราสวน 1:1 โดยปรมาตร ใชเจลเขมขน 5 เปอรเซนต กระแสไฟฟาคงท 20 mA/gel ยอมเจลดวย Coomassie brilliant blue (R-250) 0.05 เปอรเซนต (w/v) ในเมทธานอล 15 เปอรเซนต (v/v) และกรดอะซตก 5 เปอรเซนต (v/v) ลางเจลดวยเมทธานอล 30 เปอรเซนต (v/v) และกรดอะซตก 10 เปอรเซนต (v/v)

9

4.6 การวเคราะห Fourier Transform Infrared spectra (Yan et al., 2008) ชงตวอยางคอลลาเจน 0.2 มลลกรม ผสมกบโปรแตสเซยมโบรไมด 10 มลลกรม บรรจในจาน

กลมภายใตสภาวะแหง วเคราะหโครงสรางเกลยวสามสายของคอลลาเจนดวยเครอง Fourier Transform Infrared spectrometer (FTIR) ท wave number 4000 – 500 cm-1 ใชอตราการบนทกขอมล 2 cm-1 ตอจด ซงในการทดลองน ไดสงตวอยางตรวจวเคราะหทศนยเครองมอวจย คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย 5. การวเคราะหทางสถต

วางแผนการทดลองแบบ CRD (Completely randomized design) วเคราะหความแปรปรวนโดยใช ANOVA และเปรยบเทยบความแตกตางของคาเฉลยโดย Duncan’s multiple range test (DMRT) ทระดบความเชอมน 95% โดยใชโปรแกรมสาเรจรปในการคานวณทางสถต

ผลการทดลองและวจารณผล

1. องคประกอบทางเคมของหนงปลานล

การวเคราะหองคประกอบทางเคมของหนงปลานลทใชเปนวตถดบในการสกดคอลลาเจน ซงผลแสดงดงตารางท 1 พบวาหนงปลานลมปรมาณความช นรอยละ 67.29 ปรมาณโปรตนรอยละ 30.75 ปรมาณไขมนรอยละ 1.64 และปรมาณเถารอยละ 0.25

ตารางท 1 องคประกอบทางเคมของหนงปลานล

องคประกอบทางเคม รอยละ (%) ความช น 67.29 ± 0.77 โปรตน 30.75 ± 0.02 ไขมน 1.64 ± 0.12 เถา 0.25 ± 0.03

2. ปรมาณรอยละของผลผลตคอลลาเจน (% yield)

จากการทดลอง เมอสกดคอลลาเจนจากหนงปลานลโดยการแปรคาความเขมขนของกรดอะซตก 3 ระดบ คอ 0.25, 0.5 และ 0.75 โมลาร พบวาไดปรมาณรอยละของผลผลตคอลลาเจนดงตารางท 2

10

ตารางท 2 ปรมาณรอยละของผลผลตคอลลาเจนทไดจากการสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ ความเขมขนของกรดอะซตก (โมลาร) ปรมาณคอลลาเจน (% dry weight)

0.25 33.95 ± 0.91 a 0.50 39.23 ± 1.60 b 0.75 35.97 ± 1.48 a

a, b อกษรทแตกตางกนตามแนวต งแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคม (P≤0.05)

ซงพบวาการใชกรดอะซตกความเขมขน 0.50 โมลาร ในการสกดคอลลาเจนจะไดปรมาณผลผลตคอลลาเจนสงทสดอยางมนยสาคม (P≤0.05) คอ รอยละ 39.23 ของหนงปลาเรมตน ซงสอดคลองกบงานวจยของ Wang et al. (2008) ทศกษาสภาวะทเหมาะสมในการสกดคอลลาเจนจากหนงปลา Grass carp โดยใชความเขมขนของกรดอะซตกในการสกดต งแต 0.20 - 0.80 โมลาร พบวาทความเขมขนของกรดอะซตก 0.54 โมลาร จะใหปรมาณคอลลาเจนสงทสด อยางไรกตาม ปรมาณคอลลาเจนทสกดไดจากหนงปลานลยงมปรมาณนอยกวาปรมาณคอลลาเจนจากหนงปลาทะเล 3 ชนด คอ Japanese sea-bass, Chub mackerel และ Bullhead shark ดงน รอยละ 51.4, 49.8 และ 50.1 (dry basis) ตามลาดบ (Nagai and Suzuki, 2000)

ภาพท 2 คอลลาเจนทสกดไดจากหนงปลานลหลงจากการทาแหงดวยเครอง freeze dryer 3. การดดกลนแสงยว

การดดกลนแสงยวของคอลลาเจนจากหนงปลานลแสดงดงภาพท 3 พบวาคอลลาเจนทสกดไดจากหนงปลานลสามารถดดกลนแสงยวสงสดทความยาวคลน 232 นาโนเมตร ซงใกลเคยงกบผลการทดลองของนรนทร และ วรางคณา (2558) ทสกดคอลลาเจนจากหนงปลาสลาดแลวพบวา คอลลาเจนจากหนงปลาสลาดสามารถดดกลนแสงยวสงสดทความยาวคลน 233 นาโนเมตร ซงโดยปกตแลวโปรตนสวนใหมจะดดกลนแสงยวสงสดทความยาวคลน 280 นาโนเมตร เนองจากมกรดอะมโนชนดไทโรซน และทรปโตเฟน (Yan et al.,

11

2008) แต UV spectrum ของคอลลาเจนจากหนงปลานลในการทดลองน (ภาพท 3) ไมพบการดดกลนแสงทความยาวคลน 280 นาโนเมตร ดงน นโปรตนทสกดไดคอโปรตนคอลลาเจน

ภาพท 3 การดดกลนแสงยวของคอลลาเจนทสกดไดจากหนงปลานล 4. ปรมาณกรดอะมโน (Amino acid composition)

ผลการวเคราะหกรดอะมโนของคอลลาเจนทสกดไดจากหนงปลานลโดยใชกรดอะซตก 3 ระดบความเขมขน แสดงดงตารางท 3 พบวาคอลลาเจนจากหนงปลานลมปรมาณไกลซนสงทสดคอ 25.60 - 25.91 กรมตอ 100 กรม รองลงมาเปนโพรลน 8.64 - 10.09 กรมตอ 100 กรม อะลานน 7.51 – 8.94 กรมตอ 100 กรม และกรดกลตามก 6.66 – 8.55 กรมตอ 100 กรม ตามลาดบ โดยไมพบไทโรซนเลย ซงสอดคลองกบงานวจยของ Woo et al. (2008) ทสกดคอลลาเจนจากหนงปลาทนาครบเหลองแลวพบวาปรมาณกรดอะมโนของคอลลาเจนทสกดไดมปรมาณไกลซนสงทสด รองลงมาเปนโพรลน และไมพบไทโรซน องคประกอบของกรดอะมโนในคอลลาเจนจะมผลตอสมบตทางเคมกายภาพของคอลลาเจน เชน สมบตการละลายในสารละลายเกลอ และความคงตวตอความรอน (Lin and Liu, 2006) สตวแตละชนดจะมองคประกอบของกรดอะมโนทแตกตางกน คอลลาเจนจากหนงสตวน ามปรมาณของไฮดรอกซโพรลนตากวาคอลลาเจนจากหนงสตวบก เชน วว และสกร ซงปรมาณของไฮดรอกซโพรลนจะมความสมพนธกบความคงตวตอความรอนของคอลลาเจน เนองจากไฮดรอกซโพรลนจะชวยใหโครงสรางของโทรโปรคอลลาเจนมความคงตวมากข น (Jose and Harrington, 1964)

12

ตารางท 3 ปรมาณกรดอะมโนของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ ชนดกรดอะมโน ปรมาณกรดอะมโน (กรม) / 100 กรม คอลลาเจน

กรดอะซตก 0.25 โมลาร กรดอะซตก 0.5 โมลาร กรดอะซตก 0.75 โมลาร Aspartic acid 2.93 ± 0.03 a 3.56 ± 0.14 b 3.36 ± 0.07 b Threonine 2.45 ± 0.01 a 2.95 ± 0.11 b 2.73 ± 0.05 b

Serine 2.72 ± 0.01 a 3.34 ± 0.15 b 3.07 ± 0.10 b Glutamic acid 6.66 ± 0.01 a 8.55 ± 0.40 b 8.00 ± 0.26 b

Proline 8.64 ± 0.01 a 10.09 ± 0.12 b 9.16 ± 0.34 a Glycine 25.60 ± 0.43 ns 25.75 ± 1.19 ns 25.91 ± 0.17 ns Alanine 7.51 ± 0.02 a 8.94 ± 0.31 b 8.44 ± 0.54 ab Valine 1.86 ± 0.31 a 2.24 ± 0.11 b 2.12 ± 0.06 b

Methionine 0.62 ± 0.01 ns 0.61 ± 0.04 ns 0.68 ± 0.02 ns Isoleucine 0.76 ± 0.07 ns 1.11 ± 0.34 ns 0.83 ± 0.02 ns Leucine 1.61 ± 0.17 ns 2.32 ± 0.55 ns 1.85 ± 0.09 ns Tyrosine 0.00 0.00 0.00

Phenylalanine 1.57 ± 0.01 a 1.95 ± 0.09 b 1.77 ± 0.09 ab Histidine 0.83 ± 0.01 a 0.97 ± 0.01 b 0.98 ± 0.02 b Lysine 4.20 ± 0.02 a 5.00 ± 0.28 b 4.43 ± 0.05 a

Arginine 5.21 ± 0.11 a 7.10 ± 0.30 b 5.70 ± 0.06 a a, b อกษรทแตกตางกนตามแนวนอนแสดงถงความแตกตางกนอยางมนยสาคม (P≤0.05) ns มความแตกตางกนอยางไมมนยสาคม (P>0.05) 5. การละลายของคอลลาเจน (Collagen solubility)

ผลกระทบของปรมาณเกลอตอการละลายของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ แสดงดงภาพท 4 พบวาคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดได มรปแบบการละลายในสารละลายเกลอทคลายคลงกนดงน คอลลาเจนท งหมดสามารถละลายไดดทความเขมขนของเกลอตากวา 2 เปอรเซนต จากน นการละลายของคอลลาเจนจะลดลงอยางรวดเรวจนถงทความเขมขนของเกลอ 4 เปอรเซนต และการละลายของคอลลาเจนจะคงทในระดบตา ทเปนเชนน เนองจากเมอความเขมขนของเกลอในสารละลายเพมข นจะทาใหคา ionic strength เพมข น ซงมผลทาใหสายโซโปรตนทาปฏกรยาไฮโดรโฟบกระหวางกนมากข น แลวโปรตนกจบตวเปนกอนจนกระทงตกตะกอนแยกตวออกมาจากสารละลาย ซงเราเรยกปรากฏการณน วา salting out (Vojdani, 1996)

13

ภาพท 4 การละลายสมพทธของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ ทความ เขมขนของเกลอตางๆ

ผลกระทบของ pH ตอการละลายของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ แสดงดงภาพท 5 พบวาคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดไดมรปแบบการละลายทคลายคลงกนคอ คอลลาเจนจากหนงปลานลสามารถละลายไดดในสภาวะทเปนกรด โดยมคาการละลายสมพทธของคอลลาเจนมากกวา 90 เปอรเซนต ในชวง pH ต งแต 1 - 4 จากน นการละลายของคอลลาเจนจะลดลงตาสดท pH 7 ท งน เนองจากคา pH อยในชวง pI ของคอลลาเจน กลาวคอในชวง pI คาประจมวลรวมของโมเลกลโปรตนจะเทากบศนย ทาใหโมเลกลโปรตนไมเกดแรงผลกระหวางกน ดงน นสายโซโปรตนจงสามารถทาปฏกรยา ไฮโดรโฟบกระหวางกน เกดการจบตวกนเปนกอนและตกตะกอนออกมา คาการละลายของโปรตนจงลดลง ในทางตรงกนขาม ท pH ตากวาหรอสงกวาคา pI จะทาใหคาประจมวลรวมของโมเลกลโปรตนเพมข น เมอสายโซโปรตนมประจมวลรวมมากข นทาใหเกดแรงผลกกนระหวางสายโซโปรตน จงทาใหการละลายของโปรตนเพมมากข น (Vojdani, 1996) โดย Foegeding et al., (1996) ไดรายงานคา isoelectric point ของคอลลาเจนอยในชวง pH 6 - 9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6

Re

lati

ve c

olla

gen

so

lub

ility

(%

)

NaCl concentration (%)

0.25 M

0.5 M

0.75 M

14

ภาพท 5 การละลายสมพทธของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ ท pH ตางๆ 6. ความหนด (Viscosity)

ความหนดสมพทธของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ แสดงดงภาพท 6 พบวาคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกท ง 3 ความเขมขน มรปแบบการลดลงของความหนดทคลายกนคอ ความหนดสมพทธของคอลลาเจนจะคอยๆ ลดลงอยางชาๆ จาก 100 เปอรเซนตทอณหภม 4 องศาเซลเซยส จนถง 80 เปอรเซนต ทอณหภม 28 องศาเซลเซยส จากน นความหนดสมพทธของคอลลาเจนจะ ลดลงอยางรวดเรวจาก 80 เปอรเซนต จนถง 50 เปอรเซนต ทอณหภม 40 องศาเซลเซยส และความหนดสมพทธจะคอยๆคงทจนถงอณหภม 48 องศาเซลเซยส การทความหนดของคอลลาเจนลดลงเมออณหภมสงข นเนองจากการใหความรอนทอณหภมสงสามารถสลายพนธะไฮโดรเจน ซงเปนพนธะททาใหโครงสรางของคอลลาเจนคงตว (Wong, 1989)

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

100.0

110.0

1 2 3 4 5 6 7

Re

lati

ve c

olla

gen

so

lub

ility

(%

)

pH

0.25 M

0.5 M

0.75 M

15

ภาพท 6 ความหนดสมพทธของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ ทอณหภมตางๆ 7. รปแบบของโปรตนโดยวธ SDS-PAGE

รปแบบของโปรตนจากคอลลาเจนหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตก 3 ระดบความเขมขน แสดงดงภาพท 7 พบวารปแบบโปรตนของคอลลาเจนจากหนงปลานลท งหมดมรปแบบทคลายกนคอ ประกอบไป

ดวยสายโซแอลฟา 2 สาย (α 1 และ α 2) สายโซเบตา (ß) และสวนประกอบแกมมา (γ) ซงสอดคลองกบรายงานของ Giraud-Guille et al. (2000) ทกลาววาคอลลาเจนจากหนงปลาสวนใหมประกอบไปดวยสายโซ

แอลฟา 2 สาย (α 1 และ α 2) สายโซเบตา (ß) และสวนประกอบแกมมา (γ) เมอเปรยบเทยบรปแบบโปรตนของคอลลาเจนจากหนงปลานลกบรปแบบโปรตนของคอลลาเจน

Type I จากหนงสกร (ชองท 7 และ 8) พบวามองคประกอบหลกทคลายกนคอ ประกอบไปดวยสายโซแอลฟา

2 สาย (α 1 และ α 2) และสายโซเบตา (ß) แสดงวาคอลลาเจนจากหนงปลานลเปนชนด Type I คอประกอบไปดวยสายโซ α1 2 สาย และสายโซ α2 1 สาย ซงเปนคอลลาเจนสวนใหมทพบในสวนของหนง เอน และกระดกในสตวช นสง (Bailey and Light, 1989)

40

50

60

70

80

90

100

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

Rel

ativ

e v

isco

sity

(%

)

Temperature (0C)

0.25 M

0.5 M

0.75 M

16

M 1 2 3 4 5 6 7 8 M ภาพท 7 รปแบบโปรตนของคอลลาเจนหนงปลานลทสกดดวยกรดอะซตก 3 ระดบความเขมขน M: โปรตนมาตรฐาน 1, 2: 0.25 โมลาร 3, 4: 0.5 โมลาร 5, 6: 0.75 โมลาร 7, 8: คอลลาเจน Type I จากหนงสกร 8. การวเคราะห Fourier Transform Infrared spectra

FTIR spectrum ของคอลลาเจนจากหนงปลานลแสดงดงภาพท 8 พบแถบ Amide A ท wave number 3331 cm-1 ซงเกยวของกบการเกดพนธะไฮโดรเจนทตาแหนง N-H หากวาตาแหนงน ไมเกดพนธะไฮโดรเจน (free N-H) จะปรากฏแถบการดดซบในชวง 3,400-3,440 cm-1 แตถาตาแหนง N-H เกดพนธะไฮโดรเจนจะปรากฏแถบการดดซบท wave number ตาลง ทคาประมาณ 3,300 cm-1 พบแถบ Amide B ท wave number 2933 cm-1 ซงเกยวของกบการยดตวแบบไมสมมาตรของ CH2

ตาแหนง Amide I พบท wave number 1651 cm-1 มาจากการสนสะเทอนของการยดตวของ

หมคารบอนลในเปปไทด ซงเกยวของกบโครงสรางทตยภมของโปรตน แถบ Amide II พบท wave number 1534 cm-1 ซงเกยวของกบการงอทตาแหนง N-H และการยดตวของ C-N สาหรบแถบ Amide III พบท wave number 1235 cm-1 เกยวของกบการยดตวของ C-N และ N-H ซงแสดงถงโครงสรางเกลยวสามสายของคอลลาเจน ดงน นคอลลาเจนจากหนงปลานลในการทดลองน มการจดเรยงตวของโครงสรางโมเลกลเปนแบบเกลยวสามสาย

200

116

97

66

45

kDa

ß α1

11 α2

1

γ

17

นอกจากน แถบการดดซบ Amide A, Amide B, Amide I, Amide II และ Amide III ของคอลลาเจนจากหนงปลานลในการทดลองน มความใกลเคยงกบรายงานของนรนทร และ วรางคณา (2558) ทสกดคอลลาเจนจากหนงปลาสลาด พบแถบการดดซบท wave number 3332, 2932, 1649, 1534 และ 1235 cm-1 ตามลาดบ

ภาพท 8 FTIR spectrum ของคอลลาเจนทสกดไดจากหนงปลานล 9. การเปรยบเทยบคณสมบตของคอลลาเจนจากหนงปลานลกบคอลลาเจนจากหนงปลาชนดอนๆ

ตารางท 4 แสดงการเปรยบเทยบคณสมบตของคอลลาเจนจากหนงปลานลทสกดไดจากการทดลองน กบคอลลาเจนจากหนงปลาชนดอนๆ อก 4 ชนด พบวาคอลลาเจนจากหนงปลานลมคณสมบตใกลเคยงกบคอลลาเจนจากหนงปลาชนดอนๆ กลาวคอ มการดดกลนแสงยวสงสดในชวงความยาวคลน 220- 233 นาโนเมตร มไกลซนเปนองคประกอบหลกของกรดอะมโน ละลายไดดในสารละลายเกลอความเขมขน 0-2 เปอรเซนต และละลายไดดในสารละลายทมสภาวะเปนกรด คอ pH 1-4 คอลลาเจนจากหนงปลาทกชนดเปนชนด Type I และมโครงสรางเปนเกลยวสามสาย

Amide A

Amide B

Amide I

Amide II

Amide III

18

ตารางท 4 คณสมบตของคอลลาเจนจากหนงปลาชนดตางๆ

คณสมบต คอลลาเจนจากหนงปลาชนดตางๆ

ปลานล1

ปลาสลาด2

ปลาตาหวาน3

ปลากะพงแดง ขางแถบ4

ปลา Walleye pollock5

ดดกลนแสงยวสงสด 232 นาโนเมตร

233 นาโนเมตร

- - 220 นาโนเมตร

องคประกอบของ กรดอะมโนหลก

Gly 25.7% Pro 10.1% Ala 8.9% Glu 8.5%

Gly 33.7% Pro 11.3% Ala 11.6% Glu 8.5%

Gly 28.6% Pro 11.6% Ala 13.6% Glu 7.8%

Gly 25.2% Pro 13.1% Ala 14.3% Glu 8.1%

Gly 19.7% Pro 11.5% Ala 10.4% Glu 11.6%

การละลายในสารละลายเกลอความเขมขนตางๆ - ละลายไดด - ละลายไดนอย

0-2% 2-4%

0-2% 2-4%

0-3% 3-6%

0-2% 2-6%

- -

การละลายในสารละลาย pH ตางๆ - ละลายไดด - ละลายไดนอย

pH 1-4 pH 5-7

pH 1-5 pH 6-8

pH 1-5 pH 6-10

pH 1-4 pH 4-10

- -

ชนดของคอลลาเจน Type I Type I Type I Type I Type I โครงสรางของ คอลลาเจน

เกลยวสามสาย

เกลยวสามสาย

- เกลยวสามสาย เกลยวสามสาย

ทมา: 1ผลการวเคราะหจากการทดลองน 2นรนทร และ วรางคณา (2558) 3Kittiphattanabawon et al. (2005) 4Jongjareonrak et al. (2005) 5Yan et al. (2008) 10. ตนทนการผลต (ตอคอลลาเจน 100 กรม)

- หนงปลา 1.98 บาท

- โซเดยมไฮดรอกไซด 61.54 บาท

- บวทานอล 2,547.69 บาท

- กรดอะซตก 1,121.54 บาท

- โซเดยมคลอไรด 1,211.54 บาท

รวม 4,944.29 บาท

19

จากการคานวณตนทนการผลตของคอลลาเจนจากการทดลองน พบวามราคาคอนขางสง เนองจากยงทาในระดบ lab scale ซงทดลองทาในปรมาณนอยจงมราคาตนทนคอนขางแพง แตถาผลตในระดบอตสาหกรรมทตองผลตในปรมาณมาก กจะสามารถลดตนทนลงไดอก

สรปผลการทดลอง

ความเขมขนของกรดอะซตกทเหมาะสมในการสกดคอลลาเจนจากหนงปลานลคอ 0.5 โมลาร เนองจากไดปรมาณผลผลตคอลลาเจนสงทสดคอ รอยละ 39.23 ซงมปรมาณมากกวาการใชกรดอะซตกเขมขน 0.25 โมลาร และ 0.75 โมลาร อยางมนยสาคม คอลลาเจนจากหนงปลานลสามารถดดกลนแสงยวสงสดทความยาวคลน 232 นาโนเมตร คอลลาเจนจากหนงปลานลเปนชนด Type I ซงคลายกบคอลลาเจนทพบในหนงปลาสวนใหม และคอลลาเจนทสกดไดยงคงมโครงสรางเปนเกลยวสามสาย โดยมองคประกอบหลกของกรดอะมโนคอ ไกลซน รองลงมาเปนโพรลน อะลานน และกรดกลตามก ตามลาดบ คอลลาเจนทสกดไดสามารถละลายไดดทความเขมขนของเกลอตากวารอยละ 2 และการละลายจะลดลงอยางรวดเรวเมอความเขมขนของเกลอเพมข นถงรอยละ 4 และสามารถละลายไดดในสารละลายทมสภาวะเปนกรด (pH 1 - 4) โดยการละลายจะลดลงเมอ pH เพมข นจนถงสภาวะเปนกลาง (pH 7) ความหนดของสารละลายคอลลาเจนทสกดไดจะลดลงอยางตอเนองเมออณหภมเพมข นจนถง 40 องศาเซลเซยส หลงจากน นความหนดจะคอยๆ คงทจนถงอณหภม 48 องศาเซลเซยส

ขอเสนอแนะ

ควรมการทดลองเพอตอยอดการใชประโยชนจากคอลลาเจน ดงน 1. การทดลองนาคอลลาเจนทผลตไดไปใชประโยชน โดยอาจนาไปทาเปนอาหารเสรมสขภาพ

หรอ เปนสวนผสมของเครองสาอาง 2. การทดลองนากรดทไดจากการหมกพชหรอผลไม มาใชในการสกดคอลลาเจนจากหนงปลา

เพอลดการใชสารเคม และเปนมตรตอสงแวดลอม

20

เอกสารอางอง กรมประมง. 2551. Monitoring Report สนคาปลานลและผลตภณฑ ประจาเดอนกรกฎาคม 2551.

แหลงทมา : http://fishco.fisheries.go.th/economic_divistion/fish_situation.html, 16 กรกฎาคม 2551.

นรนทร ทาหอม และ วรางคณา สมพงษ. 2558. สมบตของคอลลาเจนทละลายดวยกรดจากหนงปลาสลาด. วารสารวทยาศาสตรและเทคโนโลย. 2 : 257-267.

นนทพร อคนจ. 2550. การสกดคอลลาเจนจากหนงปลาสกดและลกษณะบางประการของคอลลาเจนทสกดได. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพมหานคร. 76 หนา.

Ahmad, M. and S., Benjakul. 2010. Extraction and characterization of pepsin solubilised collagen from the skin of Unicorn leatherjacket (Aluterus monocerous). Food Chem. 120 : 817-824.

Bailey, A.J. and N.D. Light. 1989. Connective Tissue in Meat and Meat Product. Elsevier Sciences Publishers, London. 355 pp.

Foegeding, E., T. C., Lanier and H. O., Hultin. 1996. Characteristics of edible muscle tissue. In: O. R. Fennema (Ed.), Food chemistry. New York: Marcel Dekker. p. 879–942.

Giraud-Guille, M. M., L. Besseau, C. Chopin, P. Durand and D. Herbage. 2000. Structural aspects of fish skin collagen which forms ordered arrays via liquid crystalline states. Biomaterials. 21 : 899–906.

Jongjareonrak, A., S. Benjakul, W. Visessanguan, T. Nagai and M. Tanaka. 2005. Isolation and characterisation of acid and pepsin-solubilised collagens from the skin of Brownstripe red snapper (Lutjanus vitta). Food Chemistry. 93 : 475–484.

Jose, J. and W.F. Harrington. 1964. Role of pyrrolidine in structure and stabilization of collagen. J. Molecular Biol. 9 : 267-287. Kittiphattanabawon, P., S. Benjakul, W. Visessanguan, T. Nagai and M. Tanaka. 2005.

Characterisation of acid-soluble collagen from skin and bone of Bigeye snapper (Priacanthus tayenus). Food Chemistry. 89 : 363–372.

Kucharz, E.J. 1992. The Collagens : Biochemistry and Pathophysiology. Springer-Verlage, Berlin. 430 pp.

Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 : 680–685.

Lin, Y.K. and D.C. Liu. 2006. Comparison of physical-chemical properties of type I collagen from different species. Food Chem. 99 : 244-251.

21

Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr and R.J. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1) : 265–275.

Morrissey, M.T., J.W. Park and L. Huang. 2000. Surimi processing waste: Its control and utilization. In: J.W. Park (Ed.), Surimi and surimi seafood. New York: Marcel Dekker, Inc. p. 127–166.

Muyonga, J.H., C.G.B. Cole and K.G. Duodu. 2004. Characterisation of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch (Lates niloticus). Food Chemistry. 85 : 81–89.

Nagai, T. and N. Suzuki. 2000. Isolation of collagen from fish waste material - skin, bone and fins. Food Chemistry. 68 : 277-281.

Nalinanon, S., S. Benjakul, W. Visessanguan and H. Kishimura. 2007. Use of pepsin for collagen extraction from the skin of bigeye snapper (Priacanthus tayenus). Food Chemistry. 104 : 593–601.

Piez, K.A. 1985. Collagen, In: J. I. Kroschwitz (Ed.), Encyclopedia of Polymer Science and Engineering. Wiley, New York. pp 699-727.

Sadowska, M., I. Kolodziejska and C. Niecikowska. 2003. Isolation of collagen from the skins of Baltic cod (Gadus morhua). Food Chemistry. 81 : 257–262.

Shahidi, F. 1994. Seafood processing by-products. In: F. Shahidi and J.R. Botta (Eds.), Seafoods chemistry, processing, technology and quality. Glasgow: Blackie Academic and Professional. p. 320–334.

Vojdani, F. 1996. Solubility. In: G. M. Hall (Ed.), Methods of testing protein functionality. Great Britain: St. Edmundsbury Press. p. 11–60.

Wang, L., B. Yang, X. Du, Y. Yang and J. Liu. 2008. Optimization of conditions for extraction of acid-soluble collagen from Grass carp (Ctenopharyngodon idella) by response surface methodology. Innovative Food Science and Emerging Technologies. 9(4 ) : 604-607.

Wong, D. W. S. 1989. Mechanism and theory in food chemistry. NewYork: Van Nostrand Reinhold. 428 pp.

Woo, J.W., S.J. Yu, S.M. Cho, Y.B. Lee and S.B. Kim. 2008. Extraction optimization and properties of collagen from Yellowfin tuna (Thunnus albacares) dorsal skin. Food Hydrocolloids. 22 : 879–887.

Yan M., B. Li, X. Zhao, G. Ren, Y. Zhuang, H. Hou, X. Zhang, L. Chen and Y. Fan. 2008. Characterization of acid-soluble collagen from the skin of Walleye pollock (Theragra chalcogramma). Food Chemistry. 107 : 1581–1586.

22

Zhang, Y., W. Liu, G. Li, B. Shi, Y. Miao and X. Wu. 2007. Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of Grass carp (Ctenopharyngodon idella). Food Chemistry. 103 : 906–912.

23

ภาคผนวก ภาพผนวกท 1 ข นตอนการสกดคอลลาเจนจากหนงปลานล

หนงปลานลทตดเปนช นเลกๆ

เตมสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด 0.1 นอรมอล กวนเปนเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 4ºC

หนงปลานลหลงจากแชสารละลายดางเพอกาจดโปรตนทไมใชคอลลาเจน

24

ลางน าเยนจนกระทงคา pH ของน าลางเปนกลาง

แชในสารละลาย butyl alcohol เขมขน 10% กวนเปนเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 4ºC

หนงปลานลหลงจากแชสารละลาย butyl alcohol เพอกาจดไขมน

25

แชในสารละลายกรดอะซตกเขมขน 3 ระดบ กวนเปนเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 4ºC

นามากรองเอาสวนของเหลวเกบไว สวนกากนาไปสกดตออกคร ง

สกดดวยกรดอะซตกเขมขนรอบท 2 กวนเปนเวลา 24 ชวโมง ทอณหภม 4ºC

26

นาสวนของเหลวทไดมาเตมเกลอโซเดยมคลอไรดเพอตกตะกอนโปรตน

นาตะกอนโปรตนไปเหวยงเพอแยกสวนของแขงกบของเหลว

ทา dialysis ในน ากลน ทอณหภม 4ºC จนกระทงคา pH ของน ากลนเปนกลาง