Orgánica y Bioquímica - repositorio.unal.edu.co

BIOTRANSFORMACIÓN DE LOS SUSTRATOS 2-FENILETANOLY ACETOFENONA CON EL HONGO FITOPATÓGENO

Colletotrichum acutatum

BIOTRANSFORMATION OF 2-PHENYLETHANOL AND ACETOPHENONEBY THE PLANT PATHOGENIC FUNGUS Colletotrichum acutatum

BIOTRANSFORMAÇÃO DOS SUBSTRATOS 2-FENILETANOLE ACETOFENONA COM O FUNGO FITOPATOGÊNICO

Colletotrichum acutatum

Diego A. Aristizábal1, Clara S. Lezcano1, Carlos M. García1, Diego L. Durango1,2

Recibido: 2/09/07 – Aceptado: 7/04/08

RESUMEN

En este estudio se evaluaron las biotrans-formaciones realizadas por el hongo fito-patógeno Colletotrichum acutatum, sobrelos sustratos 2-feniletanol 1 y acetofenona2; los procesos se realizaron en el mediode cultivo líquido Czapeck-Dox a tempe-ratura promedio de 24 oC, humedad rela-tiva entre 45 y 60%, y agitación a 150rpm en un agitador orbital tipo shaker. Enla biotransformación a partir del sustrato1 se obtuvieron los productos metabólicos1-fenil-1,2-etanodiol 3, (2-metoxietil)benceno 4 y acetato de 2-feniletilo 5, ydesde el sustrato 2 los compuestos1-fenil-1,2-etanodiol 3, 1-feniletanol 6 y2-feniletanol 1. Los productos de la trans-

formación microbiana se identificaronmediante cromatografía de gases acopla-da a espectrometría de masas (CG-EM),y resonancia magnética nuclear de protóny carbono (RMN 1H y 13C). Se observóuna tendencia marcada del patógeno aproducir hidroxilaciones sobre el sustitu-yente del anillo aromático; igualmente,tiene la capacidad de reducir el grupo car-bonilo y esterificar los grupos hidroxilode alcoholes primarios. Se discute unaposible ruta metabólica para la transfor-mación de los sustratos.

Palabras clave: hidroxilaciones enzi-máticas, reducción enzimática de cetonasaromáticas, esterificación enzimática dealcoholes.

7

REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA, VOLUMEN 37, No. 1 DE 2008

Org

ánic

ay

Bio

quím

ica

1 Escuela de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, Calle 59A No. 63-020Autopista Norte, Medellín, Colombia.

2 [email protected], [email protected]

ABSTRACT

The microbial transformation of 2-pheni-lethanol 1 and acetophenone 2 was inves-tigated using the plant pathogenic fungusColletotrichum acutatum; the processwas carried out in liquid media cultureCzapeck-Dox at an average temperatureof 24 oC, a relative humidity between45% and 60% and with agitation in a sha-ker at 150 rpm. The biotransformation ofthe substrate 1 produced the metabolicproducts 1-phenyl-1,2-ethanediol 3, (2-methoxyethyl)benzen 4 and 2-pheny-lethyl acetate 5, and from substrate 2

were obtained the compounds 1-phenyl-1,2-ethanediol 3, 1-phenylethanol 6 and2-phenylethanol 1. The structures of me-tabolic products were determined by gaschromatography coupled with mass spec-trometry (GC-MS) and nuclear magneticresonance of proton and of carbon (1Hand 13C NMR). The process has a strongtendency of the pathogen to producehydroxylations on the substituents atta-ched to the aromatic ring. Additionally,C. acutatum was effective to reduce thecarbonyl group and produce esterifica-tion reactions in the hydroxyl groupsfrom primary alcohols. The metabolicpathway of both substrates is discussed..

Key words: Enzymatic hydroxyla-tions, enzymatic reduction of aromaticketone, enzymatic esterification of al-cohols.

RESUMO

Neste estudo foi analisada as biotransfor-maçoes feitas pelo fungos fitopatogênicoColletotrichum acutatum, nos substratos2-feniletanol 1 e acetofenona 2; os pro-cessos forem feitos no meio de cultura

Czapeck-Dox a uma temperatura médiade 24 °C, umidade relativa entre 45 e60% e agitação 150 rpm em um agitadororbital tipo shaker. Na biotransformaçaodo substrato 1 é obtido os produtos meta-bólicos 1-fenil-1,2-etanodiol 3, (2-meto-xietil)benceno 4 e acetato de 2-feniletilo5, e do substrato 2 os compostos 1-fe-nil-1,2-etanodiol 3, 1-feniletanol 6 e 2-feniletanol 1. Os produtos da transfor-mação microbial forem identificados pormeio do cromatografia de gás acoplada aoespectrometria da massas (CG-EM) eressonância magnética nuclear de hi-drogênio e de carbono (RMN 1H e 13C).Uma tendência marcada do patógeno éobservada para produzir hidroxilaçoes nacadeia lateral do anel aromático; tambémtem a capacidade de reduzir ao grupo car-bonilo e esterificar dos grupos hidroxiloda função álcool primária. Uma rota me-tabólica possível para a transformaçãodas substratos é discutida.

Palavras-chave: Hidroxilaçoes enzi-mática, redução enzimática da cetonaaromática, esterificaçoe enzimática doálcool.

INTRODUCCIÓN

La necesidad de la industria farmacéuticade obtener moléculas quirales cada vezmás complejas ha propiciado el desarro-llo de nuevos procesos de biocatálisis obiotransformación combinados con nue-vas tecnologías de ingeniería bioquímica(1, 2). Las enzimas son excelentes catali-zadores en las reacciones regio- yestéreo-selectivas en condiciones suaves(3, 4). Además, pueden aceptar comosustratos muchos compuestos artificiales.

8


Por biotransformación o biocatálisisse entiende todo proceso por el que unasustancia se transforma en otra medianteuna reacción o conjunto de reaccionesbioquímicas (5). Aunque la principalaplicación de las biotransformaciones ensíntesis orgánica está en la preparación decompuestos enantiopuros, éstas tambiénse usan para efectuar transformaciones degrupos funcionales aquirales, ya que lasbiotransformaciones se llevan a cabo ge-neralmente a temperatura ambiente y pre-sión atmosférica, evitándose con ello eluso de condiciones de reacción extremas,las cuales pudieran causar isomerizacio-nes, racemizaciones, epimerizaciones otransposiciones (6).

Los hongos fitopatógenos del géneroColletotrichum se han reconocido por suhabilidad para transformar diferentes sus-tratos orgánicos (7-10), algunas vecescon la finalidad de hacer frente a los me-canismos de defensa del hospedero. C.

acutatum es uno de los principales hongospatógenos en la agricultura, y responsa-ble de importantes pérdidas económicasen frutales en áreas tanto de climas tem-plados como subtropicales y tropicales(11-13); en Colombia, este microorganis-mo afecta principalmente el cultivo de to-mate de árbol Solanum betaceum (cav.)sinónimo Cyphomandra betacea (cav.)(Sendt) (14). Debido a estos factores, lamayor parte de los estudios llevados acabo sobre C. acutatum se han encamina-do a conocer aspectos relevantes de suepidemiología y control, desconociéndo-se su potencialidad para obtener sustan-cias químicas con valor agregadomediante la biotransformación de sustra-tos orgánicos. En el presente trabajo seevaluó la capacidad del hongo fitopa-tógeno C. acutatum, de transformar los

compuestos 2-feniletanol y acetofenona.Adicionalmente, se discuten algunas ru-tas metabólicas empleadas por elpatógeno para la transformación de talessustratos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Procedimiento general. La cromatografíade capa fina (CCF) se realizó en cromato-placas (sílica gel 60 F254, 0,25 mm,Merck). Los sistemas de solventes fueronhexano/acetato de etilo [sistema de sol-vente 1 (S1), 1:1 (v/v); sistema de solven-te 2 (S2), 4:6 (v/v)]. Los compuestos sevisualizaron mediante luz UV (254 nm,310 nm) y vapores de yodo sublimado, omediante aspersión con FeCl3 al 5%, yposteriormente la mezcla ácido acético-H2SO4-agua (7:1.5:1.5, v/v), seguida porun calentamiento suave. La cromatogra-fía de gases (CG) se realizó en un croma-tógrafo acoplado a espectrometría de ma-sas, Agilent Technologies modelo 6890N equipado con una columna de naturale-za no polar HP-5, 30 m x 0,25 mm d.i.,0,25 mm de espesor de película. Las con-diciones del análisis cromatográfico fue-ron las siguientes: temperatura inicial dela columna, 50 °C; temperatura del in-yector, 230 °C; temperatura del detector,280 °C; programa de temperatura para elhorno: rampa de calentamiento a razón de10 °C/min hasta 250 °C, y conservadadurante 6 min; tiempo de corrido delanálisis 30 minutos. Como gas de arrastrese empleó N2 calidad analítica a un flujode 1 mL.min-1. Las determinaciones deespectrometría de masas por ionizaciónelectrónica (EM-IE) se obtuvieron usan-do cromatografía de gases- espectrome-tría de masas (CG-EM), empleando lascondiciones citadas previamente. Los es-

9


Org

ánic

ay

Bio

quím

ica

pectros infrarrojo (IR) se llevaron a cabocon un espectrómetro con transformadade Fourier Perkin Elmer Paragon 1000empleando como solvente cloroformo.Los espectros de resonancia magnéticanuclear (RMN) de protón y carbono-13 sedeterminaron usando deuterocloroformocomo solvente en un espectrómetro Bru-ker AMX 300 con 300,12 MHz para elnúcleo de 1H- y 75,42 MHz para el núcleo13C. Las multiplicidades se establecieronmediante la secuencia de pulsos 13CJMOD. Los desplazamientos químicosestán expresados como valores de ä

(ppm) y las constantes de acoplamiento J

en Hertz (Hz). Las biotransformacionesse realizaron en un agitador orbital tiposhaker, marca Centricol serie 0239 concámara de incubación; los aislamientos einoculaciones se realizaron en unacámara de flujo laminar clase 2, tipo A,de la compañía de Control de Contamina-ción Colombiana, modelo CSB-180A. El

patógeno se obtuvo de frutos comercialesde tomate de árbol (Solanum betaceum)infectados con antracnosis, y la identifi-cación se realizó mediante caracteriza-ción morfológica y molecular en el labo-ratorio de fitopatología de la UniversidadNacional de Colombia sede Medellín.Las cepas se mantuvieron en medio decultivo sólido PDA, a temperatura pro-medio de 24 oC y humedad relativa de 45a 60%.

Evaluación de la actividad antifún-

gica de los sustratos 2-feniletanol 1 y

acetofenona 2. Las evaluaciones se lle-varon a cabo empleando la metodología

de la placa perforada para la cual se utili-zaron los frotis del microorganismorealizados sobre PDA e incubados duran-te 72 horas, después de lo cual se retira-ron con un sacabocados de 6 mm dediámetro los correspondientes cilindros,que se utilizaron para inocular nuevas ca-jas que contenían el medio de cultivo y elsustrato de interés a diferentes concentra-ciones. El inóculo se colocó en estas cajasdentro de las perforaciones que se habíanrealizado previamente con un sacaboca-dos de diámetro idéntico. La actividadantifúngica se determinó midiendo losdiámetros de crecimiento micelial cada24 horas y durante un tiempo de 15 días.Las evaluaciones se realizaron por tripli-cado y se repitieron en el tiempo para ob-servar la reproducibilidad; los ensayos serespaldaron con los correspondientes tes-tigos (blanco absoluto y blanco de solven-tes). Los porcentajes de inhibición secalcularon utilizando la expresión:

Para los sustratos se construyeron lascorrespondientes curvas de toxicidadcontra el patógeno, y para el proceso debiotransformación se seleccionó la con-centración que produjo un porcentaje deinhibición entre 50 y 60%.

Procesos de biotransformación. Enel proceso de biotransformación se utili-zaron 3 L de medio de cultivo líquidoCzapeck-Dox, preparado con los siguien-tes componentes: Fuente de carbono y

nitrógeno, disolución A: 5% de glucosa y0,1% de extracto de levadura, en aguadestilada (hasta completar 1000 mL);Micronutrientes, disolución B: 0,5% de

10


% inhibiciónDiámetro promedio del testigo Diámetro pro

=− medio del ensayo

Diámetro promedio del testigo×100%

K2HPO4, 0,2% de NaNO3, 0,05% deMgSO4��2O y 0,001% de FeSO4��2O,en agua destilada (1000 mL). La glucosafue sustituida de la formulación originalpor sacarosa en la misma proporción.Para la preparación del medio de cultivose esterilizaron por separado las disolu-ciones A y B con el fin de evitar la degra-dación de los componentes; la mezcla serealizó antes de su utilización, combinan-do partes iguales en volumen de la disolu-ción A, B y agua estéril. El proceso debiotransformación se realizó en erlenme-yers de base ancha de 1,0 L conteniendo500 mL de medio. La inoculación se rea-lizó con trozos de siembra en placa porextendido provenientes de cajas con edadde 20 días; se utilizó una caja de cultivopor litro de medio. Los erlenmeyers secerraron con tarugos de algodón estéril, yse realizó una preincubación del hongoantes del proceso de biotransformación;se emplearon las colonias de un aisladomonospórico de C. acutatum cultivadasdurante 7 días como máximo, en un agita-dor orbital tipo shaker a 170 rpm. Termi-nado el periodo de preincubación se retiróasépticamente la biomasa, mediante fil-tración con un lienzo de nylon estéril, y setransfirió a un nuevo medio de cultivofresco; sobre este material se adicionócada uno de los sustratos a las concentra-ciones que producen inhibiciones delcrecimiento micelial entre 50 y 60%.

El proceso de biotransformación seextendió por un periodo de tiempo de 14días; en este rango de tiempo se esperaque el hongo transforme la mayor parteposible del sustrato de partida, y en losmedios de cultivo se obtenga una gamaamplia de compuestos, incluyendo inter-mediarios y productos de biotransfor-mación más avanzados.

Estudios en el curso del tiempo. Losestudios en el curso del tiempo para labiotransformación de ambos sustratos seiniciaron a partir del séptimo día. Losmuestreos se realizaron cada 48 horas,retirándose a través de una sonda estéril50,0 mL de medio de cultivo e incluyendoparte de micelio; este material se mezclócon 50,0 mL de etanol al 95% con la fina-lidad de inhibir el proceso enzimático ydetener la biotransformación. Cada unade las muestras se saturó con cloruro desodio y se extrajo con tres porciones de50,0 mL de acetato de etilo. Los extractosse mezclaron y secaron con sulfato de so-dio anhidro, y posteriormente se filtrarony destilaron a presión reducida medianteun rotaevaporador con una temperaturainferior a 45 °C. Las muestras fueronposteriormente pasadas por una columnade Sephadex LH-20 eluida inicialmentecon una mezcla de éter de petróleo (40-60°C)-CH2Cl2-MeOH, 2:1:2 v/v, para eli-minar el material lipídico, y finalmentemetanol. La fracción obtenida por elusióncon metanol se concentró a sequedad enun rotoevaporador, se redisolvió con 5,0mL de cloroformo grado análisis, se filtróa través de un microfiltro Whatman (0,45ìm), y se almacenó a 4 °C hasta su análi-sis por CCF y CG-EM. La relación entreel sustrato y los productos metabólicos sedeterminó con base en el área de los picosen CG.

Extracción y purificación de los pro-

ductos de biotransformación. Finaliza-da la biotransformación de cada uno delos sustratos, los medios de cultivo obte-nidos se filtraron sobre una malla denylon para retirar la mayor parte de labiomasa (micelio); el filtrado se saturócon cloruro de sodio y acetato de etilo, yse sometió nuevamente a un proceso de

11


Org

ánic

ay

Bio

quím

ica

filtración sobre tierra de diatomeas (celi-ta). El filtrado se reunió y se extrajo tresveces con acetato de etilo, empleando encada extracción un tercio de su volumen;el extracto obtenido se denominó fracción

neutra. La fase acuosa se llevó a un pH de2 con solución de HCl al 10%, y se some-tió a una nueva extracción utilizando lasmismas proporciones anteriores de aceta-to de etilo; el extracto obtenido se deno-minó fracción ácida. El micelio se saturócon cloruro de sodio, se adicionó acetonahasta cubrirlo completamente, y se dejóen reposo durante una hora. La masa re-sultante se extrajo tres veces con acetonay la fase orgánica obtenida se reunió, fil-tró y destiló a presión reducida hasta reti-rar la acetona. El extracto acuoso resul-tante se saturó con NaCl, y se extrajo conacetato de etilo tres veces; el extracto ob-tenido se denominó fracción micelio.

Mediante análisis comparativo realiza-do por cromatografía de capa fina se ob-servó que la fracción ácida y neutra pro-venientes de la biotransformación del2-feniletanol y la acetofenona, presentansimilitud en su composición cualitativa,por ello se reunieron en una sola fracción yse denominaron “2FAN”, a la obtenida dela combinación de las fracciones ácida yneutra provenientes del 2-feniletanol, y“AAN” a la que resulta de la mezcla de lasmismas fracciones pero a partir de la ace-tofenona. Las fracciones micelio, proce-dentes de la biotransformación de los dossustratos, no presentaron una composicióncualitativa (CCF) promisoria por estarconstituidas fundamentalmente por mate-rial lipídico, y no fueron consideradas eneste análisis. Los componentes presentesen las fracciones “2FAN” y “AAN” fue-ron sometidos a procesos de purificacióncromatográfica, utilizando columnas suce-

sivas de sílica gel 60 y Sephadex LH-20.La cromatografía de adsorción sobre síliceempleaba como sistema de elusión gra-dientes de polaridad creciente de éter depetróleo (40-60 °C) y acetato de etilo,mientras que la cromatografía por exclu-sión molecular utilizaba inicialmente elsistema éter de petróleo-diclorometano-metanol en proporción en volumen 2:1:1 yfinalmente metanol.

Aislamiento de los productos de bio-

transformación 3, 4 y 5. La fracción“2FAN”, obtenida a partir del 2-fenileta-nol, se sometió a CC empleando comofase estacionaria sílica gel 60, y comofase móvil mezclas de polaridad crecientede éter de petróleo-acetato de etilo. Lassubfracciones obtenidas se refinaron nue-vamente mediante cromatografía de per-meación en gel empleando SephadexLH-20, y como eluente la mezcla éter depetróleo-CH2Cl2-MeOH, 2:1:1 (v/v),para obtener los productos metabólicos 3

(36 mg) y 5 (18 mg). Un análisis porCG-EM de una fracción refinada tambiénreveló la presencia de 4, cuya estructurase determinó mediante comparación de suEM-IE con el reportado en la base de da-tos NIST (19).

Compuesto 3: se aisló como un mate-rial semisólido a temperatura ambiente.Mediante análisis CG-EM presentó untiempo de retención, tR de 10,57 min.EM-IE, m/z (% intensidad relativa): 138[M]+ (8), 120 [M-H2O]+ (5), 107[M-CH3O]+ (100), 77 [C6H5]+ (48). IRímax (CHCl3) cm-1: 3350 (OH), 3100,2980, 1493, 1454, 1212, 1150. RMN 1H(300 MHz, CDCl3): ä 7,26 (5H, m); 4,81(1H, d, H-1); 3,75-3,60 (2H, m, H-2 y2’). RMN 13C (75 MHz, CDCl3): ä

140,98 (C-1’), 128,93 (C-3’ y 5´),

12


128,36 (C-4´), 126,51 (C-2’ y 6’), 75,13(C-2), 68,48 (C-1). El análisis de los es-pectros de RMN 1H y 13C reveló que la es-tructura del compuesto coincide con ladel 1-fenil-1,2-etanodiol.

Compuesto 4: en el análisis porCG-EM presentó un tR de 9,85 min.EM-IE, m/z (% int. rel.): 136 [M]+ (52),104 [M-CH3OH]+ (25), 91 [C7H7]+ (100),77 [C6H5]+ (22), 65 [C5H5]+ (32), 51 (28),45 (44). Este producto de transformaciónse identificó como el éter metílico del2-feniletanol, el (2-metoxietil)benceno.

Compuesto 5: se aisló como un líquidoincoloro, viscoso y de olor agradable. Enel análisis CG-EM presentó tR de 10,69min. EM-IE, m/z (% int. rel.): 104[M-CH3CO2H]+ (100), 91 [C7H7]+ (23).IR ímax (CHCl3) cm-1: 3060, 2950, 1750(C=O), 1660 (C=C aromático), 1490,1370, 1240. RMN 1H (300 MHz,CDCl3): ä 7,64-7,02 (5H, m), 4,60 (2H,t, J = 7,0, H-1), 3,01 (2H, t, J = 7,0,H-2), 2,10 (3H, s). RMN 13C (75 MHz,CDCl3): ä 171,46 (C=O), 138,28 (C-1’),129,34 (C2’ y 6’), 128,95 (C3’ y 5’),127,02 (C-4’), 65,38 (C-1), 35,55 (C-2),21,40 (CH3). El compuesto 5 presentóuna fórmula molecular C10H12O2 deacuerdo con el EM-IE. A partir de otrosdatos espectroscópicos, 5 posee un grupoacetil (äH 2,10; äC 171,46, 21,40; ímax

1759, 1240 cm-1). Las propiedades cro-matográficas y espectroscópicas de 5 sontotalmente concordantes con las de unamuestra auténtica de acetato de2-feniletilo obtenida por acetilación del2-feniletanol.

Aislamiento de los productos de bio-

transformación 1, 3 y 6. La fracción“AAN”, obtenida a partir de la acetofe-

nona, se sometió a cromatografía de co-lumna empleando como fase estacionariasílica gel 60, y como eluente éter de pe-tróleo, mezclas de éter de petró-leo-acetato de etilo de polaridad crecien-te, acetato de etilo puro, y finalmente conmetanol. Las subfracciones obtenidas sesometieron posteriormente a sucesivasCC empleando Sephadex LH-20 comofase estacionaria y la mezcla éter de pe-tróleo- CH2Cl2-MeOH, 2:1:1, y final-mente metanol. Se obtuvieron los pro-ductos de transformación microbiana 1 (8mg), 3 (22 mg) y 6 (19 mg).

Compuesto 1: se aisló como un líquidoincoloro y viscoso. Mediante análisisCG-EM presentó un tiempo de retencióntR de 7,88 min. EM-IE, m/z (% int. rel.):122 [M]+ (30), 104 [M-H2O]+ (5), 91[C7H7]+ (100). IR ímax (CHCl3) cm-1:3400 (-OH), 3030, 2950, 1600 (C=Caromático), 1493, 1454, 1050. RMN 1H(300 MHz, CDCl3): ä 7,27-7,07 (5H, m),3,69 (2H, t, J = 7,0, H-2), 2,76 (2H, t, J

= 7,0, H-1). RMN 13C (75 MHz,CDCl3): ä 134,86 (C-1’), 125,09 (C-2’ y6’), 124,49 (C-3’ y 5’), 122,34 (C-4’),59,40 (C-1), 35,19 (C-2). Los espectrosde RMN 1H y 13C corresponden con losdel 2-feniletanol; adicionalmente, las ca-racterísticas espectroscópicas (EM-IE,RMN 1H y 13C), y el comportamiento cro-matográfico (tR) se compararon con las deuna muestra auténtica de 2-feniletanol(Merck) coincidiendo perfectamente.

Compuesto 6: se aisló como un líquidode color amarillo, viscoso. En CG-EMmostró un tR de 7,15 min. EM-IE, m/z (%int. rel.): 122 [M]+ (20), 107 [M-CH3]+

(100), 77 [C6H5]+ (42). IR ímax (CHCl3)cm-1: 3386 (-OH), 3040, 2975, 1675(C=C aromático), 1492, 1451, 1217.

13


Org

ánic

ay

Bio

quím

ica

RMN 1H (300 MHz, CDCl3): ä 7,38-7,25(5H, m), 4,88 (1H, c, J = 6,5, H-1), 1,50(3H, d, J = 6,5). RMN 13C (75 MHz,CDCl3): ä 146,51 (C-1’), 129,20 (C 2’ y6’), 128,16 (C 4’), 126,10 (C3’ y 5’),71,09 (C-1), 25,85 (CH3). El producto detransformación 6 se identificó como el1-feniletanol.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Toxicidad de los sustratos hacia C. acu-

tatum. Previo al proceso de biotransfor-mación se evaluó la toxicidad de los sus-tratos sobre el microorganismo en mediosólido (PDA), a diferentes concentracio-nes durante un periodo de 14 días. Los sus-tratos 2-feniletanol y acetofenona presen-tan una moderada actividad antifúngicacontra C. acutatum (Figuras 1 y 2). A unaconcentración de 1000 mg/L la acetofeno-na inhibió casi completamente el creci-miento radial del hongo fitopatógeno du-

rante los quince días de la evaluación,mientras que el 2-feniletanol sólo lo hizoen aproximadamente un 60%. De las Fi-guras 1 y 2 se determinó que para una inhi-bición del crecimiento radial entre el 50 y60% después de 14 días de incubación, serequiere de una concentración de acetofe-nona de 1000 mg/L y de 2-feniletanol de750 mg/L. Con estas concentraciones sellevó a cabo el procedimiento de biotrans-formación de los sustratos, a fin de garan-tizar una adecuada actividad enzimática yconversión del sustrato por parte del mi-croorganismo.

Experimentos en el curso del tiem-

po. La abundancia relativa en el curso deltiempo para los metabolitos se observócualitativamente por CCF y se midiócuantitativamente mediante GC (Figuras3 y 4). En este sistema, el sustrato de par-tida 2-feniletanol 1 se transformó princi-palmente a 3 y 5, y tan sólo el 20% de 1 se

14


Figura 1. Actividad antifúngica del 2-feniletanol 1 contra el hongo C. acutatum durantelos 15 días.

15


Org

ánic

ay

Bio

quím

ica

Figura 2. Actividad antifúngica de la acetofenona 2 contra el hongo C. acutatum durantelos 15 días.

Figura 3. Experimento en el curso del tiempo de la biotransformación de 2-feniletanol 1

por el hongo fitopatógeno C. acutatum: (�) 2-feniletanol, 1; (�) 1-fenil-1,2-etanodiol,3; (�) acetato de 2-feniletilo, 5; (�) (2-metoxietil)benceno, 4.

consumió durante los 14 días. El metabo-lito mayoritario 3 alcanzó cerca del 12%de la abundancia relativa pasados los 14días, mientras que 5 presentó en este mis-mo lapso de tiempo un 9%. Por otra par-te, a partir de la acetofenona 2, se genera-ron como productos mayoritarios 3 y 6.Este último alcanza su máxima concen-tración en el décimo día de biotransfor-mación. Por su parte, el producto meta-bólico 3 se comienza a formar, a expensasde un declive en la concentración de ace-tofenona, luego del octavo día de bio-transformación, y alcanza su concentra-ción mayoritaria (30% de la abundanciarelativa) pasados 10 días. Igualmente, elproducto 1 sólo se empieza a producir apartir del día 10, a la par con la reducciónen los niveles de 6 y 2. A diferencia delsustrato 1, la conversión del sustrato 2

por parte de C. acutatum fue mayor, y

cerca de un 90% del sustrato se metaboli-zó pasados los 14 días del proceso. Estosmetabolitos no fueron detectados poranálisis mediante CCF y CG a partir deun cultivo de C. acutatum carente de lossustratos.

A partir de las estructuras de los pro-ductos obtenidos y los experimentos en elcurso del tiempo, se plantearon las posi-bles rutas metabólicas para la biotransfor-mación de 1 (Figura 5) y 2 (Figura 6) porel hongo fitopatogénico C. acutatum. Enla transformación de 1 se manifiesta la ca-pacidad del microorganismo para efec-tuar reacciones de esterificación (acetila-ción) y formación de éteres metílicos apartir de alcoholes primarios, para la pro-ducción de 5 y 4, respectivamente. Adi-cionalmente, se aprecia la formación delproducto de oxidación 3 (glicol), prove-niente del proceso oxidativo en el carbo-

16


Figura 4. Experimento en el curso del tiempo de la biotransformación de acetofenona 2

por el hongo fitopatógeno C. acutatum: (�) acetofenona, 2; (�) 1-feniletanol, 6; (�)1-fenil-1,2-etanodiol, 3; (�) 2-feniletanol, 1.

no bencílico (monohidroxilación) del2-feniletanol.

De otro lado, en la biotransformacióndel sustrato 2, el producto 1 se consideraproveniente de la ruta (2 � 6 � 3 � 1).En esta secuencia, la acetofenona 2 es ini-cialmente reducida para formar el alcoholsecundario 1-feniletanol 6; el cual es pos-

teriormente hidróxilado en el carbonometílico para la producción del glicol 3.La última etapa implica la conversión del1,2-diol 3, para la obtención del 2-fenile-tanol 1, la cual puede proceder posible-mente de acuerdo con una secuencia dedeshidratación selectiva-reducción (véa-se Figura 7).

17


Org

ánic

ay

Bio

quím

ica

Figura 5. Proceso de biotransformación del sustrato 2-feniletanol 1 mediante el hongoC. acutatum.

Figura 6. Proceso de biotransformación del sustrato acetofenona 2 mediante el hongoC. acutatum.

CONCLUSIONES

De la biotransformación del sustrato2-feniletanol 1 con el hongo C. acutatum,se identificaron mediante una combinaciónde RMN 1H y 13C, EM-IE, y por compara-ción con los datos cromatográficos y espec-trales obtenidos para muestras auténticas yreportados en la literatura, los metabolitos1-fenil-1,2-etanodiol 3, acetato de 2-fenile-tilo 5 y el éter metílico del 2-feniletanol, y apartir de la acetofenona 2, se elucidaron loscompuestos 1-feniletanol 6, 2-feniletanol 1

y 1-fenil-1,2-etanodiol 3.

Los resultados sugieren que el hongofitopatógeno C. acutatum tiene la capaci-dad de convertir diferentes sustratos me-diante reacciones de reducción (2 � 6)y oxidación (1� 3) sobre el sustituyentedel anillo aromático. Esta versatilidadpuede ser aprovechada en la síntesis orgá-nica para la obtención de productos másespecializados. Adicionalmente, C. acu-

tatum produce reacciones metabólicas deesterificación (acetilación) y formaciónde éteres metílicos sobre los sustratos deltipo alcohol primario, permitiendo desdeel sustrato 1 la obtención de los compues-tos, acetato de 2-feniletilo, 5 y (2-meto-xietil)benceno, 4.

Los resultados sugieren la posibilidadde efectuar reacciones de hidroxilaciónen la posición bencílica, reducción degrupos carbonilo y acilaciones sobre al-coholes primarios empleando el hongo fi-topatógeno C. acutatum.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Huisman G.W.; Gray D. Towardsnovel processes for the fine-chemicaland pharmaceutical industries. Curr.

Opin. Biotechnol. 2002. 13:352-358.

18


Figura 7. Ruta propuesta para la formación de los productos de la biotransformación deacetofenona con el hongo fitopatógeno C. acutatum.

2. Straathof A. J.; Panke S.; Schmid A.The production of fine chemicals bybiotransformations. Curr. Opin.

Biotechnol. 2002. 13: 548-556.

3. Kirk O.; Borchert T.V.; FuglsangC.C. Industrial enzyme applications.Curr. Opin. Biotechnol. 2002. 13:345-351.

4. Schmid A.; Hollmann F.; Park, J. B.The use of enzymes in the chemicalindustry in Europe. Curr. Opin. Bio-

technol. 2002. 13: 359-366.

5. Faber, K. Biotransformations in or-ganic chemistry. 3 ed. Berlin Heidel-berg New York: Springer. 1997.

6. Luna H. Aplicación de la biocatálisisa la preparación de intermediariospara la síntesis de fármacos. Rev.

Soc. Quím. Méx. 2004. 48: 211-219.

7. Romano A.; Romano D.; Ragg E.;Constantino F.; Lenna R.; GandolfiR.; Molinari F. Steroid Hydroxyla-tions with Botryodiplodia malorum

and Colletotrichum lini. Steroids.2006. 71: 429-434.

8. Miyazawa M.; Akazawa S.; SakaiH.; Nankai H. Biotransformation of(-)-Dihydromyrcenyl Acetate Usingthe Plant Parasitic Fungus Glomere-

lla cingulata as a Biocatalyst. J.

Agric. Food Chem. 2000. 48:4826-4829.

9. Nankai H.; Miyazawa M.; AkazawaS.; Kameoka H. Biotransformation

of (±)-Lavandulol by the Plant Pat-hogenic Fungus Glomerella cingula-

ta. J. Agric. Food Chem. 1998. 46:3858-3862.

10. Miyazawa M.; Nankai H.; KameokaH. Biotransformations of AcyclicTerpenoids, (±)-trans-Nerolidoland Geranylacetone, by Glomerella

cingulata. J. Agric. Food Chem.1996. 44: 1543-1547.

11. Fernando T.H.; Jayasinghe C.K.;Wijesundera R.L. Factors affectingspore production, germination andviability of Colletotrichum acutatum

isolates from Hevea brasiliensis.Mycological Research. 2000. 104

(6): 681-685.

12. Freeman, S.; Shabi E.; Katan T.Characterization of Colletotrichum

acutatum causing anthracnose ofanemone (Anemone coronaria L.).Applied and Environmental Micro-

biology. 2000. 66 (12): 5267-5272.

13. Freeman S.; Katan T.; Shabi E. Cha-racterization of Colletotrichum spe-cies responsible for anthracnose di-seases of various fruits. Plant

Disease. 1998. 82 (6): 596-605.

14. Saldarriaga A.; Bernal J.; TamayoP. Reconocimiento y manejo de lasenfermedades del cultivo del tomatede árbol en Antioquia. CorporaciónColombiana de Investigación Agro-pecuaria (Corpoica). Instituto Co-lombiano Agropecuario (ICA). Me-dellín, Colombia. Boletín de SanidadVegetal N° 31. 2000. 44 p.

19


Org

ánic

ay

Bio

quím

ica

Documents

Orgánica y Bioquímica - repositorio.unal.edu.co