Origine et différenciation des lymphocytes T TCR et tolérance centrale

Pr. Guislaine Carcelain Immunologie, Hôpital Robert Debré, Université Paris Diderot

guislaine.carcelain@aphp.fr

- Les lymphocytes T dans le système immunitaire - Le récepteur à l’antigène des lymphocytes T = TCR - Les organes lymphoïdes primaires - La maturation centrale des lymphocytes T

- Sortie du thymus des lymphocytes T et circulation périphérique

- La numération lymphocytaire

- Les lymphocytes T non classiques

PARTIE I : Les Lymphocytes T dans le système immunitaire

Rôle du système immunitaire

Distinguer le SOI et NON-SOI Reconnaître un contexte de DANGER

Non-soi et danger : parasites micro-organismes virus L’Autre (?) Soi modifié et danger : cellules tumorales Non-soi sans danger : fœtus Soi sans danger:

tolérance

Immunité Innée Immunité Spécifique

Dendritiques, langherans

Phagocytes : Monocytes/macro /PNn

Lymphocytes NK

Lymphocytes T CD4+ et CD8+

Récepteur Spécifique d’antigène/ CMH CD4 : Régulation des réponses immunes

CD8 : Cytotoxicité cellules infectées ou anormales

Les Réponses immunes, coordonnées et coopérantes

Lymphocytes B

Récepteur spécifique d’antigène Réponse Anticorps à distance

Maturation centrale MO, thymus

Production dans la moelle osseuse

(CPA professionnelles)

Maturation pérophérique

Des récepteurs pour reconnaître spécifiquement des épitopes

Récepteur spécifique d’antigène (non soi)

CMH CPA

TCR

LyT

antigène

BCR

LyB

antigène

BCR : B cell receptor (Ig de surface)

TCR : T cell receptor Crées par recombinaison, diversité importante

Notion de clone : 1 antigène ↔ 1 lymphocyte

Activation Production d’anticorps

Activation Prolifération

CPA : cellule présentatrice d’antigène

CMH = HLA : molécule du complexe majeur d’histocompatibilité

Les lymphocytes T: 75 à 85% des lymphocytes sanguins

TCR ab

CD3+ TCR gd

CD3+

< 10% T > 90% T

CD4- CD8+

CD4- CD8-

CD4+ CD8+

Cytotoxicité régulation cytotoxicité

«fonction auxiliaire» (sécrétion de cytokines)

< 1% T TCRab invariant CD3+

PARTIE II : Le Récepteur T pour l’antigène (TCR)

Le Récepteur T pour l’antigène = T-Cell Receptor ou TCR

Structure du complexe TCR-CD3

α β

+ +

+

δ ε ε γ

- - - -

TCR

CD3 CD3

Reconnaissance

Transduction du signal

Région hypervariable (recombinaison somatique)

Région Variable “V”

Région Constante “C”

Region transmembranaire

Queue Cytoplasmique

ITAM ITAM

ITAM ITAM

ITAM

ITAM ITAM

ITAM

ITAM ITAM

ζ ζ

500000/lymphocytes T

Les TCR ont une structure de type «Immunoglobulin like»

• Domaine d’immunoglobulinique= structure de base de la famille Domaine conservé de 110 acides aminés avec un pont disulfure, Structure-type en feuillets bêta antiparallèles Structure en tonneau

• Super-famille des immunoglobulines = molécules contenant de tels domaines immunoglobuliniques

Les molécules CD4 et CD8

Written by Dan Stowell (©2002-2006)

• Stabilisation interaction CMH/TCR : interaction avec le CMH • Participent à la signalisation intracellulaire : recrutement de kinases

Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)

Complexe: > 200 gènes codant pour des produits très divers Majeur: les produits sont à l’origine de différences allogéniques importantes entre individus de la même espèce. Histocompatibilité: à l’origine de phénomènes de rejet de greffe entre sujets incompatibles Fonctions :

Présentation de peptides du soi/non soi aux LT Sélection Thymique

Réponse immunitaire adaptative

Surveillance exercée par les cellules Natural Killer

Il existe sur certaines cellules humaines des molécules qui sont différentes d’un sujet à un autre

Molécules du CMH de classe I et de classe II

CMH Classe III C4, c2, HSP70, TNF …

Le complexe majeur d’histocompatibilité

A1 B7 Cw6 DP1 DQ5 DR3

A26 B27 Cw3 DP5 DQ2 DR4

A8 B28 Cw6 DP2 DQ5 DR3

A2 B7 Cw4 DP4 DQ2 DR1

A8 B28 Cw6 DP2 DQ5 DR3

A1 B7 Cw6 DP1 DQ5 DR3

A8 B28 Cw6 DP2 DQ5 DR3

A26 B27 Cw3 DP5 DQ2 DR4

A2 B7 Cw4 DP4 DQ2 DR1 A2 B7 Cw4 DP4 DQ2 DR1

A1 B7 Cw6 DP1 DQ5 DR3 A26 B27 Cw3 DP5 DQ2 DR4

recombinaisons rares

Transmission en haplotype

Expression codominante à la surface cellulaire

A2

A3

B14 B7 Cw

4

Cw

6

fixe des peptides de 8-10 aa

fixe des peptides >13 aa

b2-M

a1

Peptide

a1

b1 Peptide

HLA classe I HLA classe II

a2

Contenu de la cavité présentatrice d’Ag

Cavité des molécules du CMH Cl I : fermée par des ponts salins qui limitent

la taille du peptide

Cavité des molécules du CMH Cl II : le peptide peut dépasser aux extrémités

- La liaison des peptides se fait par des résidus dits d’ancrage (ou motifs) : acides aminés (aa) que l’on retrouve préférentiellement à certaines positions dans les peptides élués de molécules du CMH

Présentation du peptide par le CMH au TCR

Le TCR reconnait le peptide et le CMH notion de reconnaissance restreinte par le (au) CMH

Le TCR du lymphocyte T mature

- Les TCR des LT CD4 reconnaissent des peptides de 12 à 25 acides aminés, présentés par le CMH de classe II présent sur les cellules présentatrices d’antigène, provenant de la dégradation intracellulaire de protéines extracellulaires

Reconnaissance de peptides antigéniques

- Les TCR des LT CD8 reconnaissent des peptides de 9 acides aminés, présentés par le CHM de classe I présent sur toutes les cellules nucléées, provenant de la synthèse de protéines intracellulaires de pathogènes

Voie endosomale

Voie du protéasome

Partie III : Les Organes lymphoïdes 1aire : Moelle osseuse et Thymus

Organes et tissus lymphoïdes

Organe souche - Moelle Osseuse formation des précurseurs

lymphoïdes primaires ou centraux - Thymus maturation et différenciation - Moelle Osseuse des précurseurs

Organes et tissus lymphoïdes secondaires ou périphériques

- ganglions lymphatiques - rate siège des - tissu lymphoïde associé aux bronches réactions - amygdales végétations immunitaires - ganglions mésentériques - plaques de peyer - tissus lymphoïde urogénital

Organes lymphoïdes primaires

Cellules souches hématopoiétiques

Maturation des lymphocytes marqueurs spécifiques de lignée, récepteur spécifique de l’antigène, éducation (sélection) Production en périphérie de lymphocytes T ou B naïfs Thymus

Moëlle osseuse

● Tissu hématopoiétique présent dans les os longs et le squelette axial

● Toutes les cellules sanguines sont dérivées des cellules souches de la moelle, seules capables d’auto- régénération

© 2009 Nucleus Medical Media, Inc.

Adipocytes

Globules rouges

Blastes

Vaisseau central

Os

L’anatomie de la moelle osseuse permet la production

et l’exportation des cellules hématopoïétiques

Fonctions de la moëlle osseuse

MO assure 3 fonctions: • Maintien d ’un contingent de cellules souches et production des cellules hématopoïétiques

• Maturation et différentiation des prolymphocytes B en lymphocytes B matures aptes à coloniser les organes lymphoïdes secondaires

• Hébergement des B activés par l ’antigène en provenance des organes secondaires et qui se transforment en plasmocytes sécréteurs d ’anticorps, à longue durée de vie

Structure du thymus

● Organe lymphoïde primaire

● Colonisé par les progéniteursT

Anatomie

● Bilobé, thoracique, médian

● Divisé en lobules :

- Cortex : thymocytes immatures

- Medulla : cellules matures

Composition cellulaire des lobules

Les différents types cellulaires thymiques:

Thymocytes

Cellules épithéliales corticales (cTECs) Cellules épithéliales médullaires (mTECs) Cellules dendritiques (DCs)

Macrophages

Fonctions du Thymus

Maturation des progéniteurs T pour produire des lymphocytes T CD4+ et CD8+ naïfs qui vont migrer en périphérie

Pas de thymus = pas de lymphocytes T naïfs (syndrome de Di Georges)

Production journalière moyenne environ 108 lymphocytes T/jour

Evolution du Thymus avec l’âge

- Le thymus involue avec l’âge à partir de la puberté et durant toute la vie, replacement du tissu thymique par tissu adipeux

- Mais des cellules T continuent à se former dans le thymus de l’adulte, variable selon les individus

Augmentation de production thymique lors du traitement par antirétroviraux, patients infectés VIH

(Markert ML 2001)

(Rubio 2002)

Spearman test; R = 0·571, P = 0·007

Augmentation du nombre de cellules naïves CD4 produites par le thymus Augmentation progressive du nombre de cellules naïves CD4 en périphérie

Partie IV : Maturation centrale des lymphocytes T

Etapes importantes de la maturation centrale des lymphocytes T

- Multiplication intense des thymocytes - Acquisition des marqueurs de surface spécifiques de lignée : ex : CD3 spécifique des LT - Acquisition des récepteurs spécifiques à l’antigène par recombinaison somatique au hasard : TCR (T Cell Receptor) - Sélections des lymphocytes compétents et ne reconnaissant pas le soi

- sortie des organes lymphoïdes de lymphocytes T naïfs

Facteurs nécessaires à la maturation centrale des cellules lymphoïdes

Moelle Osseuse

Cellule Souche hématopoïétique

Cellule Souche lymphoïde

IL3, SCF

IL7, SCF

Organes Lymphoïdes secondaires

Thymus

IL2, IL7

SCF, FT

CD34

Pro-B

Pro-T

B naïf

T naïf

FT= thymuline, thymosines a1, thymopoiétine

Récepteurs Notch / Ligands

Le réseau des cellules épithéliales permet la maturation des cellules T

- Cellules épithéliales nourricières (cortex externe) : IL-7

- Cellules épithéliales du cortex thymique (cTEC) : sélection positive

(CMH I et II)

- Cellules épithéliales médullaires (mTEC), DC : sélection négative

(peptides spécifiques d’organes du soi)

4 - 8 low

4 low 8 low

4 + 8 + TCR

4 + 8 + TCR

macrophage

Réarrangement TCR productif

Réarrangement TCR Non productif

Reco MHC S+

Non Reco MHC

Pas de Reco Ag du soi

Reco Ag du soi S-

APOPTOSIS

4 - 8 -

Region sous-capsulaire

Cortex

région cortico-médullaire

4+ 8- TCR

4- 8+ TCR vaisseaux

Medullaire

DN

DP

SP

prolifération

Sélection négative

Sélection positive

Le thymus est l’organe de différentiation central des progéniteurs T en cellules T naïves

DN1 DN2

1 – le réarragement des gènes du TCR

Un lymphocyte T naïf = un TCR unique

α β

+ +

+

δ ε ε γ

- - - -

TCR

CD3 CD3

Reconnaissance

Transduction du signal

Région hypervariable (recombinaison somatique)

Région Variable “V”

Région Constante “C”

Region transmembranaire

Queue Cytoplasmique

ITAM ITAM

ITAM ITAM

ITAM

ITAM ITAM

ITAM

ITAM ITAM

ζ ζ

500000/ly

Gènes du TCR en configuration germinale

Chromosome 14

Chromosome 7

- Réarragement chaîne béta puis alpha - Le réarragement de la chaîne alpha induit l’excision du locus codant pour les gènes de la chaîne delta

Le réarragement de la chaîne alpha induit l’excision du locus de la chaîne delta

Réarragement chaînes alpha et béta

RAG (Recombinase Activating Gene)

Endonucléase, TdT (Terminal Desoxynucleotidyl Transferase)

ADN non réarrangé

ADN réarrangé ARN

Cercles d’excision

Intervention des mêmes systèmes enzymatiques que pour le BCR

séquences signal de recombinaison de part et autre segments

répertoire T: diversité combinatoire et jonctionnelle

combinatoire

jonctionnelle

totale

V-D et VD-J V-J

1 cellule T 1 récepteur à l’antigène, 10 13-15 TCR différents

Structure tridimentionnelle de l’extrémité terminale du TCR

a b

Complexe ternaire CDR1

CDR2

CDR3

Le site de fixation est défini par des séquences hypervariables CDR (Complementary Determining Regions) CDR1, 2, 3 dans chaque région V

Entre les CDR: les FR (framework region) présentent peu de variabilité Les interactions ont lieu entre les AA des CDR (paratope) et l’Ag (épitope)

- Lymphocytes T naïfs ayant chacun un TCR unique, créés au hasard par la recombinaison de gènes Reconnaissance d’un grand nombre de peptides différents Mais : - Reconnaissant les molécules CMH de l’hôte ou pas - Reconnaissant du non soi ou du soi

Éliminer les thymocytes ayant un TCR: ne reconnaissant pas les molécules du CMH de l’hôte reconnaissant le soi PERTES +++

Au total,

2 – la sélection Positive

Sélection Positive des Lymphocytes T dans le thymus : rôle des cellules épithéliales corticales

antigènes du soi présentés par les cellules Épithéliales Corticales (peu efficace )

Pas de reconnaissance CMH-peptide Mort programmée par négligence

Engagement faible du TCR Engagement CMH Cl I : CD8+ Engagement CMH Cl II : CD4+ Survie et poursuite différenciation

La sélection positive a lieu au stade DP lorsque les thymocytes expriment un TCRab potentiellement fonctionnel

Les CMH de classe I et II permettent la sélection positive des cellules CD8 et CD4 respectivement

Les CMH de classe I et II permettent la sélection positive des cellules CD8 et CD4 respectivement, restriction par le CMH

3 – la sélection Négative

Sélection négative: les cellules épithéliales médullaires expriment des antigènes de tissus grâce à Aire

- Aire : auto-immune regulatory gene (facteur de transcription) - mutation de Aire : syndrome de polyendocrinopathie auto-immunitaire (ACEPED) - les gènes spécifiques d’organes non exprimés par les cellules épithéliales

médullaires mTEC sont la cible des auto-anticorps

Rôle des cellules dentritiques et épithéliales médullaires dans la sélection négative ?

Sélection Négative dans le thymus

cellules Dendritiques , Cellules Épithéliales Médullaires thymiques Présentation des antigènes efficace

ENGAGEMENT FORT DU TCR : mort cellulaire induite via le TCR

Cellule souche

Précurseur T DN1

SP T naïfs

T matures

CD34 cCD3

CD7

CD5

CD2

MOELLE OSSEUSE THYMUS

corticale médullaire

cCD3

CD7

CD5

CD2

CD1a

cCD3

CD7

CD5

CD2 CD3 - TCR

CD7

CD5

CD2

CD4

DN = double négatif, DP = double positif CD4+CD8+ SP = simple positif CD4+ou CD8+

CD3- preTCR

CD7

CD5

CD2

CD4

CD8

DN2 DP

CD3 - TCR

CD7

CD5

CD2

CD8

CD3 - TCR

CD7

CD5

CD2

CD4

CD3 - TCR

CD7

CD5

CD2

CD8

PERIPHERIE

Progression des différentes étapes du réarragement des gènes du TCR

Multi potents Pro-T

Partie V : Sortie du thymus des lymphocytes T et circulation périphérique

Circulation des Lymphocytes emprunte les vaisseaux sanguins et lymphatiques

ORGANES LYMPHOIDES PRIMAIRES Moelle Osseuse / Thymus PRODUCTION

ORGANES LYMPHOIDES SECONDAIRES Ganglions, rate, tissus lymphoïde associé aux muqueuses ACTIVATION, DIFERENCIATION

ORGANES LYMPHOIDES TERTIAIRES Lieu de l’aggression FONCTIONS EFFECTRICES

Cellules naïves - Entrée dans les gg lymphatiques et le MALT à travers les veinules à endothélium élevé (HEV) - Entrée dans la rate à travers la zone marginale

Lymphe, CT, sang, tissus …

Sang

Cellules effectrices Sang Cellules naives, mémoires

Les lymphocytes T gagnent le ganglion par les HEV pour être activés par les cellules dendritiques

Flux sanguin Contact = roulement du lymphocyte Adhérence primaire réversible Activation du lymphocyte

Adhérence secondaire irréversible

transmigration

L sélectine CD62L ELAM-1

Intégrines LFA-1/ VLA4 ICAMS

Lymphocytes Cellules endothéliales des veinules post capillaires

CCR7 / CXCR5 CCL21, 19 / CXCL13 Tissus

Passage trans-endothélial des Lymphocytes

adhésion chimiotactisme

Partie VI : Numération lymphocytaire

Principaux Marqueurs des lymphocytes T

TCR récepteur à l’antigène CD2, CD5, CD7 marqueurs de lignée T CD3 lignée T, transduction du signal CD4 liaison MHC Cl II, signalisation CD8 liaison MHC Cl I, signalisation CD28 co-activation / B7 CD40L co-activation / CD40 IL2R récepteur à l’IL2 LFA1, ICAM-1 molécules d’adhésion CD45 RA / RO marqueur de différenciation

488 nm

excitation émission

FITC

PerCP

PE CD8

CD4

CD3

CD45

CELL

680 nm

578 nm

543 nm

Principe de la cytométrie en flux

LASER

Informations sur: - taille - structure - fluorescence

Numération des lymphocytes CD4 et CD8

1) marquage sang total Ac anti-CD4, Anti-CD8, anti-CD3, anti-CD45 couplés à des fluorochromes différents lyse des hématies 2) analyse cytomètre sur 10,000 cellules 1 à 3 min/prélèvement

Immunofluorescence à l’aide d’Ac monoclonaux anti-CD4, CD8, CD3, CD45 Analyse en cytométrie en flux

2 phases

10-20 min

1-3 min

Polynucléaires Neutrophiles

Monocytes

Lymphocytes

Str

uctu

re

Taille

0 200 400 600 800 1000

0

20

0

40

0

60

0

80

0

100

0

Débris cellulaires

Exemple sur sang total lysé: informations sur la taille et la structure

CD3 APC

CD3 APC

CD4 F

ITC

CD8 P

E

CD4 FITC

CD8 P

E

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

10 0

10

1

10 2

10

3

10 4

10 0

10

1

10 2

10

3

10 4

10 0

10

1

10 2

10

3

10 4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

Exemple sur sang total lysé : Information sur les fluorescences/molécules

CD4+, CD3+

CD3+,CD4- (ex: CD8)

DN (ex LB)

CD4+, CD3-, (ex monocyte)

CD8+, CD3+

CD3+,CD8- (ex:CD4)

CD4

CD8

CD8+, CD3- ex NK

Répartition tissulaire des populations lymphocytaires

Sang périphérique Moelle osseuse Thymus Ganglions Rate

Lymphocytes T Lymphocytes B Lymphocytes NK

70-85 %

70-80 %

5-10 %

99 %

30-40 %

5-15 % 5-15 %

80-90 % 5-10 %

<1 % <1%

20-30 % <1 %

50-60 % 1-5 %

Populations lymphocytaires, valeurs normales adulte

Résultats en % de lymphocytes circulants et en valeurs absolues Pour valeur d’exemple, normes laboratoire Immunologie Pitié-Salpêtrière

CD3+ (lymphocytes T) 70%-85% CD4+CD3+ 47% 860/mm3 (SD 260)

CD8+CD3+ 26% 480/mm3 (SD 160)

CD4+CD3+/CD8+CD3+ > 0.9 CD19+ (lymphocytes B) 5-15%

CD3-CD16+et/ou56+ (lymphocytes NK) 5-15%

Variations des sous populations lymphocytaires T aux âges extrêmes

Sang cordon

J1-11 mois 1-6 ans 7-17 ans 18-70ans

Lymphocytes % .103/mm3

Cellules T CD4+ % .103/mm3

Cellules T CD8+ % .103/mm3

Cellules T CD3+ % .103/mm3

CD4/CD8

41 5.4

47 4

46 3.5

40 2.5

32 2

55 3

64 2.5

64 2.5

70 1.8

72 1.4

35 2

41 2

37 1.6

37 0.8

42 0.8

29 1.5

21 0.9

29 0.9

30 0.8

25 0.5

1.2 (0.8-1.8)

1.9 (1.5-2.9)

1.3 (1-1.6)

1.3 (1-1.4)

1.2 (1-1.5)

>75ans

Partie VII : Lymphocytes T non conventionnels

Les lymphocytes T avec un récepteur à l’antigène de type gd

Doubles négatives CD4-CD8- ou Simples positives CD8+CD4- Tissus et muqueuses Diversité beaucoup plus restreinte, restriction par le CMH non classique CD1 Reconnaissance d’épitopes conservés au sein des pathogènes Action rapide, proche de l’innée, cytotoxicité +++ et sécrétion de cytokines

Les lympocytes NKT

- Marqueurs T : CD3 et TCR et marqueurs NK CD56 et CD16 - TCR quasi invariant : chaine a V14-J18, diversité b mais restreinte - Reconnait des lipides présentés par la molécule du CMH non classique CD1d

- Fréquence sanguine variable et faible, distribution tissulaire hétérogène

- Rôle dans la régulation des réponses immunitaires: anomalies associées à des pathologies auto-immunes, inflammatoires, tumorales

Points clefs

- la majorité des lymphocytes T circulants ont un récepteur à l’antigène composé des chaînes a et b

- le TCR est au sein d’un complexe : TCR/CD3/ CD4 ou CD8

- le TCR reconnait le complexe CMH/peptide, notion de restriction par CMH

-le TCR des LT CD4 reconnait des peptides de 12-25 acides aminés, présentés par le CMH II des cellules présentatrices provenant de la dégradation intracellulaire de protéines extracellulaires

-les TCR des LT CD8 reconnait des peptides de 9 acides aminés, présentés par le CMH I des cellules nucléées, qui proviennent de la synthèse de protéines intracellulaires de pathogènes

- thymus : organe de différenciation centrale des lymphocytes T : multiplication, formation TCR, sélection TCR adéquats

- TCR formés par la recombinaison au hasard de segments de gènes

- sélection positive des thymocytes présentant un TCR reconnaissant le CMH

- sélection négative des thymocytes présentant un TCR reconnaissant le soi

-populations de lymphocytes T non classiques , minoritaires, fonction se rapprochant de celle des cellules innées

Livre Immunologie Fondamentale et Immunopathologie Les cours de L2-L3 Médecine Elsevier Masson