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O R q - 1 ’Cc-5

NOMBRE: TEL E FONO : MATRICULA

TRIMESTRE:

J

JC A R R E R A :

MARGARITA ROSA RAMIREZ SOLIS. 6 74 11 79 79332948 INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS 12 avo.

HORAS SEMANA: 20 HORAS

LUGAR DONDE SE LLEVA A CABO: U A M IZTAPALAPA

FECHA DE INICIO: SEPTIEMBRE 2 1 DE 1981. DEPTO. DE CIEN CIAS DE LA SALUD

JFECHA DE TERMINACION: OCTUBRE 20 DE 19- . L

/TUTOR INTERNO: DR. SERGIO CRUZ MONTALVO

COORDINADOR DE LABORATORIOS DE DOC(! CIA Y TRONCO COMUN DE ASIGNATURAS.

V

ADSCRIPCION: DEPTO. DE CIENCIAS .DE LA SALUD

PUESTO:

/ TITULO: -

ESTUOIO QUIMICO DE DIOON EDULE

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E S T U D I O Q U I M I C O D E

D I O O N - E D U L E

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I N D I C E

Pgg. INTRODUCCION ............................ 1

O B J E T I V O S ............................. 4 -

P A R T E E X P E R I M E N T A L ........................ 5

R E S U L T A D O S ............................ 1 2

D I S C U S I O N Y CONCLUSIONES ................ 18

E S P E C T R O S ............................ 2 1

B I B L I O G R A F I A ............................ 2 2

I N T R O D U C C I O N

En los estados de Tamaulipas. Nuevo León, San Luis Po- tosí y Ourango crece una planta silvestre conocida como cha- m a l , que produce intoxicación al ganado cuando l a ingiere, - causando parálisis de las extremidades posteriores. Los gang deros de l a región sostienen que este problema solo aparece durante la primavera ocasionándoles serias pérdidas económi- cas por l a postración de los animales intoxicados, motivo por el cual se ven obligados a venderlos a precios castigados, - ya que además las canales presentan cambios degenerativos de las fibras musculares con depósito de material basófilo gra- nular, así como necrosis focal.

Esta planta, perteneciente a l a familia de las Cicada- ceas, tiene por nombre científico Dioon edule; mide de 1 a 2 metros de altura, sus hojas alcanzan una longitud entre 1 y 1.5 m siendo rígidas y ascendentes. Abunda en lugares cerri- les y sombreados, su polinización se'rea1iza.a finales de la primavera y es parecida a l a palma.

El tóxico se localiza en todas las partes de la planta y las lesiones provocadas por su ingestión son irreversibles, pudiendo aún causar la muerte; éstas son hemoglobinuria, di- suria y parálisis en las extremidades posteriores.

Por otro lado, el valor alimenticio empírico de l a se- milla es sumamente apreciado por los campesinos de la región, lo que se consigue con lavados alcalinos sucesivos. La masi- lla obtenida es utilizada como base para hacer tamales, cuyo color debe ser púrpura indicando que puede ser ingerida por el hombre sin peligro alguno. Si una persona se intoxica con la planta, presenta vómitos continuos y fuertes dolores gas- trolntestinales.

En ,investigaciones sobre el mismo tema, previas al es- tudio objeto de este servicio social, se encontraron eviden-

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2 c i a s d e f i n i t i v a s de l a p r e s e n c i a de f l a v o n o i d e s , s o b r e t o d o en l a s f r a c c i o n e s s o l u b l e s en b u t a n o l . As7 mismo se r e a l i z ó un b i o e n s a y o con c o n e j o s machos de r a z a Nueva Zelanda, a l o s que se d i s t r i b u y ó p o r p a r e j a s a l i m e n t á n d o l o s con l a p l a n t a en c u e s t i ó n , o b i e n se l e s a d m i n i s t r a b a d i r e c t a m e n t e e l e x - t r a c t o b u t a n ó l i c o - somet ido a h i d r ó l i s i s á c i d a o s i n t a l - t r a t a m i e n t o - p o r v í a i n t r a p e r i t o n e a l . Los a n i m a l e s a l o s que se l e s a d m i n i s t r ó e l e x t r a c t o b u t a n ó l i c o h i d r o l i z a d o f u e r o n l o s Ú n i c o s en m o s t r a r i n m o v i l i d a d comp le ta de l a s p a t a s t r a - se ras , y no p r e s e n t a r o n r e s p u e s t a a e s t i m u l a c i ó n e x t e r n a ; p o r e l l o se presume que e l f l a v o n o i d e , s i e n d o e l compuesto t ó x i - co, no p r e s e n t a t o x i c i d a d a l no haber s i d o l i b e r a d o de su g l g c d s i d o r e s p e c t i v o p o r medio de una h i d r ó l i s i s , t r a t a m i e n t o - que puede t e n e r l u g a r en e l rumen d e l ganado vacuno.

Los p r i n c i p a l e s f l a v o n o i d e s en l a s p l a n t a s son a n t o c i a n i n a s , l e u c o a n t o c i a n i n a s , f l a v o n a s y f l a v o n o l e s . SDn e l g r u - po más i m p o r t a n t e de m a t e r i a l c o l o r a n t e en l a s p l a n t a s , s i e n do r e s p o n s a b l e de l a mayor ía d e l c o l o r n a r a n j a , e s c a r l a t a , - ca rmes í , p ú r p u r a y a z u l . Las a n t o c i a n i n a s p r o p o r c i o n a n en ran go c o m p l e t o de r o s a y n a r a n j a h a s t a v i o l e t a y a z u l ; l a s c h a l conas y au ronas son s u s t a n c i a s a m a r i l l o b r i l l a n t e , m i e n t r a s que l a s f l a v o n a s y f l a v o n o l e s dan c o l o r b l a n c o m a r f i l o crema.

Los f l a v o n o i d e s se c a r a c t e r i z a n p o r l a p r e s e n c i a de un e s q u e l e t o c6-C3-c6, c o n s i s t e n t e en 2 a n i l l o s a r o m á t i c o s u n i - dos p o r una cadena a l i f á t i c a de 3 carbonos que se forma en un a n i l l o p i r o n a :

~.

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Las d i f e r e n t e s c l a s e s de f l a v o n o i d e s d i f i e r e n p o r e l - e s t a d o de o x i d a c i ó n de e s t a u n i ó n de 3 carbonos. Los compues t o s i n d i v i d u a l e s e n t r e cada c l a s e se d i s t i n g u e n p r i n c i p a l m e n t e p o r e l número y o r i e n t a c i ó n de l o s g rupos s u s t i t u y e n t e s - h i d r o x i l o s . m e t o x i l o s y o t r o s en l o s a n i l l o s boncén icos . En e l a n i l l o A de l a m a y o r f a de l o s f l a v o n o i d e s , l o s h i d r o x i l o s

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estdn sustitufdos ya sea en los carbonos 5 6 2, o solo en el carbono 7, y generalmente son no metoxilados. El anillo B, - está generalmente sustituido por uno, dos o tres grupos hidrg I _. xilo o metoxilo. El primero que raramente está metilado, se sustituye e n posicidn para respecto al punto d e unidn del a - nillo al resto de la molécula (C-4'1, con el segundo y ter- c e r grupos orto a él, en C-5' y C - 3 ' , siendo estos Últimos - grupos con frecuencia metilados.

Los flavonoides usualmente existen en la planta como - glicdsidos, ésto es que uno o más de sus grupos hidroxilo se une, por medio de un enlace semiacetal, al C - 1 d e una m o l é c i l a de carbohidrato. La glicosidación no solo confiere alta - solubilidad a las agliconas flavonoides -generalmente algo i n - solubles- sino también da estabilidad especialmente a las an - tocianinas y compuestos altamente hidroxilados.

La gran mayoría de los flavonoides son no tóxicos al - hombre y a los animales, y la actividad farmacológica obser- vada, se ve limitada a escasas sustancias d e este grupo. La rutina actúa como antioxidante para adrenalina y ácido ascór - bico; también relaja el músculo liso y s e comporta como un - inhibidor enzimático general. Por su parte el foridzin, en - los mamíferos causa glicosuria por interferencia con la read - sorción de glucosa en el riñón y por inhibición de la absor- cidn de la misma en el intestino delgado.

en la literatura con actividad farmacologica. Estos dos últimos flavonoides son los Unicos reportados

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O B J E T I V O S

I. llevar a cabo l a identificación de los flavonoides presen tes en un extracto de material vegetal, por técnicas de - cromatografia en papel.

11. Purificación de los compuestos detectados. Identificación por metodos espectroscópicos.

111. Realizar l a reacción de metoxilación sobre l a mezcla de flavonoides obtenida a partir de un extracto de material vegetal. .

IV. Aislar y purificar cada uno de los compuestos por técni- cas de cromatografía en capa fina y en columna.

VI. Identificación por métodos espectroscópicos de los com- puestos purificados.

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P A R T E E X P E R I M E N T A L

A C T I V I D A D E S Y METODOS

I . IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL

P r e p a r a c i ó n d e l E x t r a c t o .

Método A.

Se p u l v e r i z a r o n 50 g d e l germen de D ioon e d u l e y se s o m e t i d a h i d r ó l i s i s a c i d a d i r e c t a , a d i c i o n a n d o 100 m l de HC1 2 N y 100 m l de e t a n o l a l m a t e r i a l v e g e t a l ; l a mezc 20 r e f l u j a r p o r e s p a c i o de 1 h o r a . Terminado e l r e f pues de f i l t r a r e l m a t e r i a l v e g e t a l , e l e x t r a c t o se en e v a p o r a d o r r o t a t o r i o a l v a c i ó . E l r e s i d u o acuoso 3 veces s u c e s i v a s con 50 m l de a c e t a t o de e t i l o . La nes en a c e t a t o de e t i l o se e v a p o r a r o n a sequedad ( 2

a se h i - u j o y des- c o n c e n t r ó se l a v ó

f r a c c i o -

T a n t o e l r e s i d u o acuoso como e l e x t r a c t o en AcOEt d i e - r o n r e a c c i o n p o s i t i v a a l a p rueba qu ím ica a l a g o t a con c l o - r u r o f é r r i c o .

FeC13 a l 1%. y a cada m u e s t r a se ag regd unas g o t a s de l a mis ma. S i l a p rueba es p o s i t i v a p a r a f e n o l e s , apa rece una c o l o - r a c i ó n que v a r í a de v e r d e a a z u l ( 3 ) .

Para e s t a p rueba se p r e p a r ó una s o l u c i d n e t a n ó l i c a de

C r o a a t o g r a f í a en Pape l . -

Se h i c i e r o n c r o m a t o g r a f 4 a s u n i d i m e n s i o n a l e s usando pa- p e l Whatman No. 2 en t i r a s de 23 x 56 Q. E l e x t r a c t o obteni- do se a p l i c ó en banda a 6 cm de d i s t a n c i a d e l ex t remo supe-- r i o r d e l p a p e l , e x t e n d i é n d o s e a l o ancho d e l mismo (8 ) . Los cromatogramas s e c o r r i e r o n e n d i r e c c i ó n descendente usando - B A W (n b u t a n o 1 : b c i d o acé t i co :agua) 4:1:5 ( p r o p o r c i o n e s - v / v ) ( 6 ) . Se c o r r i e r o n en t o t a l 6 cromatogramas.

l o s cromatogramas s e . a n a l i z a r o n de l a s i g u i e n t e manera:

1. S e o b s e r v a r o n l a s bandas v i s i b l e s a l uz no rma l . 2. S e o b s e r v a r o n l a s bandas b a j o l u z u l t r a v i o l e t a .

6

3. Las c r o m a t o g r a f i a s s e somet ieron a vapores de amoniaco y s e obse rvó s u c o l o r a c i ó n b a j o l u z normal y l u z u l t r a v i o l e t a .

4 . Se mid i e ron l o s R f de cada una de l a s bandas d e t e c t a d a s . 5 . Se r e v e l 6 uno de l o s cromatogramas con r e a c t i v o s c o l o r i -

dos p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n de f l a v o n o i d e s . L o s r e a c t i v o s usados f u e r o n e l r e v e l a d o r de c l o r u r o f é r r i c o - f e r r i c i a n u - ro de p o t a s i o y e l r e v e l a d o r de n i t r a t o de p l a t a amonia-- c a l .

P r e p a r a c i ó n de l a s Soluc ' iones de Reve lado.

- Reve l ado r de c l o r u r o f a r r i c o - f e r r i c i a n u r o de p o t a s i o . Se p repa ran s o l u c i o n e s de c l o r u r o f e r r i c 0 y f e r r i c i a n :

ro de p o t a s i o separadamente y que contengan 1 go ta de pe r - manganato de p o t a s i o . Se mezclan l a s s o l u c i o n e s y d i l u y e n - con agua de modo que l a concent rac ión d e cada r e a c t i v o sea de 0 . 5 % . Los cromatogramas s e sumergen en l a s o l u c i ó n ; l a s manchas s e r e v e l a n inmediatamente. Pos te r i o rmente s e en jua ga e l cromatograma con HC1 0 .25 N y s e l a v a con agua d e s t i l a d a para remover e l r e a c t i v o en exceso . L o s f e n o l e s o x i d a dos r eacc ionan pa ra d a r manchas de c o l o r a zu l p r u s i a o a zu l c l a r o (11).

- Reve lador de n i t r a t o de p l a t a amoniaca l . Se d i s u e l v e n 1 4 g de n i t r a t o de p l a t a en 100 ml de agua

y s e aiiade NH40H 6 N h a s t a l a d i s o l u c i 6 n de l ó x i d o de p l a t a formado. L o s cromatogramas s e rocean con e s t a s o l u c i ó n y - s e l a v a n 3 veces con agua d e s t i l a d a . Después s e sumergen - en una s o l u c i d n de t i o s u l f a t o de sodio a l 0.1% p o r 3 o 4 - minutos y f ina lmente s e l a v a n con agua d e s t i l a d a . Es te r e a c t i v o da manchas c o l o r c a f 6 , n e g r o o g r i s m e t á l i c o depend ien do de l a e s t r u c t u r a d e l f l a v o n o i d e (11).

P u r i f i c a c i O n de l o s F l avono ides .

Las zonas de l cromatograma 'unidimensional donde s e l o - c a l i z a b a n l a s 4 bandas mas fmportantes s e c o r t a r o n en f r a c - c i o n e s pequeiias. Cada uno de l o s compuestos s e e x t r a j o de l -

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papel a g i t a n d o l o s f ragmentos en 50 a 100 ml de metanol Merck po r 10 minutos en u n matraz e r l enmeyer de 250 ml . La s o l u c i ó n o b t e n i d a s e f i l t r ó y evaporó a sequedad en un evaporador r o t o torio a l v a c i o ( 8 ) .

Se a p l i c ó una p l a c a unid imensional de l o s compuestos od t e n i d o s en pape l Whatman N o . 2 , usando como e l u y e n t e á c i d o - a c é t i c o a l 1 5 % en c o r r i m i e n t o descendente y s e mid ie ron l o s Rf de l o s compuestos.

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I d e n t i f i c a c i ó n por métodos e s p e c t r o s c ó p i c o s .

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S e p repa ró una s o l u c i ó n de r e f e r e n c i a ext rayendo u n p g dazo en b l anco de pape l c r o m a t o g r á f i c o del mismo cromatogra - ma s i g u i e n d o e l método d e s c r i t o anter io rmente . Es n e c e s a r i o p r e p a r a r e s t a s o l u c i ó n , y a que e l metanol e l u y e de l pape l m i l mo a l gunos compuestos que abso rben en e l rango de l o n g i t u d de onda de 280 a 220 nm ( 8 ) .

Se midieron l o s e s p e c t r o s d e abso rc ión u l t r a v i o l e t a de l o s f l a v o n o i d e s a i s l a d o s y de l a s o l u c i ó n de r e f e r e n c i a en u n Espec t ro fo tómet ro U.V. - V i s i b l e H i t a c h i , Perkin-Elmer , Mode - l o 200. Se p roced ió según l o s s i g u i e n t e s pasos :

- Se c a l i b r ó e l e spec t ro fo tómet ro y s e a j u s t ó l a v e l o c i d a d - d e l g r a f i c a d o r de modo que l a a g u j a r e c o r r i e r a 10 nm/cm.

- Aproximadamente 0 . 1 mg de l a muestra d e l f l a v o n o i d e s e d i - s o l v i ó en 10 ml d e metanol Merck y s e determinó s u espec - tro.

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- La concent rac ión de l a s o l u c i ó n d e l f l a v o n o i d e s e f u e a j u s tando de modo que l a dens idad ó p t i c a d e l punto máximo de - a b s o r c i ó n d i e r a u n a l e c t u r a en l a r e g i 6 n de 0 . 6 a 0 . 1 ( 8 ) .

Una vez ob ten idos l o s da tos de i d e n t i f i c a c i ó n de l o s - compuestos s e e s t a b l e c i d una comparaci6n e n t r e l o s da tos r e - po r tados en l a b i b l i o g r a f í a ( 1 . 4 , 5 , 8).

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XI. METOXILACION DE F L A V O N O I O E S .

P r e p a r a c i ó n d e l E x t r a c t o .

Método B.

50 g de germen de Dioon e d u l e s e p u l v e r i z a r o n y e x t r a - jeron en 300 ml de metanol acuoso ( a l 90%) p o r 20 h o r a s . Del. pues de e s t e p e r i o d o s e evaporó e l metanol en u n evaporador r o t a t o r i o a l v a c í o ; e l r e s i d u o as5 ob ten ido s e l a v ó con 3 f r a c - cienes s u c e s i v a s de 6 t e r de 50 ml cada uno pa ra e l i m i n a r d e l e x t r a c t o g r a s a s , c e r a s , e t c . ( 9 ) .

Se obtuvo u n a f r a c c i ó n e t é r e a , una acuosa y u n p r e c i p i - tad0 que r e s u l t 6 s e r i n s o l u b l e e n - l o s s o l v e n t e s o r g á n i c o s c& nunes y t e n f a u n a s p e c t o p a s t o s o . A cada f r a c c i ó n s e l e e f e c - tuaron pruebas qu ímicas a l a go ta con FeC13. La prueba f u e - p o s i t i v a pa ra l a f r a c c i ó n acuosa y para e l p r e c i p i t a d o .

H i d r ó l i s i s .

El p r e c i p i t a d o ob ten ido ( 0 . 8 g ) s e d i s o l v i ó en 100 ml de HC1 2 N y 100 ml de e t a n o l ; l a mezcla s e sometió a r e f l u - j o p o r 3 h o r a s . T r a n s c u r r i d o e l tiempo de h i d r ó l i s i s l a mez- c l a de r e a c c i ó n se concentró en evaporador r o t a t o r i o y l a f r a c ción acuosa r e s i d u a l s e l a v ó 3 veces con f r a c c i o n e s de a c e t a to de e t i l o de 50 ml cada una ( 2 ) .

Se r e c o l e c t a r o n l a s f r a c c i o n e s de a c e t a t o de e t i l o y - s e evaporaron a sequedad.

Se h i z o e l a n á l i s i s c r o m a t o g r á f i c o c o r r e s p o n d i e n t e po r c r o m a t o g r a f i a s b id imens iona l e s s o b r e p l a c a s de c e l u l o s a de 20 x 20 cm, usando como e l u y e n t e s B A W 4 : 1 : 5 y á c i d o a c é t i - c o a l 15% ( 6 ) .

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P r e p a r a c i ó n de l Reac t i vo de M e t o x i l a c i b n .

1. Obtención de a c e t i l - m e t i l - u r e a . A una s o l u c f 6 n de 5 9 g ( I mol) de acetamida en 88 g -

(0 .55 moles ) de Br. s e a d i c i o n ó go ta a go ta y a g i t a n d o , -

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una s o l u c i ó n de 40 g de NaOH en 100 m l de agua. E l p r e c i - p i t a d o a m a r i l l o r e s u l t a n t e en l a s o l u c i ó n se c a l e n t ó a b o ño m a r í a y c o n a g i t a c i ó n l e n t a h a s t a que d e j a r a de h a c e r e f e r v e s c e n c i a ; e l c a l e n t a m i e n t o se c o n t i n u ó p o r 2 o 3 min mas, o b t e n i é n d o s e c r i s t a l e s b l a n c o s de a c e t i l - m e t i l - u r e a

(12) .

2. O b t e n c i ó n de N - n i t r o s o - m e t i l - u r e a . 49 g de a c e t i l - m e t i l - u r e a se c a l e n t a r o n con 50 m l de -

H C l c o n c e n t r a d o con a g i t a c i ó n no rma l en un baflo de v a p o r h a s t a d i s o l u c i ó n comp le ta . P o s t e r i o r m e n t e se ag reg6 un VE lumen i g u a l de agua y se d e j ó r e p o s a r p a r a o b t e n e r c r i s t a l e s d e N - n i t r o s o - m e t i l - u r e a . ( 1 2 ) .

3. O b t e n c i ó n de d iazometano. 97.8 m l de C H 2 C 1 2 y 14

y e n f r i a r o n a 0°C; a e s t a n i t r o s o - m e t i l - u r e a con ag t a l Que l a t e m p e r a t u r a de Se a d i c i o n a r o n 3 3 m l de a

5 g -de KOH a l 50% se m e z c l a r o n s o l u c i ó n se a g r e g a r o n 7 g de N- t a c i d n mecanica, a una v e l o c i d a d l a r e a c c i ó n no r e b a s a r a l o s 5 ° C . ua y se c o n t i n u ó a g i t a n d o p o r -

10 min más. La capa i n f e r i o r a m a r i l l a de d iazometano se - separó y secd s o b r e una capa de NaOH (12 ) .

H e t o x i l a c i ó n .

0.5 g de l a mezc la de f l a v o n o i d e s se c o l o c a r o n en un - m a t r a z b o l a de 100 m l y se l e a d i c i o n ó poco a poco y con a s 1 t a c i ó n mecánica, aprox imadamente 25 m l d e l a s o l u c i d n de d i g tometano en C H 2 C 1 2 r e c i é n p reparada . La a d i c i ó n se h i z o l e n - tamen te c u i d a n d o que l a t e m p e r a t u r a d e l a mezc la de ' r e a c c i b n no e x c e d i e r a l o s 5 " C y se c o n t i n u 6 h a s t a o b s e r v a r d i s o l u c i o n comp le ta , i n d i c a n d o que l a r e a c c i ó n se l l e v ó a cabo en su to- t a l i d a d ( 1 2 ) .

en un e v a p o r a d o r r o t a t o r i o .

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La s o l u c i ó n r e s u l t a n t e se evapord a sequedad a l v a c í o

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A n á l i s i s C romatog rá f i co d e l o s F l avono ides M e t o x i l a d o s .

Se h i c i e r o n c r o m a t o g r a f f a s un id imens iona l e s de l o s f l a vonoides met i l ados en p l a c a s de s f l i c a g e l 60 G Merck de 5 x 20 cm u t i l i z a n d o v a r i o s e l u y e n t e s pa ra encont ra r e l ( l o s ) de mayor r e s o l u c i ó n . Estos e l u y e n t e s f u e r o n :

- Aceta to de e t i1o : benceno ; 20 - A c e t a t o de e t i1o : benceno ; 50 - Cloro formo a l 100% - Cloroformo a l 100% con g o t a s

po r cada 10 mi de c l o ro fo rmo - C1oroformo:metanol ; 9O:lO

80 50

de metanol ( 3 g o t a s de MeOH -

Los cromatogramas s e obse rva ron b a j o l u z normal y b a j o l u z U. V. para l o c a l i z a r l a s manchas d e s a r r o l l a d a s e i d e n t i - f i c a r su c o l o r a c i ó n . El cromatograma con mayor r e s o l u c i ó n f u e en el que s e usó como e l u y e n t e c l o ro fo rmo a l 100% con go tas de metano l ; en é s t e s e mid i6 e l R f de l a s manchas o b s e r v a d a s .

P u r i f i c a c i ó n de l o s F l avono ides M e t o x i l a d o s .

Se a p l i c a r o n 15 cromatogramas de l a mezcla de f l a v o n o l des metox i l ados en p l a c a s de s i l i c a ge l 60 G de 20 x 20 cm - usando como e l u y e n t e c l o ro fo rmo con g o t a s de metano l . La mues tra s e a p l i c ó en banda a l o ancho de l a p l a c a . Las bandas ob t e n i d a s a l d e s a r r o l l o d e l cromatograma se sepa ra ron por r a s - pado de l a s p l a c a s . Los f l a v o n o i d e s s e e x t r a j e r o n de l a s f l L ca g e l en C H 2 C 1 2 ; después de f i l t r a r l a s o l u c i ó n pa ra sepa - r a r l a s p a r t í c u l a s de g e l de s í l i c e s e evaporo a sequedad en un evaporador r o t a t o r i o .

ban l a p r e s e n c i a de más de u n compuesto, po r l o que p r o c e d i ó a hace r una p u r i f i c a c i ó n por c romatogra f fa en columna de sf- l i c a g e l .

Las bandas d e s a r r o l l a d a s en l o s cromatogramas mostra -

- C r g n & t g g ~ a f f a ~ n - C g l ~ m ~ a L - Se p r e p a r 6 una suspens idn con 30 g de g e l de s l l i c e Merck de 60 - 200 m a l l a s , en 80 ml de he-

xano y s e empacó una columna de 1 5 cm de l a r g o x 2 cm de dig - metro. E n l a columna s e a p l i c ó e l m a t e r i a l obtenido de l a - separac ión de l a banda más cercana a l f rente , de los croma- togramas a n t e r i o r e s . L o s e l u y e n t e s usados fueron : hexano, - para l a s f r a c c i o n e s I a 6 ; cloroformo para l a s f r a c c i o n e s 1 7 a 2 2 ; y benceno para a s f r a c c i o n e s 2 3 en a d e l a n t e . Se - r e c o l e c t a r o n en t o t a l 30 f r a c c i o n e s de 125 ml, l a s c u a l e s se fueron anal izando por c romatograf ias en p l a c a s de s i l i c a ge l de 20 x 5 cm ( 8 ) .

12

R E S U L T A D O S

i i

o

1 . IDENTIFICACION DE FLAVONOIDES POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL.

De l a s c r o m a t o g r a f í a s en p a p e l d e l e x t r a c t o A se d e t e c - ti5 l a p r e s e n c i a de 6 bandas, l a s c u a l e s se numeraron p r o g r e s i - vamente c o r r e s p o n d i e n d o e l No. I a l a banda más ce rcana a l a - a p l i c a c i ó n , y e l No. V I a l a más c e r c a n a a l f r e n t e d e l s o l v e n t e .

P o r l o s a n á l i s i s r e a l i z a d o s a l o s cromatogramas se o b t u - v i e r o n sus v a l o r e s de R f , c o l o r a c i o n e s c a r a c t e r í s t i c a s y máx. de a b s o r c i ó n U. V. E s t a s p r o p i e d a d e s se d e t a l l a n en l a s T a b l a s I y 11. -

La i n f o r m a c i ó n que p r o p o r c i o n a n e s t o s d a t o s e s t á r e l a - - c i o n a d a d i r e c t a m e n t e con l a e s t r u c t u r a d e l f l a v o n o i d e . En p r i - mer t é r m i n o se obse rva que s o l o l a s bandas que den r e a c c i o n e s c o l o r i d a s con e l r e a c t i v o de c l o r u r o f é r r i c o - f e r r i c i a n u r o de - p o t a s i o , pueden s e r c o n s i d e r a d a s como f l a v o n o i d e s (11); en con - s e c u e n c i a l a s bandas I y 11, que d i e r o n r e a c c i ó n n e g a t i v a a e s t e r e v e l a d o r , no f u e r o n c o n s i d e r a d a s p a r a l o s a n á l i s i s p o s t e - r l o r e s .

do somet idas l a s c r o m a t o g r a f f a s a vapores de amoníaco, es una c a r a c t e r í s t i c a e s p e c í f i c a de l a c l a s e de f l a v o n o i d e de que se t r a t e . Para e l c.aso de l o s compuestos d e t e c t a d o s e i d e n t i f i c a - dos como f l a v o n o i d e s , é s t o s c o r r e s p o n d e n a l o s s i g u i e n t e s g r u -

E l c o l o r observado b a j o l u z U. V . y después de haber s i

.- pos:

Compuestos 111 y 1V.- F l a v o n a s o f l a v o n o l e s s i n e l g rupo 5 - O H 11 b r e

p O

F l a v o n a F l a v o n o l

..

. .

U O c, V

L c, X W

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14

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U -I m U c

15

Compuesto V.- D i h i d r o f l a v o n o l s i n e l g rupo 5-OH l i b r e .

_.

.. K P \I O OH

D i h i d r o f l a v o n o l

Compuesto VI. I s o f l a v o n a s i n e l g rupo 5-OH l i b r e .

o . I s o f l a v o n a .

Por U P r t e , l a s c o l o r a c i o n e s d e s a r r o l l a d a s c o n el r e a c t i v o de n i t r a t o de p l a t a amon iaca l r e v e l a n l a p r e s e n c i a de u n l dades de c a t e c o l o p i r o g a l o l . Según l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s - ( T a b l a I I ) , s e deduce l o s i g u i e n t e :

- En l o s compuestos I I I y V e s t á n p r e s e n t e s un idades de p i r o - g a l o 1 :

.- P i r o g a l o l

- En l o s compuestos I V y V I e s t á n p r e s e n t e s un idades de c a t e - c o l :

Ca t e c o 1

16

.. Con r e s p e c t o a l a máx. de a b s o r c i ó n U. Y., l o s es - p e c t r o s medidos c o n s t a n ún icamen te de una banda de a b s o r c i ó n

.. mbxima, l o que es c a r a c t e r í s t i c o de i s o f l a v o n a s , f l a v a n o n a s , y d i h i d r o f l a v o n o l e s en l o s s i g u i e n t e s rangos :

i s o f 1 avonas 250 - 270 nm

f l a v a n o n a s y d i h i d r o f l a v o n o l e s 275 - 295 nm ( 4 )

P o r t a n t o l o s compuestos 111, IV .y Y p e r t e n e c e n a l g r u - PO de los d i h i d r o f l a v o n o l e s , m i e n t r a s que e l compuesto No. VI a l d e l a s i s o f l a v o n a s .

Con jun tando l o s d a t o s de R f . c o l o r a c i o n e s y A m i x . - de abs. U.V., se compararon con l o s r e p o r t a d o s en l a l i t e r a - t u r a p a r a una v a r i e d a d de f l a v o n o i d e s , p r i n c i p a l m e n t e i s o f l a - venas y d i h i d r o f l a v o n o l e s , s i n embargo no se e n c o n t r ó n i n g u - no que c o n c o r d a r a exac tamen te con l o s d a t o s de a l g u n o de l o s compuestos a i d e n t i f i c a r .

Se e n c o n t r a r o n ún icamen te y p o r separado a lo i i nos seme - j a n z a s p a r a l o s v a l o r e s de Rf en BAW ( 4 : 1 : 5 ) y máx. en me - t a n o l ; s i n embargo, é s t a s no pueden s e r c o n s i d e r a d a s como d o t o s i m p o r t a n t e s , p u e s t o que s e r í a n e c e s a r i o e n c o n t r a r cuando menos dos c a r a c t e r í s t i c a s i g u a l e s p a r a poder c o n s i d e r a r esa e s t r u c t u r a .

17

XI. METOXILACION DE FLAVONOIDES.

..

..

1. Por l a c r o m a t o g r a f í a b i d i m e n s i o n a l hecha d e l e x t r a c t o B h i - d r o l i z a d o se d e t e c t 6 l a q r e s e n c i a d e 6 manchas, de l a s c u a l e s dos e r a n v i s i b l e s a l u z normal , de c o l o r c a f é r o j i z o y l a s demás s o l o se d e t e c t a r o n b a j o l u z u l t r a v i o l e t a de onda l a r -

ga.

2. De l a s p l a c a s u n i d i m e n s i o n a l e s p r e p a r a t i v a s de l a mezc la de f l a v o n o i d e s m e t o x i l a d o s se d e t e c t a r o n 4 manchas, 2 muy c e r - canas a l p u n t o de a p l i c a c i ó n y 2 más ce rcanas a l f r e n t e d e l s o l v e n t e . Las c o l o r a c i o n e s observadas y l o s Rf son:

MANCHA No. R f COLOR. LUZ BLANCA COLOR LUZ U. V.

- 1 O. 15 Amar i 11 o Ama r i 1 1 o b r i 1 1 a n t e 2 o. 22 - A z u l b r i 11 an t e 3 0.81 - Azul b r i 1 1 an t e 4 0.84 - A z u l b r i l l a n t e

En e s t e caso no se d e t e r m i n a r o n más c a r a c t e r i s t i c a s de i d e n t i f i c a c i ó n , p u e s t o que en l a l i t e r a t u r a no e x i s t e n da- t o s de f l a v o n o i d e s comple tamente m e t o x i l a d o s , p a r a e s t a b l e - c e r una comparac ión adecuada que nos de i n d i c i o s de su es - t r u c t u r a .

3. De l a s c r o m a t o g r a f í a s en g e l de s í l i c e a p l i c a d a s en banda - se o b t u v i e r o n bás i camen te 2 f r a c c i o n e s . cada una de l a s c u g l e s c o n t e n í a dos manchas muy ce rcanas e n t r e s í -como l o i n - d ican l o s v a l o r e s de Rf- p a r a s e r separadas p o r e l método de raspado de g e l .

c o n t e n i e n d o a l a s manchas 3 y 4, p o r p r e s e n t a r l a menor po- l a r i d a d , que es l o esperado p a r a un f l a v o n o i d e completamen- te m e t o x i l a d o .

.-

Se d e c i d i 6 t r a b a j a r con l a zona más c e r c a n a a l f r e n t e ,

4:El r e s u l t a d o o b t e n i d o de l a c r o m a t o g r a f f a en columna no fue muy s a t i s f a c t o r i o , y a que s o l o se l o g r ó s e p a r a r u n compuesto no v i s i b l e en l u z normal , y b a j o l u z U.V. p r e s e n t a b a c o l o r

azu l b r i l l a n t e , p e r o se o b t u v o en una c a n t i d a d t a n pequefía.- que no f u e p o s i b l e r e a l i z a r n i n g ú n a n á l i s i s e s p e c t r o s c 6 p i c o .

18

D I S C U S I O N Y C O N C L U S I O N E S

Aún cuando l o s h a l l a z g o s de e s t e e s t u d i o no p e r m i t e n d e f i n i r c o n c r e t a m e n t e l a i d e n t i d a d de l o s compuestos a i s l a - dos. s f puede a f i r m a r s e que se l o g r ó un avance c o n s i d e r a b l e en l a d e l u c i d a c i ó n de su e s t r u c t u r a b á s i c a .

E l hecho de que no se hayan e n c o n t r a d o en l a l i t e r a t K r a compuestos c o n i d é n t i c a s c a r a c t e r í s t i c a s a l a s de l o s corn p u e s t o s 111, I V , V y V I q u i z á pueda s u g e r i r que sean compues t o s no i d e n t i f i c a d o s aún, s i n embargo cabe h a c e r n o t a r que p a r a l a mayor p a r t e de l o s f lavono id .es r e p o r t a d o s en l a li- t e r a t u r a , sus d a t o s co r responden a sus g l i c ó s i d o s , l o que h a c e d i f í c i l e s t a b l e c e r una comparac ión adecuada y l o g r a r una i d e n t i f i c a c i ó n p r e c i s a de l o s compuestos de e s t e e s t u d i o , p o r t r a t a r s e e s t o s Ú l t i m o s de a g l i c o n a s .

Se l o g r ó h a c e r una i d e n t i f i c a c i ó n p r e l i m j n a r de e s t o s compuestos s i t ú a n d o l o s d e n t r o de l a s c a t e g o r í a s o c l a s e s de f l a v o n o i d e s . Para e l l o l a e v i d e n c i a más c o n f i a b l e es l a i n f o r m a c i ó n o b t e n i d a de l o s e s p e c t r o s de a b s o r c i ó n U. V., que p o r p r e s e n t a r s o l o una banda de a b s o r c i ó n máxima, r e v e l a n que en l o s compuestos e s t u d i a d o s hay escasa o . n u l a c o n j u g a c i ó n en- t r e l o s a n i l l o s A y C. Con e l l o , y tomando e n c o n s i d e r a c i ó n en segundo t é r m i n o l a s c o l o r a c i o n e s d e s a r r o l l a d a s se puede - c o n c l u i r l o s i g u i e n t e :

.- 1. E l compuesto No. I11 es un d i h i d r o f l a v o n o l ; uno de sus a -

n l l l o s a r o m á t i c o s es un n ú c l e o p i r o g a l o l .

. 2. E l compuesto No. I V es un d i h i d r o f l a v o n o l con un n ú c l e o - p i r o g a l o l .

p i r o g a l o l . 3. E l compuesto V es tamb ién un d i h i d r o f l a v o n o l con un n ú c l e o

4. E l compuesto V I es una i s o f l a v o n a con un n l i c l e o c a t e c o l .

N inguno de e s t o s compuestos p r e s e n t a e l g rupo 5-OH li- bre.

19

Genera lmente l o s v a l o r e s de Rf y l a s r e a c c i o n e s c o l o r i das son s u f i c i e n t e s p a r a i d e n t i f i c a r f l a v o n o i d e s , no o b s t a n - t e debe a s e g u r a r s e de que l a s c o n d i c i o n e s sean c o n s t a n t e s , y no s i e m p r e es p o s i b l e r e p r o d u c i r l a s c o n d i c i o n e s en que se - r e a l i z a r o n l o s e s t u d i o s p u b l i c a d o s . A s i , l a s c a r a c t e r í s t i c a s de un mismo f l a v o n o i d e b a j o v a r i a c i ó n de c o n d i c i o n e s de e s t 1 d i o , pueden v e r s e a l t e r a d a s . Po r e l l o l a comparac ión se d i f l c u l t a más, p u e s t o que no s iempre se c u e n t a con l o s med ios o m a t e r i a l e s p a r a h a c e r u n e s t u d i o con i g u a l d a d de c o n d i c i o n e s . En t a l e s casos, l o más i n d i c a d o s e r í a u s a r un compuesto de - e s t r u c t u r a c o n o c i d a como "marcador " en e l mismo cromatograma s i e m p r e que sea p o s i b l e .

Los e s p e c t r o s U. V. o r d i n a r i o s - d e l o s f l a v o n o i d e s p r o - p o r c i o n a n i n f o r m a c i ó n i m p o r t a n t e s o b r e l a e s t r u c t u r a de l a - m o l é c u l a , s i n embargo, además de l o s e s p e c t r o s medidos en me t a n o l l o s e s p e c t r o s medidos con v a r i a c i o n e s de pH, en p r e s e n c i a de un i ó n m e t á l i c o q u e l a n t e ( e s p e c i a l m e n t e A l ) o de un - a n l d n capaz de u n i r g rupos o r t o - d i h i d r o x i , dan mucho mayor - i n f o r m a c i ó n , t a l como l a c l a s e y l o c a l i z a c i ó n de, los g rupos h i d r o x i l o , que puede s e r s u f i c i e n t e pa ra i d e n t i f i c a r un com-

..

..

p u e s t o f l a v o n o i d e ( 4 ) . Tambien es n e c e s a r i o menc ionar que o t r o s

t r o s c d p i c o s como l a e s p e c t r o s c o p i a de masas o n a g n e t i c a n u c l e a r p r o p o r c i o n a n i n f o r m a c i ó n aún de mucha u t i l i d a d en e s t u d i o s más avanzados.

P o r s u p a r t e , l a m e t o x i l a c i d n de las a g l

mente pequeiía c e r una c r i s t a t l f i c a c i ó n .

Lo a n t e r

métodos e s p e c a r e s o n a n c i a más p r e c i s a ,

conas se p r o - puso como un medio p a r a o b t e n e r un compuesto más e s t a b l e ( s i n r i e s g o de p o l i m e r i z a c i ó n ) p a r a s e r a n a l i z a d o p o s t e r i o r m e n t e por metodos e s p e c t r o s c ó p i c o s que p e r m i t k r a n d e l u c i d a r su e s t r u c t u r a c o n c r e t a . S i n embargo se o b t u v o maa c a n t i d a d suma-

e a g l i c o n a m e t o x i l a d a p u r i f i c a d a como p a r a h& i z a c i d n y l o s s u b s i g u i s a t e r a n á l i s i s de i d e n -

r e n d i m i e n t o en o r puede d e b e r s e en p r i m e r t e r m i n o a un b a j o l a r e a c c i d n de m e t o x i l a c i b n . y a que p a r a e s t o s

20

compuestos se e s p e r a r í a una p o l a r i d a d muy b a j a , con v a l o r e s de Rf a l t o s , y l a p r e s e n c i a en l a s c r o m a t o g r a f f a s p r e p a r a t i - vas de manchas con R f muy b a j o s , i n d i c a que una p a r t e c o n s i - d e r a b l e de l a mezc la de f l a v o n o i d e s no se m e t o x i l ó o s o l o - p a r c f a lmen t e .

En consecuenc ia l a r e a c c i ó n de m e t o x i l a c i ó n debe s e r - e x h a u s t i v a , a d i c i o n á n d o s e e l d iazometano un mín imo de 3 ve- c e s s o b r e l a misma m u e s t r a de f l a v o n o i d e s , con un p e r i o d o de 8 a 24 h o r a s de r e p o s o e n t r e cada a d i c i ó n , y a que aunque e l d iazometano es en g e n e r a l un buen r e a c t i v o p a r a l a m e t i l a c i ó n de g rupos h i d r o x i l o en f l a v o n o x i l o d e l C - 5 , se r e q u i e r e que c o n un exceso de r e a c t i v o ( 8 ) . l a c i d n s e g u i d o en e s t e e s t u d i o r a de r e a c c i ó n no rebase l o s 5

des, con e x c e p c i ó n d e l h i d r o - os f l a v o n o i d e s sean t r a t a d o s Además - en e l método de m e t o x i

se s u g i e r e que l a t e m p e r a t u - C. Siendo l a t e m p e r a t u r a un -

f a c t o r que i n f l u y e de manera i m p o r t a n t e en l a c i n é t i c a de una r e a c c i ó n qu ím ica , l a b a j a t e m p e r a t u r a en e s t e caso a f e c t ó n e g a t i v a m e n t e a l d e s a r r o l l o de l a r e a c c i ó n .

O t r o p u n t o i m p o r t a n t e a c o n s i d e r a r es que l a s a g l i c o - nas m e t o x i l a d a s deben s e r somet idas a una p u r i f i c a c i ó n p r e - v i a a l a c r o m a t o g r a f í a en columna. En e s t e caso se p r o c e d i ó a l a s e p a r a c i ó n p o r raspado de l a s i l i c a g e l de l a c r o m a t o g r g f í a en capa f i n a , s i n embargo pueden u t i l i z a r s e o t r o s métodos, como l a s e p a r a c i ó n de l a s a g l i c o n a s d e l med io de r e a c c i ó n p o r med io de s o l v e n t e s , que p o d r í a n s e r más e f e c t i v o s y r e p r e s e l l t a r menor p é r d i d a de m a t e r i a l .

- A s 1 pues, l o s l o g r o s de e s t e e s t u d i o además de p e r m i -

t ir h a c e r una c l a s i f i c a c i ó n de l o s f l a v o n o i d e s p r e s e n t e s en D i o o n e d u l e y r e v e l a r a l g u n a s c a r a c t e r í s t i c a s de su e s t r u c t g r a , p r o p o r c i o n a n i n f o r m a c i ó n i m p o r t a n t e de l o s métodos a se- g u i r en e s t u d i o s p o s t e r i o r e s s o b r e e s t e mismo tema.

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E S P E C T R O S

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