Outline Lecture 3

1. Advantages/Disadvantages of Monoclonal Antibodies

2. Types of Monoclonal Antibodies

www.ajahntechno.wordpress.com

ขอ้ดี Monoclonal Antibodies

• ใช ้Ag น้อย และมคีวามบรสิทุธิพ์อประมาณในการฉีดกระตุ้น เนื่องจากสามารถเลือกเซลล์ท่ีมคีวามจำาเพาะเจาะจงต่อ Ag ท่ีต้องการได้ในระหวา่งการทำา cell cloning ในการฉีดกระตุ้นหนู สามารถใช ้ Ag ประมาณ 100 micrograms หรอืน้อยกวา่ก็ได้

• ในแต่ละครัง้ท่ีผลิต สามารถผลิต monoclonal antibodies ท่ีมีลักษณะเหมอืนกัน (homogeneous) เป็นมาตรฐาน (Standardization) และในปรมิาณท่ีต้องการไมจ่ำากัดได้

• เซลล์ท่ีสรา้ง monoclonal antibodies สามารถเก็บไวเ้ป็นเวลานานเป็นปีๆ ในสารละลายไนโตรเจนเหลว และนำากลับมาเลี้ยงเพื่อผลิต monoclonal antibodies ได้อีก

Cryopreservation เปนเทคนิคท่ีใชในการเก็บรกัษาเซลลหรอืเน้ือเยื่อของสิง่มชีวีติ ทัง้เซลลของมนุษย สตัว พชืและเชื้อจุลินทรยีตางๆ ภายใตสภาวะอุณหภมูท่ีิเยน็จดั (Ultra low temperature) - เก็บรกัษาเซลลหรอืเน้ือเยื่อใหไดเป็นระยะเวลานาน (Long

term preservation) - หลักการของเทคนิคนี้ คือ การทําใหน้ําภายในเซลลเปล่ียน

สถานะไปเปนของเหลวหนืด ไมผ่านขัน้ตอนการเปนผลึกนํ้าแขง็ ซึ่งผลึกนํ้าแขง็ดังกลาวน้ีจะมผีลทําให Viability ของเซลลลดลง โดยใชสาร Cryoprotective agent เป็นตัวชว่ย- ป้องกันไมใหเกิดผลึกนํ้าแขง็ขึ้นภายในเซลล เมื่อทําการลด

อุณหภมูขิองเซลลตํ่าลงไปจนถึงจุดวกิฤต(Critical point) คือ -135 องศาเซลเซยีส เซลลก็จะกลายเปนของแขง็มลัีกษณะเหมอืนแกว และสามารถเก็บรกัษาเซลลไดนานถึง 20 ป

Cryoprotective agents- ลดปัญหาการเกิดเซลล์หดตัว ในชว่งการลดอุณหภมูลิง- ลดการแตกตัวของสารละลาย ท่ีเกิดจากการแขง็ตัวในชว่งท่ีลดอุณหภมูลิง- ลดการเกิดผลึกนํ้าแขง็ขึ้นภายในเซลลสารเคมท่ีีนิยมนํามาใชเป็น Cryoprotective agent   เชน่ DMSO, polyvinylpyrrolidone, Dextrans, Glycols และ glycerol เป็นต้น

• มคีวามจำาเพาะสงูมาก (High Specificity) โดย monoclonal antibodies จะเขา้ทำาปฏิกิรยิากับ antigenic determinant (epitope) เพยีงตำาแหน่งเดียวบนโมเลกลุของ Ag ดังนัน้ monoclonal antibodies จงึสามารถใชจัำาแนกสายพนัธุข์องเชื้อจุลินทรยี์หรอืศึกษาลักษณะของโมเลกลุของ Ag ได้

• ม ี affinity สงูต่อ Ag เนื่องจาก monoclonal antibodies ม ี affinity สงูนี้จะสามารถถกูใชใ้นลักษณะท่ีมคีวามเขม้ขน้ตำ่า จงึทำาให้ลดปฏิกิรยิารบกวน (background) ในการทดลองลงได้

ขอ้เสยี Monoclonal Antibodies

- การผลิต monoclonal antibodies มกีรรมวธิท่ีีค่อนขา้งยาก ซบัซอ้น ต้องใช้เวลา และ ค่าใชจ้า่ยแพงกวา่การผลิต polyclonal antibodies

- เนื่องจาก monoclonal antibodies ม ี ความจำาเพาะสงูมากจงึมคีวามไวต่อการเปล่ียนแปลงโครงสรา้งของ Ag ท่ีเกิดขึน้ระหวา่งท่ี Ag เกาะกับพื้นผิว (solid phase) หรอื สภาวะท่ีใชใ้นการทำาการทดลอง

- เนื่องจาก monoclonal antibodies ในบางชนิดมคีวามไวต่อการเปลี่ยนแปลงของ pH, ionic strength และสิง่แวดล้อมอ่ืนๆ จงึทำาให้ monoclonal antibodies เกิดการเปลี่ยนแปลงได้ง่ายในระหวา่งการทำาให้บรสิทุธิ์

- monoclonal antibodies หลายชนิดไมส่ามารถทำาปฏิกิรยิาบางอยา่งเชน่ปฏิกิรยิาการตกตะกอน (Precipitation) ได้

The Ag must have at least two copies of the same epitope, or have different epitopes that react with different antibodies present in polyclonal antisera

The Chimera composed of the parts of three animals — a lion, a snake and a goat. Usually depicted as a lion, with the head of a goat arising from its back, and a tail that ended in a snake's head

Types of Monoclonal Antibodies (Mabs)

monkeys used for immunization are the source of the variable domains.

เป็นวงศ์ยอ่ยของสตัวฟ์นัแทะ

The more human the antibody is, the less likely it will generate an immune response and the more utility it has for chronic (repeat) therapy.

Types of mAbs

Blue denotes human component

Orange murine component

โมโนโคลนอลแอนติบอดี ถือเป็นสารท่ีพฒันาด้วยวธิกีารทางวศิวพนัธุ ศาสตร์ แบง่เป็น 1. chimeric antibody ซึ่งเกิดจากการตัดต่อพนัธุกรรม DNA ของมนุษยแ์ละหนู

(murine) โดยมสีดัสว่นท่ีมาจากมนุษย์ 65-90% 2. humanized antibody ซึ่งมสีดัสว่นท่ีมาจากมนุษย์95% 3. fully human antibody      เป็นสว่นของมนุษยทั์ง้หมด ซึ่งการยิง่ทําใหแ้อนติบอดีท่ีได้ใกล้เคียง

  กับมนุษยม์ากเท่าใด ก็จะลดปัญหาการเกิดปฏิกิรยิาการแพไ้ด้มากเท่านัน้ โมโนโคลนอล แอนติบอดี เหล่า น้ี จะเหน็ epitobe เดียวเท่านัน้ จะไมไ่ปจบักับเซลล์อ่ืนท่ีไมต้่องการอีก ทําใหเ้กิดความจาํเพาะเจาะจงต่อ

การออกฤทธิข์องยามากขึ้น จงึถือเป็นกลุ่ม โมเลกลุาทารเ์ก็ต (molecular target) คือ ออกฤทธิจ์ำาเพาะ ต่อโมเลกลุ ซึ่งโมเลกลุาทารเ์ก็ตท่ีดีในการรกัษามะเรง็ นัน้ ควรมคีณุสมบติัดังต่อไปนี้ 1. มคีวามจาํเพาะ

ต่อเซลล์มะเรง็ ดังนัน้ควรศึกษาใหท้ราบถึงเฉพาะเซลล์มะเรง็ จะพบตัวรบัแบบน้ีเท่านัน้ ซึ่งหาไมเ่จอในเซลล์ปกติ2. มผีลตอบสนองต่อการรกัษาเมื่อนํามาใชจ้รงิ

First Generation: Murine MAbs Derived from mice

Patients treated with murine mAbs develop a human anti-

mouse antibody (HAMA) response

Rapid clearance of the mAb

Hypersensitivity reactions

Adverse events serum sickness or anaphylaxis Ibritumomab Tositumomab

17

The HAMA response is essentially an allergic reaction: a mild form, like a rash, to a more extreme and life-threatening response, such as renal failure.

Origin

Second generation

DNA technology or genetic engineering used to

construct hybrids composed of human Abs regions

with murine

Chimeric Abs

Humanized Abs

Human Abs

19

PROBLEMS

• HAMA Response.

• Loss of effector functions.

• Production of human Mab.

• Make mouse Ab more “human-like”

SOLUTIONS

Chimeric Abs

Antigen binding parts (variable region) of mouse Ab with effector parts (constant region) of human – Infliximab– Abciximab – Rituximab

22

CHIMERIC HUMAN/MOUSE

FR1 FR2 FR3 FR4CDR1 CDR2 CDR3

CONSTANT

CONSTANT

CONSTANTFR1 FR2 FR3 FR4CDR1 CDR2 CDR3

Mouse

Human

Chimeric

Humanized

Human Ab with complimentary determining region

(CDR) or hypervariable region from non-human source– Daclizumab– Trastuzumab

25

HUMANIZED ANTIBODIES

FR1 FR2 FR3 FR4

CDR1 CDR2 CDR3

CONSTANT

CONSTANT

CONSTANTFR1 FR2 FR3 FR4CDR1 CDR2 CDR3

Mouse

Human

Humanized

Human AbsRecombinant DNA technology:

Genes for variable Fab portion of human Abs is

inserted in genome of bacteriophages & replicated

Mixed with Ag & complementary Ab producing

phages selected

e.g. Adalimumab

27

เทคนิค “ ”ฟาจดิสเพลย์ (Phage Display Technology)

คือการนํายนีท่ีเก็บรหสัการสรา้งโมเลกลุแอนติบอดีจากลิมโฟซยัท์บขีอง คนมาเชื่อมต่อกับพนัธุกรรมของไวรสั (ฟาจ) ของแบคทีเรยีชนิด อี. โคไล

เมื่อนําไวรสัหรอืฟาจท่ีมพีนัธุกรรมของลิมโฟซยัท์บไีปเล้ียงในแบคทีเรยี ชนิด อี. โคไล แบคทีเรยีจะผลิตฟาจท่ีมลิีมโฟซยัท์บอีอกมา ทําใหฟ้าจมี

สภาพเหมอืนลิมโฟซยัท์บี ซึ่งสามารถเพิม่จำานวนในแบคทีเรยีได้อยา่งไม่จำากัดในชว่งเวลาขา้มคืน “ซึง่เรยีกวา่เป็น คลังฟาจสำาหรบัผลิต

” แอนติบอดีของคน หรอืระบบฟาจดิสเพลย์ (Human antibody phage)

http://www.crucell.com/Technology%20-%20Antibody%20Technology%20-%20History

ประโยชน์ของเทคโนโลยกีารแสดงโปรตีนบนผิวฟาจเพื่อการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดี

1. . การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีด้วยเทคโนโลยฟีาจ สะดวก และประหยดักวา่   การใชเ้ทคนิคดัง้เดิม เพราะใชเ้วลาน้อยกวา่ ใชเ้งินน้อยกวา่ ใชแ้รงงานและความ

  ชาํนาญน้อยกวา่ และขอ้สาํคัญคือไมต้่องใชส้ตัวท์ดลอง

2.     สามารถใชก้ับแอนติเจนได้หลากหลายชนิดกวา่ เพราะสามารถใชก้ับแอนติเจนท่ีเป็น พษิต่อสตัว์ แอนติเจนที่คล้ายกับโปรตีนในสตัวท์ดลอง หรอือาจใชเ้ซลทัง้เซลเป็น

  แอนติเจนก็ได้ นอกจากนัน้แล้วยงัสามารถใชก้ับแอนติเจนที่ไมส่ามารถกระตุ้นระบบ ภมูคิุ้มกันของสตัวไ์ด้ (non-immunogenic antigen)

3.       สามารถประยุกต์ใชใ้นการสรา้งแอนติบอดีที่มคีณุสมบติัเหมอืนของคน(humanized antibody) เพื่อใชใ้นการรกัษาโรค (therapeutic antibody)

4.       สามารถปรบัปรุงใหม้คีณุสมบติัเปล่ียนไปตามต้องการ เชน่มคีวามสามารถในการ จบั หรอืความจาํเพาะเจาะจงสงูขึ้น หรอืทนต่อสภาวะต่างๆ

5.      สามารถนําไปผลิตเป็นจาํนวนมากได้ง่าย ด้วยเทคนิคการเพาะเล้ียงแบคทีเรยีโดย ทัว่ไป เพื่อใชใ้นการผลิตในระดับอุตสาหกรรม

http://www.sut.ac.th/iat/biotech/montarop/phd/ฟาจแอนติบอด.ีhtm