R

ProtocolVA CRYO KITO

[ 卵巣組織 ガラス化法 ]

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Vitrification

・ Ova Cryo Kit ( Ref. 82212 Code. VT301S)・ Ova Cryo Device Type M ( Ref. 81213 Code. ODT x 10 )・ Modified HTF medium with 10% Human Serum Albumin・ ディッシュ ( 外径 60mm ～ 100mm ) x 5・ 1mm シリンジと 21G 注射針 x 5セット・ ハサミ メモ : 先端がカーブしている剪刀と、ストレートの剪刀の２種類を用いることで、卵巣の処理作業が効率的に行えます。・ 曲がりピンセット ( 約 12cm )・ ピンセット ( 約 20cm ) x 2・ メス ( ブレード No. 10 )・ 滅菌ガーゼ・ 滅菌ドレープ : クリーンベンチカバーとして使用・ タイマー・ 液体窒素とコンテナ ( 発泡スチロール等 )・ ケーン ( C-2 ケーン )

【 Method 2 の器具 】・ スクエアメジャー・ ハンドル付きマイクロトーム

卵巣組織 凍結保存の手順

卵巣組織の採取 平衡化 ガラス化 冷凍保存

用意するもの

　　・Cryo 1: 20 mL x 1　　・Cryo 2: 20 mL x 1　　・Cryo 3: 20 mL x 1

Ova Cryo Kit ( Ref. 82212 Code. VT301S )

Ova Cryo Device Type M ( Ref. 81213 Code. ODT x 10 )

使用製品

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OVA CRYO KIT

STEP 1 製品準備

STEP 2 摘出した卵巣の断片化処理

摘出卵巣を生理食塩水で洗浄し、余分な血液を洗い流します。1.卵胞を注射針で穿刺し、シリンジで卵胞液を吸引します。

メモ : 採取した未熟卵は、IVM で成熟卵に培養後に凍結します。 回収した成熟卵は、卵子凍結もしくは体外受精に用います。

2.

※mHTF ( modified HTF medium + 10% Human Serum Albumin )を用いて卵巣が乾燥しないように 注意しながら次の手順を行います

Method 1

卵巣赤道面に沿い、ハサミで切り込みを入れ、卵巣を切り開きます。 この際、卵巣赤道部に小さな切り込みを入れたら、その部分にハサミの先端を入れ、ハサミを卵巣内部で開き切開します。この手順を卵巣の赤道部を一周するまで繰り返します。

卵巣赤道部に沿い、卵巣を開きます。卵巣は片方ずつ処理していきます。処理しない卵巣は乾燥しないよう、mHTFに浸漬させます。

切り開いた卵巣の髄質部分をハサミで除去し、皮質のみをガラス化に用います。ピンセットで髄質をやさしく押さえ、髄質をハサミで切除します。皮質が 1mm になるまでこの作業を繰り返します。この作業は mHTF 内で行ってください。

メモ : 先端がカーブしているハサミを用いると、切除しづらい髄質部の処理が容易です。メモ : すくいあげるようにハサミを入れ、切り取っていくイメージで進めてください。 焦らず十分に時間をかけ、少しずつ切り取っていきます。

皮質のみになった卵巣を、メスを用いて 1cm × 1cm に細切します。

メモ : 卵巣の辺縁の髄質は卵巣組織を細切後、除去します。

1.

2.

3.

4.

・Cryo1、Cryo2、Cryo3 を室温 ( 25 ～ 27℃ )に戻します。・ディッシュを「Cryo1」、「Cryo2」、「Cryo3」と識別できるよう油性ペンで記載、もしくはラベルを貼り、 各ディッシュに該当する液を全量入れます。

卵巣赤道面

4

Vitrification

スクエアメジャー A スクエアメジャー B

Method 2

メソッド1を推奨しますが、卵巣皮質の処理が困難な場合は、スクエアメジャーの使用が可能です。この手順は処理が容易ですが、最終的に細切される卵巣組織の数と獲得卵子数が減少する可能性があります。

スクエアメジャーは２つのパート、 A と B で構成されます。

卵巣表面の余分な水分を滅菌ガーゼで拭き取り、スクエアメジャーが滑らないようにします。

卵巣表面にスクエアメジャー A の金属突起を左上になるように乗せます。

スクエアメジャー A の内側に沿って切り目を入れていきます。

1.

2.

3.

スクエアメジャー B をスクエアメジャー A に取り付け、卵巣表面に押し付けます。マイクロトームの刃をスクエアメジャー A と B の間に挿入し、金属突起まで切り進めます。

スクエアメジャーを外し、細切した卵巣皮質を mHTF に浸漬し、乾燥を防ぎます。

スクエアメジャーで細切した卵巣皮質を、ハサミを用いてさらに薄くすることで、厚さを均等 ( 1mm ) にします。

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6.

※mHTF ( modified HTF medium + 10% Human Serum Albumin )を用いて卵巣が乾燥しないように 注意しながら行います。

※ 必ず ＃ の形に切り目を入れてください

TIP

卵巣

スクエアメジャー A

スクエアメジャー A 卵巣

スクエアメジャー A

卵巣

スクエアメジャー A

スクエアメジャー B

5

OVA CRYO KIT

STEP 3 卵巣皮質の平衡化

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細切した卵巣組織をガーゼで拭き、Cryo1 に移します。Cryo1 では卵巣組織を５分浸漬させます。

Cryo1 の卵巣組織の余分な液を、ディッシュの縁で取り除き、Cryo2 に移します。Cryo2 では、卵巣組織を５分浸漬させます。

Cryo2 の卵巣組織の余分な液を、ディッシュの縁で取り除き、Cryo3 に移します。Cryo3 では、卵巣組織を１５分浸漬させます。

平衡化の待ち時間に、ODT 及び液体窒素の準備を行います。

※ 複数の卵巣組織を同時に Cryo1, Cryo2, Cryo3 で処理することが可能です。

1.

2.

3.

4.

Cryo 1

5 分 5 分 15 分

Cryo 2 Cryo 3

6

Vitrification

STEP 4 卵巣皮質のガラス化保存

細切した卵巣組織の片数分の ODT を準備し、患者の ID を ODT のバイアル上に記載します。

卵巣皮質をガーゼで拭き、卵巣組織の表面積が最大になるよう広げ、ODT の上に乗せます。卵巣組織は ODT の金属先端部寄りに置くようにし、金属部分が埋め込まれているキャップの根本は避けます。キャップから 5mm 程度開けて卵巣を置いてください。

ODT のキャップ部分をピンセットで掴み、液体窒素に素早く投入します。

1.

2.

3.

メモ : 卵巣組織を乗せた面から ODT を液体窒素に投入するようにしてください。 ODT から組織がはがれてしまうのを防ぎます。

メモ : 液体窒素内で、卵巣組織が ODT より剥がれてしまった場合は、 まずは卵巣組織を ODT バイアル部分に入れ、そのままキャップで蓋をします。

メモ : ODT を液体窒素に投入後ゆっくりと振り、周りの空気を振り切るようにガラス化します。

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Thawing

用意するもの

Ova Thawing Kit ( Ref. 82222 Code. VT302S )

卵巣組織 融解手順

卵巣組織の融解 希釈と洗浄 移植 / 培養

　　・Thaw 1: 100 mL x 1　　・Thaw 2: 20 mL x 1　　・Thaw 3: 20 mL x 1

・ Ova Cryo Kit ( Ref. 8222 Code. VT302S )・ 液体窒素とコンテナ ( 発泡スチロール等 )・ ウォーターバス・ ディッシュ ( 外径 60mm ～ 100mm ) x 2・ コンテナ ( 110mL / 4.5 oz. )・ ピンセット ( 約 12cm ) : 卵巣組織の希釈、洗浄用・ ピンセット ( 約 20cm ) : 融解手順用・ タイマー・ Modified HTF medium with 10% Human Serum Albumin・ 滅菌ドレープ : クリーンベンチカバーとして使用

使用製品

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OVA CRYO KIT

製品準備

融解STEP 2

STEP 1Thaw1 全量をコンテナに入れ、ウォーターバスで３７℃に温めておきます。

Thaw2 、Thaw3 は室温 ( 25 ～ 27℃ ) に戻します。

ディッシュを「 Thaw1 」、「 Thaw2 」と識別できるよう油性ペンで記載、もしくはラベルを貼り、各ディッシュに該当する液を全量入れます。

液体窒素は、ウォーターバスのすぐ隣に設置します。これは空気に触れる時間をできるだけ短くすることで、急速に融解をするためです。

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4.

ピンセットを使用し、液体窒素中で ODT のキャップ部分をねじり、バイアル部分を外します。ODT に卵巣片が在ることを確認します。

ODT をウォーターバスで温めた３７℃の Thaw1 へ素早く移動します。Thaw1 内で ODT を振るように動かし、卵巣が剥がれたら、すぐに ODT を取り出してください。Thaw1 では卵巣組織を１分浸漬させます。

メモ : Thaw1 に浸すのは ODT の金属部分までとし、温めた Thaw1 の温度を必要以上に下げないよう気をつけます。

卵巣組織を Thaw1 から室温の Thaw2 に移し、３分浸漬させます。

卵巣組織を Thaw2 から Thaw3 に移し、５分浸漬させます。

1.

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4.

Thaw3 で５分浸漬させた後、回復培養を行い移植手術に移行します。

1分 , 37℃

Thaw 1

3 分 5 分

Thaw 2 Thaw 3

Cryo 1

Cryo 2

Thaw 1

Thaw 2

Thaw 3

5分

3分

5分

5分

Cryo 3

15分

1分, 37℃

移植 / 培養

Ova Cryo Kit

Protocol

Ovarian Tissue Vitrification

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