KJB220

Jurkat celler(T-lymfocytter)

HL60 celler(Myeloide celler)

HeLa celler(Cervix celler)

RNA isolering

RT: cDNA-syntese med revers transkriptase

Kvantitering av spesifikke mRNAs

Forsøk 1

Forsøk 2

Forsøk 3

±RT for å sjekke kvaliteten av RNA

Test av referanse-mRNA (husholdningsgen)

PP1

Test av celletype- spesifikk mRNA

c-myb

Real-timePCR

Lightcycler

Oversikt over oppgaven

KJB220

Ulike mønstre av mRNA uttrykk

Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA Noen er de samme i alle celler og

blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener)

Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener).

I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse

mRNA mRNA

cDNAcDNA

Referanse UkjentKvantitering

KJB220

The quantitative assay - step by step

Primer design RNA isolation cDNA synthesis Set up of the experiment Programming and running the LightCycler Optimizing the PCR reaction Interpretation of the results Troubleshooting

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Stage 1: Primer design

1

2

3

4

5

6

7

8

Length: 18-24 bp Try to make the two primers equal in length

GC content: Between 40% and 60% with equal GC content in both primers Avoid an unbalanced distribution of G/C and A/T-rich domains

Sequence: 3´-region most important, free of secondary structures, repetive sequences,

palindromes, and highly degenerate sequences Last 5 nucleotides should contain no more than 2 G/C

Melting temperatures Tm = temp at which 50% of the primer-target hybrids are single stranded. Depends on primer sequence and buffer composition Tm between 55-65oC, primers used together should have similar Tm value

KJB220

2. step: RNA isolation

Several methods GTC metoden Trizol metoden Ulike kommersielle kit

Kits for cultured cells 5 x 106 cells/prep, expected yield: 10-20 ug/ 106

cells

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Arbeid med RNA er krevendepga RNA lett degraderes RNA er et labilt molekyl

som lett degraderes Pga 2´-OH som deltar i degraderings-

mekanismen Pga RNAser som finnes overalt

(fingre etc) og som er svært robuste enzymer (noen tåler koking).

RNA er derfor langt mer ustabilt enn DNA

I cellene er mRNA beskyttet dels med ende-modifikasjoner, dels via assosiasjon med protein

Arbeid med RNA krever derfor særlig forsiktighet

capAAAAAAAAAAAAA

Pre-mRNA(hnRNA)

mRNA

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Tiltak for å unngå RNA degradering

Unngå RNaser (allestedsnærværende) Bruk hansker (men ha ikke blind tiltro til hvor effektive de er) Løsninger behandles med DEPC (diethylpyrocarbonate) Bruk RNase-frie rør og pipettespisser (helst med filter) Elektroforesekar behandles med H2O2

Glass og metall varmebehandles: 180 oC minst 8 timer

Bruk RNase inhibitorer DEPC (diethylpyrocarbonate) er et reaktivt alkyleringsagens Vanadyl ribonucleoside komplekser - ikke-kovalent inhibitors, må

fjernes før RNA skal brukes videre pga inhibering av polymeraser Protein inhibitorer - et ca 50 kDa cytoplasmatisk inhibitor protein

isolert fra placenta binder sterkt til og inhiberer mange Rnaser (kommersielle navn: RNasin, prime inhibitor etc)

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Inhibitorer av Rnaser - DEPC

DEPC (diethylpyrocarbonate) DEPC er et reaktivt alkyleringsagens som inaktiverer RNaser

i buffere og på glassutstyr. Modifiserer Histidine grupper med ethoxyformyl DEPC reagerer med RNA og protein generelt, og kan derfor

ikke brukes under isolering. Inaktiveres raskt i vann (halveringstid ca 10 min ved pH 7) og

omdannes til CO2 og etanol. Bør ikke brukes sammen med Tris.

Bruk: 0.1% DEPC i vann overnatt ved rom temp (eller 1 time 37oC) etterfulgt av vask med DEPC-behandlet vann og autoklavering

1

2

3

4

5

6

7

8

C-CH2-CH3

C-CH2-CH3

O

O

O

KJB220

Hvordan isolerer vi RNA? Kit for RNA isolering

The Absolutely RNATM RT-PCR miniprep kit

Prinsipp Celler lyseres i nærvær av guanidin

thiocyanat, en av de sterkeste kjente protein denaturanter, som inaktiverer Rnaser

Pre-filter spin fjerner partikler og noe DNA

RNA blir absorbert til en silika-basert fiber-matriks i nærvær av høye konsentrasjoner chaotropiske salter (mens kontaminanter vaskes ut).

KJB220

Hvordan isolerer vi RNA?

Prinsipp forts. Vask med lav-salt buffer Rester av DNA fjernes med DNase

behandling Videre vask fjerner protein og rester

av DNase Høy-renset RNA isoleres i et lite

volum ved eluering med en buffer med lav ionestyrke og samles opp i mikrosentrifuge-røret

Renset RNA Har lavere DNA-innhold enn mange

metoder Er derfor velegnet for RT-PCR og

real-time PCR analyser

KJB220

3. step: cDNA synthesis Omdanning av mRNA til cDNA

Ulike kommersielle RT-enzymer Omniscript RT-kit (Qiagen) Kit from Roche: Master RNA

Cybergreen Superscript (Life Technol.)

1

2

3

4

5

6

7

8

mRNAoligo dT

RT: Reverse transcriptase

cDNA

mRNA

5´3´5´ 3´

Templat forReal-time PCR

capAAAAAAAAAAAAA

mRNA

KJB220

Reaction mix for the LightCycler

Template DNA cDNA from 50 ng total RNA, diluted 1:10 or 1:50

Primers 0.3-1.0 uM of each primer

MgCl2 1-5 mM

Nucleotides, Taq PCR buffer, Taq DNA Polymerase Included in the LightCycler DNA Master SYBR Green I

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Samples to run

A series of dilutions are made to construct a standard curve for target gene Using a subclone of the target

Sample (cDNA) with primers for target gene In the form of cDNA made from the isolated RNA

Sample (cDNA) with primers for housekeeping genes for normalization purposes

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Standard curve

Use at least 3 concentrations for a standard curve

Use serial dilutions that are one order of magnitude apart _ 1:10, 1:100, 1:1000,...

For medium and high concentrations, a single point per concentration is sufficient

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Programming the Lightcycler

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Programming the Lightcycler

Preincubation Denaturation Amplification

Denaturation, annealing (primer dependent), elongation (bp/25 sec), cycle number (may be increased during run)

Melting curve Primer dependent, 5-10 higher than the primer annealing temp

Cooling Edit samples

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Optimization - an important step

Finding optimal MgCl2

Find conc (1-5 mM) that gives best crossing point, signal intensity and slope

Annealing temperature? Try to design primers with similar Tm, allows standard conditions of

annealing temp

Controls - positive and negative Always include a NTC (non template control, here water) to see

primer-dimers Also include a positive control to see that the reaction works

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

1

2

3

4

5

6

7

8

Optimizing PCR conditions

Template dilution Use dilution that gives crossing points in the 20-30 range

Programming Annealing temp, elongation time

Improve your primer design? If difficult to optimize, order new primers (much cheaper than long

optimalization experiments)

KJB220

Interpretation of the results

Quantification by one or several standard curves

Ratio: target gene/housekeeping gene in each sample Assumption: housekeeping gene expression = constant in the

samples Normalisation of the total cDNA using constitutively expressed

housekeeping genes

1

2

3

4

5

6

7

8Jurkat/Myb = 2.351

Jurkat/PP1

HeLa/Myb = 0.107

HeLa/PP1

KJB220

Interpretations of the results

Evaluation Parameters Error < 1 r = -1.00 Slope

Melting curve analysis Primer dimers Expected melting point

Calculations

E = 10 -1/slope

E = 10 -1/-3.407

= 1.97

Jurkat/Myb = 2.351

Jurkat/PP1

HeLa/Myb = 0.107

HeLa/PP1

22 fold

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Troubleshooting:Problem 1: primer dimers

Primer-dimers interferes with quantitation LC with SYBR-green measures all DNA produced Primer-dimer is a template-independent product that also

produces fluorescence

Identifying primer-dimers: melting curve analysis Pure, homogenous PCR products produce a single, sharply

defined melting curve with a narrow peak. Primer dimers melt at relatively low temperatures and have broader peak

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

How to avoid primer/dimers?

General approaches Reduce delays in workflow Optimize primers - may be more important with LC than in conventional

PCR Increase the annealing temperature Reduce annealing time to 1-5 sec. Use hot start

inactive modified enzyme/Ab-bound enzyme that becomes activated after heat exposure

LC-specific approaches Increase the temperature for fluorescence registration Use of hybridization probes rather than SYBR-green Reduce number of cycles, e.g. to 40.

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Problem 2: RNA contaminated with genomic DNA

Identify by running ± reverse transcriptase, compare Cps

Traces of genomic DNA will work as templates interfering with quantitation, may reduce reproducibility

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

How to avoid problems with genomic DNA?

Always include a DNase I purification step in the RNA isolation procedure Included in the kit used here

Always run a ±reverse transcriptase reaction to check the quality of the RNA Used as the first experiment here

1

2

3

4

5

6

7

8

KJB220

Jurkat celler(T-lymfocytter)

HL60 celler(Myeloide celler)

HeLa celler(Cervix celler)

RNA isolering

RT: cDNA-syntese med revers transkriptase

Kvantitering av spesifikke mRNAs

Forsøk 1

Forsøk 2

Forsøk 3

•±RT for å sjekke kvaliteten av RNA

•Test av referanse-mRNA (husholdningsgen)

• PP1

•Test av celletype- spesifikk mRNA

•c-myb

Real-timePCR

Lightcycler

Mandag

KJB220

Jurkat celler(T-lymfocytter)

HL60 celler(Myeloide celler)

HeLa celler(Cervix celler)

RNA isolering

RT: cDNA-syntese med revers transkriptase

Kvantitering av spesifikke mRNAs

Forsøk 1

Forsøk 2

Forsøk 3

•±RT for å sjekke kvaliteten av RNA

•Test av referanse-mRNA (husholdningsgen)

• PP1

•Test av celletype- spesifikk mRNA

•c-myb

Real-timePCR

Lightcycler

Tirsdag

KJB220

Ulike mønstre av mRNA uttrykk

Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA Noen er de samme i alle celler og

blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener)

Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener).

I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse

mRNA mRNA

cDNAcDNA

Referanse UkjentKvantitering

KJB220

Criteria for single standard curve

Equal Efficiency Required for Accurate Analysis

Prerequisite: EfficiencyStandard = EfficiencyTarget

Efficiency depends on:

- fragment length - advantage with short PCR-products (100-200 bp)

- intervening sequence

- spacing RT primer to PCR primer - advantage to design primers in the 3´-part of the gene

KJB220

Prerequisites of a suitable housekeeping gene RNA-specific detection

pseudogene free amplification / detection specific for active target

No regulation of expression level in the system analysed normal vs. tumor tissue unstimulated vs. stimulated cells

Similar expression level compared to the target analysed

KJB220

Housekeeping Genes

ß-actin multigene family; > 20 genes; 1 active locus : hormones of tyroid gland20 pseudogenes : stomach tumor

-actin multigene family; pseudogenesGAPDH multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse : lung, pancreatic, colon cancer

mostly pseudogenes : insulin, EGF5.8S,18S, 28S RNA pseudogenesß2-microglobulin no pseudogenes : Non-Hodgkin lymhoma

abnormal expression in tumorsG6PDH no pseudogenes : kidney, stomach tumor

: hormones, oxidant stress, growth factors

PBGD no pseudogenesaldolase pseudogenesHPRT pseudogenesU3, U8, ... Pseudogenesornithin : tumorsdecarboxylase...

Gene Genomic structure / pseudogenes Regulation e.g.