p53, ALTERACIONES CROMOSOMICAS, TABAQUISMOY ARSÉNICO EN CÁNCER DE VEJIGA

Rey, OmarRey, OmarSambuelli RubenSambuelli RubenGuidi, AndrésGuidi, AndrésGómez SilviaGómez SilviaMoore, LeeMoore, LeeSmith, AllanSmith, Allan

Introducción:Estudios previos demostraron que tabaquismo y exposición exposición al arsénicoal arsénico en el agua de beber son factores de riesgo para cáncer de vejiga.

La exposición al arsénico arsénico inorgánico como agente cancerígeno está demostrada en varios cánceres humanos, incluído el urotelial vesical y es un grave problema de salud pública.

El mecanismo y dosis a los cuales el As provoca cáncer no está bien claro.

No hay datos que comparen genéticamente los cánceres relacionados con el arsénico respecto a los no relacionados.

Estudios genéticos comparando tumores de individuos expuestos y no expuestos al As pueden proveer datos sobre el mecanismo de estos cánceres inducidos químicamente.

La MUTACION DEL GEN de p53 se cree que es

un mecanismoclave de la inactivación genética.

p53 está frecuentemente mutada en casi todos los tipos de cánceres humanos.

LaLa inactivación del gen supresor tumoral p53 se observa en muchos tumores malignos humanos incluyendo el cáncer de vejiga.

El estudio fue dirigido a comparar las mutaciones de p53 en tumores vesicales en pacientes de una zona de hidroarsenicismo crónico regional endémico (HACRE).

p53 es excelente biomarcador para estudio de prevalencia, tipo y localización de mutaciones en tumores.

La proteína normal p53 actúa en la regulación del ciclo celular, mantención de la estabilidad genómica y en la apoptosis.

Mayoría de las mutacionesinactivantes de p53

consisten en mutaciones puntuales en dominios que llevan a cambios en la composición de los aminoácidos de la proteína p53.

El estudio de los patrones de cambios moleculares en el gen p53 en tejidos de tumores puede proveer claves para conocer el mecanismo de formación tumoral y de los eventos carcinogénicos iniciales.

Tipos específicos de canceres están asociados con mutaciones características.

Hay algunas evidencias de un espectro mutacional específico de p53 asociado a exposiciones a determinados carcinógenos.

Mecanismos mutacionales endógenos y exógenos pueden mostrar distintos patrones mutacionales de p53.

Mutación en sitios CpG indican compromiso de diversos agentes exógenos.

Se han sugerido como loci frecuentes de daño del ADN por agentes carcinógenos exógenos las bases de citosina en sitios metilados CpG.

Carcinógenos como tabaquismo y cloruro de vinilo causan primariamente transversiones G:C a C:G, y A:T a T: A respectivamente.

El gen p53 se halla mutado en casi 40%

de tumores vesicales.

Con IHQ pueden detectarse mutaciones de p53 ya que una p53 mutada posee mayor vida media detectable con el Ac.

Errores potenciales de la IHQ : puede haber mutaciones fuera de los exones examinados con sitios promotores extragénicos que llevan a expresión génica reducida o pueden resultar en codones de paro que interrumpen la traslación.

P53 también puede ser transcripcionalmente sub o sobre-expresada determinado falsa negatividad o positividad con la IHQ.

18% de las mutaciones- inserciones y delecciones- halladas en tumores vesicales resultan de un cambio G:C a A:T en el sitio de los dinucleótidos CpG

Las mutaciones en sitios CpG son vía deaminación de 5´metilcitosina a timidina.

Material y métodos

Se compararon tumores de vejiga de 105 pacientes fumadores y no fumadores expuestos a diversos niveles de As en el agua de beber en una zona de HACRE agrupándolos en 4 categorías basadas en la concentración media de As en el agua de beber conforme registros oficiales de un periodo entre 5 y 40 años previos al diagnóstico de cáncer vesical

Material y métodosExposición al As: midiendo concentración de As en agua en casa del paciente y residencias previas basándose en registros oficiales en los 5 años con mayor concentración de As- basados en registros oficiales de un periodo entre 5 y 40 años previos al diagnóstico del Carcinoma urotelial- En caso de pozos privados se investigó el actual y anteriores, y en caso de cerrado el más próximo a similar profundidad.

Material y métodos

G1 (0 a < 10 μg/L) G2 (10-99 μg/L), G3 (100- 299 μg/L),G4 (> 300 μg/L).

Material y métodos

Las alteraciones de p53 se estudiaron con IHQy métodos de secuenciación para estudio de mutaciones.Se confrontaron las mutaciones de p53 con el estadio, grado, género e historia o no de tabaquismo.

Material y métodos

Casos nuevos diagnósticados de Ca vesical a células transcicionales entre 1996 y 2000 en pacientes residentes en departamentos Unión y Marcos Juarez de Córdoba (población 193000 hab)- Area seleccionada por alta concentración de As en el agua y alta mortalidad por Cancer vesical

Material y métodos

En pacientes se chequeo tiempo de residencia, hábitos actuales y pasados de consumo de aguas, hábitos tabáquicos si los había, e historia ocupacional.

Material y métodos

•4 grupos Cada grupo estratificado por

• estadio y grado conforme OMS

• género y hábito tabáquico

Material y métodos

• Microdisección de cortes de parafina de 5 μm, seleccionado el área de tejido menos “contaminada” con células normales no tumorales y representativa de la lesión.

• Tamaño mínimo requerido: 0.3 mm2 (aprox. 500 céls)

• Aislamiento del ADN y amplificación por PCR

Material y métodos

• IHQ con Ac para p53 – con recuperacion antigénica.

• Interpretación positiva: patrón de tinción finamente granular sólo nuclear. Estimación del número de células positivas y negativas.

Material y métodos

• Se consideró negativa : ninguna célula teñida.

• Se consideró como ”< 10%”: entre 1 célula y menos del 10% de células marcadas.

• Se consideraron positivas marcaciones de al menos 10% de las células.

Material y métodos

• SecuenciaciónSecuenciación: en la secuenciación fluorescente se usó BigDye TM de PE Biosystems, luego se purificó con kitt de Amersham Pharmacia Biotech para remover exceso de primers y nucleótidos.

• Primero se secuenciaron los exones en sentido “forward”- Si se sospechaba una mutación se secuenciaba para confirmar en sentido reverso con reacción de PCR independiente.

Material y métodos

• Se investigó también frecuencia y tipo de cambios cromosómicos comparando ADN extraído de tumores vesicales de pacientes expuestos y no expuestos al As

Material y métodos

Para definir aberraciones genéticas del genoma:

Técnicas de hibridación genómica comparativa (HGC) sobre ADN extraído de muestras de tumores incluidos en parafina

En la HGC, las copias anormales de ADN se detectan por hibridizaciones simultáneas del tumor y ADN de metafases normales.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOSANÁLISIS ESTADÍSTICOS

• Test del chi- cuadrado X2 sobre tablas de análisis de contingencia para verificar variaciones en mutación y frecuencia de tinción para cada categoría de variables (género, hábito tabáquico y arsenicismo)

• La proporción de casos con mutaciones o IHQ positiva se calculó dividiendo el número de casos anormales totales por el número de tumores en el grupo.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOSANÁLISIS ESTADÍSTICOS

• Con software Stata 6.0 se calculó OR e intervalos de confidencia (CI 95%).

• Cálculo de transciciones y transversiones dividiendo el número de tumores con una mutación dada por el número total de tumores con mutaciones

GRUPOS

• ESTADIO ESTADIO

Nº %TOTAL 105 (100)ESTADIOTa 31(30)T1 40(38)T2-T4 34(32)

GRUPOS

• GRADO GRADO

Nº %TOTAL 105 (100)GRADO 1 31(30) 2 51(49) 3 21(22)

GRUPOS

GENERO( p< 0.01)

Masculino 90 (86%)

Femenino 15 (14 %)

HABITO TABAQUICOHABITO TABAQUICO

TotalTotal Nº % Nº % Siempre 84 (80)Nunca 21 (20)

CAMBIOS CROMOSOMICOS CAMBIOS CROMOSOMICOS POR ESTADIOPOR ESTADIO

TOTAL CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS

ESTADIO

Ta 5.1 + 6.1 2.4 + 3.5 2.7+ 3.1

T1 5.6 + 4.9 2.4 + 2.7 3.2 + 2.7

T2-T4 9.8+ 6-3 4.8 + 3.5 5.3+3.4

p (tend) <0.001 <0.001 <0.001

CAMBIOS CROMOSOMICOS CAMBIOS CROMOSOMICOS POR GRADOPOR GRADO

GRADO CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS

1 2.6+2.6 0.8+1.2 1.8+1.7

2 7.9+6.2 3.5+3.4 4.4+3.3

3 9.5+6.4 4.9+3.5 4.6+3.4

p (tend) <0.001 < 0.001 <0.001

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR GENERO

GENERO CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS

Masculino 6.7+6.1 3.0+3.3 3.7+3.1

Femenino 6.6+6.4 2.9+3.3 3.2+ 3.3

p 0.89 0.84 0.91

CAMBIOS CROMOSOMICOS CAMBIOS CROMOSOMICOS POR HABITO TABAQUICOPOR HABITO TABAQUICO

CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS

HABITO HABITO

TABAQUICOTABAQUICO

Siempre 6.9+6.0 3.1+3.3 3.8+3.1

Nunca 6.1+6.4 2.9+3.3 3.2+3.3

p 0.51 0.73 0.37

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION

EXPOS. CAMBIOS GANANC. PERDID. m+ Ds m + DS m+ DS 1 5.7+5.1 2.4+2.7 3.3+2.9 2 5.6+5.1 2.4+2.9 3.3+2.8 3 7.3+7.4 3.8+4.1 3.6+3.4 4 9.1+6.5 4.1+4.0 5.1+3.4 p 0.03 0.03 0.06

p 0.02 0.008 0.05 (tend.ajust.grado y estadio)

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION

Categoria de Exposición

Bajo grado(1)

1 2 3 4 p cambios cambios cambios cambiosTa 3.3+4.9 1.2+1.1 3.3+3.3 3.0+3.6 0.67

T1 3.6+2.5 0.7+1.2 2.1+2.1 2.0 0.42 T2-4 0 2.0 0 7.0 - Total 3.5+3.1 1.1+1.1 2.5+2.5 3.6+3.2 0.79

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION

Categoria de Exposición Alto grado(2-3)

1 2 3 4 p cambios cambios cambios cambios

Ta 3.6+3.5 9.0+2.7 9.3+11.9 13.3+11 0.07 T1 7.0+5.1 6.6+5.0 5.7+3.6 9.7+6.3 0.42 T2-4 7.6+6.4 9.8+5.4 14.3+6.5 10.1+5.5 0.11 Total 6.3+5.5 8.3+4.7 10.3+7.8 10.5+6.4 0.01

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION Y HABITO TABAQUICO

Categoria de FUMADORESExposición CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS 1 6.3+5.3 3.7+2.8 3.6+3.0 2 5.7+5.2 2.4+3.0 3.3+2.8 3 7.1+7.1 3.6+4.1 3.5+3.2 4 9.9+ 6.0 4.3+3.2 5.7+3.2 p 0.11 0.16 0.10 p ajustada 0.03 0.02 0.06

CAMBIOS CROMOSOMICOS POR CATEGORIA DE EXPOSICION Y HABITO TABAQUICO

Categoria de NO FUMADORESExposición CAMBIOS GANANCIAS PERDIDAS 1 3.8+4.1 1.6+2.1 2.4+2.3 2 5.3+5.3 2.5+2.6 2.8+2.8 3 8.9+9.8 4.8+4.7 4.0+5.4 4 7.9+7.3 3.8+5.8 4.1+3.7 p 0.08 0.04 0.25 p ajustada 0.15 0.07 0.52

El porcentaje de mutaciones halladas fue más alto en fumadores que en no fumadores y sólo en los fumadores se hallaron los pocos tumores con mutaciones dobles.

La relación con el tabaquismo fue débil, 38% de mutaciones de p53 en fumadores y 27% en no fumadores (p=0.34)

TENDENCIAS EN ALTERACIONES CROMOSÓMICAS ESPECÍFICAS CON

ESTADIO, GRADO, HÁBITO DE FUMAR Y EXPOSICIÓN AL ARSENICO

GANANCIAS p

3q (p>0.1) 0.01 ------ 0.04 (p.aj-0.03)

5p 0.04 0.003 ------- ----- 6p 0.03 0.002 ------- ----- 7p ----- 0.04 ------ ----- 10p ----- 0.01 ------ ----- 8q 0.03 ----- 0.03 ----- 11q 0.006 0.02 -----

0.04(0.03) 17q 0.004 0.006 ----- ----- 19q ------ 0.05 ----- ----- 20q ------ 0.03 ------ -----

TENDENCIAS EN ALTERACIONES CROMOSÓMICAS ESPECÍFICAS CON

ESTADIO, GRADO, HÁBITO DE FUMAR Y EXPOSICIÓN AL ARSENICO

PERDIDAS

8p 0.0001 0.001 0.03 0.07 (0.05) 11p ------ ---- 0.06 ----- 17p 0.0001 0.00001 5q 0.002 ----- ----- -----

9q ------ ---- 0.04 0.03(0.03) 18q 0.03 0.05 0.08 ------ Y 0.03 ------ ------ -----

Los tipos más frecuentes de mutaciones fueron sustituciones de una sola base (transciciones y transversiones)

El porcentajede tumores conteniendo transiciones aumentó con el estadio tumoral (tend p= 0.005) y el grado (p= 0.004), pero no fue evidente con las pocas transversiones halladas.

TRANSICIONES TRANSVERSIONES

TOTAL 81% 19%

ESTADIO

Ta 62% 38%

T1 85% 15%

T2-4 84% 16%

p tendencia 0.29

TRANSICIONES TRANSVERSIONES

TOTAL 81% 19%

GRADO

1 75% 25%

2 83% 17%

3 80% 20%

p tendencia 0.99

TRANSICIONES TRANSVERSIONES

TOTAL 81% 19%

TABACO

Siempre 85% 15%

Nunca 57% 43%

p tendencia 0.08

TRANSICIONES G a A en sitios CpG

(a) (b) (c)

TOTAL 24.6% 14.2% 40%

GRADO

1 10.7% 10.7% 75%

2 24.6% 13.9% 37.5%

3 36.4% 18.2% 35.2%

Tend. p 0.02 0.40 0.28

(a): Transición G a A(b): Transición G a A en sitios CpG(c): % de mutaciones G a A en sitios CpG / Total de mutaciones

TRANSICIONES G a A en sitios CpG

(a) (b) (c)

TOTAL 24.6% 14.2% 40%

ESTADIO

Ta 11.4% 11.45% 50%

T1 27.5% 13.7% 41.2%

T2-4 32.5% 17.5% 35%

Tend. p 0.04 0.45 0.46

(a): Transición G a A(b): Transición G a A en sitios CpG(c): % de mutaciones G a A en sitios CpG / Total de mutaciones

TRANSICIONES G a A en sitios CpG

(a) (b) (c)

TOTAL 24.6% 14.2% 40%

TABACO

Siempre 28.0% 17.0% 44.7%

Nunca 11.5% 3.8% 14.3%

Tend. p 0.08 0.11 0.16

(a): Transición G a A(b): Transición G a A en sitios CpG(c): % de mutaciones G a A en sitios CpG / Total de mutaciones

TRANSICIONES G a A en sitios CpG

(a) (b) (c)

TOTAL 24.6% 14.2% 40%

ARSENICO

1 16.3% 14.0% 50.0%

2 25.0% 14.3% 40.0%

3 42.9% 25.0% 53.3%

4 16.0% 0.0% 0.0%

Tend. p 0.26 0.39 0.22

(a): Transición G a A(b): Transición G a A en sitios CpG(c): % de mutaciones G a A en sitios CpG / Total de mutaciones

ARSENICO EN NO FUMADORES SOLAMENTE(a) (b) (c)

1 20.6% 17.6% 54.5% 2 29.2% 16.7% 40.0% 3 48.0% 24.0% 70.0% 4 17.7% 0.0% 0.0%Tend. p 0.45 0.40 0.20(a): Transición G a A(b): Transición G a A en sitios CpG(c): % de mutaciones G a A en sitios CpG / Total de mutaciones

La prevalencia de tumores con mutaciones transcicionales aumentó con el grado y el estadio, siendo mayor en fumadores.Se halló el codón 273 con mutación en el 11% de tumores de fumadores.

MUTACIONES DE p53 e IHQ y EXPOSICIÓN AL ARSÉNICO

IHQ p53+ CASOS % OR OR ajust 95% IC 95% ICExposición 1 34 1.0 1.0 2 42 1.4 1.57 (0.8-3.5) (0.6-4.2) 3 46 1.63 1.91 (0.7-4.0) (0.8-4.9) 4 47 1.69 1.74 (0.7-4.3) (0.6-4.7)p (tendencia) 0.21 0.18

MUTACIONES DE p53y EXPOSICIÓN AL ARSÉNICO

MUTACIONES CASOS

Exposición 1 28 1.0 1.0

2 36 1.44 1.77

(0.5-4.0) (0.9-7.6 3 46 2.24 2.61

(0.8-6.1) (0.9-4.8

4 36 1.45 1.53(0.5-4.2) (0.5-4.7

p (tendencia) 0.28 0.24

OR OR ajus95% IC 95% IC

CONCLUSIONES

• Los tumores de vejiga asociados con más altos niveles de exposición al As muestran aumento de la inestabilidad cromosómica

CONCLUSIONES

El número de aberraciones cromosómicas se incrementa con el estadio tumoral y el grado (p>0.001),independiente de la exposición al As, pero NO se asoció con historia de tabaquismo

CONCLUSIONES

La mayoría de los cambios cromosómicos específicos que se relacionan con el As estuvieron asociados también con el estadio y el grado de los tumores, lo que sugiere que posiblemente la exposición al Arsénico podría determinar mayor agresividad en los carcinomas de células transcicionales.

La mutación de p53 en tumores vesicales aumentaron con el estadio y el grado tumoral, pero no con el grado de exposición al As.

CONCLUSIONES

La exposición al As en el agua de beber no es fuerte inductora de mutaciones en p53.

CONCLUSIONES

La inestabilidad genética asociada con la exposición al As en tumores vesicales probablemente ocurre por un mecanismo independiente de p53.

CONCLUSIONES