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LISIANE DE SANTANA SOUZA
PADRONIZAÇÃO DE TESTES PARA AVALIAÇÃO DO ESTADO DE MANIA
E POTENCIAL ANTI-MANÍACO DE UM AGONISTA DO RECEPTOR NOP
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, para
obtenção do título de Mestre em
Psicobiologia.
Natal
2015
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LISIANE DE SANTANA SOUZA
PADRONIZAÇÃO DE TESTES PARA AVALIAÇÃO DO ESTADO DE MANIA
E POTENCIAL ANTI-MANÍACO DE UM AGONISTA DO RECEPTOR NOP
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, para
obtenção do título de Mestre em
Psicobiologia.
Orientador: Prof.ª Dr.ª Elaine C. Gavioli
Natal
2015
3
4
PADRONIZAÇÃO DE TESTES PARA AVALIAÇÃO DO ESTADO DE MANIA
E POTENCIAL ANTI-MANÍACO DE UM AGONISTA DO RECEPTOR NOP
Lisiane de Santana Souza
Data da Defesa: ____/____/____
Banca Examinadora:
___________________________________
Prof.ª Dr.ª Alianda Maira Cornélio da Silva
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN
___________________________________
Prof.ª Dr.ª Elaine Cristina Gavioli
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN
___________________________________
Prof. Dr. Pablo Pandolfo
Universidade Federal Fluminense, RJ
5
O que prevemos raramente ocorre; o
que menos esperamos geralmente
acontece.
(Benjamin Disraeli)
Porém,
Eu sou brasileira e não desisto nunca!
(Autor desconhecido)
6
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, minha fonte de força desde sempre, especialmente
quando tudo deu errado e eu não consegui passar na primeira seleção do mestrado,
assim como no período em que, pra variar, os experimentos demoraram a funcionar.
À minha orientadora, Elaine Gavioli, por todo o conhecimento repassado,
além de ajuda, conselhos, carinho e paciência, assim como por nunca ter se negado a
ouvir minhas lamúrias e indecisões sobre o que fazer da vida. Serei eternamente grata,
principalmente pelo suporte dado no período em que não pude estar presente no
laboratório. “Xô uruca” pra nós!
À minha família, por todo o amor dado, pelos muitos sacrifícios que fizeram
por mim, e por sempre terem me dado liberdade pra ir de encontro ao que me fizesse
mais feliz, embora, muitas vezes, não entendam os caminhos que eu prefiro trilhar
(mamãe que o diga!).
Aos colegas de laboratório, pela ajuda, risadas, apoio, piadas, semanas de
limpeza do biotério e falhas de experimentos compartilhadas durante os últimos 5 anos.
Cada um de vocês tem algo que agrega vida ao laboratório. Aos que tomaram outro
rumo: Manara e as reclamações de que seus experimentos supostamente não
funcionam; Luana e suas doidices que nos fazem falta; e Maíra, que virou minha
companheira de viagens ao Rio e águas de coco em Copacabana: “É nóis na Tijuca!”.
Aos que permanecem: Laila, a “matutina extrema” que me fazia acordar mais cedo que
o usual; Iris e seu jeito fashion e alegre; Julia, detentora de cadeira cativa no Thomas;
Victor e as suas fontes quentíssimas; Décio e Adriana, os melhores organizadores de
festas do laboratório; Nataly, que me assumiu como dupla da semana da limpeza; e
Epifanio, também conhecido como “Antonio Pãozinho”, que sabota minha dieta todos
os dias. Você subiu de nível, mas será sempre meu aluno de IC, e todo mundo na feira
sabe: Gláucia, D. Ana, Ana Rita... Aos demais, que não citei, mas que com certeza tem
um lugarzinho reservado aqui dentro: muito obrigada!
Aos amigos que o mestrado me deu: Ariela, Lu Rocha e Jaqueiuto, vulgo
“galerinha do mal”, amo vocês! O mestrado também não teria sido o mesmo sem a
presença das ladies: Ceci, Lu Varella, Mari e May. Eu tenho fé que um dia a gente
consegue reunir todas pro nosso chá! Aos demais colegas do PPG Psicobiologia, mais
próximos ou um pouco mais distantes, obrigada por terem feito esses últimos 2 anos
serem mais felizes.
Às minhas “amigas lindas”, as cajazeiras: Aldi, Anassely, Ju, Candy, também
agradeço a vocês o suporte e amizade que vocês me dão desde a graduação. Somos cada
uma diferente das outras, mas juntas, nos completamos!
Aos professores do PPG Psicobiologia, que me repassaram conhecimentos
valiosos durante esta jornada.
7
Aos professores Pablo e Alianda, por aceitarem fazer parte da banca de
avaliação deste trabalho.
À CAPES e ao CNPq, pelo apoio financeiro imprescindível para a
viabilização deste projeto.
Aos demais que não foram citados, mas que tiveram participação na realização
deste trabalho (ou na manutenção da minha sanidade mental), muito obrigada!
8
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 17
1.1 Transtorno bipolar ............................................................................................. 17
1.2 Tratamento do Transtorno Bipolar .................................................................. 19
1.3 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP .................................. 21
1.4 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP e transtornos
afetivos ....................................................................................................................... 24
1.5 Modelos Animais de Mania ................................................................................ 26
METODOLOGIA ......................................................................................................... 31
2.1 Animais ................................................................................................................ 31
2.2 Drogas e tratamentos .......................................................................................... 31
2.3 Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular em
camundongos ............................................................................................................. 32
2.4 Testes comportamentais ..................................................................................... 34
2.4.1 Campo aberto ................................................................................................. 34
2.4.2 Hole board...................................................................................................... 34
2.5 Desenho experimental ......................................................................................... 35
2.5.1.Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania induzido pela
administração de ouabaína em camundongos ........................................................ 35
2.5.2 Etapa II – Padronização do hole board como um modelo para se avaliar a
mania ....................................................................................................................... 36
2.5.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do
receptor NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania induzido
por metilfenidato no hole board .............................................................................. 37
9
2.6 Análise estatística ................................................................................................ 38
RESULTADOS ............................................................................................................. 39
3.1 Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania promovido pela
administração de ouabaína em camundongos ........................................................ 39
3.2 Etapa II – Padronização do hole board como um teste para se avaliar a
mania .......................................................................................................................... 40
3.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do
receptor NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania
induzido por metilfenidato no hole board .............................................................. 49
DISCUSSÃO ................................................................................................................. 56
CONCLUSÕES ............................................................................................................. 64
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 65
10
RESUMO
O transtorno bipolar é caracterizado pela disfunção do humor, alternando entre
episódios de mania/hipomania e depressão, e sua fisiopatologia exata ainda continua
indeterminada. A farmacoterapia do transtorno bipolar baseia-se na prevenção dos
episódios de mania e depressão através do uso de estabilizadores do humor. A
nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) é um heptadecapeptídeo endógeno e agonista do
receptor NOP, um receptor acoplado à proteína G do tipo inibitória. A N/OFQ e seu
receptor desempenham uma série de papéis funcionais no organismo, e, entre eles, está
a modulação de processos emocionais. Sabe-se que há alteração na concentração
plasmática de N/OFQ em pacientes na fase depressiva e maníaca do transtorno bipolar
e, por isso, presume-se que esse sistema teria algum papel na etiologia deste transtorno.
Com relação à mania, os modelos animais utilizados na pesquisa tendem a focar em
apenas um aspecto do quadro maníaco, como a hiperatividade ou agressividade. Nos
anos 60, foi proposto o teste do hole board, aparato provido de furos onde
prioritariamente se mede nos animais um comportamento conhecido como “imersão de
cabeça” (head-dipping). Altos níveis de head-dippings podem ser indicativos de
neofilia, enquanto baixos níveis poderiam ser reflexo de um comportamento do tipo
ansioso. Como o aumento do comportamento exploratório e direcionado a objetivos são
sintomas característicos dos quadros maníacos, este teste poderia oferecer subsídios
para a pesquisa deste transtorno. Deste modo, o presente trabalho foi dividido em 3
etapas e visa apresentar (1) a indução de um estado similar ao de mania promovido pela
administração de ouabaína, um inibidor da enzima Na+/K
+-ATPase, em camundongos
no campo aberto; (2) a padronização do hole board como um teste para mensuração de
comportamentos do tipo maníacos; e (3) a investigação do efeito da N/OFQ na
prevenção destes comportamentos no hole board. Para o desenvolvimento deste estudo,
foram usados camundongos Swiss machos que participaram de apenas uma das etapas
descritas acima e receberam um ou mais dos seguintes tratamentos, de acordo com a
etapa: (1) ouabaína, nas doses de 10-6
, 10-5
, 10-4
, 10-3
ou 10-2
M, intracerebroventricular
(icv); (2) valproato de sódio 300 mg/kg, intraperitoneal (ip); (3) valproato de sódio 400
mg/kg, ip; (4) diazepam 1 mg/kg, ip; (5) metilfenidato 10 mg/kg, ip; e (6) N/OFQ nas
doses de 0,1 ou 1 nmol, icv. Os resultados sugerem que o hole board é um teste que
pode ser usado para a avaliação de quadros maníacos, através da análise de vários
comportamentos do animal. Entretanto, não foi possível padronizar o modelo da
disfunção da enzima Na+/K
+-ATPase induzido pela administração de ouabaína usando
camundongos como sujeitos experimentais. Ainda, os dados sugerem que a N/OFQ, nas
doses testadas, não é eficaz na prevenção de um quadro de mania. Tomados em
conjunto, os resultados apontam para uma nova abordagem na pesquisa da mania,
através do uso do hole board. Entretanto, mais estudos precisam ser feitos a fim de
comprovar o envolvimento do sistema da nociceptina/orfanina FQ na ocorrência do
transtorno bipolar.
Palavras-chave: transtorno bipolar, nociceptina/orfanina FQ, hole board, ouabaína.
11
ABSTRACT
Bipolar disorder is characterized by mood impairment, alternating between
mania/hypomania and depression, and its exact pathophysiology is already unknown.
The treatment of bipolar disorder is based on prevention of the manic and depressive
episodes using mood stabilizers. Nociceptin/orfanin FQ (N/OFQ) is an endogenous
heptadecapeptide which binds as an agonist to NOP receptor, which is a G-coupled
inhibitory receptor. N/OFQ and its receptor modulate a lot of functions in the organism,
including emotional processes. It is known that the plasmatic concentration of N/OFQ is
altered in patients in both phases depressive and manic of bipolar disorder and it is
assumed that this system has a role on the etiology of this disorder. Concerning mania,
the animal models used in research tend to focus in an unique aspect of the manic
behavior, as hyperactivity or agressivity. In the 60’s, the hole board test was proposed,
and it consists of an apparatus with holes where a behavior known as head-dippings is
measured. High levels of head-dippings are suggestive of neophilia, while low levels
can be characteristic of an anxious-like behavior. As the increase of exploratory and
goal-directed behavior are characteristics of manic behavior, this test could help in
mania research. Thus, this work was organized in 3 steps and aims to: (1) investigate the
induction of a manic-like state promoted by ouabain, a Na+/K+-ATPase inhibitor, in the
mouse open field test; (2) set up the hole board as a test to measure manic-like
behaviors; and (3) investigate the N/OFQ effects in prevention of this kind of behavior
on hole board. Male Swiss mice were used in this study, and they take part of only one
of the described steps. Depending on the step performed, mice received one or more of
the following treatments: (1) ouabain 10-6
, 10-5
, 10-4
, 10-3
or 10-2
M,
intracerebroventricular (icv); (2) sodium valproate 300 mg/kg, intraperitoneal (ip); (3)
sodium valproate 400 mg/kg, ip; (4) diazepam 1 mg/kg, ip; (5) methylphenidate 10
mg/kg, ip; and (6) N/OFQ 0,1 or 1 nmol, icv. The results suggest that hole board can be
used to evaluate a manic state, through analysis of different animal behaviors. However,
it was not possible to standard the model of Na+/K
+-ATPase dysfunction through
ouabain administration in mice. Moreover, the data suggest that N/OFQ, at the doses
tested, has not affected the methylphenidate-induced mania-like behavior. Taken
together, the results point to a new approach of manic research, through the hole board
using. However, more studies are necessary in order to verify the role of N/OFQ system
on bipolar disorder.
Keywords: bipolar disorder, nociceptin/orfanin FQ, hole board, ouabain.
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Esquema de tratamento adotado na etapa I......................................... 36
Tabela 2. Esquema de tratamento adotado na etapa II....................................... 36
Tabela 3. Esquema de tratamento adotado na etapa III...................................... 37
Tabela 4. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg e
metilfenidato na dose de 10 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na
distância percorrida por camundongos no teste do campo aberto durante 30
minutos de observação.........................................................................................
40
Tabela 5. Resumo dos efeitos das substâncias testadas no hole board............... 55
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura da prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), da nocistatina e da N/OFQ
em rato, camundongo e humano (Adaptado de Mogil e Pasternak, 2001)..............
22
Figura 2. Foto de camundongo durante o teste do hole board............................... 35
Figura 3. Efeito do tratamento com ouabaína nas doses de 10-4
, 10-5
e 10-6
M,
por via intracerebroventricular, na distância percorrida por camundongos no
teste do campo aberto durante 30 minutos de observação.......................................
39
Figura 4. Efeito do tratamento com metilfenidato na dose de 10 mg/kg (0,1
ml/10g), por via intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do
centro (A) e da periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de
rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do
tabuleiro durante os 10 minutos de observação.......................................................
41
Figura 5. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1
ml/10g), por via intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do
centro (A) e da periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de
rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do
tabuleiro durante os 10 minutos de observação no hole
board........................................................................................................................
43
Figura 6. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg associado com
valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na
interação com os furos centrais (A) e periféricos (B) do tabuleiro efetuado por
camundongos durante 10 minutos de observação no hole board............................
44
Figura 7. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg associado com
valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na
distância total percorrida (A) e no número de rearings efetuados (B) por
camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação...............
45
Figura 8. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg associado com
valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na
distância percorrida (A) e no tempo gasto (B) no centro do tabuleiro por
camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação...............
47
14
Figura 9. Efeito do tratamento com diazepam na dose de 1 mg/kg (0,1 ml/10g),
por via intraperitoneal, nas interações com os furos do centro (A) e da periferia
(B) do aparato durante os 10 minutos de observação no teste do hole
board........................................................................................................................
48
Figura 10. Efeito do tratamento com N/OFQ nas doses de 0.1 e 1 nmol, por via
intracerebroventricular, na quantidade de interações com os furos no centro (A) e
periferia (B) do tabuleiro no teste do hole board durante 10 minutos de
observação................................................................................................................
50
Figura 11. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg (0,1 ml/10g)
associado com N/OFQ nas doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via
intracerebroventricular, na quantidade de interações dos camundongos com os
furos no centro (A) e periferia (B) do tabuleiro no teste do hole board durante 10
minutos de observação.............................................................................................
51
Figura 12. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg (0,1 ml/10g)
associado com N/OFQ nas doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via
intracerebroventricular, na distância total percorrida (A) e quantidade de
rearings (B) no teste do hole board durante 10 minutos de observação.................
52
Figura 13. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg (0,1 ml/10g)
associado com N/OFQ nas doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via
intracerebroventricular, na distância percorrida (A) e tempo gasto (B) no centro
do tabuleiro por camundongos submetidos ao hole board durante 10 minutos de
observação................................................................................................................
53
15
LISTA DE ABREVIATURAS
µl – microlitros
5-HT – serotonina
AMPc – adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico
AP – ântero-posterior
Ca2+
- íons cálcio
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
DV – dorso-ventral
GABA – ácido gama-aminobutírico
icv – intracerebroventricular
ip – intraperitoneal
K+ - íons potássio
M – molar
ML – médio-lateral
N/OFQ – nociceptina/orfanina FQ
nmol – nanomolar
NOP – receptor da nociceptina/orfanina FQ
ppn/OFQ - prepro-N/OFQ
sc – subcutânea
16
SNC – sistema nervoso central
VL – ventrículo lateral
17
INTRODUÇÃO
1.1 Transtorno bipolar
Os transtornos mentais, uma das classes de doenças mais prevalentes no
mundo, são caracterizados pela presença de um padrão mental ou comportamental
anormal que leva a estados de sofrimento e/ou incapacidade de realizar adequadamente
algumas funções neurais, levando a prejuízos na vida social e no bem-estar. Uma
pesquisa publicada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2001 revelou que
aproximadamente 450 milhões de pessoas ao redor do mundo sofrem de algum tipo de
transtorno mental, e que uma em cada quatro pessoas desenvolve alguma desordem do
tipo durante a vida (World Health Organization 2001). Uma revisão de estudos feitos
em 16 países da Europa e incluindo 150.000 sujeitos estimou que aproximadamente
27% da população adulta da União Europeia têm ou teve pelo menos um quadro de
desordem mental nos 12 meses anteriores à pesquisa, e 1/3 apresenta mais de um
transtorno. Os mais frequentes foram: transtornos de ansiedade, depressão e
dependência de substâncias psicoativas (Wittchen & Jacobi 2005). Hoje em dia,
presume-se que, em geral, os transtornos mentais seriam fruto da interação entre os
sistemas neurotransmissores, componentes genéticos e o ambiente, como sugerido em
vários estudos (Dani & Harris 2005; Strous & Shoenfeld 2006; Cannon & Keller 2006;
Repetti et al. 2002).
O transtorno bipolar é caracterizado pela disfunção do humor, alternando entre
episódios de mania/hipomania e depressão. Nos episódios de mania/hipomania, o
humor é anormal, persistentemente elevado, expansivo ou irritável. Nos episódios
depressivos do transtorno bipolar, o quadro clínico é semelhante ao do transtorno
depressivo maior, caracterizado por humor depressivo ou perda de interesse em quase
18
todas as atividades diárias, além de sintomas como: alterações no apetite ou peso, sono
e atividade psicomotora; diminuição da energia, sentimentos de desvalorização pessoal
ou culpa, dificuldades em pensar, concentrar-se ou tomar decisões; pensamentos
recorrentes de morte e planos ou tentativas suicidas (MacQueen et al. 2001; Townsend
& Altshuler 2012, DSM-V, 2013). De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico
de Transtornos Mentais em sua 5ª edição (DSM-V) (DSM-V, 2013), um episódio
maníaco é caracterizado por humor eufórico ou irritável que ocorre concomitante com
outros sintomas, como diminuição da necessidade de sono, loquacidade, sentimento de
grandiosidade, distrabilidade, aumento de atividades direcionadas a um objetivo claro e
envolvimento em comportamentos de risco (como promiscuidade, impulsividade, etc.).
Estima-se que a prevalência do transtorno bipolar durante a vida seja de
aproximadamente 3,9%, com idade média de início aos 25 anos (Flaisher-Grinberg &
Einat 2010). Em pessoas acima de 18 anos, a Organização Mundial da Saúde estimou a
prevalência nos Estados Unidos para o transtorno bipolar de 0,8% para homens e 1%
para mulheres (Ayuso-Mateos 2002; World Health Organization 2004).
Apesar dos esforços empregados para o entendimento da neurobiologia do
transtorno bipolar, sua fisiopatologia exata ainda continua indeterminada, mas
evidências sugerem que este transtorno decorre de um complexo quadro de interação
entre os múltiplos genes que causam suscetibilidade ao seu desenvolvimento, bem como
a relação destes com fatores ambientais. Além da genética, variáveis relacionadas às
vias neurohormonais, à neurotransmissão, às vias de transdução de sinal e à regulação
da expressão gênica parecem participar da neurobiologia do transtorno (Frey et al.
2009).
19
1.2 Tratamento do Transtorno Bipolar
O paciente com diagnóstico de transtorno bipolar tem sua qualidade de vida
afetada, em virtude dos impedimentos funcionais resultantes das alterações nos
componentes afetivos, cognitivos, comportamentais e físicos. A capacidade de trabalho
e socialização é reduzida ou até anulada. Por causa dessas alterações, existe um alto
grau de morbidade para este transtorno, o que leva à necessidade de intervenção através
da farmacoterapia (Barge-Schaapveld et al. 1999). A escolha do medicamento nos
transtornos afetivos deve basear-se na apresentação mínima de efeitos adversos, para
que ocorra boa adesão ao tratamento (Lam et al. 2009).
No caso do transtorno bipolar, a farmacoterapia baseia-se na prevenção dos
episódios de mania e depressão através do uso de estabilizadores do humor,
principalmente pela administração do cátion monovalente lítio ou de fármacos
anticonvulsivantes, como ácido valpróico ou carbamazepina. Já com relação às crises,
sejam elas maníacas ou depressivas, a politerapia é preconizada e são prescritos
fármacos das seguintes classes: antipsicóticos atípicos, antidepressivos e
benzodiazepínicos (Lafer et al., 2009; Matson et al. 2006; Sanches et al. 2010).
Vários sistemas de transdução de sinal e de receptores parecem estar
envolvidos no mecanismo de ação do lítio. Sabe-se que a administração de lítio causa
inibição das inositol monofosfatases, modulação de proteínas G e inibição de cascatas
de transdução de sinal, como a da glicogênio sintetase quinase 3 (GSK3), mas nenhum
dos mecanismos supracitados ainda foi totalmente creditado aos efeitos antimaníacos da
droga (Stahl, 2008).
Apesar de ser considerado o “padrão ouro” para o tratamento da mania, uma
característica deste fármaco é que ele possui faixa terapêutica estreita com variações na
20
excreção, o que leva à necessidade de monitoramento periódico dos níveis séricos, mais
frequentemente no início do tratamento ou quando as doses forem alteradas, ou ainda a
qualquer momento, desde que haja indícios ou suspeita de intoxicação. Em decorrência
dessa característica, a farmacoterapia com o lítio produz uma variedade de efeitos
adversos, em especial relacionados ao sistema endócrino e renal (Lydiard & Gelenberg,
1982; Matson et al. 2006). Além disso, o lítio apresenta início de ação lento, efeito
antimaníaco limitado e potencial teratogênico. Assim, a busca para substituir o uso do
lítio tornou-se tema comum, e a utilização de outros medicamentos estabilizadores do
humor tem sido colocada em prática pela comunidade científica. Dentre eles, estão a
carbamazepina, cujo efeito antimaníaco é creditado ao bloqueio da atividade de canais
de Na+ sensíveis à voltagem, e o ácido valpróico, que além do bloqueio de canais de
Na+, também pode exercer ações através da facilitação da neurotransmissão
GABAérgica e da inibição da atividade de segundos mensageiros (Stahl, 2008). Tanto a
carbamazepina quanto o ácido valpróico são medicamentos originalmente usados para
epilepsia, e que, em relação à mania, são menos eficazes que o lítio, além de
compartilharem de seu perfil teratogênico. Outros aspectos destes medicamentos é que
ambos levam à alteração do metabolismo de medicamentos em geral: a carbamazepina é
um potente indutor de enzimas hepáticas, enquanto que o valproato atua como inibidor
de algumas enzimas do citocromo P450, o que gera inúmeras interações
medicamentosas (Rosa et al. 2009; Wilson et al. 1998).
Os sistemas peptidérgicos, devido ao seu papel modulatório exercido sobre
sistemas clássicos de neurotransmissão central, têm se mostrado como alvos
terapêuticos inovadores no tratamento de transtornos psiquiátricos. Os neuropeptídeos
são neurotransmissores compostos por 3 a 100 resíduos de aminoácidos, cujo tamanho
pode ser 50 vezes maior que a molécula de um neurotransmissor clássico. Apesar de sua
21
natureza protéica, eles são menores que a maioria das proteínas, e sua estrutura terciária
é menos complexa. Eles são providos de muito mais informações químicas e sítios de
reconhecimento para os receptores que os neurotransmissores clássicos, o que leva a
uma afinidade e seletividade ao receptor muito maior quando comparado a estes – os
neuropeptídeos têm afinidade de ligação até 1000 vezes maior com o seu receptor que o
visto para os neurotransmissores clássicos e seus respectivos receptores. Como
conseqüência disso, apenas uma pequena quantidade de peptídeos é suficiente pra
promover efeitos no organismo. Os neuropeptídeos se difundem através do organismo e
ligam mais lentamente - porém mais fortemente - ao seu receptor que os
neurotransmissores clássicos, e o complexo neuropeptídeo-receptor pode ser
internalizado pelas células para causar dessenssibilização (Hökfelt et al. 2003).
1.3 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP
A nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) é um heptadecapeptídeo que apresenta
estrutura similar ao peptídeo opioide dinorfina A (Houtani et al. 1996). Entretanto, a
despeito desta similaridade estrutural, ambos os peptídeos são funcionalmente distintos,
já que a N/OFQ não apresenta afinidade pelos receptores opioides clássicos (Mogil &
Pasternak 2001). Parece que tal falta de afinidade deve-se à presença do aminoácido
fenilananina na posição 1 da sua estrutura aminoacídica, visto que a substituição deste
aminoácido pode aumentar a afinidade aos receptores opioides tradicionais (Champion
& Kadowitz 1997). Em 1995, dois grupos relataram o isolamento da N/OFQ
simultaneamente. Meunier et al. (1995) isolaram este neuropeptídeo de extratos de
cérebro de rato e o denominaram de nociceptina, pois quando injetado no cérebro de
camundongos promovia hiperalgesia no teste da placa quente e no teste de retirada da
22
cauda. Reinscheid et al. (1995) isolaram este ligante endógeno de extrato de cérebro de
porco e o denominaram de orfanina FQ, pois foi mostrado que este peptídeo interagia
com um receptor órfão, por isso orfanina. Além disso, eles perceberam que na sequência
aminoacídica deste peptídeo, os aminoácidos fenilalanina e glicina (abreviados pelas
letras F e Q), estão localizados nas extremidades carboxi e amino terminal,
respectivamente, daí o peptídeo se chamar orfanina FQ (figura 1).
A N/OFQ, assim como a maioria dos neuropeptídeos, é derivada da clivagem
de um precursor maior, a prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), o qual já foi clonado a partir de
ratos, camundongos e humanos (Meunier et al. 1995; Pan et al. 1996; Reinscheid et al.
2000) e cujo gene, nesta última espécie, foi localizado no cromossomo 8 (8p21)
(Mollereau et al. 1996). A ppN/OFQ apresenta alta homologia entre as espécies animais
supracitadas, com similaridade estrutural superior a 80%, e sua clivagem, além da
N/OFQ, dá origem também a outros peptídeos bioativos, como por exemplo a
nocistatina (Mogil & Pasternak 2001).
Figura 1. Estrutura da prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), da nocistatina e da N/OFQ em rato, camundongo e
humano (Adaptado de Mogil & Pasternak, 2001).
A partir da comprovação da interação do receptor órfão (na época denominado
ORL1) com a N/OFQ, este receptor foi denominado de receptor da nociceptina/orfanina
FQ (receptor NOP) (Snyder & Pasternak 2003). O receptor NOP é um receptor
acoplado à proteína G do tipo inibitória, que ao ser ativado aumenta o efluxo de K+,
Figura 1. Estrutura da prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), da nocistatina e da N/OFQ em rato,
camundongo e humano (Adaptado de Mogil e Pasternak, 2001).
23
reduz a entrada de Ca+2
e diminui a produção de AMPc (Connor et al. 1996; Vaughan &
Christie 1996; Wu et al. 1997). Mesmo fazendo parte da família dos receptores
opioides, devido inclusive à grande similaridade estrutural, o receptor NOP difere, do
ponto de vista farmacológico, dos sistemas opioides clássicos. Nem os opioides, nem os
seus antagonistas se ligam com alta afinidade ao receptor NOP (Mogil & Pasternak
2001). O receptor NOP possui alta expressão em diversas áreas do sistema nervoso
central, em particular no prosencéfalo, sistema límbico e na medula espinhal, nos cornos
dorsal e ventral. É densamente localizado nos núcleos serotoninérgicos, noradrenégicos
e dopaminérgicos, como nos núcleos da rafe, locus coeruleus, núcleo do trato solitário,
área tegmental ventral e substância nigra (Mollereau et al. 1994; Neal et al. 1999). Já o
precursor da N/OFQ, a proteína pronociceptina, possui distribuição mais limitada em
comparação ao receptor NOP. No cérebro de rato, transcritos do gene da pronociceptina
foram encontrados em áreas envolvidas na transmissão ou modulação de estímulos
nociceptivos, em núcleos pertencentes a outras vias sensoriais, incluindo aferências
visuais e auditivas, no sistema límbico e núcleos hipotalâmicos (Boom et al. 1999). A
N/OFQ e o seu receptor estão bem distribuídos em estruturas do sistema límbico
envolvidas no processamento de estímulos emocionais, como: hipocampo, septo, núcleo
do leito da estria terminal, banda diagonal de Broca, a habênula, o complexo
amigdalóide e formação hipocampal (Mollereau & Mouledous 2000), o que dá suporte
ao papel deste sistema na modulação de estados emocionais, como a ansiedade e
depressão (Gavioli & Calo' 2006).
A N/OFQ e seu receptor desempenham uma série de papéis funcionais, como
processamento de estímulos nociceptivos, controle das funções neuroendócrinas,
balanço hídrico, controle motor, resposta ao estresse, modulação dos processos
emocionais, comportamento sexual e regulação da pressão arterial, entre outras funções
24
(Lambert 2008). A disponibilidade de ligantes seletivos do receptor NOP, sejam eles
peptidérgicos (Calo’ et al. 2000; Calo' et al. 2002) ou não-peptidérgicos (Ozaki et al.
2000; Zaratin et al. 2004), permite a investigação do papel desempenhado pelo sistema
endógeno N/OFQ-receptor NOP no controle de diferentes funções biológicas.
1.4 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP e transtornos afetivos
Estudos pré-clínicos mostram que antagonistas do receptor NOP, incluindo
[Nphe1]N/OFQ(1-13)-NH2, J-113397, UFP-101 e SB-612111 possuem atividade do
tipo antidepressiva em animais experimentais (Gavioli & Calo' 2006). De fato, estudos
realizados em roedores tratados com antagonistas peptídicos do receptor NOP, como
[Nphe1]N/OFQ(1-13)-NH2 e UFP-101, por via intracerebroventricular (icv) e
submetidos a testes de desespero comportamental, como o teste de natação forçada e o
teste de suspensão pela cauda, mostraram diminuição do tempo de imobilidade dos
animais (Redrobe et al. 2002; Gavioli et al. 2003; Gavioli et al. 2004), mas a N/OFQ ou
o agonista do receptor NOP Ro64-6198 (icv), não foram capazes de afetar o tempo de
imobilidade nestes mesmos testes comportamentais (Gavioli et al. 2004; Goeldner et al.
2012). O antagonista UFP-101 também mostrou atividade do tipo antidepressiva em
tratamento crônico por 21 dias (icv) no modelo de estresse crônico variável, restaurando
o consumo de solução de sacarose, o equilíbrio na concentração de serotonina (5-HT) e
nos níveis de cortisol sérico (Vitale et al. 2009). O trabalho de Vitale e colaboradores
(2009) foi o único que conseguiu demonstrar que o bloqueio dos receptores NOP
reverte parâmetros comportamentais, neuroquímicos e endócrinos relacionados à
depressão experimental.
Em ratos e camundongos knockout para o receptor NOP, estudos mostraram
que, quando submetidos aos testes de desespero comportamental, os animais
25
apresentavam comportamento do tipo antidepressivo, reforçando o papel exercido pelo
sistema peptidérgico N/OFQ-receptor NOP na mediação da depressão experimental
(Gavioli et al. 2003; Gavioli et al. 2004; Rizzi et al. 2011).
Já é sabido que a N/OFQ causa hipolocomoção em roedores de forma dose-
dependente (Reinscheid et al. 1995). No entanto, em relação aos antagonistas NOP, não
foi observada nenhuma alteração na locomoção espontânea. As doses administradas dos
antagonistas que levavam à diminuição do tempo de imobilidade na natação forçada e
teste de suspensão pela cauda não mostraram alteração de mobilidade no teste do campo
aberto (Nishi et al. 1997; Redrobe et al. 2002; Gavioli et al. 2004), o que confere um
comportamento genuíno do tipo antidepressivo induzido por antagonistas NOP.
Considerando o transtorno bipolar, há apenas um estudo clínico relacionando
esta psicopatologia ao sistema peptidérgico N/OFQ-receptor NOP. Wang e
colaboradores (2009) demonstraram haver alteração na concentração plasmática de
N/OFQ em pacientes na fase depressiva e maníaca do transtorno bipolar. Amostras de
sangue periférico foram coletadas de 78 adultos, sendo 21 de pacientes diagnosticados
com depressão bipolar, 26 de pacientes com mania bipolar e 31 de adultos saudáveis
(grupo controle). O nível plasmático de N/OFQ do grupo com depressão bipolar foi
significativamente maior do que o do grupo controle, e o nível de N/OFQ do grupo com
mania bipolar foi significativamente menor quando comparado ao do grupo controle.
Estes resultados sugerem o envolvimento do sistema peptidérgico da N/OFQ na
etiologia do transtorno bipolar (Wang et al. 2009). Entretanto, não há atualmente
nenhuma evidência pré-clínica que possa sustentar a hipótese do emprego de agonistas
ou antagonistas do receptor NOP no tratamento deste transtorno e, devido a isso, existe
a necessidade de mais estudos, principalmente em nível pré-clínico, com o auxílio de
26
modelos animais do transtorno bipolar, para investigar o potencial terapêutico dos
ligantes do receptor NOP nesta psicopatologia.
1.5 Modelos Animais de Mania
Os modelos animais já provaram ser uma ferramenta vital para o estudo da
neurobiologia e tratamento de vários transtornos neuropsiquiátricos. Contudo, o
desenvolvimento de parâmetros a serem avaliados continua sendo um desafio. Como
em todos os modelos animais de doenças psiquiátricas, é difícil inferir estados afetivos
em roedores que mimetizem os sintomas clínicos e déficits cognitivos que caracterizam
a psicopatologia em humanos. O modelo animal ideal para o estudo do transtorno
bipolar seria aquele que incluiria comportamentos espontâneos e progressivos que
oscilariam entre a manifestação de aumento e a redução de determinada conduta,
mimetizando, assim, o comportamento humano nos episódios maníacos e depressivos.
Este quadro observado nos animais deveria também normalizar por meio do tratamento
crônico, porém não agudo, com estabilizadores do humor (Gavioli et al. 2009).
Infelizmente, um modelo animal como o descrito acima, com alta validade aparente,
preditiva e de construto, é muito difícil de reproduzir em laboratório.
Atualmente, os modelos disponíveis tendem a focar apenas um dos pólos do
transtorno, utilizando alguma especulação e estudos empíricos, identificando, nos
animais, comportamentos similares à depressão e mania (Potash & DePaulo 2000;
Nestler & Hyman 2010). Os modelos mais utilizados para o estudo da depressão bipolar
são: estresse moderado crônico, modelo do desamparo aprendido, modelo de separação,
bulbectomia e testes do desespero comportamental (como a natação forçada e a
suspensão pela cauda). Esses modelos, mesmo sendo úteis para mimetizar alguns
27
aspectos da depressão, contribuem pouco para a natureza recorrente do transtorno
bipolar (Redrobe & Bourin 1999; Prica et al. 2008).
Os modelos de mania atualmente disponíveis foram desenvolvidos baseando-
se, principalmente, em três abordagens: farmacológica, comportamental e genética. Os
modelos de mania com abordagem farmacológica baseiam-se no fato de que o aumento
da concentração sináptica de dopamina, decorrente da administração de fármacos
psicoestimulantes, causa aumento da atividade locomotora, que é revertida pela
administração de fármacos estabilizadores do humor. Já a abordagem comportamental
envolve a análise do comportamento espontâneo do animal ou, ainda, após manipulação
experimental, a qual promove alteração no comportamento de base, como no caso dos
animais privados de sono. Finalmente, os modelos com abordagem genética visam à
criação de animais com traços específicos de determinada patologia ou que sofreram
manipulação genética em genes tidos como responsáveis pela etiologia do transtorno
(para revisão: Gavioli et al., 2009), como, por exemplo, o caso dos camundongos que
não expressam os genes clock (Mukherjee et al. 2010). Atualmente, os modelos mais
utilizados para estudar a mania são: modelo de hiperatividade induzida por
psicoestimulantes, modelo da disfunção da enzima Na+/K
+-ATPase, utilizando um
inibidor específico dessa enzima, como a ouabaína; e modelo da privação do sono
(Herman et al. 2007; Young et al. 2011).
O modelo da disfunção da enzima Na+/K
+-ATPase já é um modelo consagrado
para a indução de mania, devido a um dos correlatos biológicos da mania ser a
desregulação de íons (El-Mallakh et al. 2003). Estudos mostram que pacientes em
episódios de mania apresentam aumento de cálcio (Dubovsky et al. 1989; Dubovsky et
al. 1991; Dubovsky et al. 1992; Emamghoreishi et al. 2000; Emamghoreishi et al. 1997;
Hough et al. 1999) e sódio (Coppen et al. 1966; Shaw 1966) intracelular e decréscimo
28
na atividade da bomba de sódio (Looney & El-Mallakh 1997). Além disso, os cérebros
de indivíduos portadores de transtorno bipolar podem expressar menores níveis da
subunidade alfa-2 da bomba de sódio (Rose et al. 1998).
A ouabaína, um potente inibidor da bomba de sódio, é uma substância já
consolidada como indutora de um estado similar ao de mania em ratos, tendo sido
empregada em vários estudos (El-Mallakh et al. 2003; Herman et al. 2007; Riegel et al.
2009). Contudo, ainda não existe um protocolo para a indução de um estado de mania
induzido por ouabaína em camundongos. Do ponto de vista da pesquisa, o uso de
camundongos é mais viável para alguns laboratórios, pois apresentam menor custo de
manutenção, sendo animais muito prolíferos e que não ocupam tanto espaço quanto os
ratos, daí a importância de se padronizar um modelo experimental utilizando esse
animal.
Os episódios de mania são também marcados por uma variedade de sintomas,
incluindo grandiosidade e verborragia, que são extremamente difíceis de inferir a partir
do comportamento de roedores. Por isso, o aumento da atividade motora continua sendo
o parâmetro comportamental mais avaliado pelos modelos animais. Contudo, cabe
ressaltar que a hiperlocomoção dos roedores não é exclusividade dos modelos de mania,
sendo este mesmo comportamento também aferido em modelos animais para outros
transtornos psiquiátricos, como esquizofrenia e transtorno de déficit de atenção e
hiperatividade (TDAH) (Young et al. 2011). Portanto, a busca por modelos de mania
que avaliam comportamentos específicos e que apresentem validade aparente, preditiva
e de construto são imprescindíveis para o estudo da fisiopatologia do transtorno bipolar.
Considerando que a hiperatividade é um sintoma característico e está presente
em quase todos os estados maníacos (90%), seguido pela irritabilidade (ocorrendo em
71% dos pacientes), diminuída necessidade de sono e hiperverbosidade, espera-se que
29
um modelo ideal de mania seja baseado na avaliação de comportamentos relacionados a
estes sintomas. Já sintomas como hipersexualidade e religiosidade são menos frequentes
nos pacientes em mania (40-50% dos casos) (Goodwin & Jamison 2007).
Um outro sintoma encontrado nos quadros de mania é o aumento do vigor e
dos comportamentos direcionados a um objetivo específico (socialmente, no trabalho,
na escola ou sexualmente) (DSM-V, 2013), e tem-se sugerido que a sua ocorrência
estaria associada a uma hiperatividade do sistema dopaminérgico (Cousins et al. 2009).
Dada a variedade de sintomas apresentados pelos pacientes na fase de mania e
a dificuldade de se obter um modelo que englobe todos os aspectos da doença, uma
possível abordagem a ser utilizada na pesquisa seria o uso de vários modelos em uma
bateria de testes, de modo a avaliar os diversos comportamentos indicativos de mania
para que, assim, se consiga fazer uma completa caracterização deste quadro em animais.
Deste modo, modelos que apresentam validade aparente de maneira parcial (como o
modelo de hiperlocomoção induzida por psicoestimulantes ou o modelo do residente-
intruso, por exemplo), quando combinados, podem levar a uma caracterização muito
mais confiável do real estado do animal.
Nos anos 60, foi proposto o teste do hole board, aparato que consiste em uma
arena com buracos no piso, nos quais o animal pode introduzir a cabeça,
comportamento conhecido como “imersão de cabeça” (head-dipping) (File & Wardill
1975b; File & Wardill 1975a). A frequência e duração dos head-dippings são tidas
como medidas de neofilia ou exploração direcionada que são independentes da
atividade locomotora geral do animal (File & Wardill 1975b; Ljungberg & Ungerstedt
1976) e, de fato, existem estudos mostrando que a locomoção e a quantidade de head-
dippings podem variar independentemente entre si (Abel 1995; Durcan & Lister 1989).
Em geral, altos níveis de head-dippings são interpretados como indicativos de neofilia,
30
enquanto baixos níveis podem ser resultado de falta de neofilia ou, ainda, reflexo de um
comportamento do tipo ansioso por parte do animal (Crawley 1985; Takeda et al.
1998), motivo pelo qual este teste tem sido usado largamente na pesquisa de substâncias
ansiolíticas.
Como o aumento do comportamento exploratório e direcionado a objetivos são
sintomas característicos dos quadros maníacos, o uso do hole board poderia ser cotado
como um novo modelo animal para a pesquisa de mania, fornecendo informações sobre
esses tipos de comportamentos através da medida da interação do animal com os furos
do aparato que, em conjunto com outros aspectos demonstrados durante o teste,
formassem um quadro característico de mania que poderia ser prevenido pelo
tratamento com estabilizadores do humor.
Em suma, não existe um modelo animal apropriado para o estudo do transtorno
bipolar, nem mesmo para os episódios maníacos. Portanto, o desenvolvimento de novos
modelos é de grande importância para o estudo da fisiopatologia do transtorno bipolar,
do ponto de vista molecular, comportamental e funcional (Gavioli et al., 2009), além de
propiciar o desenvolvimento de medicamentos melhores aos utilizados atualmente na
clínica. Deste modo, o presente trabalho visa apresentar modelos de mania alternativos
aos já existentes, através da padronização do modelo de hiperatividade produzido pela
disfunção da enzima Na+/K
+-ATPase, já empregado com sucesso em ratos, usando
camundongos como sujeitos experimentais. Além disso, iremos apresentar uma nova
abordagem do já conhecido hole board como um modelo para a mensuração de
comportamentos do tipo maníacos. Ainda, visando avaliar a participação do receptor
NOP na modulação de estados de mania, este estudo objetivou investigar o efeito do
agonista endógeno do receptor NOP, a N/OFQ, em comportamentos do tipo maníacos
em camundongos.
31
METODOLOGIA
2.1 Animais
Foram empregados camundongos Swiss machos (25-30 g) provenientes do
biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Os animais foram alojados em, no máximo, quinze por caixa (40 x 33
x 17 cm), com livre acesso a comida e água, e mantidos em um ciclo claro-escuro de 12
horas (6:00-18:00 h), a uma temperatura ambiente de 23°C 1oC. Todos os
procedimentos experimentais foram executados de acordo com as recomendações da
Lei nº 11.794 de 08/10/2008 (Lei Arouca) e foram aprovados pela Comissão de Ética no
Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Protocolo
nº 040/2012; 041/2014).
2.2 Drogas e tratamentos
Para este estudo, foi utilizado o agonista peptídico do receptor NOP, a N/OFQ,
doado pelo Prof. R. Guerrini (Dept. of Biotechnology and Pharmaceutical Chemistry,
University of Ferrara, Itália). O peptídeo foi diluído em solução salina e mantido a -
20ºC em solução estoque. Imediatamente antes do teste, uma alíquota de solução
estoque foi diluída em salina para se chegar à dose desejada, que foi administrada por
via icv no volume de 2µl.
Na etapa que objetivou verificar o efeito de um ansiolítico clássico no hole
board, foi usado o diazepam em solução injetável (Compaz®, Cristália) na dose de 1
32
mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, diluído em solução salina. O grupo controle
recebeu apenas solução salina pela mesma via de administração.
Para a indução de um estado similar ao de mania induzido por ouabaína em
camundongos, foram avaliados os efeitos comportamentais das seguintes concentrações:
10-2
, 10-3
, 10-4
, 10-5
e 10-6
M de ouabaína (Sigma-Aldrich), diluída em solução salina e
injetada por via intracerebroventricular (icv), no volume de 2 µl. Os animais controle
foram tratados com solução salina pela mesma via de administração.
Para a padronização do modelo do hole board, foi feita a indução de um estado
de mania nos animais através da administração de metilfenidato (Ritalina®
, Novartis) na
dose de 10 mg/kg, 15 minutos antes do teste. A escolha desta droga justifica-se pelo fato
de que a hiperatividade induzida por anfetamínicos é considerada o padrão-ouro para
indução de mania em roedores (Berggren et al. 1978; Gould et al. 2001), ainda que as
alterações comportamentais induzidas em animais não sejam exatamente as mesmas
apresentadas por humanos quando na fase de mania (Silverstone et al. 1998). Para a
avaliação da prevenção dos sintomas de mania, foi utilizado o valproato de sódio
(Valpakine®, Sanofi Aventis) na dose de 300 mg/kg, e o mesmo foi administrado 45
minutos antes do teste (30 minutos previamente à administração de metilfenidato) por
via intraperitoneal. Solução salina foi usada como controle, assim como meio de
diluição de ambas as drogas.
2.3 Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular em
camundongos
Os animais foram anestesiados com ketamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg
ip (intraperitoneal) para a implantação de uma cânula no cérebro através do emprego de
33
um aparelho estereotáxico. A pele da região craniana foi removida para facilitar a
visualização do bregma, que serviu de ponto de partida para a orientação das
coordenadas. Uma cânula-guia de 8 mm foi implantada unilateralmente no ventrículo
lateral (VL) de acordo com as seguintes coordenadas: AP -0.6 mm; ML ±1.1 mm; DV -
1.0 mm. A cânula foi fixada com acrílico e pontos foram aplicados a fim de fechar a
incisão. Todo o procedimento foi executado sob condições de higiene e o local da
incisão foi tratado com o agente antisséptico iodo-povidine. Logo após o procedimento
cirúrgico, os animais receberam uma injeção do anti-inflamatório diclofenaco sódico
(10 mg/kg, uma dose por via subcutânea) e do antibiótico oxitetraciclina (2 mg/kg,
intramuscular), a fim de evitar infecções e atenuar a dor causada pelo procedimento.
Três a cinco dias após a cirurgia, os camundongos foram submetidos aos testes
comportamentais conforme descrição abaixo. Para a administração de ouabaína e da
N/OFQ, os animais foram manualmente imobilizados e receberam as soluções pela via
intracerebroventricular (icv) com o auxílio de uma agulha (cujo comprimento excede 1
mm a cânula-guia) ligada a um tubo de polietileno, que por sua vez era conectado a uma
microseringa de Hamilton, através da cânula-guia anteriormente implantada. Foram
injetados 0,5µl da substância a ser testada a cada 30 segundos (volume total: 2µl) e,
após a injeção completa, foi dado um tempo mínimo de 15 segundos antes de retirar a
agulha injetora de dentro da cânula, de modo a garantir que todo o conteúdo injetado
fosse difundido. Após o tratamento, os camundongos foram submetidos à análise
comportamental no campo aberto ou no hole board.
34
2.4 Testes comportamentais
2.4.1 Campo aberto
Os camundongos foram submetidos ao teste do campo aberto 5 minutos após a
administração da ouabaína, por via icv, e permaneceram no aparelho por 30 minutos,
sendo este período dividido em blocos de 5 minutos cada. Este teste foi realizado em
uma caixa de fórmica quadrada medindo 40 cm x 40 cm e cercada por paredes de 40 cm
de altura. Os animais foram submetidos individualmente a 30 minutos de exploração do
aparelho e, durante este período, foram avaliados pelo video tracking AnyMaze
(Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA) quanto aos seguintes parâmetros
comportamentais: distância percorrida pelo animal (em metros) e tempo de imobilidade
(em segundos).
2.4.2 Hole board
Os animais foram postos no centro de um tabuleiro medindo 40 cm x 40 cm e
cercado por paredes de 35 cm de altura. O tabuleiro conta com 16 furos de 3 cm de
diâmetro, sendo 4 centrais e 12 periféricos, e está suspenso a 5 cm do chão. Para a
execução deste teste, os animais foram avaliados por 10 minutos. Durante esse tempo,
foram medidos parâmetros como a distância total percorrida, distância percorrida no
centro e tempo no centro através do software AnyMaze (Stoelting Co., Wood Dale, IL,
USA). Após os experimentos, os vídeos foram avaliados por um observador quanto ao
número de interações com os furos no tabuleiro e cálculo da porcentagem da distância
percorrida no centro em relação à distância total percorrida (dividiu-se a distância
35
percorrida no centro dividida pela distância total percorrida e o resultado foi
multiplicado por 100). Considera-se interação tanto quando o animal examina o furo,
quanto quando ele imerge a cabeça dentro deste pelo tempo mínimo de
aproximadamente 1 segundo. Foi registrado o número de interações com os furos
centrais e periféricos. Nas situações em que o animal interagiu com um furo, retirou a
cabeça e voltou a interagir com o mesmo em até 3 segundos, registrou-se apenas uma
interação. Além disso, foi medida a frequência de levantamento de patas dianteiras
(rearings), tanto no tabuleiro quanto nas paredes do aparato. Os animais que porventura
acessaram a parte de baixo do tabuleiro por algum buraco e passaram mais de 2 minutos
fora do alcance da câmera foram excluídos do teste (aproximadamente 7% dos animais
testados).
2.5 Desenho experimental
2.5.1.Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania induzido pela
administração de ouabaína em camundongos
A ouabaína foi administrada nas seguintes concentrações: 10-2
, 10-3
, 10-4
, 10-5
e
10-6
M, por via intracerebroventricular (2 µl). A administração foi feita através da
cânula previamente implantada no ventrículo lateral. Cinco minutos após a
Figura 2. Foto de camundongo
durante o teste do hole board.
Figura 2. Foto de camundongo
durante o teste do hole board.
36
administração da ouabaína, a atividade locomotora do animal foi medida no teste do
campo aberto por 30 minutos. A tabela abaixo ilustra os tratamentos da etapa I:
Tabela 1 – Esquema de tratamento adotado na etapa I
Grupo Número de
animais
Tratamento icv
Volume
A 6-12 Salina
2 μL
B 6-12 Ouabaína 10-2
M
C 6-12 Ouabaína 10-3
M
D 6-12 Ouabaína 10-4
M
E 6-12 Ouabaína 10-5
M
F 6-12 Ouabaína 10-6
M
2.5.2 Etapa II – Padronização do hole board como um modelo para se avaliar
a mania
Quinze minutos após a administração de salina ou metilfenidato na dose de 10
mg/kg, os animais foram submetidos ao hole board por 10 minutos. Após a
caracterização do comportamento animal decorrente da administração de metilfenidato
neste modelo, o mesmo foi validado através da utilização de valproato de sódio (300 ou
400 mg/kg, ip), um estabilizador do humor. Para isso, os animais foram pré-tratados
com valproato de sódio e, após 30 minutos, foi administrado o metilfenidato, ambos por
via intraperitoneal. Após 15 minutos, os animais foram submetidos ao hole board, onde
ficaram por 10 minutos. A tabela abaixo ilustra os tratamentos da etapa 2:
Tabela 2 – Esquema de tratamento adotado na etapa II:
Grupo Número de
animais
Pré-tratamento
ip
Dose
(volume)
Tratamento
ip
Dose
(volume)
A 6-12
Controle
(0,1 ml/10 g)
Controle (0,1
ml/10 g)
37
B 6-12
Controle
(0,1 ml/10 g)
Metilfenidato
10
mg/kg
(0,1
ml/10 g)
C 6-12
Valproato de
sódio
300 mg/kg
(0,1 ml/10 g)
Controle (0,1
ml/10 g)
D 6-12
Valproato de
sódio
300 mg/kg
(0,1 ml/10 g)
Metilfenidato
10
mg/kg
(0,1
ml/10 g)
E 6-12
Valproato de
sódio
400 mg/kg
(0,1 ml/10 g)
Controle (0,1
ml/10 g)
F 6-12
Valproato de
sódio
400 mg/kg
(0,1 ml/10 g)
Metilfenidato
10
mg/kg
(0,1
ml/10 g)
2.5.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do
receptor NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania
induzido por metilfenidato no hole board
Visando avaliar o efeito do tratamento com o agonista do receptor NOP, a
N/OFQ, no comportamento de camundongos no hole board, uma cânula foi implantada
no ventrículo lateral dos animais. Após 3 a 5 dias, os mesmos foram pré-tratados com
salina ou N/OFQ nas doses de 0,1 ou 1 nmol (2 μL) e, 5 minutos depois, tratados com
metilfenidato (10 mg/kg) ou salina. Após 15 minutos, os animais foram expostos ao
teste do hole board durante 10 min. O desenho experimental se desenvolveu de acordo
com a tabela abaixo:
Tabela 3 – Esquema de tratamento adotado na etapa III:
Grupo Número de
animais
Pré-tratamento
icv
Dose
(volume)
Tratamento
ip
Dose
(volume)
A 6-12
Controle
(2 μL)
Controle (0,1
ml/10 g)
38
B 6-12
Controle
(2 μL)
Metilfenidato
10
mg/kg
(0,1
ml/10 g)
C 6-12
N/OFQ 0,1 ou 1 nmol
(2 μL)
Controle (0,1
ml/10 g)
D 6-12
N/OFQ
0,1 ou 1 nmol
(2 μL)
Metilfenidato
10
mg/kg
(0,1
ml/10 g)
2.6 Análise estatística
Todos os dados foram apresentados como média erro padrão da média.
Dependendo da etapa experimental analisada, as diferenças entre os grupos
experimentais foram determinadas por ANOVA de uma via seguida pelo teste de
Newman-Keuls para comparações múltiplas ou ANOVA de duas vias (considerando os
seguintes fatores: [1] pré-tratamento com valproato e [2] tratamento com metilfenidato)
e análise pós-hoc usando o teste de LSD. O nível de significância assumido neste estudo
foi para valores de P≤0,05. Para a realização das análises estatísticas empregadas neste
estudo, foram utilizados os softwares Prism 5 (Graphpad) e Statistica 7.0 (Statsoft,
USA).
39
RESULTADOS
3.1 Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania promovido pela
administração de ouabaína em camundongos
A figura 3 ilustra o efeito do tratamento icv com ouabaína, em concentrações
crescentes, no desempenho locomotor de camundongos submetidos ao teste do campo
aberto durante 30 minutos de observação.
Ouabaína icv
0-5
min
5-10
min
10-1
5 m
in
15-2
0 m
in
20-2
5 m
in
25-3
0 m
in
5
10
15
20
25
ouabaína 10-6 M
ouabaína 10-5 M
salina
ouabaína 10-4 M
Dis
tân
cia
(m
)
Figura 3. Efeito do tratamento com ouabaína nas concentrações de 10-6
, 10-5
e 10-4
M, por via
intracerebroventricular, na distância percorrida por camundongos no teste do campo aberto durante 30
minutos de observação. A dose de 10-2
M causou morte dos animais, enquanto a de 10-3
M causou um
estado de pré-convulsão (dados não mostrados). As barras representam a média erro padrão da média.
Cada grupo é constituído por 6-12 animais.
Como se pode observar, nenhuma das concentrações testadas promoveu um
aumento significativo na distância total percorrida por camundongos, efeito que seria
característico de um estado similar ao de mania. Deste modo, não foi possível
prosseguir com a padronização do modelo de indução de um estado similar ao de mania
através da injeção icv de ouabaína em camundongos.
40
3.2 Etapa II – Padronização do hole board como um teste para se avaliar a mania
Como um estágio prévio a esta etapa, foi realizada uma análise da atividade
locomotora espontânea dos animais, de modo a mensurar se os tratamentos, per se,
produziam algum efeito nesta função. Para isso, os animais passaram pelo teste do
campo aberto por 30 minutos, onde foram avaliados os parâmetros distância percorrida
e tempo de imobilidade. Os resultados encontram-se na tabela abaixo:
Tabela 4. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg e metilfenidato na dose de
10 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância percorrida por camundongos no teste do
campo aberto durante 30 minutos de observação. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs.
controle e #p≤0,05 vs. metilfenidato 10 mg/kg. ANOVA de uma via seguida do teste de Newman-Keuls.
Grupos
(0,1 ml/10g – via i.p.)
Distância percorrida (m)
Média±erro padrão
Tempo de imobilidade (s)
Média±erro padrão
Controle 46,74±5,67 1045,17±64,49
Valproato 300 mg/kg 70,08±14,37* 1095,38±137,58
Valproato 400 mg/kg 43,66±5,73 1161,28±117,04*
Metilfenidato 10 mg/kg 175,04±19,69* 231,28±50,33
*
Valproato 300 mg/kg +
Metilfenidato 10 mg/kg
242,36±13,69*#
129,98±46,10*#
Valproato 400 mg/kg +
Metilfenidato 10 mg/kg
104,75±11,05*#
810,12±109,41*#
Como demonstrado na tabela acima, apenas a dose de 400 mg/kg de valproato
foi capaz de prevenir o efeito hiperlocomotor causado pela administração de
metilfenidato 10 mg/kg. Contrariamente, o valproato na dose 300 mg/kg potencializou o
efeito do metilfenidato na hiperlocomoção e redução do tempo de imobilidade dos
animais.
Posteriomente, foi feita a caracterização do efeito do metilfenidato 10 mg/kg
no teste do hole board, a fim de avaliar quais comportamentos foram afetados com o
tratamento.
41
A figura 4 mostra a quantidade de interações dos animais nos furos do centro
(A) e na periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D),
distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) durante os 10 minutos de teste.
O grupo tratado com metilfenidato 10 mg/kg apresentou uma quantidade
significativamente maior de interações com os furos centrais e periféricos que o
controle.
0
10
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controle
metilfenidato 10 mg/kg
*
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Tem
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gasto
no
cen
tro
(s)
0-1
0 m
in
A) B)
C) D)
F) E)
42
Figura 4. Efeito do tratamento com metilfenidato na dose de 10 mg/kg (0,1 ml/10g), por via
intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do centro (A) e da periferia (B), a distância total
percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do
tabuleiro durante os 10 minutos de observação. As barras representam a média erro padrão da média.
Cada grupo é constituído por 6-12 animais. ***
p≤0,001 vs. controle; *p≤0,05 vs. controle. Student teste T
independente.
Observando os gráficos, podemos inferir que o grupo tratado com
metilfenidato 10 mg/kg apresentou uma quantidade significativamente maior de
interações com os furos centrais (A) e periféricos (B) que o controle. Com relação à
distância total percorrida (C), o metilfenidato foi capaz de aumentar significativamente
a locomoção dos animais, enquanto reduziu significativamente a quantidade de rearings
(D), sinalizando que, ao contrário da atividade exploratória horizontal, o metilfenidato
provoca uma diminuição da atividade exploratória vertical. Em (E), podemos ver a
porcentagem da distância percorrida no centro em relação à distância total percorrida
pelos animais dos grupos controle e metilfenidato e em (F), o tempo gasto no centro
pelos animais. Nos dois parâmetros, a diferença entre os grupos não foi significativa,
embora haja uma tendência ao aumento no tempo gasto no centro pelos animais tratados
com metilfenidato (p=0,09).
Após a padronização dos comportamentos induzidos pelo metilfenidato,
investigou-se o perfil de ação do valproato, nas doses de 300 e 400 mg/kg, no
comportamento dos animais submetidos ao hole board. A figura 5 mostra a quantidade
de interações dos animais com os furos do centro (A) e periferia (B), a distância total
percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo
no centro (F) durante os 10 minutos de teste.
43
0
10
20
30
salina
valproato 300 mg/kg
valproato 400 mg/kg
*
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)
0-1
0 m
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20
40
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*
Tem
po
gasto
no
cen
tro
(s
)
0-1
0 m
in
Figura 5. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via
intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do centro (A) e da periferia (B), a distância total
percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do
tabuleiro durante os 10 minutos de observação no hole board. As barras representam a média erro
padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs. controle. ANOVA de uma via
seguida do teste de Newman-Keuls.
Podemos notar que a dose de 400 mg/kg reduziu significativamente as
interações com os furos (A) centrais (F(2,37) = 5,29) e (B) periféricos (F(2,37) = 6,88) do
tabuleiro. Assim como demonstrado no teste do campo aberto, o valproato na dose de
A) B)
C) D)
F) E)
44
300 mg/kg aumentou significativamente a locomoção total (C) dos animais no hole
board (F(2,37) = 16,48). Também houve um aumento significativo com relação ao
número de rearings efetuados (D) pelos animais (F(2,37) = 76,00). Não foram
encontradas diferenças entre os grupos com relação à porcentagem da distância
percorrida no centro em relação à distância total (E), porém, com relação ao tempo
gasto no centro (F), tal parâmetro foi significativamente reduzido pelo tratamento com
valproato 400 mg/kg (F(2,37) = 3,80).
Feitas as caracterizações do perfil do metilfenidato e valproato no hole board, a
próxima etapa foi testar o efeito da associação entre essas duas substâncias, a fim de
saber se a administração prévia de valproato ao metilfenidato seria capaz de prevenir as
alterações comportamentais causadas pelo mesmo nos animais.
A figura 6 mostra a quantidade de interações com os furos do centro (A) e da
periferia (B) do tabuleiro durante os 10 minutos de observação. A associação do
metilfenidato 10 mg/kg com o valproato, nas duas doses, foi capaz de prevenir o
aumento na interação com os furos centrais provocados pelo metilfenidato (ANOVA de
duas vias, pré-tratamento com valproato: F(2,64) = 5,01, p≤0,05; tratamento com
metilfenidato: F(1,64) = 5,72, p≤0,05). Ao contrário, com relação à quantidade de
interações com os furos periféricos, a associação do metilfenidato 10 mg/kg com o
valproato, nas duas doses, apresentou resultado semelhante ao grupo metilfenidato 10
mg/kg + controle.
controle valproato 300 mg/kg valproato 400 mg/kg0
10
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30
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metilfenidato 10 mg/kg*
##
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metilfenidato 10 mg/kg*
Pré-tratamentos
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0 m
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Figura 6. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg associado com valproato nas doses de 300 e
400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na interação com os furos centrais (A) e periféricos (B)
do tabuleiro efetuado por camundongos durante 10 minutos de observação no hole board. As barras
representam a média erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs.
controle + controle e #p≤0,05 vs. metilfenidato + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.
A figura 7 mostra a distância total percorrida (A) e o número de rearings (B)
efetuados pelos animais no hole board durante os 10 minutos de teste. Em (A),
percebe-se que a associação metilfenidato 10 mg/kg + valproato, nas duas doses
testadas, tem resultado significativamente maior do que a associação metilfenidato 10
mg/kg + controle.
Já quanto ao número de rearings, o grupo tratado com a dose de 10 mg/kg de
metilfenidato não demonstrou uma redução significativa na quantidade destes, enquanto
que o tratamento com valproato, nas duas doses, foi capaz de restabelecer a atividade
exploratória vertical dos animais reduzida pelo tratamento com metilfenidato (ANOVA
de duas vias, pré-tratamento com valproato: F(2,64) = 10,44, p≤0,05).
controle valproato 300 mg/kg valproato 400 mg/kg0
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controle
metilfenidato 10 mg/kg
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B)
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metilfenidato 10 mg/kg
# #
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Figura 7. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg associado com valproato nas doses de 300 e
400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância total percorrida (A) e no número de rearings
efetuados (B) por camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação. As barras
representam a média erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. ***
p≤0,001 vs.
controle + controle; ###
p≤0,001 vs. metilfenidato + controle; #p≤0,05 vs. metilfenidato + controle.
ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.
A figura 8 mostra a porcentagem da distância percorrida no centro em relação à
distância total percorrida (A) e o tempo gasto no centro do tabuleiro (B) pelos animais
no hole board durante os 10 minutos de teste. O metilfenidato aumentou
significativamente a distância percorrida no centro do aparato. O pré-tratamento com
valproato na dose de 300 mg/kg preveniu significativamente o aumento da porcentagem
de tempo gasto no centro induzido pelo metilfenidato (ANOVA de duas vias, pré-
tratamento com valproato: F(2,64) = 3,08, p≤0,05), e tal efeito também tende a ser
prevenido pelo pré-tratamento com a dose de 400 mg/kg (p=0,07).
Quanto ao tempo gasto no centro do tabuleiro, não houve diferença entre
nenhum dos grupos testados, embora haja uma tendência, novamente, que o grupo
controle + metilfenidato seja significativamente diferente do grupo controle + controle
(p=0,06).
B)
47
controle valproato 300 mg/kg valproato 400 mg/kg0
5
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25controle
metilfenidato 10 mg/kg
#*
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controle valproato 300 mg/kg valproato 400 mg/kg0
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metilfenidato 10 mg/kg
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Figura 8. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg associado com valproato nas doses de 300 e
400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância percorrida (A) e no tempo gasto (B) no
centro do tabuleiro por camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação. As barras
representam a média erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs.
controle + controle e #p≤0,05 vs. metilfenidato + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.
Devido a um efeito ansiolítico já descrito na literatura para o valproato, e
levando em conta os resultados encontrados, onde a dose de 300 mg/kg foi capaz de
aumentar a atividade exploratória tanto horizontal quanto vertical dos animais sem
afetar o número de interações com os buracos do tabuleiro, foi incluído no estudo um
grupo experimental tratado com diazepam 1 mg/kg (0,1 ml/10g), um fármaco ansiolítico
clássico, a fim de avaliar o efeito deste tratamento no comportamento dos animais no
hole board e servir de comparação para os demais grupos aqui estudados.
A figura 9 mostra a quantidade de interações dos animais nos furos do centro
(A) e periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância
A)
B)
48
percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) durante os 10 minutos de teste pelos
animais tratados com diazepam em comparação ao grupo controle.
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diazepam 1 mg/kg
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Figura 9. Efeito do tratamento com diazepam na dose de 1 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal,
nas interações com os furos do centro (A) e da periferia (B) do aparato durante os 10 minutos de
observação no teste do hole board. As barras representam a média erro padrão da média. Cada grupo é
constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs. controle;
**p≤0,01 vs. controle. Student teste T independente.
Como podemos ver no gráfico, o tratamento com diazepam foi incapaz de
modificar a quantidade de interações com os furos centrais (A), ao passo que aumentou
A) B)
C) D)
F) E)
49
significativamente a quantidade de interações com os furos da periferia (B). Em (C),
podemos ver a atividade exploratória horizontal, mensurada pela distância total
percorrida e em (D), a vertical, mensurada pela quantidade de rearings. Como já
esperado, devido ao seu efeito ansiolítico, o diazepam foi capaz de aumentar
significativamente a locomoção dos animais, enquanto que, com relação ao número de
rearings, não houve diferenças entre os grupos. Em (E), podemos ver a porcentagem da
distância percorrida no centro em relação à distância total percorrida, onde nota-se que
não houve mudança de perfil do animal em decorrência da administração de diazepam
e, em (F), o tempo gasto no centro do tabuleiro do hole board pelos animais, que foi
significativamente aumentado no grupo que recebeu diazepam em relação ao controle.
3.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do receptor
NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania induzido por
metilfenidato no hole board
Para a avaliação dos efeitos do peptídeo nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) em
animais submetidos ao hole board, foi seguido o mesmo protocolo da etapa II, apenas
substituindo-se a administração ip de valproato pela administração icv do peptídeo nas
doses testadas.
Primeiramente foi feita a caracterização do perfil apresentado pelos animais
após a injeção da N/OFQ. As doses testadas foram as de 1 e 0,1 nmol, por via icv (2µl).
A figura 10 mostra o padrão de exploração dos furos do tabuleiro no centro
(A) e na periferia (B) a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D),
distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) durante os 10 minutos de teste
50
pelos animais que receberam as diferentes doses de N/OFQ. Não houve diferença entre
os grupos testados em nenhum dos parâmetros mensurados.
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controle
N/OFQ 0,1 nmol
N/OFQ 1 nmol
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no
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0 m
in
Figura 10. Efeito do tratamento com N/OFQ nas doses de 0.1 e 1 nmol, por via intracerebroventricular,
na quantidade de interações com os furos no centro (A) e periferia (B) do tabuleiro no teste do hole board
durante 10 minutos de observação. As barras representam a média erro padrão da média. Cada grupo é
constituído por 6-12 animais. ANOVA de uma via.
A) B)
C) D)
F) E)
51
Após a caracterização do perfil apresentado pelos animais que receberam o
peptídeo nas duas doses, a próxima etapa foi testar a associação deste com o
metilfenidato a fim de verificar se a sua administração prévia, assim como a do
valproato na etapa anterior, também seria capaz de prevenir as alterações causadas pelo
metilfenidato nos animais.
Na figura 11, são apresentados os resultados da avaliação da quantidade de
interações com os furos no centro (A) e periferia (B) do tabuleiro pelos animais durante
os 10 minutos de teste. Não foram encontradas diferenças entre os grupos pré-tratados
com N/OFQ que posteriormente receberam metilfenidato e o grupo controle +
metilfenidato em nenhum dos dois parâmetros (ANOVA de duas vias, tratamento com
metilfenidato: F(1,64) = 10,51, p≤0,05).
controle N/OFQ 0.1 nmol N/OFQ 1 nmol0
10
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50controle
metilfenidato 10 mg/kg***
Nº
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0 m
in
controle N/OFQ 0.1 nmol N/OFQ 1 nmol0
30
60
90
120
controle
metilfenidato 10 mg/kg
Pré-tratamentos
Nº
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tera
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a
0-1
0 m
in
A)
B)
52
Figura 11. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg (0,1 ml/10g) associado com N/OFQ nas
doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via intracerebroventricular, na quantidade de interações dos
camundongos com os furos no centro (A) e periferia (B) do tabuleiro no teste do hole board durante 10
minutos de observação. As barras representam a média erro padrão da média. Cada grupo é constituído
por 6-12 animais. ***
p≤0,001 vs. controle + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.
A figura 12 mostra a distância total percorrida (A) e a quantidade de rearings
efetuados (B) pelos grupos analisados no hole board durante os 10 minutos de teste.
Percebe-se que a N/OFQ, nas duas doses, não foi capaz de prevenir o aumento da
locomoção total induzido pelo metilfenidato, como podemos ver em comparação com o
grupo controle + metilfenidato (ANOVA de duas vias, tratamento com metilfenidato:
F(1,64) = 24,86, p≤0,05). Quanto ao número de rearings, também não houve diferença
entre ambos os grupos que receberam N/OFQ e metilfenidato e o grupo controle +
metilfenidato (ANOVA de duas vias, tratamento com metilfenidato: F(1,64) = 7,18,
p≤0,05).
controle N/OFQ 0.1 nmol N/OFQ 1 nmol0
10
20
30
40
salina
metilfenidato 10 mg/kg
***
**
Pré-tratamentos
DIs
tân
cia
to
tal p
erc
orr
ida
(m)
0-1
0 m
in
controle N/OFQ 0.1 nmol N/OFQ 1 nmol0
10
20
30salina
metilfenidato 10 mg/kg
**
Pré-tratamentos
Nº
de r
eari
ng
s
0-1
0 m
in
Figura 12. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg (0,1 ml/10g) associado com N/OFQ nas
doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via intracerebroventricular, na distância total percorrida (A) e quantidade
A)
B)
53
de rearings (B) no teste do hole board durante 10 minutos de observação. As barras representam a média
erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs. controle + controle e
**p≤0,01 vs. controle + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.
A figura 13 mostra a porcentagem da distância percorrida no centro em relação
à distância total percorrida (A) e o tempo gasto no centro do tabuleiro (B) pelos animais
durante os 10 minutos de teste. A administração de metilfenidato conseguiu induzir um
aumento significativo na distância percorrida no centro em comparação ao grupo
controle (ANOVA de duas vias, tratamento com metilfenidato: F(1,48) = 12,73, p≤0,05).
Já com relação ao tempo gasto no centro, não houve diferenças entre os grupos N/OFQ
+ metilfenidato, nas duas doses, e o grupo controle + metilfenidato.
controle N/OFQ 0.1 nmol N/OFQ 1 nmol0
5
10
15
20
25
***
metilfenidato 10 mg/kg
controle
*
Pré-tratamentos
Dis
tân
cia
pe
rco
rrid
a n
o c
en
tro
(%
)
0-1
0 m
in
controle N/OFQ 0.1 nmol N/OFQ 1 nmol0
20
40
60
80
100controle
metilfenidato 10 mg/kg*
Pré-tratamentos
Tem
po
gasto
no
cen
tro
(s)
0-1
0 m
in
Figura 13. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg (0,1 ml/10g) associado com N/OFQ nas
doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via intracerebroventricular, na distância percorrida (A) e tempo gasto
(B) no centro do tabuleiro por camundongos submetidos ao hole board durante 10 minutos de
observação. As barras representam a média erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12
animais. *p≤0,05 vs. controle + controle e
***p≤0,001 vs. controle + controle. ANOVA de duas vias
seguida do teste de LSD.
A)
B)
54
A tabela 5 apresenta um resumo dos resultados encontrados em todos os
experimentos. As comparações da tabela são feitas com o grupo controle, exceto nos
tratamentos que envolveram associações de fármacos, onde a comparação é feita em
relação ao grupo controle + metilfenidato 10 mg/kg.
55
Tabela 5: Resumo dos efeitos das substâncias testadas no hole board.
Interações Locomoção Exposição ao risco
Tratamento Interações
centrais
Interações
periféricas
Horizontal
total
Vertical
(rearings)
Distância
no centro
(%)
Tempo
no
centro
Metilfenidato
10 mg/kg
Valproato
300 mg/kg
Valproato
400 mg/kg
Diazepam 1
mg/kg
N/OFQ 0,1
nmol
N/OFQ 1
nmol
Valproato
300 mg/kg +
metilfenidato
Preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Preveniu as
alterações
causadas
pelo
metil-
fenidato
Valproato
400 mg/kg +
metilfenidato
Preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Preveniu as
alterações
causadas
pelo
metil-
fenidato
N/OFQ 0,1
nmol +
metilfenidato
Não
preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu
as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu
as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu
as
alterações
causadas
pelo
metilfe-
nidato
N/OFQ 1
nmol +
metilfenidato
Não
preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu
as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu
as
alterações
causadas
pelo metil-
fenidato
Não
preveniu
as
alterações
causadas
pelo
metil-
fenidato
56
DISCUSSÃO
O presente estudo objetivou propor novos testes para avaliar o comportamento
do tipo maníaco em camundongos e, também, verificar se o sistema peptidérgico da
N/OFQ estaria, de alguma maneira, envolvido na mediação deste comportamento. Os
resultados aqui apresentados sugerem que o hole board é um teste que, além de ser
usado para a avaliação de comportamentos ansiosos, também pode ser usado para a
avaliação de comportamentos maníacos. Entretanto, não foi possível padronizar o
modelo da disfunção da enzima Na+/K
+-ATPase através da administração de ouabaína
usando camundongos como sujeitos experimentais.
A indução de um estado de mania em animais usando a ouabaína foi descrita
inicialmente em 2003 por El-Mallakh e colaboradores. Tal modelo baseia-se na
disfunção da enzima Na+/K
+-ATPase, a qual é fortemente inibida pela administração
desta substância (El-Mallakh et al. 2003). Este estudo, assim como vários subsequentes
que reproduziram este modelo (Riegel et al. 2009; Herman et al. 2007), usou ratos como
sujeitos experimentais. O motivo pelo qual não foi possível transpor o modelo para o
camundongo pode ser devido ao fato deste comportamento (hiperlocomoção induzida
por ouabaína) ser replicável apenas em ratos, como já descrito para outros modelos
animais (para revisão: Anders & Vielhauer 2007). Estudos anteriores mostram um
efeito hiperlocomotor em ratos nas concentrações de 10-2
M e 10-3
M (El-Mallakh et al.
2003; Riegel et al. 2009). Enquanto isso, em camundongos, a concentração de 10-2
M
promoveu morte dos animais e a de 10-3
M levou a um estado de pré-convulsão, o que
mostra que este é um efeito variável entre espécies e não pode ser extrapolado.
Antes de iniciar os testes com o hole board, a fim de assegurar que as doses de
metilfenidato e valproato utilizadas neste estudo eram capazes de, respectivamente,
57
mimetizar e prevenir um estado do tipo maníaco, foi utilizado o teste do campo aberto
para avaliar a hiperlocomoção induzida por metilfenidato. Como já esperado por seu
efeito estimulante descrito na literatura (Young et al. 2011; Barbosa et al. 2011), o
metilfenidato foi capaz de aumentar a locomoção total e diminuir o tempo de
imobilidade dos animais. No entanto, o pré-tratamento com valproato, apenas na dose
de 400 mg/kg, preveniu o efeito hiperlocomotor induzido pelo metilfenidato no teste do
campo aberto, enquanto que a dose de 300 mg/kg pareceu potencializar seu efeito
estimulante, resultado anteriormente descrito por Barbosa et al. (2011).
Interessantemente, este estudo também mostrou que a administração repetida (14 dias)
de valproato na dose 300 mg/kg, ao contrário da administração aguda, foi capaz de
prevenir o efeito hiperlocomotor causado pelo metilfenidato (Barbosa et al. 2011). Per
se, o tratamento com valproato, na dose de 300 mg/kg, levou a um aumento da distância
modificou a distância percorrida, mas, em contrapartida, aumentou significativamente o
tempo de imobilidade dos animais. Não podemos descartar que o valproato esteja
exercendo algum tipo de efeito psicoestimulante, resultado que seria similar ao já
observado em outros estudos usando drogas como a morfina, por exemplo, que apesar
de produzir efeitos sedativos em humanos, causa efeito hiperlocomotor em
camundongos (ver: Villareal et al., 1973), o que reforça a necessidade de validação
deste modelo com outros estabilizadores do humor, de modo a retirar este viés do
estudo. No entanto, já é sabido que o valproato, além de suas ações como
anticonvulsivante, também apresenta potencial ansiolítico, conforme demonstrado em
vários modelos (de Angelis 1995; Dombrowski et al. 2006), e que sua administração
leva a um aumento de 15 a 45% nos níveis cerebrais de GABA, que pode ser mais ou
menos pronunciado dependendo da região cerebral. Esta alteração deve-se à modulação
de enzimas envolvidas no metabolismo do GABA pelo valproato (Johannessen 2000) e
58
explicaria o aumento na locomoção promovido pela dose de 300 mg/kg. Porém, como
qualquer substância ansiolítica que atua potencializando a neurotransmissão
GABAérgica, altas doses de valproato podem promover efeito sedativo, o que
contribuiria para explicar o aumento do tempo de imobilidade dos animais tratados com
a dose de 400 mg/kg.
Nos anos 60, foi proposto o teste do hole board, onde, em geral, altos níveis de
head-dippings (imersão de cabeça no buraco do tabuleiro) são vistos como indicativos
de neofilia ou de um comportamento secundário a um efeito do tipo ansiolítico
(Crawley 1985; Takeda et al. 1998). Por conta desta observação, o hole board vem
sendo extensivamente usado para a pesquisa de compostos que apresentam potencial
ansiolítico através do registro de comportamentos relacionados à exploração do aparato,
como a atividade locomotora total e no centro, assim como as imersões de cabeça.
Sendo um ansiolítico clássico, já é esperado que o diazepam promova um
aumento na quantidade de interações com os furos do tabuleiro, como já demonstrado
em outros trabalhos onde essa substância, em doses similares, foi capaz de aumentar a
quantidade de head-dippings (Crawley 1985; Takeda et al. 1998). Ademais, a dose
utilizada promoveu efeito ansiolítico sem sedação nos animais, como foi evidenciado
pelo aumento na locomoção total.
Neste estudo, feito usando camundongos expostos ao hole board, podemos ver
que o metilfenidato foi capaz de aumentar a distância percorrida total, um indicativo de
hiperatividade; aumentar o tempo gasto no centro, o que pode ser interpretado como
aumento do comportamento de risco; aumentar a interação com os furos centrais e
periféricos do aparato, o que não parece estar relacionado a um efeito ansiolítico e, sim
à exacerbação de um comportamento dirigido a um objetivo específico; e diminuir a
59
quantidade de rearings, o que poderia ser interpretado como prejuízo no julgamento
daquela situação, visto que o animal deixa de explorar as paredes do aparato, local de
onde poderia surgir alguma situação aversiva, para se focar na exploração dos furos,
principalmente centrais, potencialmente perigosos. Pode-se sugerir que as alterações
comportamentais induzidas pelo metilfenidato no hole board estão relacionadas ao
efeito psicoestimulante da droga.
Com relação aos resultados obtidos pelos grupos submetidos ao tratamento
com valproato, pode-se ver, principalmente na dose de 300 mg/kg, um potencial
ansiolítico, e um certo potencial sedativo no grupo tratado com a dose de 400 mg/kg,
exatamente como encontrado no campo aberto. Para se comprovar que os efeitos
encontrados no grupo que recebeu valproato 300 mg/kg eram de fato devido a um certo
grau de ansiólise, foi feita a comparação com diazepam 1 mg/kg, porém, limitada
similaridade foi observada entre os grupos. Deste modo, não podemos descartar que os
efeitos induzidos pelo valproato per se sejam de caráter estimulatório.
A associação de valproato com metilfenidato, em ambas as concentrações
testadas, foi capaz de prevenir diversos efeitos causados pela administração de
metilfenidato em camundongos, com destaque para a quantidade de interações com os
furos centrais, de rearings e na porcentagem da distância percorrida no centro. Todavia,
os demais parâmetros, apesar de não serem seletivamente afetados por metilfenidato,
podem ajudar a dar um maior suporte ao quadro de mania, já que representam sintomas
que se assemelham aos experimentados por pacientes maníacos.
Este teste permitiu registrar um parâmetro que pode estar relacionado com um
comportamento comum nos estados de mania, que é o comportamento “dirigido a um
alvo”, como é o caso da interação com os furos centrais do tabuleiro. Este estudo
60
concluiu que o aumento das interações com os furos centrais e a diminuição na
quantidade de rearings são os principais aspectos que permitem diferenciar um
comportamento do tipo ansiolítico de um comportamento maníaco neste teste, já que,
conforme demonstrado, a administração de diazepam foi incapaz de aumentar a
quantidade de interações dos animais com os furos centrais e não teve efeito sobre a
quantidade de rearings. Quanto ao uso do hole board como um teste para avaliação do
comportamento exploratório, alguns trabalhos já o utilizaram com este intuito, inclusive
com o uso de estabilizadores do humor como o lítio e o valproato. Tais trabalhos
mostraram que ambas as drogas per se, dependendo da dose, diminuem a quantidade de
head-dippings por parte do animal (Rao et al. 1991; O’Brien et al. 2004). Entretanto,
nenhum trabalho até hoje testou o uso destas substâncias no hole board após a indução
de um estado de mania. Nosso trabalho é inovador por propor um novo teste para o
estudo de um comportamento relacionado ao estado de mania e demonstrar a sua
prevenção com o uso de um estabilizador do humor.
A padronização do uso do hole board para o estudo da mania é de grande
importância, visto que a maioria dos modelos foca em um ou outro aspecto deste estado,
como, por exemplo, o modelo da hiperlocomoção induzida por psicoestimulantes ou o
modelo do residente-intruso (usado para visualizar a ocorrência de comportamentos
agressivos). O uso do hole board, contudo, permite a avaliação de diversos
comportamentos que, juntos, permitem traçar um quadro semelhante ao de mania em
animais. Os comportamentos avaliados podem ser divididos em 3 grandes classes:
comportamentos dirigidos a um alvo específico (mensurado pela quantidade de
interações com os furos), comportamento locomotor (locomoção horizontal e vertical) e
exposição ao risco (tempo gasto e porcentagem da distância percorrida no centro). Os
resultados obtidos com a administração de metilfenidato remetem aos sintomas
61
apresentados pelos pacientes num estado de mania, de acordo com a classificação do
DSM-V, visto que o animal apresenta um aumento das interações com os furos, tanto
centrais como periféricos (aumento da atividade dirigida a objetivos); aumento da
locomoção horizontal (agitação psicomotora); diminuição da locomoção vertical
(prejuízo no julgamento); e aumento da porcentagem de distância percorrida e do tempo
no centro (exposição a situações de risco) (DSM-V, 2013). Além disso, o estudo
permitiu inferir que alguns comportamentos foram seletivamente prevenidos (aumento
das interações com os furos no centro, diminuição na quantidade de rearings e aumento
da porcentagem de distância percorrida no centro) pela administração prévia de
valproato, um estabilizador de humor largamente usado na clínica e, portanto, tais
comportamentos podem ser considerados o “carro-chefe” deste teste.
Sendo assim, este estudo deu as primeiras evidências de que o hole board é um
teste potencialmente apto a apresentar validade aparente (mostra semelhança com os
sintomas observados na mania), preditiva (o teste responde a um fármaco usado no
tratamento da mania) e de construto (reproduz a etiologia e a fisiopatologia da doença).
Além disso, é um teste barato e de fácil execução, podendo ser adotado sem problemas
pela maioria dos laboratórios. Cabe ressaltar, no entanto, que os nossos estudos ainda
necessitam ser expandidos e é necessário verificar o perfil de outras substâncias usadas
no tratamento da mania (por exemplo: antipsicóticos atípicos, lítio, carbamazepina) para
que se possa estender a validação preditiva deste teste. Apesar das suas vantagens,
entretanto, o nosso teste ainda conta com a limitação comum aos demais modelos
disponíveis até hoje, que é a de conseguir focar apenas em um dos polos do transtorno
bipolar, não sendo apto para avaliar o quadro de depressão. Mais esforços precisam ser
empregados neste sentido, de modo a promover a descoberta de um modelo ideal para a
pesquisa do transtorno bipolar nas suas duas fases.
62
O presente estudo também avaliou o potencial da N/OFQ em prevenir os
efeitos do tipo maníacos induzidos pelo metilfenidato no hole board. Os dados sugerem
que a N/OFQ, nas doses testadas, não é capaz de modificar o quadro induzido pela
administração de metilfenidato em animais e, por isso, não é eficaz na prevenção de um
quadro de mania.
Das várias ações causadas pela administração de N/OFQ em animais, uma das
que mais se destacam é o seu potencial ansiolítico, como demonstrado em vários
estudos, inclusive nas doses de 0,1 e 1 nmol (Mogil & Pasternak 2001; Gavioli & Calo';
2006). Não obstante, no nosso estudo, essas doses foram incapazes de modificar o
comportamento dos animais no hole board. Corroborando nossos resultados, um estudo
de 2004, objetivando avaliar os efeitos da N/OFQ no comportamento exploratório de
animais no hole board, encontrou efeito ansiolítico apenas na dose de 0,01 nmol do
peptídeo, que estaria relacionado ao aumento do turnover de serotonina no hipocampo
(Kamei et al. 2004). Deste modo, pode-se considerar que o teste do hole board não
parece ser sensível o suficiente para detectar o efeito ansiolítico já descrito para a
N/OFQ.
Referente aos resultados da associação N/OFQ e metilfenidato, nosso estudo
mostrou que ambas as doses testadas do peptídeo são incapazes de prevenir os efeitos
causados pelo metilfenidato.
De acordo com os resultados encontrados, um possível direcionamento para
esta pesquisa seria o teste com um antagonista do sistema da N/OFQ, de forma a
verificar definitivamente o seu papel na mediação de um estado de mania.
Em vários trabalhos anteriores, mostrou-se que o sistema da N/OFQ está
envolvido na depressão e ansiedade (Gavioli et al., 2003, 2004; Gavioli & Calo', 2006;
63
Redrobe, Calo', Regoli, & Quirion, 2002; Vitale et al., 2009). Porém, até o presente
momento, nenhum trabalho havia pesquisado o efeito deste sistema em modelos de
mania. A pesquisa sobre o papel dos peptídeos como alvos terapêuticos para doenças é
de suma importância para o desenvolvimento de novos fármacos que permitam um
melhor controle das doenças ainda sem um fármaco que trate todas as suas fases, como
no caso do transtorno bipolar, e também pelas vantagens com relação à afinidade e
seletividade de ligação ao receptor quando comparados com os sistemas de
neurotransmissores clássicos, que são os alvos de praticamente todos os fármacos
utilizados na clínica até hoje.
64
CONCLUSÃO
Por fim, tomados em conjunto, os resultados deste trabalho apontam para uma
nova abordagem na pesquisa da mania, através do uso do hole board, e potencialmente
descarta o efeito anti-maníaco da nociceptina/orfanina FQ, um agonista do receptor
NOP. Porém, mais estudos necessitam ser feitos, com outros fármacos estabilizadores
do humor, a fim de expandir a validação deste teste. Outro ponto que necessita de mais
estudos é o da avaliação do potencial anti-maníaco do sistema da N/OFQ, através do
teste com antagonistas do receptor NOP, de modo a elucidar completamente a
participação deste sistema na fisiopatologia da mania.
65
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