PAPEL DA DIPEPTIDIL PEPTIDASE IV NA REABSORÇÃO

DE SAIS E ÁGUA EM TÚBULO RENAL

Adriana Castello Costa Girardi

Sequência da Aula

Visão Geral da Função Renal Isoforma 3 do Trocador Na/H (NHE3) Dipeptidil Peptidase IV (DPPIV) Modulação do NHE3 pela DPPIV DPPIV e Função Renal Novas linhas de investigação

Principais Funções dos Rins no Organismo

Regulação da osmolaridade e do volume dos fluidos corporais;

Regulação do balanço eletrolítico; Regulação do balanço ácido-base; Excreção dos produtos metabólicos e substâncias

exógenas; Produção e secreção de hormônios.

A Unidade Funcional dos Rins é o Néfron.

1,5 L/dia

Túbulo Proximal

Modelo Proposto NHEs

Circulaçãosistêmica

NaCl

NaHCO3

H2O

Capilar peritubular

CO2 + H2O

HCO3-

Cl-

3 HCO3-

Na+

2K+

HCO3- + H+

H2O + CO2

Filtrado Glomerular NHE3

a.c.

H2CO3

Na+

H+

a.c.

3Na+

Célula de túbuloproximal

NHE3

-

3Na+

2K+

Cl-

Hânion

Cl-

Na+

H+NHE3

ÂnionHÂnion

Cl-

+

NHE3 – knockout mice

HipovolemiaHipotensãoAcidose Metabólica

Schultheis PJ et al Nature Genetics, 1998.

Modulação Pós-Tradução do Trocador NHE3

Fosforilação direta do trocador NHE3 por PKA (S552 e S605);

Translocação entre os sub-compartimentos da membrana apical;

Interação com outras proteínas formando um complexo funcional.

Atividade NHE3-OKP WB Fosforilação NHE3-OKP

Translocação do NHE3 entre os sub-compartimentos da membrana apical

Leong PK et al, AJP Renal 2006.

MET-LYS-THR-PRO-X-LYS-VAL-LEU-LEU-GLY

NH2

Pro

Ala

…

Peptídeos envolvidos na homeostase da glicose: Peptídeo glucagon like 1

(GLP-1), Peptídeo glucagon like 2 (GLP-2), Peptídeo insulinotrópico dependente

de glicose (GIP) Peptídeos pancreáticos:

Peptídeo YY Neuropeptídeo Y;

Substância P; Quimiocinas.

Dipeptidil Peptidase IV (CD26)

Protease Extracelular mCAP1 Aumenta Probabilidade de Abertura

do ENaC

Effect of mCAP on INa in oocytes. Oocytes were injected with Xenopus (left), rat (middle), and human (right) ENaC subunits in the presence of mCAP1 (filled bars) or water (open bars). (Vuagniaux et al., JASN 2000)

Estudos in vivo: Objetivos

Avaliar se a DPPIV, em virtude de sua associação física com o trocador NHE3, modula a atividade deste transportador túbulo proximal de rato;

Avaliar as possíveis conseqüências fisiológicas desta modulação, ou seja alterações do balanço ácido-base e/ou da homeostase do NaCl.

Modelo Experimental

Ratos Wistar machos (190-230g) receberam injeção intraperitoneal de 60 mg/kg/dia de Lys[Z(NO2)]-pyrrolidide (I40) durante 7 dias.

Grupo controle: Ratos Wistar machos (190-230g) receberam injeção injeções i.p. contendo um análogo inativo do inibidor I40, Lys[Z(NO2)]-OH.

Medida da atividade catalítica da enzima dipeptidil peptidase IV (DPPIV) e da (gama-GTP)

em tecido renal de ratos

CTRL I40 CTRL I40

0

100

200

300

400

DPPIV gamma-GTP

*

mU

/mg

pro

tein

Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a atividade do trocador NHE3 em preparação de vesículas de

membranas microvilares de túbulos proximais (MMV)

CTRL

CTRL + E

IPA I4

0

I40

+ EIP

A

0

500

1000

1500

2000

2500

*

Na

up

take

(pm

ol/

mg

/15s

)

Em comparação com o grupo controle, a atividade de NHE3 encontra-se significativamente diminuída (~45%) em ratos que receberam I40 por sete dias.

Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a atividade do co-transportador Na/Pi, NaPi-2, em preparação

de vesículas de membranas microvilares de túbulos proximais

CTRL I40

0

200

400

600

800

1000

Na

dep

end

ent

PO

4 u

pta

ke(p

mo

l/m

g/1

0s)

Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a expressão de NHE3 em preparação de

vesículas de membranas microvilares de túbulos proximais (MMV)

CTRL I400

100

200

300

400

500

*

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e o

f N

HE

3(A

rbit

rary

Un

its

)

Animais tratados com inibidores da DPPIV demonstraram uma redução de (~48)% na expressão relativa de NHE3 em MMV em comparação com animais controle.

CTRL I40

0

50

100

150

200

*

Re

lati

ve

Ab

un

da

nc

e o

f N

HE

3(A

rbit

rary

Un

its

)

Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a expressão total de NHE3 em membranas de

córtex renal

I40 causa ~13% de diminuição de NHE3 total.

AP-2

Vilina

1 2 3 4 5 6 7MMV IMV

CTRL I400

100

200

300

400

500

*D

V-N

HE

3 A

bu

nd

an

ce

(Arb

itra

ry U

nit

s)

Inibidor da DPPIV (I40) provoca translocação do trocador NHE3 de membranas microvilares

para o domínio intermicrovilar

Sumário

A inibição da atividade catalítica da DPPIV está associada com a inibição da atividade do trocador NHE3 em túbulos proximais renais de ratos.

Esta inibição ocorre principalmente em decorrência da redução na abundância de NHE3 em membrana apical;

Mecanismo: translocação do NHE3 da superfície microvilar da membrana apical para o domínio intermicrovilar das vesículas revestidas de clatrina.

Peso Corporal, Consumo de Ração e Água e Concentração de Eletrólitos no Plasma

CTRL(n = 20)

I40(n = 20)

P value

Initial Body Weight (g)

218.5 ± 7.8 221.9 ± 7.8 0.7592

Final Body Weight (g) 235.5 ± 7.4 225.2 ± 7.5 0.2308

Weight Gain (%) 8.0 ± 0.9 3.0 ± 0.8* < 0.0001

Food Intake (g/ day) 20.3 ± 1.3 18.8 ± 1.6 0.4986

Water Intake (mL/day)

40.5 ± 4.0 44.91 ± 4.0 0.4487

Plasma Na+ (mM) 147.7 ± 2.3 145.3 ± 2.4 0.4870

Plasma K+ (mM) 4.37 ± 0.09 4.21 ± 0.15 0.3741

Plasma Creatinine (mg/dL)

0.38 ± 0.03 0.44 ± 0.02 0.1243

Efeito da inibição da atividade catalítica da DPPIV sobre o fluxo urinário

CTRL I400

10

20

30

40

50

60U

rin

e O

utp

ut

mL

/24

ho

urs

kg

-1

*

52% Aumento do Fluxo Urinário I40 vs. CTRL, n = 20.

CTRL I40

0.0

0.5

1.0

*

FE

Na+

(%

)

CTRL I40

0.0

0.5

1.0

1.5C

reat

inin

e C

lear

ance

mL

min

-1 k

g-1

52% I40 vs. CTRL, n = 8.

RFG: 16% I40 vs. CTRL, n = 20, P = 0.1029.

Observa-se uma tendência à queda da PAS (5%) e PAD (6%) em ratos tratados com I40, porém esta redução não é significativa.

Efeito do Inibidor da DPPIV sobre o Balanço Ácido-Base

CTRL(n = 16)

I40(n = 16)

P value

Plasma pH 7.35 ± 0.01 7.32 ± 0.01 0.0530

Plasma HCO3- (mM) 22.20 ± 0.51 20.46 ± 0.67 0.0627

Plasma pCO2 (mm Hg)

43.14 ± 1.93 39.50 ± 1.09 0.1457

Urine pH 5.66 ± 0.05 6.36 ± 0.10* < 0.0001

Urine HCO3- (mM) 0.33 ± 0.21 5.33 ± 0.74* 0.0001

FE HCO3- (%) 0.06 ± 0.03 0.85 ± 0.14* 0.0004

Sumário

Inibição da atividade catalítica da DPPIV causa diurese e natriurese em ratos.

Não há variação significativa do RFG em ratos tratados com I40 vs. controle.

Ratos tratados com I40 podem apresentar acidose metabólica moderada.

Ocorre uma tendência à redução da MAP em ratos normotensos tratados com I40, mas esta redução não é significativa.

O menor ganho de peso em animais tratados com I40 em relação ao grupo controle pode ser em parte devido a maior eliminação de sódio e água ocasionada pela inibição da atividade da DPPIV.

Bases Moleculares: Modulação de NHE3 por DPPIV

Qual o mecanismo pelo qual inibidores da DPPIV inibem a atividade de NHE3?

Hipótese: DPPIV pode degradar um peptídeo inibidor de NHE3.

Qual a identidade deste peptídeo?

Será que este inibidor age diretamente ou por meio de segundos mensageiros?

Bases Moleculares: Modulação de NHE3 por DPPIV

Qual o mecanismo pelo qual inibidores da DPPIV inibem a atividade de NHE3?

Hipótese: DPPIV pode degradar um peptídeo inibidor de NHE3.

Qual a identidade deste peptídeo?

Será que este inibidor age diretamente ou por meio de segundos mensageiros?

Bases Moleculares: Modulação de NHE3 por DPPIV

Qual o mecanismo pelo qual inibidores da DPPIV inibem a atividade de NHE3?

Hipótese: DPPIV pode degradar um peptídeo inibidor de NHE3.

Qual a identidade deste peptídeo?

Será que este inibidor age diretamente ou por meio de segundos mensageiros?

Correlação entre os aspectos estruturais e funcionais do complexo NHE3-DPPIV: Identificação das proteínas acessórias que fazem parte deste complexo protéico em túbulo proximal renal.

Identificação Maldi-TOF:

Miosina IIa

220

116

97

45

GST fpDPPIV fpNHE3 fpNHE3 (295-491) (702-756) (757-829)

GLP1

GLP1

Modelo Proposto: Modulação de NHE3 por DPPIV

GLP1RNHE3

MIIa

DPPIV

Daniel Biemesderfer

Florence J. Wu

Peter S. Aronson

Robert B. Thomson

Gerhard Malnic

Lívia E. Fukuda

Luciana V. Rossoni

Lisete C. Michelini

Luciene R. C. Lacroix

Nancy A. Rebouças