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Febre Reumática: Vacina contra o S. pyogenes
para evitar a Febre Reumática
Luiza Guilherme, PhD
Instituto do Coração (InCor) Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil
2013
mailto:[email protected]
Febre Reumática
(3-5% ind. suscetíveis não tratados, 5-18 anos)
Doença Reumática Cardíaca - DRC
• 30-45% dos pacientes – 4 a 8 semanas
• Lesão valvular – Mitral e/ou Aórtica
• Estenose / Insuficiência Narula et. al, 1999
S. pyogenes
A resposta imune contra a bactéria, em
indivíduos com suscetibilidade genética,
desencadeia reatividade contra proteínas do
coração - Lesão
Infecções GAS – Mortes no Mundo
~ 500 000/ano
WHO 2005
Infecções GAS > 600 milhões casos
WHO 2004
Carapetis J
RHD – 15.9- 19.6 milhões/ano Carapetis J
Febre Reumatica – InCor São Paulo - 2011
• ~ 600 pacientes ambulatorio / mês • ~ 2000 pacientes lista de espera - cirurgia valvular • 38% das cirurgias realizadas : pacientes jovens
FR Cirurgias Numero de Pacientes
Troca Valvular 3873
Plastica Valvular 1131
Total 5004
CIRURGIAS VALVAR - InCor
1980 - 2004
Pomerantzeff PMA, Brandao CM , et al. Valve Reconstruction in the Heart Institute of São Paulo, Brazil.; Semin Thorac Cardiovasc Surg, 2002;4: 324-7.
49.5 % das cirurgias cardiacas realizadas em 25 anos
Tratamento da FR/DRC – Custo Annual
(DATASUS-2007)
Tratamento Clínico : US$ 30 000 000.00
Cirurgias : US$ 50 000 000.00
Barbosa PJB, Müller RE, et al , Arq Bras Cardiol, 2009
N-acetil β-D
glucosamina
Proteina M
A B C D NH2 COOH
Epitopos de Reação Cruzada
com Proteína Humana
Several authors
TCR MHC/Peptideo
APC Celula T
Respostas Imune Celular e Humoral
S. pyogenes Goldstein,Zabriskie
1967
Kaplan , 1964
“Mimetismo Biológico”
Peptideo
Proteina M
Proteina Própria
Peptideo
HLA-DR HLA-DR
Mecanismo Mimetismo Molecular
APC APC
T Cell
HLA – Alelos Classe II Reconhecimento Antigênico pelo Linfócito T
Citocinas
TNF- alfa - Inflamatória
TGF-beta – Crescimento celular
IL-1 Ra e IL-10
Anti-inflamatórias
Febre Reumática : Suscetibilidade Genética
RI Adaptiva
RI Inata
SNP FCN-2 – Ativa C´ via lectina
MBL-2- Alelos A / O
TLR-2 - Reconhece patógeno
FcRII A – Clearence IgG
• Guilherme et al, Infect Immun, 2001
DRC - Reconhecimento Antigênico PBMC: Proteína M e Proteínas Tecido Cardíaco
grave /leve DRC Controles
Respondedores ao peptideo M5(81-96)
0
20
40
60
80
DR7+ DR7- DR53+ DR53-
HLA classe II
Re
ativ
idad
e (
%)
Proteina M5, peptideos: 1-25, 81- 96, 83-103, 163-177
0
20
40
60
80
100
Myoc+ Ao v . Myoc>150 KDa Ao v 90-150 kDa Ao v 65-90 kDa Ao v 43-65 kDa
% R
esp
on
der
s S grave RDRC
Leve DRC
controles
70% pacientes RHD reconhecem proteinas cardíacas
Valvulite Reumática – v. Mitral
Clone Intralesional cel T
Fase Aguda– 67%
Fase Crônica – 20 a 30%
Guilherme,L et al, Circulation 1995
Vegetações
0
10
20
I E
PepM5 (81-96) v. Ao 90-150kDa
SI
Guilherme,L et al, J. Autoimmunity, 2001
• Vimentina
• Colageno VI
• Lumican
Martins, C et al, Submetido 2013
Reguladoras
• IL-10
• IL-4
* P < 0.02; O.R. = 15.8 Valvar Tissue
>10% IL4
18%
10% IL4
78%
CD4+CD25+FoxP3+
RHD HD0
1
2
3
4
5
5
10
15
20
PB
MC
- P
en
cen
tual
(%)
p= 0.0328
Sangue Periférico: CélulasT reguladoras da Inflamação
CD4+FoxP3+CD62L+
RHD HD0
2
4
6
8
PB
MC
- P
en
cen
tual
(%)
p= 0.0270
Fae K, Guilherme L et al , em preparo
Marcadores Celulares de celsT-reg (FACs)
Estratégia para a produção de uma vacina
segura e eficaz contra o S. pyogenes para
prevenir FR/DRC
Desenvolvimento Vacina contra o S. pyogenes Proteína M – Região C-terminal
Região Idêntica 253 KGLRRDLDASREAKKQLEAEQQ279 epitopo T 288 EASRKGLRRDLDASREAKKQVEKA 312 epitope B
253KGLRRDLDASREAKKQLEAEQQKLEEQNKISEASRKGLRRDLDASREAKKQVEKA312
PepVac – StreptInCor 55 aa
Guilherme L, Kalil, J, et al, Clin Dev Immunol, 2006,
Methods, 2009, J Biol Chem, 2011
Patentes INPI – 0501290 / 0604997-4,
PCT-BR07/000184 Epitopo T
(1-22 aa)
Epitopo B
(31-55 aa)
RNM
PDB ID 2KK9 RCSB 101224
Guilherme et al, J Biol Chem 2011
253KGLRRDLDASREAKKQLEAEQQKLEEQNKISEASRKGLRRDLDASREAKKQVEKA312
G D B
F E C A
HLA Classe II – Predição de Ligação
P1 - L, I
P4 - D, S, E, A, Q, N
P6 - D, E, Q, R,
P9 - R, K, E, L,
Afinidade Predição de ligação
HLA Overlapping Peptides RecognizedClass II molecules 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
DRB1* 01DRB1* 02DRB1* 03DRB1* 04DRB1* 11, 12DRB1* 13, 14DRB1* 07DRB1* 08DRB1* 09DRB1* 10DRB5*DRB3*DRB4*
≥ 50% 30-49% 29-10% ≤10% NegGuilherme et al, J Biol Chem, 2011
Reatividade Humoral e Celular
S. pyogenes Adesão - Inibição Adesão/Invasão, soro humano
S. pyogenes Inibição Adesão/Invasão
% M5 99.0
M6 99.0
M44/61 98.0
M87 97.0
M1 90.0
M71 and M22 70.0
UFC sem soro > 200.000
Soro individuos normais, epitopo B reativos
“StreptInCor” será vacina segura ?
Controle Autoimunidade Vacina com Linhagens T das lesões cardíacas de pacientes com Doença Reumática Cardíaca
* 14 válvulas e 15 miocárdio – Linhagens T
Oshiro S, Guilherme L, et al, em Preparo
Negative
23/29
79.3
42/49
85.7
Positive
6/29
20.7
7/49
14.3
StreptInCor
Variospeptideos)
Linhagens T *
N=29
%
Clones T
N=49
( 5 Linhagens)
%
IL-10
Cels
T-Reg ?
StreptInCor : EfeitoTerapêutico?
Cels T reguladoras: sangue periferico de pacientes com DRC
HD
RHD
RHD 1
0ug/
ml S
trep
tInco
r10
100
1000
10000
100000
Ab
so
lute
nu
mb
er
of
cells
CD3+ CD4+ CD25high CD127- Foxp3+
P = 0.0341
P = 0.0181
P = NS
Köhler KF, Guilherme L, et al , em Preparo
Citometria
Fluxo
\
StreptInCor
(vacina candidata )
Aumenta número
Celulas
T Reguladoras
Naturais
Análise Experimental
•Camundongos (Balb-C, C57BL6, Swiss,
Transgênicos para HLA- classe II)
•Mini porcos (25-30Kg)
S. pyogenes Adesão -
Inibição Adesão/Invasão
Soro de Camundongos Imunizados StreptInCor
S. pyogenes - M1 Inibição Adesão/Invasão
BALB/c (N=5) 95.0 %
C57BL6 (N=7) 92.0 %
Swiss (N=3) 98.5 %
CFU sem soro > 200.000
Opsonofagocitose com Células Peritoneais de
Camundongo Balb/C
De Amicis, KM, Guilherme L, Vaccine, 2013
S. pyogenes: Sobrevida pos-vacinação (StreptInCor + ALUM)
Postol, E; Guilherme L, Plos One, 2013
1x107 bacteria
I.P Log rank test
Sob
revi
da
%
10 µg StreptInCor
Controles.
Swiss (n=15) 0.05
Overlapping Peptides
Sequences
(20 aa residues)
Transgenic Mice Bearing HLA Class II Alleles
Humoral Immune Response (IgG)
DR2 DR4 DQ6 DQ8
KGLRRDLDASREAKKQLEAE 6+/6 5+/6 2+/6 5+/6
KGLRRDLDASREAKKQVEKA 5+/6 5+/6 3+/6 4+/6
GLRRDLDASREAKKQVEKAL 5+/6 5+/6 2+/6 3+/6
LDASREAKKQLEAEQQKLEE 4+/6 5+/6 3+/6 6+/6
KLEEQNKISEASRKGLRRDL 5+/6 4+/6 3+/6 5+/6
KISEASRKGLRRDLDASREA 5+/6 2+/6 2+/6 3+/6
SEASRKGLRRDLDASREAKK 5+/6 4+/6 3+/6 5+/6
ASRKGLRRDLDASREAKKQV 4+/6 4+/6 1+/6 2+/6
Resposta Humoral Camundongos HLA- classe II Tg aos Peptideos Compartilhados “StreptInCor”
Guerino, T; Guilherme L, Vaccine, 2011
A- Coração
B, C, D – v. Tri, Mi, Ao
E- Articulações
F- Rim
G - Baço
H - Cérebro
I - Fígado
Vacina não
induz
autoimunidade
1 ano pós- vacinação
em modelo animal
transgênico
HLA – classe II
Humano
Guerino, T; Guilherme L, et
al, Vaccine, 2011
• Ensaio Clínico Fase I/IIa – 2013 / 2014
Desenho do Estudo
• Randomizado, duplo-cego controlado com placebo: Doses
sequenciais do StreptInCor (50 µg, 100µg, 200 µg - 2 doses com
28d intervalo); 6 meses reforço.
• Voluntários sadios: indivíduos sem doença confirmada ou
infecção que possa comprometer a resposta imune, idade entre
18 e 45 anos.
Prof. Luiza Guilherme, Farm,PhD, Líder grupo Febre Reumatica
Prof Jorge Kalil, MD,PhD Diretor do Lab Imunologia,Instituto Coração
RF/RHD Mecanismos da Patogenese
Kellen Cristhina Faé, PhD
Rajendranath Ramasawy,PhD
Ana Flavia Vigna, PhD
Luciana Nogueira, PhD
Sandra Emiko Oshiro, MSc
Carlo Martins, PhD
Nathalia Moreira Santos, MsC
Selma A Palácios
Simone Santos
Desevolvimento Vacina
Claudio R Puschel, PhD – Sintese Peptideo
Washington R Silva
Samar F Barros, PhD – Biologia Molecular, Microbiologia
Raquel Alencar, MSc
Karine Marafigo De Amicis, MsC
Karen Kohler, PhD Imunologia Celular
Leticia Chaves, MSc – Resposta Humoral
Edilberto Postol, PhD – Experimental
Fabio T Higa
Milton T.G. Silva, MsC
Luiz R Mundel
Frederico Moraes Ferreira, PhD- Análise Estrutural
Colaboradores – Lab Imunologia Prof Edecio Cunha-Neto, MD,PhD
Veronica Coelho, MD,PhD
Instituto Coração, 1. Cardiologia Pediatrica, 2.Valvopatia,
3.Cirurgia e 4. Divisão Patologia
1. Ana C Tanaka, MD
2. Prof Max Grinberg, MD; Prof Flavio Tarasoutchi, MD; Guilherme Spina, MD;
Roney Sampaio,MD
3. Prof Pablo Pommerantzeff, MD, Carlos Brandão, MD
4. Lea Demarchi, MD, Prof Vera D Aiello, MD: Paulo S Gutierrez
Reumatologia Pediatrica, Hospital Clinicas Prof Maria H Kiss, MD, Clovis A Silva, MD
HospitalSaint Louis, Paris, France –RCT, CelsTreg Prof Dominique Charron, MD,PhD; Prof Antoine Toubert, MD,PhD
Universidade Oklahoma, Oklahoma, USA – Estudos Miosina
Cardiaca Prof Madeleine W Cunningham, PhD
Instituto Finlay, Havana, Cuba –Adjuvante Mucosa Prof Oliver Perez Martin, MD; Miriam Lastre, MD; Caridad Zayas
Clinica Mayo Rochester, USA, Camundongos Tg HLA-classe II Prof Chella David, MD,PhD
Agua – viva, Luiza Guilherme 2013