Gram +

PARETE DEI GRAM+ E GRAM -PARETE DEI GRAM+ E GRAM -Esistono importanti differenze sia di struttura che di composizione

chimica tra Gram+ e Gram-

Gram -

Complessa ultrastrutturae composizione;

Componenti non mureiniciorganizzati a formareuna

MEMBRANA ESTERNAMEMBRANA ESTERNAO PARIETALE:O PARIETALE:

Struttura:Struttura:in due foglietti tipicadi tutte le membranebiologiche;

FOSFOLIPIDIFOSFOLIPIDI: simili a quelli della membrana citoplasmatica, situatinel foglietto interno.

LIPOPOLISACCARIDE:LIPOPOLISACCARIDE: costituisce con la sua componente lipidica lamaggior parte del foglietto esterno.

PROTEINE:PROTEINE: inserite a varie altezze.

LIPOPROTEINA:LIPOPROTEINA: ancora la membrana esterna allo stratosottostante di peptidiglicano.

Composizione:Composizione:

STRUTTURA COMPLESSIVA DELLA PARETE CELLULARE DEI BATTERI GRAM -STRUTTURA COMPLESSIVA DELLA PARETE CELLULARE DEI BATTERI GRAM -

STRUTTURA DEL LIPOPOLISACCARIDE (LPS)

CATENA LATERALE O CORE LIPIDE A

Lipopolisaccaride

LipidePolisaccaride

Outercore

Unità diripetizione

Innercore

POSIZIONE DEL LPS NELLA MEMBRANA ESTERNA

Occupa la maggior parte del foglietto esterno della membrana esterna;la porzione polisaccaridica è rivolta verso l’esterno, il lipide A è immersonello spessore della membrana

E' un glicofosfolipide;Consiste in un dimero di NAG-fosforilata con legati acidi grassi a catena lunga;Rappresenta la porzione idrofobica che si ancora alla membrana esterna;Rappresenta il principio tossico dell'intera molecola;Altamente conservato in tutti batteri Gram-

Polimero di unità oligosaccaridiche di ripetizione (in media 40 unità);Trisaccaride lineare o tetra, penta saccaride ramificato;Almeno 20 diversi tipi di zuccheri molti dei quali sono dei dideossiesosi che siritrovano, in natura, solo nella parete dei batteri Gram-;Legionella pneumophila, serogruppo 1: omopolimero formato da circa 75 residuidi un solo zucchero;Rappresenta la parte più variabile alla base della classificazione sierologica deibatteri Gram-

E' un oligosaccaride costante nell'ambito di un genere;L' inner core di tutti i batteri Gram- contiene uno zucchero a 8 atomi di C(2-keto-3-deoxyoctulosio) più, in tutte le Enterobacteriaceae, è presente unozucchero a 7 atomi di C.L'outer core è la porzione relativamente più variabile anche se vi sono presentizuccheri a 6 atomi di C comuni.

CORE

CATENA LATERALE O

LIPIDE A

LIPOPOLISACCARIDE (LPS)LIPOPOLISACCARIDE (LPS)

FUNZIONI DELLA MEMBRANA ESTERNA E DELL' LPSFUNZIONI DELLA MEMBRANA ESTERNA E DELL' LPS

barriera di permeabilità selettiva (ancor più selettiva della membrana interna) che sioppone al passaggio di molecole idrofobicheidrofobiche (dovuto alla catena laterale O, idrofilica,del LPS) e di molecole idrofilicheidrofiliche (dovuto al doppio strato fosfolipidico) al di sopra dicerte dimensioni.

LPS rappresenta unaimportante struttura disuperficienell'interazionedell'agente patogenocon il suo ospite: peres. può esserecoinvolto nell'adesione(colonizzazione) e nellaresistenza allafagocitosi; è sede deideterminanti antigenici;se liberato in un ospitesensibile, dà luogo anumerosi effetti tossici(ENDOTOSSINAENDOTOSSINABATTERICABATTERICA)

ENDOTOSSINEENDOTOSSINE

componenti strutturali; quasisempre rilasciate in seguito a lisi

TOSSINE BATTERICHETOSSINE BATTERICHE: molecole con attività tossica neiconfronti dell’ospite; la produzione di tossine è uno deimeccanismi principali con cui i batteri causano le malattie(es: tetano, difterite, pertosse, colera)

ESOTOSSINEESOTOSSINE

rilasciate nel mezzo esternoda cellule vitali

Proprietà Endotossine EsotossineNatura chimica Complessa: lipopolisaccaride

(MW: c.a. 10 kDa)Proteine(MW: c.a. 50-1000kDa)

Localizzazione in rapportoalla cellula batterica

Componenti della membranaesterna dei batteri Gram-

Secrete

Sensibilità alladenaturazione termica

Termostabili Termolabili

Modalità di azione esintomatologia

Non specifica; febbre,infiammazione

Specifica; citotossine,enterotossine, neurotossinecon azione specifica su cellulee tessuti

Attività enzimatica Nessuna Di solitoTossicità Relativamente poco potenti:

LD50 nel topo: 200-400µg/animale

Altamente tossiche, spessofatali: LD50 tossina botulinicanel topo: 25pg

Immunogenicità Relativamente pocoimmunogeniche: la rispostaimmunitaria non è sufficiente aneutralizzare la tossina

Altamente immunogeniche:stimolano la produzione dianticorpi neutralizzanti(antitossine)

Potenzialità del tossoide Nessuna Il trattamento della tossinacon formaldeide elimina latossicità, ma nonl'immunogenicità (tossoide)

Attività piretica Spesso inducono febbrenell'ospite

Non inducono febbrenell'ospite

EFFETTI BIOLOGICI DELL'ENDOTOSSINAEFFETTI BIOLOGICI DELL'ENDOTOSSINA§Le endotossine, inoculate in un animale a loro sensibile, danno luogo ad una vastagamma di sintomi in conseguenza del loro effetto su diversi organi e sistemi.§Qualsiasi apparato o cellula dell'organismo sembra rispondere sia in vitro che invivo allo stimolo endotossico.

Monociti-macrofagi

Neutrofili Linfociti B Complemento

Piccole dosi diendotossina

Sintesi di IL-1e TNF

Febbre

Rilascio aminevasoattive

Attivazione Attivazione

VasodilatazioneProduzione di

anticorpiInfiammazione

Coagulazioneintravasale

Alterazione dellafunzionalità dimolti organi

Alte dosi diendotossina

Shock

Bersagli

Attività

Effetti

DI SOLITO UNIMMUNOSTIMOLANTE

TALVOLTA UNA"TOSSINA"

L'ENDOTOSSINA

IL-1TNF-alfa

Centrotermoregolatoredell'ipotalamo

Macrofago

A livello cutaneo visibilidelle "petecchie"

I coaguli a livello delmicrocircolo degli organi causano

ischemia con conseguenteinsufficienza d’organo

Consumo dei fattori dellacoagulazione e

conseguente emorragie

EFFETTI BIOLOGICI DELL'ENDOTOSSINA SEMPLIFICATIEFFETTI BIOLOGICI DELL'ENDOTOSSINA SEMPLIFICATI

1) Effetto pirogeno (capacità di indurre febbre anche a basse dosi)

2) Attiva vari tipi cellulari-Macrofagi (aumento della fagocitosi e capacità battericida, produzione di monochine che

agiscono su vari altri tipi cellulari e tessuti)-Linfociti B (proliferazione e differenziazione in plasmacellule)-Cellule endoteliali-Piastrine-Granulociti3) Induce infiammazione4) Induce vasodilatiazione con conseguente ipotensione e shock5) Attiva il complemento6) Stimola la coagulazione del sangue CIDCID (coagulazione intravasale disseminata)

Coagulazione Intravasale Disseminato

LPS

VISIONE D'INSIEME DEI MOLTEPLICI EFFETTIDELL'ENDOTOSSINA

RUOLO DELL'ENDOTOSSINA NELLO SHOCK ENDOTOSSICORUOLO DELL'ENDOTOSSINA NELLO SHOCK ENDOTOSSICO

Shock endotossico:Shock endotossico: grave quadro clinico che può accompagnare le setticemieda batteri Gram- caratterizzato da febbre, ipotensione, acidosi,insufficienza renale e respiratoria e nelle fasi finali da CID ed insufficienzad’organo.

Frequenza: 1% dei pazienti ospedalizzati sviluppa sepsi; 20-30% nei repartidi terapia intensiva.

Esito fatale: 40-60% dei pazienti, nonostante terapie antibiotiche.

METODI DI DOSAGGIO DELL'ENDOTOSSINAI LPS batterici per la loro diffusione ubiquitaria e per l'estrema stabilità adagenti chimici e fisici rappresentano una frequente contaminazione ambientale

TEST PIROGENO NEL CONIGLIO

TEST DEL LILMULUSSfrutta la capacità del lisato di amebociti(unici elementi cellulari) presentinell'emolinfa di un crostaceo, il Limuluspolyphemus, di gelificare anche in presenzadi piccolissime quantità di endotossina (ng).

Può essere utilizzato per rivelare lapresenza di LPS nel liquor, nel plasma,nelle urine od in altri liquidi biologici, peruna diagnosi rapida, anche se aspecifica diinfezione da Gram-.

NECESSITA' DI VERIFICARE LA PRESENZADI ENDOTOSSINA IN PREPARAZIONITERAPEUTICHE, PRODOTTI BIOLOGICI,REAGENTI

LIPOPROTEINA: piccola proteina con funzione di ANCORAGGIO (strutturale);parte proteica, legata al peptidoglicano (tetrapeptide); parte lipidica, inserita nelfoglietto interno della membrana esterna.

PROTEINA A (OmpA): attraversa tutto il bilayer lipidico; funzione diSTABILIZZAZIONE STRUTTURALE

• Vengono indicate con la sigla Omp (outer membrane proteins) seguita da unalettera dell’alfabeto o con sigle indicative della loro funzione;

• Sono di due tipi principali:

•• PROTEINE PORINEPROTEINE PORINE

•• PROTEINE STRUTTURALIPROTEINE STRUTTURALI

LE PROTEINE DELLA MEMBRANA ESTERNA DEI BATTERI GRAM -LE PROTEINE DELLA MEMBRANA ESTERNA DEI BATTERI GRAM -(50% della massa della membrana)

LipoproteinaLipoproteina

ProteinaProteina A A

PORINE:PORINE:le più abbondanti c.a. 105/cellula

Peso Molecolare variabile (30-50 Kda);

SONO TRANS-MEMBRANALI, ORGANIZZATE AFORMARE DEI TRIMERI (TRE SUBUNITA’IDENTICHE) ciascuna delimitante un poro idrotata;

SI OPPONGONO AL PASSAGGIO DELLE MOLECOLEIDROFOBICHE; SONO PERMEABILI ALLE MOLECOLE IDROFILICHE; SONO DEI FILTRIMOLECOLARI

Due TIPI:- ASPECIFICHEASPECIFICHE: selezionanosolo in base alle dimensioni dellamolecola (piccole molecoleidrofiliche < 600 Da) o, almassimo, per la carica -anioni ocationi-

- SPECIFICHESPECIFICHE: permettono ilpassaggio di 1 solo soluto o dipochi soluti strutturalmentesimili (molecole idrofiliche piùgrosse: zuccheri, vitamineecc.es: LamB di E. coli,specifica per le maltodestrine)

FUNZIONI DELLE PORINEFUNZIONI DELLE PORINECANALI CHE PERMETTONO IL PASSAGGIO DI SOSTANZEIDROFILICHE ATTRAVERSO LA MEMBRANA ESTERNARUOLO NELLA RESISTENZA AI FARMACIsostituzione di aminoacidi neutri con aminoacidi carichi che si proiettanoall’interno del poro e perturbano la normale diffusione degli antibioticiin presenza di antibiotici viene diminuita od eliminata l’espressione delleporine implicate nella diffusione di quell’antibioticoFUNZIONE DI RECETTORIper fagiper batteriocineper componenti del complementoper anticorpiFATTORI DI PATOGENICITA’ BATTERICApossono promuovere l’invasione delle cellule dell’ospite.l’aderenzal’attività citotossica. (vengono secrete in piccole vescicole che si fondonocon la membrana delle c. eucariotiche)

Esempi di Omp di Gram-negativi

Proteina Funzione

OmpA e Entrambe stabilizzano la membranaMurein-lipoproteina

OmpB Porina aspecificaLamB (maltoporina) Porina specifica per il maltosio e maltodestrine; recettore di λOmpC Porina aspecifica per piccole molecole recettore per il fagoT4OmpF Porina aspecifica per piccole molecolePhoeE Porina specifica per anioni; viene INDOTTA da Pi limitanteTonB Sideroporo per il transito del ferro e specifico per la Vit B12Tsx Porina specifica per i nucleosidi