Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

Co nta cto :Co nta cto : digital@bl.fcen.uba.ar

Tesis de Posgrado

Participación de la inervaciónParticipación de la inervaciónsimpática en la regulación de lasimpática en la regulación de la

secreción de Parathormona ysecreción de Parathormona yCalcitoninaCalcitonina

Ladizesky, Marta Graciela

1988

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Ladizesky, Marta Graciela. (1988). Participación de la inervación simpática en la regulación de lasecreción de Parathormona y Calcitonina. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidadde Buenos Aires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2124_Ladizesky.pdf

Cita tipo Chicago:Ladizesky, Marta Graciela. "Participación de la inervación simpática en la regulación de lasecreción de Parathormona y Calcitonina". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. 1988.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2124_Ladizesky.pdf

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

TEMA DE TESIS

PARTICIPACION DE LA INERVACION SIMPATICA EN LA REGULACION

DE LA SECRECION DE PARATHORMONA Y CALCITONINA

AUTOR

MARTA GRACIELA LADIZESKY

DIRECTOR: PROF. DR. DANIEL PEDRO CARDINALI

CO-DIRECTOR: DR. CARLOS ALFREDO MAUTALEN

LUGAR DE TRABAJO

UNIDAD DE OSTEOPATIAS - HOSPITAL DE CLINICAS - UNBA

CENTRO DE ESTUDIOS FARMACOLOGICOS Y PRINCIPIOS NATURALES - CONICET

¿711/¡rÍ

TESIS PRESENTADA PARA OPTAR AL TITULO DE

DOCTOR EN CIENCIAS BIOLOGICAS

1988

AGRADECIMIENTOS

Al Profesor Dr. Daniel P. Cardinali, quien con su direc­ción, estímulo y apoyo permanentes hizo posible la reali­zación de esta Tesis.

Al Dr. Carlos Mautalen, Co-Director de la Tesis, con quienme inicié en la investigación. Por todos los años de tra­bajo en comúndurante los cuales, con su ejemplo personal,conocimientos y dirección, determinó mi Formación cientí­Fica. Mi agradecimiento especial, además, por posibilitary alentar mi reingreso a las tareas de investigación.

A los Doctores: Horacio Romeo, que efectuó la cirugía ex­

perimental de este Trabajo; Eduardo SlatOpolsky y GerardoSartorio, en cuyos laboratorios se efectuaron parte delos radioinmunoensayos y Cristina Díaz que desarrollólas técnicas histológicas.

A mis compañeros de laboratorio de la Sección Dsteopatíasdel Hospital de Clinicas por el permanente clima de amis­tad y compañerismo.

Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Téc­nicas por el apoyo brindado durante todos mis años de tra­bajo.

A la señorita Verónica Lacoste por su colaboración parael mecanografiado de esta Tesis.

A mi esposo, Félix Roisman, por su apoyo moral, compren­

sión y ayuda durante el desarrollo de este Trabajo.

A Félix y Dina

AMP

AMPc

CFx

COMPT

CT

C-terminalEDTA

GES

GCSx

i.p.LEC

MAO

NE

N-terminalDTH

PTx

a.c.TSH

1,25(ÜH)2D

24,25(DH)2025(0H)D

ABREVIATURAS

Aminometil propanolAdanosin monoFosFato cíclico

CresolFtelein complexonaCatecol-D-metil transferaaaCalcitoninaCarboxi-terminalAcidoetilendiamino tetraacéticoGanglio Cervical SuperiorGangliectOmia Cervical SuperiorIntra peritonealLíquido extracelularMonoamino oxidasa

NorepineFrinaAmino-terminal

Hormonaparatiroidea (Parathormona)ParatiroidactomiaSub cutáneo

TirotroFine1,25 dihidroxi vitamina D24,25 dihidroxi vitamina D25 hidroxi vitamina D

INDICE

CAPITULO1: INTRODUCCION................o..o...........

1.1 FISIOLOGIA DE LA REGULACION HORMONAL DEL

OCU-OOIOOOIOOCOCOOOCI0.00.000...1.1.1 CONCEPTOS GENERALES

1.1.2 HORMONApARATIROIDEA

l.l.2.A Paratiroides: Anatomía- Histología1.1.2.8 Estructura y biosíntesis1.1.2.C Regulaciónde le secreción ,_,.,,,,,.,,.,.,.1.1.2.0 Metabolismoperiférico ,,_,,,,,,,,,,,,,,,,,,1.1.2.E Mecanismosde acción ._._,,.,.,_,..,,,,.,_,,1-1-2-FACCiOÑGSbi°1691039........................1.1.2.8 Resumen oooooaoooooaoooo¡oooO-oooooooooooaoo

1.1.3 ccoo-coco.ooo-oooooooaoo-oooocoooa-o

1.1.3.A Células C-tiroideas: Anatomía - Histología .1.1.3.8Estructuray oiosintesis _,,,,,,,,,,,,,,,,,,1.1.3.C Regulaciónde 1a secreción ,,._,_,,,,.,...,,1.1.3.0 Metabolismoperiférico ,_.,_,,,,,....._..,,,1.1.3.EMecanismosde acción,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1.1.3.FAccionesbiológicas..,.....................1.1.3.5 I...OOOIO...OOOIIOOIOOOOOÍOCOOOOOOOO

1.1.4 ODIOOOOOOCOOOOOIOOOOOOOOOOCOOIOOO

1.1.5 INTEGRACION DE LA REGULACION HORMONAL

DELMETABOLISMODELCALCIO.....................

1.2. EL SISTEMANERVIOSOAUTONOMO.....................

1.2.1 ORGANIZACIONDE LA INERVACION AUTONOMA.........

‘llzcz no.aoIIIIIOOOOOOOCOIIOOOOO'

“3‘me

1.2.3 LA TRANSMISION NEUROÜUIMICA EN EL SISTEMA

SIMPATICO

1.2.3.A Neurotransmisores1.2.3.8 Liberación del transmisor1.2.3.C Adrenoceptoresy actividad postsináptica ...1.2.3.0 Destrucción del transmisor

1.3 GANGLIOCERVICALSUPERIOR(ccs) ....................

1.3.1 ANATOMIA - HISTOLOGIA

1.3.2 TERRITORIOS DEL GCS

1.3.2.A Tiroides - paratiroides1.3.2.8 Otros territorios

1.3.3 EFECTOS DE LA GCSx

1.4 AMINAS BIOGENAS Y SECRECION DE PTH Y CT

1.4.1 SECRECION DE PTH Y AMINAS BIOOENAS

1.4.1.A Estudios "in vitro"

000.00000000000000000000-o...

1.4.1.8 Estudios Farmacológicos"in vivo" ..........1.4.1.C Deprivaciónde catecolaminas...............1.4.1.0 Estimulaciónde nervios adrenárgicos .......

1.4.2 SECRECION DE CT Y AMINAS BIOGENAS

1.4.2.A Estudios "in vitro"

leccion-OOO...

ooo-ooocooo-oaoooooooaoa

1.4.2.8 Estudios Farmacológicos"in vivo" ..........1.4.2.C Daprivaciónde catecolaminas ...........1.4.2.0 Estimulación da nervios adrenérgicos .......

1.4.3 RESUMEN....

1.5 OBJETIVOS DEL TRABAJO DE TESIS

27

27

3O

SO

32

34

34

35

35

37

37

41

41

41

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46

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49

51

CAPITULO 2: MATERIALES Y METDDDS

2.1 Animalesy técnicas quirúrgicas ...................2.1.12.1.2

Gangliectomiacervical superior ............Paratiroidectomía

Inducción de respuestas secretoras en la paratiroi­desy célulasC-tiroideas.........................2.2.12.2.2

Estimulación de le secreción de DTH

Estimulación de la secreción de CT

Caracterización Farmacológica de receptores adre­oooOoooo0.0..OIII...OOOOOOOIOOOOOOIOOOCIOO

2.6.12.6.2 Determinaciones de CT sérica

Estadís

CAPITULO 3:

Determinaciones de DTHsórice

tica

RESULTADOS

Determinaciones de calcio sórico

Obtencióny conservaciónde suero .................

Radioinmunoensayos................................

oolor-a-cnoaononooooooooooaoc

3.1 PARTICIPACION DE LA INERVACIDN SIMPATICA EN LA

MDDULACIDN DE LA RESPUESTA BASAL DE LAS CELULAS

DARATIROIDEAS Y C-TIRDIDEAS

3.1.13.1.23.1.33.1.4

CalcemiaDarathcrmona sáricaCalcitonina séricaResumen

52

53

53

54

54

54

55

56

56

57

SB

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63

63

64

64

3.2 MODULACIÜN DÜR LA INERVACIÜN SIMPATICA DE LA

RESPUESTA ESTIMULADA DE LAS CELULAS PARATIRÜIDEAS

IOOOOCOIIOOOOOOOOOOCOOOIIOOOIIOOOIOO

3.2.1 Modulación de le secreción estimulada de'6...".......CCC......................

3.2.1OA O0.0.U.0...‘...............0.03.2.1.8 parathormona oaooooooooooooaooon

3.2.2 Moduleción de la secreción de PTHdurante

su estimulaciónaupramáxima...............

3.2.3 0...0..OCOOOOOOOOIOOIOIOCOOOO0...0.

3.2.4 Modulación de le secreción sstimulade deCT........................................

3.2.4.A3.2.4.8

00.00.0000...OOO-OOOOOOCOOOOOCCelcitoninasórica....................

3.2.5 Moduleción de la secreción de CTdqrantssu estimulaciónsupremáxima...............

3.2.6 OOO0.000000.00000000ICOOOOIOOOOOOII

PARTICIPACION DE LÜS RECEPTORES o< Y ÍgADRENERGICOS

EN LA MÜDULACIÜN NEURAL SIMPATICA DE LA SECRECIÜN

DE 0.0.0.0..OOIOIOOQOOOOOIOOOOOOOOOOOICOO

3.3.1 Efecto de bloqueantes adrenárgicos sobre lasecreción estimulsdade PTH...............

3.3.1.A3.3.1.8

IOOOOOOO-OIOOOIOOOOOOOOOOOOOI.

Parathormonasérica ...................

3.3.2 OOOOOOOI...’OIÜOOOCOOCODOIOOOIOIOOI

3.3.3 Efecto de bloqueentes adrenórgicos sobre 1asecreciónestimuladsde CT................

3.3.30A OOIOOOOOOIIOOOOIIOO'IOOIIlo...3.3.3.8 Calcitoninasórica....................

3.3.4 OOO0.0.0....¡OCIO-OOIOOOOIOOOOOCIIO

68

68

68

68

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76

76

77

77

83

83

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84

84

87

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87

89

3.4 REGULACIDN DE LA SECRECIÜN DE PTH DURANTE LA GCSx

CRONICA. 00000000000000003.4.13.4.2 I3.4.3 R

3.5 REGULACI

Nivelesséricos de calcio y CT.............ndice mitótico - Estudios histológicos ....

o.OOO-ooOOO-l¡oo-oooonocooaoooooonoo

DN DE LA SECRECION DE CT DURANTE LA GCSx

CRONICA

3.5.1 R 000.0.0.00.0....0000000000000000OÍOC

OO0.0.00...0000000000000000000000

BIBLIOGRAFIA

00000.0.0.000.000.000000000000

93

93

94

94

1DG

101

104

120

122

CAPITULO l

INTRODUCCION

1.1- FISIOLOGIA DE LA REGULACION HORMONAL DEL METABOLISMO

MINERAL

1.1.1- CONCEPTOS GENERALES

El ion calcio es de fundamental importancia en to­dos los sistemas biológicos. La concentración de calciointra o extra celular regula numerosas Funciones orgáni­cas y acciones celulares: participa en reacciones enzimáticas, en los mecanismos de secreción hormonal y es unmediador de efectos hormonales (1).

El calcio iónico se halla íntimamente ligado a laneurotransmisión, la contracción musc.lar y la coagula­ción de la sangre. Es el principal catión de la estructura cristalina del hueso y los dientes. Por estas y otrasrazones resulta de vital importancia que las células es­tén rodeadas por líquidos en los que la concentración decalcio se mantenga dentro de los estrechos límites de latolerancia Fisiológica, garantizando así la concentraciónintracelular adecuada para la actividad celular (1). LaFig. 1 muestra el recambio diario promedio de calcio enhumanos.

Para mantener este equilibrio, el organismo se vale de un complejo sistema de regulación hormonal que es­tá integrado fundamentalmente por las hormonas paratiroidea (PTH), calcitonina (CT) y los metabolitos derivadosde la vitamina D, cuyos principales órganos efectores ‘son hueso, riñón e intestino (1). De esta manera se man­tiene la concentración de calcio iónico sárico en su ni­vel fisiológico óptimo: 1,3 milimolar que representa a­proximadamentela mitad del calcio total circulante (2,3).

A continuación se analizarán en detalle las Fun­

INTESTINO

FIGURA l:

DIETA

.1000 mg

ABSORClON

350m9

SECREUON

150 mg%————

800m9

EXCREÜONFECAL

RECAMBIO DIARIO PROMEDIO DE CALCIO EN HUMANOS

* ““_ '“_ SOONQ

LIQUlDO POOL . m

EXTRA RAPIDAMENTE “ma” gCELULAR INTERCAMBIABLE C

REMODELAMIENTO _- ,‘1‘

OSEO 2} o1.000mg 4.000rng

SOOmgresorcidn

lOOQOOOmg

RECAMBIODIARlODE CALCIO

EXCRECIONURINARIA

Después de una ingestión diaria promedio de lg decalcio se absorbe alrededor del 35%. Para mantener el ba­lance se debe excretar la misma cantidad (350m9). Alrede­dor de lSOmgse segregan en el intestino y se excretanen las heces junto con la Fracción no absorbida de la die­ta. El riñón filtra alrededor de lOg de calcio por díareabsorbiendo un 98%.

El calcio penetra y sale de un pool extracelular delg que está en equilibrio con un pool rápidamente inter­cambiable. Aproximadamente un 50%de este último provie­

SOOmgde calcio por dia, son extraídos delespacio extracelular para la acreción ósea y vuelven a élpor resorción ósea en el proceso que conforma el remode­

ne del hueso.

lamiento del hueso. El importante almacenamiento de cal­cio del esqueleto (alredor de lKg) lo hace cuantitativa­mente el reservorio mas importante que mantiene la esta­bilidad del calcio plasmático.

ciones de dos de estas hormonas y los mecanismos que re­gulan su secreción.

1.1.2- HORMONAPARATIRÜIDEA

La PTHes la principal reguladora de la concentración de calcio en plasma. Su Función primordial consisteen mantener los niveles circulantes de calcio cuando és­

tos tienden a disminuir. Para ello incrementa la incorpgración de calcio al líquido extracelular a través de susacciones directas o indirectas sobre intestino, túbulosrenales y esqueleto.

1.1.2.A- Paratiroides: Anatomía-Histología

Las glándulas paratiroideas en mamíferos se desa­rrollan a partir de la 39 y 49 bolsas branquiales y Fi­nalmente se localizan detrás de la tiroides (4). Su i­rrigación proviene de las arterias tiroideas y su dre­naje venoso se efectúa dentro de las venas yugular y tiroidea inferior (4). Están constituidas en su mayor pagte por las células principales en las que se sintetizay secreta la PTH (5). Su diámetro es de 4-8 pm y poseenun pequeño núcleo central que contiene cromatina densa.Sobre la base de eu apariencia ultraestructural, éstascélulas se han dividido en 2 clases: "activas" que con­tienen regiones paralelas de reticulo endoplásmico enlas que es sintetizada la proteina precursora de la PTH,una región de Golgi de apariencia prominente (probable­mente el sitio de almacenamiento hormonal) y gránulossecretarios unidos a la membrana.En condiciones fisio­lógicas normales, la cantidad de hormona almacenada y

los grápulos secretarios son escasos. Tambiénexistenmicrotúbulos que juegan un papel importante Facilitando

el movimientode los gránulos secretorios hacia la peri­Feria. Las células "inactivas" presentan un reticulo en­doplásmico disperso, una región de Golgi pequeña, vacuo­las con abundante glicógeno y gránulos de lipofucsina°Existe un activo proceso de transformación de células agtivas a inactivas.

Despuésde la pubertad, aparecen células ooníli­

cas de 6-10 Fm de diámetro que contienen pequeños núcleoscentrales picnóticos y abundantes mitocondrias. General­mente presentan un reticulo endoplásmico disperso y unaregión de Golgi pobremente desarrollada; Estas células,que no son secretoras de hormona, incrementan su número

con la edad y pueden representar una Forma degenerativade las células principales (1).

Diversos estudios clínicos (6-10) y sólo un tra­bajo experimental (11) muestran que, con cierta frecuegcia, después de una paratiroidectomia parcial el tejidoparatiroideo remanentepuede desarrollar hiperplasia,aunque no hay aCUerdo respecto a los mecanismos que reg!lan la aparición de este Fenómenoni a la generalidaddel mismo (10).

1.1.2.8- Estructura y biosíntesis

Los primeros extractos activos de glándulas para­tiroideas Fueron preparadas en 1924 por Berman (12). En

1970 Breuer y Ronan (13) publicaron la secuencia comple­ta de aminoácidos de la PTHbovina y posteriormente seaclaró la estructura de la PTHhumana (14) y porcina (15).Asimismo, la hormona de pollo (16) y de rata (17) sonsimilares en tamaño a las de otras especies. En todoslos casos la PTHes una proteina que contiene 84 amino­ácidos reunidos en una cadena simple de peso molecular

aproximado 9.600 (1B). Las moléculas de diferentes espe­

cies difieren entre sí en pocos aminoácidos. Se ha demostrado que sólo el primer tercio de la molécula, la por­ción 1,34 amino-terminal, es biológicamente activa y po­see el 77%de la actividad de la hormona nativa. La ra­gión carboxi-terminal es biológicamente inactiva (resi­duos 37-84) (19).

La PTHno se sintetiza directamente. Habener ha

propuesto un modelo que resume el proceso de síntesis

(20): La Pre-pro PTHes el producto inicial de la sintgsis en los ribosomas; es una proteina de 115 aminoácidosy contiene toda la información estructural codificada enel gen para la PTH. Antes de ser volcado al reticulo en­doplásmico, este producto es clivado perdiendo primero 2y luego 23 aminoácidos a partir del extremo N-terminal

dando origen a la Pro-PTH de 90 aminoácidos. Este pépti­do ingresa al retículo endoplásmico 15-20 minutos des­puás de haber comenzadola síntesis. Alli es degradadonuevamente por una enzima triptica, perdiendo el hexa­páptido N-terminal, formándose la molécula final de PTHque es volcada al aparato de Golgi. Parte de la PTHre­sultante se empaqueta para su almacenamiento en gránulosde secreción maduros (30 minutos después de iniciada lasíntesis) y es liberada 15 minutos después. Sin embargo,cuando se requiere una rápida liberación de hormona anteun estímulo agudo, la hormonarecientemente sintetizadapuede ser transportada directamente a través de la cálu­la para su liberación inmediata (21). Asimismo, tambiénocurre degradación de PTHdentro de las células parati­roideas, de modoque no todas las moléculas sintetizadaspasan a circulación (18). Se ha encontrado que tambiénse secretan fragmentos carboxi y en menor medida amino­terminales (22,23).

1.1.2.C- Regulación de la secreción

El calcio iónico es el principal agente reguladorde la secreción de PTH(1). Existe una relación inversaentre la concentración de calcio que baña la glándula yla cantidad de hormona liberada (24) que varía de mane­ra sigmoidea (Fig.2). La máximavelocidad de secreciónocurre cuando el calcio total sérico es menor que 7 mg/dl. La secreción de PTHse reduce progresivamente a me­

dida que la calcemia aumenta a 11 mg/dl. A partir de egte punto hay una secreción basal persistente de PTHli­berada que no es suprimida por la elevación del calcioplasmático.

La respuesta secretora a la hipocalcemia ocurreen segundos (25). Bruce y Anderson (26) sugieren que lahipocalcemia provoca una rápida hiperpolarización de lamembranade la célula paratiroidea facilitando la libe­ración hormonal. Se ha encontrado que el calcio iónicoregula la degradación intracelular de la hormona(27,28) y en menor medida su síntesis (28).

Existen otros agentes que pueden afectar la se­creción de PTHaunque no resulta claro si desempeñanun rol activo en la homeostasis del calcio (18). Entreellos el de mayor importancia es el magnesio que a ni­veles elevados inhibe la secreción de PTHcon una potegcia equivalente a 1/3 de la del calcio (29,30). Sin em­bargo, esta regulación es de menor importancia sobre surango fisiológico normal (1,5 a 2,5 meq/l). La hipomagenesemia también afecta la secreción de PTH(31). Se hasugerido que podría jugar un rol directo sobre el procgso de exocitosis vesicular (18).

(ng/Kg/mln)

SECRECIÜNDEPTH

FIGURA 2: REGULACION DE LA SECRECIÜN DE PTH POR EL CALCIO

SERICO

É 5 7' á Ï ¡EJ tí 12 1'3 u.

CALCIO SERICD (mg/dl)

La máxima estimulación de la secreción de PTHse ob­serva cuando la calcemia es menor o igual a 7 mg/dl. Lasecreción mínima ocurre cuando la calcemia es mayor o i­gual a ll mg/dl.

- 9

Por otra parte hay evidencias que indican que losmetabolitos de la vitamina D afectan la función parati­roidea. En efecto, en las células paratiroideas se handetectado receptores a la 1,25-dihidroxivitamina D

(1,25(ÜH)20) (32,33). También en el material nuclear de

éstas células se ha encontrado 1,25(ÜH)ZD(32,34) que,como se Verá más adelante es el metebolito activo por e¿celencia derivado de la vitamina D, sugiriendo que elmismopuede modificar la sintesis de precursores de laPTH(33,35,36). El efecto de los metabolitos de la vita­

mina D en particular de la 1,25(ÜH)20 sobre la secreciónde PTHes inhibitorio. Se ha encontrado que la 25-hidro—xivitamina D (25(ÜH)D), la 24,25 dihidroxivitamina D

(24,25(0H)20) y la 1,25(ÜH)ZDpueden inhibir la secreciónde PTHy reducir el tamaño de adenomas paratiroideos(37,38). Sin embargo, no hay acuerdo total sobre estepunto (39).

Comose verá más adelante, también las catecolami­

Qgg pueden afectar la secreción de PTH. Sin embargo, has­

ta el momentono se han efectuado estudios claros que pegmitan evaluar la partiCipación de la invervación simpáti­ca en la regulación de la secreción de PTH.

1.1.2.0- Metabolismoperiférico

Comose mencionó en 1.1.2.8, la paratiroides secrgta tanto la hormona entera como fragmentos de la misma.La PTH tiene una vida media de 1 a 10 minutos y es degra­

dada en higado y riñón (40). La hormona circulante es he­terogénea (41) y el fragmento de mayor concentración, yaque posee una vida media plasmática más prolongada quela hormona nativa, es el carboxi-terminal (el menos 1 ho­ra de vida media), biológicamente inactivo y cuyo P.M. esde 6.000 (42). Parte de este fragmento proviene de la eg

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creción normal de la glándula y el resto del metabolismoperiférico de la hormonaposterior a su secreción. Elfragmento amino-terminal, de P.M.3.500 es biológicamente

activo y su vida media es de 2 a 4 minutos (42).

1.1.2.E- Mecanismos de acción

El control de la PTHsobre la homeostasis del calcio comienza a partir de la interacción entre el fragmegto 1-34 de la molécula con receptores especificos de msmbrana. Estos receptores se han encontrado en diferentestipos celulares de riñón (43,44) y hueso (45). Tal interacción provoca activación de la adenilato ciclasa y enconsecuencia incremento de la sintesis de AMPcintracelglar. El AMPCa su vez activa diferentes sistemas que fi­nalmente conducen a la concreción de los efectos hormonales. La interacción de la hormona con la membranacelular

también puede inducir cambios directos comomodificacio­nes en el Flujo del ión calcio hacia el interior o exte­rior de las células (1,46).

Las consecuencias que estos mecanismos provocandependen de cada célula: En los osteoblastos llevan a unainhibición de la síntesis de colágeno. En los osteoclas­tos activan el sistema de resorción ósea y en las célulasosteoprogenitoras inducen incremento en la síntesis deADNque se traduce en una mayor diferenciación a osteo­

clastos (47,48). En las células renales se modifica eltransporte de calcio y Fósforo a través de la membrana(1)­

1.1.2.F- Acciones biológicas

La PTHactúa sobre el hueso (el principal reservo­rio de calcio del organismo) a través de 3 mecanismos

(47-49):

1- Sobre los osteocitos de superficie incrementando el intercambio de calcio entre el líquido extracelu­lar óseo y la sangre. Este incremento se cumple a travésde 3 vías: a) Aumentode la solubilidad del mineral me­

diado por la inducción de sintesis de ácidos orgánicospor los osteocitos, facilitando así la salida de calciodel hueso. b) La PTHestimula una bomba de calcio preseate en los osteocitos incrementando el pasaje de calciodesde el líquido extracelular óseo al sistémico. c) Ac­tóa comovasodilatador arterial asegurando un mayor flgjo sanguíneo al hueso durante la salida de calcio desdelos osteocitos hacia el líquido extracelular sistémico.

2- Sobre los osteocitos de profundidad: Estos Forman un tejido óseo metabólicamente muy activo de ubica­ción perilacunar. Cuando la PTHaumenta, provoca resor­

ción de la matriz y disolución del mineral, incrementando el tamaño de los espacios perilacunares que puedenconFluir entre si.

3- Sobre el remodelamiento y modelamiento del hugso a través de la activación de osteoblastos y osteoclagtos. En dosis menores, la PTHactiva los osteoblastos ylos osteoclastos en reposo. Dosis mayores estimulan ladiferenciación de células osteoprogenitoras a osteoclas­tos. A través de estos mecanismos la hormona incrementa

el metabolismo del hueso, facilitando una rápida libera­ción de minerales a partir de hueso recién Formado comorespuesta a las necesidades sistémicas. Es importante rgsaltar que el tejido óseo recién sintetizado posee una“matriz proteica soluble, con un mayor contenido de aguay en consecuencia una mejor disponibilidad de mineralesque ofertar.

En resumen, la PTHactúa sobre el hueso de la si­guiente manera: 1- Estimula los osteocitos de superficie

11 ­

-12­

que facilitan el pasaje de calcio desde el líquido extracelular óseo al líquido extracelular sistémico. 2- Actúasobre los osteocitos profundos activando la resorción deltejido óseo perilacunar° 3- Estimula la diferenciaciónde células osteoprogenitoras a osteoclastos incrementan­do la velocidad de recambio óseo. La administración cró­

nica de PTH, resulta Finalmente en un aumento de la re­

sorción ósea sobre la superficie endosteal y una estimu­lación de la formación perióstica con predominancia dela primera. Algunas de estas acciones requieren la pre­sencia concomitante de metabolitos de la vitamina D (50).

La PTHtiene numerosas acciones directas sobre el

riñon. Uno de los efectos renales más estudiados es sucapacidad de inducir fosfaturia a los 15-20 minutos deser administrada disminuyendo la reabsorción tubular defosfato y conduciendo a una mayor excreción de Fósforo(S1). La inhibición de la reabsorción de fosfato por eltúbulo proximal está mediada por AMPC(52). En cambio,

a nivel de la porción distal no existe mediación delAMPccuando se administran dosis fisiológicas de PTH(53).También se ha postulado que la PTHincrementa la secre­ción tubular de fosfato (53) si bien esto no ha sido de­mostrado.

La hiperfosfaturia provocada por la PTHtiene significado fisiológico. En efecto, dado que la PTHactúasobre el hueso aumentando la resorción ósea con la consiguiente liberación de calcio, fósforo y otros mineralesal líquido extracelular, podria ocurrir un indeseable ¿gcuestro por el fósforo del calcio liberado, provocandodepósitos de fosfato de calcio en los tejidos blandos.Esto es evitado debido a que la hiperfosfaturia inducidapor la PTHelimina el fósforo proveniente de la disolucióndel mineral óseo, manteniendo los niveles circulantes de

-13­

Fósforo en tenores tales que no interfieren con el efec­to hipercalcemiante de la PTH (47). La PTHincrementa lareabsorción tubular de calcio a nivel del nefrón distal,al mismo tiempo que incrementa la excreción de sodio (54).

Por el contrario, en el túbulo proximal disminuye tantola reabsorción de calcio como la de sodio (54,55) y, co­mo ya hemos visto, también la del fósforo.

Dado que durante la resorción ósea inducida porla PTHexiste liberación de bicarbonato además de mine­

rales, la hormonapreviene la alcalosis incrementando simultáneamente la excreción renal de bicarbonato y la re­

absorción tubular de H+ y NH4+. El resultado es una modgrada acidosis (56). Se complementa asi la acción de laPTHsobre el hueso, dado que la acidosis Facilita la di­solución del mineral óseo (47).

La PTHincrementa la sintesis renal de 1,25(ÜH)20(57) que coadyuva para elevar la calcemia a través de laestimulación de la resorción ósea y de la absorción in­testinal de calcio. Recientemente se ha descripto un e­

fecto directo de la PTHsobre la aborción intestinal decalcio (58).

1.1.2.8- Resumen

El efecto integral de la PTHes mantener un tenoradecuado de calcio en el compartimiento extracelular. Lahormona actúa sobre el hueso, incrementando su resorcióncon el consiguiente aporte de calcio y fósforo a la cir­culación (59). Tambiénactúa sobre el riñón incrementan­do la retención de calcio (59), la excreción de fosfato

(51) y la Formación de 1,25(ÜH)20 (58,60). Este últimoincrementa la absorción intestinal de calcio y fósforo(61). Las acciones sobre hueso y tubo digestivo, que au­

- 14 .

mentan el ingreso de fósforo al líquido extracelular, soncompansadas por los efectos sobre riñón donde la PTHin­crementa la excreción urinaria de este mineral. De ésta

manera disminuye la concentración de fosfato plasmáticocuyo incremento podria interferir con el efecto hiper­calcemiante neto de la PTH(47).

1.1.3- CALCITÜNINA

Mientras la PTHaumenta la concentración plasmáti­ca de calcio la CT actúa da modo tal de reducirla° Sin

embargo, el rol fisiológico de la CT en humanos aón no

está del todo aclarado. Es probable que la CT sea un ra­gulador importante del calcio plasmático en peces que,como el salmón, emigran de aguas de río e aguas de mar

(62) en las que la concentración de calcio es 10 vecesmayor. En el hombre adulto y otros mamíferos, la supre­sión de la secreción de CTpor tiroidectomia no provocaalteraciones en la regulación del metabolismo mineral(63,64,81), apoyando el concepto de que es una hormonaresidual de origen acuático. Sin embargo, como se verámás adelante la CTejerce efectos biológicos bien esta­blecidos que sugieren que, en el hombre, podria tenerfunciones especificas.

1.1.3.A- Células C-tiroideas: Anatomia-Histología

La CT, como factor hipocalcemiante fue descubier­ta por Copp y col en 1962 (65). El origen tiroideo de esta hormona fue sugerido por Hirsh en 1963 (66) quien ob­tuvo un factor con propiedades hipocalcémicas a partirde un extracto de tiroides de rata. Por medio de estudios

inmunocitoquímicos y de inmunofluorescencia, se confirmóque las células C-tiroideas, también llamadas parafolicg

- 15 ­

lares, ubicadas en la zona central de los lóbulos latera­les de la tiroides, constituyen la principal fuente deCT en humanos (67). Las células C-tiroideas se originanen la cresta neural embrionaria (68). En los animales igferiores forman una glándula Último branquial que se de­sarrolla a partir de la 69 bolsa branquial (peces, reptiles, anfibios, aves). En mamíferos migran a su posiciónfinal en la glándula tiroides (69).

Las células parafoliculares presentan diferenciashistológicas y citoquímicas con las células folicularessecretoras de tiroxina. Son mayores que éstas últimas ypresentan un citoplaSma pálido. Componenalrededor del

0,1% de la masa epitelial celular de la tiroides. La ogservación por microscopio electrónico de las célulasC-tiroideas muestra gránulos unidos a la membranacelular,abundantes mitocondrias, microtúbulos, una región de Gol­gi bien desarrollada, ribosomas libres y un reticulo en­doplasmático poco desarrollado. Se ha encontrado que lahipercalcemia aguda provoca degranulación de estas célu­las (1).

1.1.3.8- Estructura y biosíntesis

En diferentes especies la CT se presenta como unpolipéptido de 32 aminoácidos de P.M. 3.500 que posee un

puente disulfuro N-terminal y una porción amido-prolinaC-terminal (70). El estudio de la secuencia de aminoáci­dos en la CT de salmón, humana, porcina, bovina, ovina yde rata muestra que las diferentes cadenas polipeptídicaspueden diferir en 19 aminoácidos (1).

Al igual que la PTH, la CT también se sintetiza apartir de una forma precursora. El producto inicial esuna Pre-pro hormona; uh polipéptido que en la rata tiene

-15.

un P.M. de 15.000 (71) y en el humano de 17.500 (1)° Des

pués de sucesivos clivajes el producto Final es almacenado en gránulos secretorios y posteriormente liberado ala circulación. La CT circula como monómero o como un dí

mero de 64 aminoácidos cuyos péptidos están unidos pordos moléculas de cistina. La actividad biológica es ejercida por la molécula entera (69). A pesar de la conside­rable variación entre especies en cuanto a la estructura,las diferentes moléculas de calcitonina son activas sobrelos seres humanos (69).

1.1.3.C- Regulación de la secreción

El principal regulador de la secreción de CTesel calcio. La liberación hormonal es estimulada por altasconcentraciones de este ión e inhibida si las mismas se

hacen mínimas (69,72,73). La magnitud de la respuesta alcalcio que se observa en las diferentes especies variaen relación a la necesidad que estas tienen de prevenirla hipercalcemia (4). En efecto, los vertebrados que seoriginaron en aguas dulces, de baja concentración en calcio, y que luego migraron a1 mar (con 40 mg de Ca/dl)

Fueron los primeros en necesitar y desarrollar una hormgna reductora de la calcemia. Posteriormente, cuando apa­recieron los vertebrados terrestres, Fue necesario desa­rrollar una defensa contra la hipocalcemia antes que cogtra la hipercalcemia y se desarrolló la PTH(4). Se hademostrado que un incremento brusco del calcio sérico(1 mg/dl) provoca aumentos de la CT circulante que mag­niFican entre 2 y 10 veces el valor basal (10 a 100 pg/ml) (69). Sin embargo no se ha podido establecer una re­lación directa entre los tenores de calcio-CT circulan­tes, comoocurre en el caso calcio-PTH (1).

-17­

Las hormonasgastrointestinales son astimuladoresFarmacológicos de la secreción de CT. Ellas son gastrina,pentagastrina, glucagón, colecistoquinina y cerulina(74,75). Entre ellas, la gastrina es le más potente. El

significado fisiológico de la acción que ejercen las hormonas gastrointestinales sobre la secreción de CTaún está en discusión. Se cree que, en su conjunto, tienen lafunción de prevenir una hipercalcemia post-prandial au­mentando los niveles de CT sórica antes de que se incremente la entrada de calcio desde el intestino (47,69).

También se discute el rol que desempeñan las Egr­mggag sexuales sobre la secreción de CT. Por ejemplo, seha encontrado en diversas eSpecies animales que la CTcirculante es mayor en hembras que en machos (62,76).Por el contrario, en el humano, las mujeres presentan:niveles séricos menores que los hombres (77), una menorreSpuesta a estímulos secretorios (77) y declinación dela CT sérica con la edad (7B). Se ha postulado que losestrógenos estimulan la secreción de CT previniendo lapérdida de calcio en mujeres embarazadas o en períodode lactancia, situaciones en que los niveles circulantesde CTson elevados (79,80,81). Por otra parte, la infusiónde somatostatina inhibe la secreción de CT (82).

Por último, se ha encontrado que, además del cal­cio, existen otros cationes divalentes comoel estroncio,bario y magnesio que incrementan la secreción de CT "invitro" e "in vivo" aunque no hay evidencias de que seanreguladores fisiológicos de la misma(69,83).

Comose verá más adelante, las catecolaminas soncapaces de alterar la secreción de CT. Hasta el momentono se han efectuado estudios claros "in vivo" que permi­tan valorar la participación de la inervación simpáticalocal en la regulación de la secreción de CT.

- la ­

1.1.3.0- Metabolismoperiférico

La vida media de la CT plasmática es de alrededor

de 10 minutos (84). La hormona se metaboliza Fundamentalmente en el riñón, donde es filtrada, reabsorbida y de­gradada en los túbulos renales (85). Estudios desarrollados "in vitro" demuestran que existe un Factor plasmáti­co capaz de degradar CT (86). Dado que en este caso el

tiempo de degradación es prolongado (aproximadamente 20horas) (84) en relación a la vida media de la hormona,

se piensa que este mecanismo representa una pequeña pro­porción del metabolismo total de la CT "in vivo" (69).

1.1.3.E- Mecanismos de acción

Tanto las células óseas comolas renales poseenreceptores específicos para la CT (87). Después de launión hormona-receptor, se activa la adenilato ciclasa,que incrementa el tenor intracelular de AMPc(87,88). Este Último desencadena, al menos en parte, la acción hor­monal. Se ha postulado que el posterior secuestro de calcio por las mitocondrias; que de esta manera reduce laconcentración del mismo en el citosol, es uno de los me­

canismos por los que se reduce el eflujo de calcio desdelas células óseas al líquido extracelular (4).

1.1.3.F- Acciones biológicas

La CT ejerce una acción directa sobre el Egggg,independiente de la PTH, inhibiendo la resorción ósea (89).Esta acción se manifiesta "in vitro" sobre los osteoclas­

tos cuyo borde activo rugoso, desaparece 15 a 30 minutosdespués de agregar CT al medio de cultivo (90).

La CT inhibe la resorción tanto de la matriz como

-19­

del mineral del hueso, impide la diferenciación de nuevososteoclastos y disminuye la actividad de los existentes(89,91). Estos afectos se traducen en una reducción dela liberación a la circulación de los minerales del hue­

so y de los constituyentes de la matriz ósea y dan comoresultado una disminución de la calcemia, de la fosfate­mia y de la excreción de hidroxiprolina urinaria (47).

Diversos autores han postulado una acción directade la CT sobre la formación ósea. Se ha encontrado quela hormonaprovoca aumento de la actividad osteoblástica

(92%.de la masa ósea (93) y de la síntesis de aminoglicgnos que participan en la Formación ósea (94). No se des­carta que estos efectos reflejen un incremento de la ac­tividad osteoblástica, secundaria a la inhibición que laCTejerce sobre los osteoclastos (64).

La magnitud de la disminución de la calcemia des­pués de administrar CT, es proporcional a la capacidadde recambio óseo que posee el esqueleto. Por ejemplo, losanimales jóvenes y en crecimiento presentan una mayor respuesta a la CTque los.adultos cuyos esqueletos poseenmayor estabilidad (95). La CT jugaría también un rol im­portante en la protección del esqueleto. Esta hipótesises apoyada por el hecho de que durante la lactancia (96)u ovulación (97) los niveles de CT sérica se encuentranelevados. Asimismo, como ya se mencionó en 1.1.3.C la

CT circulante es menor en la mujer que en el hombre y a­

demás declina con la edad. En consecuencia se ha postulado que esta hormona desempeña un papel Funcional en la

pérdida de la masa ósea que ocurre después de la menopau­sia (47).

En relación al aparato digestivo, se ha descriptoque la CTincrementa la absorción intestinal de calcio

-20­

y disminuye la excreción de calcio fecal (98,99). Indepegdientemente de su posible función sobre el calcio,la CTejerce otros efectos vinculados al aparato digestivo:inhibe la secreción gástrica (100) y biliar (101). Incrgmenta la secreción de saliva y la secreción intestinalde agua y electrolitos (102). La gastrina y otras hormo­nas digestivas, comose menciona en 1.1.3.C, incrementana su vez la liberación de CT, indicando que existe unarelación hormonalde retroalimentación entre ellas.

Se han estudiado las posibles funciones neuroen­dócrinas de la CTcirculante de origen C-tiroideo. La ho;mona fue localizada en diferentes regiones del sistemanervioso central y en la pituitaria (103,104). En conse­cuencia se piensa que podria actuar comoneurotransmisor.Sin embargo su presencia en dichas regiones podría serun caracter residual vinculado a su origen neural (64).

Si bien la CTes un antagonista fisiológico de laPTHrespecto al manejo del calcio, ambas hormonas actúanen el mismosentido en relación al fosfato: La administración de dosis farmacológicas de CT provoca en el ¿ifióguna disminución de la reabsorción tubular de calcio y fóg

foro, con el consiguiente incremento de la calciuria yen menor medida de la fosfaturia (85). Su efecto neto setraduce en una disminución de la calcemia y de la fosfa­temia. Dado que la CT estimula también la captación defosfato por ciertos tejidos blandos comoel higado (105),la disminución de la fosfatemia se acentúa.

1.1.3.0- Resumen

A pesar de que la CT se considera una hormona re­

sidual en mamíferos que refleja su origen acuático, susfunciones son específicas y se pueden resumir de la siguiegte manera (47):

- Durante la gestación y en el recién nacido pro­mueveel crecimiento y la mineralización ósea. Participatambién en el control de la composición iónica del liquido extracelular fetal.

- Ejerce un control sobre la fisiología de la di­gestión y de la absorción intestinal interactuando conlas hormonasgastrointestinales.

En síntesis, la CTprotegería al eSqueleto contra lapérdida de tejido óseo bajo circunstancias en las que exigte déficit de calcio tales comoel embarazo y la lactan­cia. Ademásprevendria la hipercalcemia y la consiguien­te pérdida renal de calcio que sigue a la ingestión dealimentos ricos en este mineral.

1.1.4- ÜTRÜS FACTORES

La vitamina D y sus metabolitos constituyen el te;cer grupo hormonal que participa en la homeostasis delcalcio. A continuación se analizará brevemente esta par­ticipación.

La vitamina D es un asteroide que ingresa al orga­

nismo por dos vias: En piel se sintetiza la vitamina D3por irradiación de luz ultra-violeta ambiental. La vita­

mina 02 por su parte, se incorpora por alimentación. Am­bas formas ejercen acciones biológicas similares (57,106,107). Una vez que la vitamina D ingresa a la circulaciónsufre una serie de transformaciones (106,107): 1- Es hi­droxilada en el higado en la posición 25 Sintetizándosela 25(0H)D.g- Este metabolito es transportado al riñóndonde puede seguir dos vias alternativas: a) hidroxilación

en la posición 1, sintetizándose la 1,25(ÜH)20, conside­rado el metabolito activo de la vitamina D por excelencia(106). b) hidroxilación en la posición 24 formándose la

-22­

24,25(ÜH)20 cuya actividad biológica global aún está endiscusión.

Las acciones biológicas de la 1,25(OH)20 son lassiguientes: 1- Incrementa la absorción intestinal de calcio y fósforo (106). 2- Sobre el hueso estimula la resogción "in vitro" Q106). Sus efectos "in vivo" aún no estánaclarados aunque se ha postulado que deteriora la minera­lización e inhibe la resorción (108). 3- Inhibe la secre­ción de PTH(32,107). 4- En menor medida, sobre riñón in­crementa la reabsorción tubular de calcio y Fósforo (57).

5- Niveles elevados de 1,25(0H)20 sérico provocan: a) estimulación de la conversión de 25(ÜH)Da 24,25(0H)20(107). b) inhibición de su propia síntesis (106). A su

vez la 24,2S(ÜH)20 estimula la Formación del hueso y/osu mineralización (50,109).

En sintesis, cuando el organismo necesita incremegtar los niveles circulantes de calcio, se activa la sín­

tesis de 1,25(DH)ZD quien apoya las acciones de la PTHmovilizando calcio desde intestino y hueso hacia el líquido extracelular sistémico. En cambio, cuando la di5poni­bilidad del mineral es abundante, la 25(ÜH)Des transfor­

mada a 24,25(ÜH)20 (47).

1.1.5- INTEGRACION DE LA REGULACION HÜRMÜNAL DÉL METABO­

LISMO DEL CALCIO

La Fig. 3 resume los puntos principales que compo­nen la regulación hormonal del metabolismo del calcio.La acción hormonal tiende a evitar que ocurran cambiosprolongados o rápidos de la calcemia. Cuando esta dismi­nuye, se incrementan la sintesis y secreción de PTH. Es­ta hormona actúa sobre el riñón provocando un aumento dela reabsorción tubular de calcio y de la excreción de

-23­

FIGURA 3: REGULACION HÜRMÜNAL DEL METABOLISMO DEL CALCIO

CELULA CELULA

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La PTHactúa sobre riñón y hueso estimulando la reab­sorción tubular de calcio y la resorción ósea y en conse­cuencia incrementando el ingreso de calcio al liquido ex­tracelular (LEC). Actúa también inhibiendo la síntesisde 24,25(ÜH)20 y estimulando la de l,25(ÜH) D que a tra­vés de sus efectos sobre intestino y hueso mantiene el a­porte de calcio al LEC. En consecuencia se eleva la cal­cemia.

Por su parte, el incremento de la calcemia provocala secreción de CT que impide el ingreso de calcio prove­niente de hueso y riñón al LEC. Además, la 1,25(ÜH)20 inhi­be la secreción de PTHy frena su propia síntesis estimu­lando asi la formación de 24,25(ÜH)20 quien estimula laentrada de calcio al hueso. La resultante es una disminu­ción del ingreso de calcio al LÉCo

-24­

Fosfato conduciendo a una elevación del ingreso de calcioal líquido extracelular sistémico. Si el estímulo hipocalcemiante no es prolongado, la calcemia retornará a SUSvalores normales. En caso contrario, la secreción de PTHcontinúa y se acentúan sus efectos biológicos: Se activa

la síntesis de 1,25(ÜH)2Dy el remodelamiento del hueso.En consecuencia se estimula la absorción intestinal decalcio y se facilita el acceso a la reserva cálcica deleSqueleto. Asimismo disminuyen la secreción de CT y la

sintesis de 24,25(DH)20evitándose asi el Flujo de calciodesde el líquido extracelular sistémico hacia el líquidoextracelular óseo (47).

Cuando existe un incremento de la calcemia, loscambios provocados son opuestos a los descriptos: Al in­hibirse la síntesis de PTHdesaparece su efecto osteolí­tico, aumenta la calciuria, disminuye la excreción renalde Fosfato y en consecuencia baja el tenor de calcio sé­rico. El incremento de la secreción de CT provoca una disminución de la actividad osteoclástica y aumenta la excrgción renal de calcio, contribuyendo a disminuir el conte­nido de calcio del líquido extracelular sistémico. La

1,25(OH)ZDFrena su propia sintesis e inhibe la secreciónde PTH. Estimula también la formación de 24,25(ÜH)20 queincrementa la mineralización del hueso. Al mismo tiempo,

la disminución de la síntesis de 1,25(DH)20 provoca unadepresión de la absorción intestinal de calcio y de laresorción ósea. Estos mecanismos conducen también a unadisminución de la calcemia.

En síntesis, la acción hormonal previene la hiper­calcemia estimulando la salida de calcio del líquido ex­tracelular, a través de su eliminación urinaria y de suingreso al compartimiento óseo. Simultáneamente, inhibeel ingreso de calcio al líquido extracelular mediante el

-25­

bloqueo de la absorción intestinal y de la resorción delhueso (47).

1.2- EL SISTEMA NERVIOSO AUTONOMO

El Sistema nervioso autónomo inerva los órganosinternos. Su Función es modular y controlar el medio in­terno contribuyendo a mantener la homeostasis del organigmo. Participa también en situaciones que requieren ajus­te a estímulos ambientales tales comoadaptación corporala los cambios de temperatura ambiente o de requerimientode nutrientes ambientales. Estas funciones son ejercidasen parte bajo el control del sistema nervioso central.La actividad del sistema nervioso autónomo, generalmenteinvoluntaria, se ejerce sobre efectores internos: 1- mús­culo liso, por ejemplo el intestino. g- músculo cardíaco.2- glándulas exócrinas, por ejemplo sudoríparas y saliva­res. fl- Algunas glándulas endócrinas (110).

La actividad de este sistema provoca rápidos ajus­tes en respuesta a los cambios del medio ambiente y es e­jercido en los ganglios o terminaciones postganglionaresmediante la liberación de agentes químicos que actúan transitoriamente en sus sitios inmediatos de liberación. En

el caso del sistema simpático, las catecolaminas circulan­tes actúan sinérgicamente con las neurales. El sistemaendócrino, en cambio, regula adaptaciones más lentas y ge­nerales liberando agentes hormonales al torrente sanguí­neo. Estos agentes actúan en sitios distantes y dispersosdurante períodos prolongados.

La teoría neurohumoral puede considerarse como unconcepto unitario del funcionamiento de los sistemas ner­

- . . . IV1080 y endócrino en el cual las diferenCias son solo cuantitativas (111).

_ 27 _

1.2.1- ORGANIZACION DE LA INERUACIÜN AUTONOMA

Desde el punto de vista Funcional y estructural,

el sistema nervioso autónomopuede dividirse en dos sec­

tores eferentes que inervan las vísceras: el sistema simpático cuyas prolongaciones parten de la médula espinala la altura de los segmentos torácico y lumbar y el sis­tema parasimpático que surge de los segmentos craneales

y sacros. Hoyee considera a la inervación vegetativa deltracto gastrointestinal comoun tercer factor, independiegte del sistema nervioso autónomo(sistema entérico).

La vía Final común en la inervación autónoma abagca una cadena bineuronal° En el sistema nervioso central

se localizan neuronas preganglionares que se proyectanhacia neuronas postganglionares ubicadas en la periferia.

El sistema simpático está principalmente involucrado en la homeostasis durante la actividad corporal de distintos tipos° En cambio, el parasimpático se vincula conlas Funciones vegetativas de restauración comodigestióny sueño (110).

1.2.2- EL SISTEMA SIMPATICÜ

La inervación simpática tiende a actuar de mododifuso y prepara al organismo para las emergencias y parala actividad muscular enérgica. Los animales simpatitec­tomizados, por ejemplo, presentan una resistencia muydigminuida a los extremos de la temperatura ambiental, a lahipoxia y a otros tipos de stress. Se pierde la regulacióndel sistema cardiovascular con imposibilidad de adaptacióna esfuerzos prolongados o intensos (110). Las interconexignes entre los diversos ganglios paravertebrales Facilitanla acción difusa del sistema simpático. Simultáneamente,

sus conexiones con la corteza cerebral avalan la presen­cia de mecanismoscapaces de anticipar las necesidadeshomeostáticas.

La trayectoria comúnpara una fibra simpática preganglionar es la siguiente: Parte de la raíz anterior yrecorre un "ramo comunicante blanco" (fibras mielínicas)que constituyen la vía de llegada a los ganglios simpáticos paravertebrales. Esta cadena abarca niveles cervica­les a sacros. Las ramas comunicantes blancas sólo se ha­

llan en los niveles que contienen cuerpos celulares pre­ganglionares (segmentos torácico y lumbar superior). Losaxones preganglionares se ramifican profusamente en lacadena paravertebral y hacen sinapsis en varios ganglios.A nivel cervical existen 3 ganglios: superior, medio einferior que reciben estas aferencias° Las neuronas delos ganglios simpáticos originan axones amielínicos pequeños que parten del ganglio para unirse a nervios espinaleso viscerales a través del "ramo comunicante gris" (amie­línico).

Ademásde estas sinapsis pre-postganglionares enla cadena paravertebral, existen otras dos estructuras:1- Algunos axones preganglionares continúan su recorrido

periféricamente pudiendo efectuar o no sinapsis en lacadena paravertebral. Finalizan en neuronas postganglignares prevertebrales comoel ganglio celíaco o el me­sentérico.

2- La médula suprarrenal es inervada por el nervio esplágnico. Las células ganglionares (en este caso cromafi­nes) son inervadas directamente por axones preganglio­nares.

1.2.3- LA TRANSMISION NEURÜÜUIMICA EN EL SISTEMA SIMPATICÜ

Los transmisores químicos que se liberan en lasterminaciones del sistema nervioso autónomo actúan sobre

distintos aceptores que a su vez originan una respuestaefectora.

1.2.3.A- Neurotransmisores

El mediador de las Fibras preganglionares de lossistemas simpático y parasimpático es la acetilcolina.Las fibras postganglionares del parasimpático también li­beran acetilcolina (colinérgicas) (111)° Los neurotrans­misores liberados por las terminaciones postganglionaresdel sistema simpático son aminas biógenas y se conocencon el nombre de catecolaminas. Existen dos excepcionesa esta regla: tanto el sistema simpático vasodilatadormuscular comoel que inerva las glándulas sudoríparasestán compuestos por neuronas que liberan acetilcolinacomo neurotransmisor (111).

Las catecolaminas tienen una vía biosintética co­múnque parte de la tirosina. Por acción de la tirosina­hidroxilasa es transformada en L-dopa que a su vez se coavierte en dopamina con la intervención de una decarboxi­lasa de aminoácidos aromáticos. Las neuronas adrenérgicas

poseen una dopamina/g-hidroxilasa que convierte la depa­mina en noradrenalina (o norepinefrina (NE)) (111). Enotros tipos celulares la NErecibe un grupo metilo quese incorpora al grupo amino de la cadena lateral, sinte­tizándose adrenalina (o epinefrina). La NEes el neurotransmisor por excelencia de las neuronas simpáticas postgan­glionares. Las células de la médula suprarrenal liberanFundamentalmente epinef‘rina° Existen también evidenciasde co-transmisión en membranasautonómicas con presencia

-30­

Simultánea de catecolaminas adrenérgicas y neuropéptidosen las terminales sinápticas (112). Tal es, por ejemplo,el caso del neuropéptido Y que coexiste con NEen las te;minales periféricas del sistema simpático cervical (112).

1.2.3.8- Liberación del transmisor

Las catecolaminas se sintetizan probablemente enla región de las terminales sinápticas donde se almacenandentro de vesículas. Durante el estado de reposo existeuna liberación lenta y continua de cuantos aislados deltransmisor, generalmente insuficiente para iniciar respuegtas poetsinápticas evidentes en el punto de unión; Sinembargo se producen cambios de potenciales postsinápticosque se asocian con el mantenimiento de la respuesta Fisiglógica del órgano efector (113). Un potencial de accióninduce la despolarización del terminal provocando la li­beración sincronizada del.neurotransmisor por un procesocalcio-dependiente. El contenido de las vesículas se des­carga al exterior junto con enzimas y otras proteinas.La cuantificación de estos componentes puede suministrarinformación de utilidad sobre la duración e intensidad

de la actividad presináptica (114).

1.2.3.0- Adrenoceptores y actividad postsináptica

El transmisor difunde a través de la hendidura si­, . . l .naptica o de union y se combina con receptores macromole­

culares eSpecializados de la membranapostsináptica. Exigten también sitios de unión presináptica. Esta unión neu­rotransmisor-aceptor lleva a la inducción de modificacio­nes en la permeabilidad de la membrana(efectos ionotróficos) o resultan en la síntesis de un segundo mensajero igtracelular (AMPC,Fosfolípidos comoel fosfatidil inosi­

-31­

tol y otros) provocando efectos metabotróficos (111). TQles respuestas están moduladas especificamente por receptores pre y postsinápticos especializados para el neuro­transmisor que inicia la respuesta en la célula efectora(111).

La actividad postsináptica en una célula glandularse refleja en un incremento o depresión de la secreción,de acuerdo al caracter excitatorio o inhibitorio de laseñal recibida. La respuesta final es la resultante dela suma algebraica de los estímulos (111).

Se ha descripto que la NEejerce acciones excita­torias sobre algunos órganos efectores (por ejemplo vasossanguíneos) y un efecto inhibitorio sobre otros (ciertosmúsculos). Ahlquist (115) propuso los términos receptores

6.o figpara los sitios de los músculos lisos donde las ca­tecolaminas producen respuestas excitatorias o inhibido­ras respectivamente° Más recientemente, en relación a lapotencia Farmacológica de acción de las catecolaminas endistintos territorios, se han descripto dos tipos de Fe­nómenos. En un caso, por ejemplo músculo vascular, la ac­

ción sigue la secuencia NEz,epinefrinazv isoproterenol(compuesto sintético formado a partir de la NEpor el a­gregado de un grupo propilo). En otro caso, como la inhi­bición de ciertos músculos lisos, la secuencia es isopro­terenol i>epinefrina 7 NE(116).

Ciertas drogas, como la Fenoxibenzamina y la fen­tolamina provocan un bloqueo selectivo de los receptorescxy otras, comoel propranolol, de los receptores/g.De esta manera es posible estudiar por separado los efec­tos de los impulsos nerviosos adrenérgicos y de los agen­tes simpático-miméticos sobre ambos tipos de aceptores(111).

IIIIIIII.IIIIIIIIIIIIIIIIIIIII.IIIIIlllII.IIIIIIII.IIIIIIIIIIIIIII'IIIII

-32­

Los receptores /gse han clasificado en dos subti­

posz/g1 (principalmente en corazón) y/B2 (en el restode los sitios de unión) sobre la base de su capacidad se­lectiva de respuesta Frente a los agentes agonistas y an­tagonistas (117). Asimismo, existen dos subtipos de receE

tores ¿»adrenérgicosz los aceptores ¡1 se localizan prin­cipalmente en los sitios postsinápticos y por ello sonresponsables de la iniciación de sucesos postsinápticos

excitatorios; los aceptoreso<2 están ubicados,en parte,en la región presináptica° La activación de los mismosprovoca la inhibición de la liberación del transmisor (117).En consecuencia se explica que en lasnsinapsis adrenérgi­

cas, los reCeptorescx2 parecen mediar la inhibición dela liberación de NEpor retroalimentación° Tambiénpare­

ce haber receptores «2 postsinápticos en sitios no iner­vados por el sistema simpático (117).

Los efectos resultantes de la acción ejercida porla NEresulta de la diferencia neta entre la actividad

provocada por la unión del neurotransmisor con cada unode los aceptores. La NEprovoca una mayor estimulación

de los sitios aceptores gxque de los aceptores/g. (116).

1.2.3.0- Destrucción del transmisor

Una vez desencadenada la acción biológica despuesde la interacción del neurotransmisor con los sitios adrgnoceptores, ocurre una desaparición gradual del neurotrangmisor. Esta se da a través de 3 vias: 1- Metabolismo en­zimático por acción de la monoamino-oxidasa (MAO)y de

la catecol-o-metiltrasferasa (CÚMPT).g- Difusión. g- Re­captación del mismopor las terminales axónicas (118).

Los procesos descriptos en el punto 1.2.3. se reSU­men en la Fig. 4.

-33­

FIGURA 4: ETAPAS DE LA NEURÜTRANSMISIÜN QUIMICA EN UNA

UNION NEURÜEFECTÜRA SIMPATICA CDN UNA CELULA

SECRETÜRA

TERMINAL NERWOSA SIMPAHCA CELULA NEUROEFECTORA

PRESINAPSIS POST SINAPSIS

Potencial 53:31:21de acción ® es ecífico

Ncao+ p

Q —‘ RESPUESTAESTIMULACIONo INHIBICION DE

l_,_A_gECRECIONHORMONAL

CD

TlROSINA-ONE

0 -—- RESPUESTA

UNIONNEUROEFECTORA

l- Síntesis del neurotransmisor (NE).2- Almacenamiento de NE.3- Un potencial de acción determina el aflujo de calcio

a la terminal de la neurona provocando:4- Depolarización de la membranay exocitosis de las ve­

siculas que contienen NEque es liberada a la hendidu­ra sináptica.

5- La NE interactúa con adrenoceptores pOStSináptiCDSb%yen menor medida y se inicia la respuesta reflejadaen una inhibición o estimulación de la secreción hor­monal.

6- El neurotransmisor interactúa con receptoresa:2 presi­nápticos inhibiendo la liberación de NE°

7- La eliminación de la misma se produce por: A, recapta­ción; B, difusión; C, metabolización.

- 34 _

1.3- GANGLIÜ CERVICAL SUPERIOR (CCS)

Como se ha mencionado en el punto 1.2.2, el BCS

integra el sistema simpático formando parte de la cadenaparavertebral. Se han establecido complejas interaccionesentre los ganglios de dicha cadena (119) que sugieren quelos mismos se pueden comportar comocentros integrativos.En efecto, sus procesos electrofisiológicos pueden serestimulados o inhibidos por neurotransmisores diversos yvarias hormonas afectan las funciones ganglionares (120,121).

Los axones que parten del GESo transitan por el

mismoprovenientes de los ganglios cervicales medio e in­

ferior, proveen inervación simpática a la cara, la mayorparte de la cavidad craneal y parte del cuello, incluyan­do tiroides y paratiroides (122).

1.3.1- ANATOMIA-HISTÜLÜGIA

El CCSde la rata adulta posee estructuras neuro­nales simples. Cada una de ellas comprende alrededor de.4Ü.ÜÜÜcélulas y pesa aproximadamente 1 mg (123). Está

formado por 4 clases de tipos celulares (124):1- Vaina conectiva que representa alrededor de un 30%del

peso húmedo y que puede ser removida fácilmente por micrg

disección sin dañar otros componentes del ganglio. g- gá­lulas ganglionares principales. Su diámetro es de 20 a

30 pm y su citoplasma contiene pequeñas vesículas que in­cluyen gránulos de densidad variable (123). La gran mayo­ria de estas células son noradrenérgicas aunque tambiénse detectó la presencia de diversos péptidos comoneuro­péptido Y, somatostatina, encefalina, sustancia P, LHRH,TRHy otros (112). Aún no se conoce el rol Fisiológico

de estos péptidos. Se postula que podrían actuar como neu

-35­

rotransmisores, factores trópicos o comofactores involu­crados an la modulación a largo plazo de los procesos gagglionares (123). 2- Células de la Glía. Se presentan co­mocélulas clásicas de Schuann distribuidas alrededor da

las fibras amielinicas y también comocélulas satélitesque rodean totalmente a las neuronas. Su citoplasma setiñe con menor densidad que al de las células gangliona­res principales y contiene finos filamentos. 3- Célulascromafines o SIF (Small intensely fluorescent). Contienengránulos de un diámetro aproximado de 1.500 A9, NE y en

algunos casos encefalina (125). Usualmente se agrupan enracimos que forman paraganglios cuyos axones penetran osalen del ganglio o se disponen alrededor de pequeñas ve­sículas de sangre. Se distribuyen en dos poblaciones:a) células aisladas (SIF Tipo 1) Q) células fuertementeunidas alrededor de sinapsis con células SIF Tipo 1 (126).

Esta relación anatómica particular entre las célu­las de Tipo II y los capilares que irrigan el CCSpuedetener un significado Fisiológico doble: 1- Los capilaresson vias para la llegada de hormonas extraganglionares(corticoides, estrógenos, gonadotrofinas) disponibles pa­ra ser utilizadas por las células SIF. g- Estos capilarespueden constituirse en canales que transportan catecolami­nas desde las células SIF a otras neuronas ganglionareso al pool circulante de catecolaminas (123).

1.3.2- TERRITORIO DEL CCS

1.3.2.A- Tiroides-paratiroides

Entre otras conexiones neuroendócrinas, por elGCStransitan fibras que ineruan las glándulas tiroides(incluyendo las células C-tiroideas) y paratiroides (Fig.5).

-35­

FIGURA 5: TERRITORIOS INERVADÜS PUR LAS FIBRAS NERUIÜSAS

QUE TRANSITAN PUR EL GCS

glándula pinealvasos pialesplexo coroideo

parénquimacerebral

nervio .carohdeo Intetno

netvío carotídeoexternogangüo

ken! cal superiorganglio cervical GLANDULAÏIROIDESmedio Y PARATIROIDESganglio cervicalinferior

medulaespinal

Si bien el origen de las proyecciones neurales esel GES, en ciertos casos los cuerpos neuronales puedenestar ubicados en ganglios mas caudales, arribar alCCSpor el tronco simpático y abandonar el ganglio sinhacer sinapsis intraganglionar.

-37­

En la tiroides de diferentes especies, incluyendoel hombre, se han localizado fibras nerviosas procedentesdel CCSque contienen NE. Parte de estas fibras se dispo­nen entre y alrededor de los folículos tiroideos (127).Asimismose ha descripto que existe inervación simpáticadentro de la paratiroides y que las terminales nerviosasdesembocan cerca de las células del parénquima (128-131).Estas observaciones constituyen una base morfológica queapoya la presencia de una acción directa, no vascular,de la inervación simpática sobre las Funciones de las cé­lulas de la paratiroides y c-tiroideas (123).

1.3.2.8- Otros territorios

Ademásde tiroides y paratiroides, el GCSinervaotras estructuras ligadas directa o indirectamente al sis­tema neuroendócrino: glándula pineal, cuerpo carotideo,plexo coroides, neurohipófisis, eminencia media (123) (Fig.5).

En diversas situaciones experimentales se observóque el incremento o la_disminución de la actividad de lasneuronas simpáticas en áreas inervadas por el CCSprovo­can cambios en la'secreción de melatonina (132-133) , re­nina-angiotensina (134), hormonasluteinizante y folículoestimulante (135), hormonade crecimiento (136), prolac­tina (136) y oxitocina (137).

Estos resultados confirman que las vías cervicalessimpáticas cumplen un rol Funcional e integrado en la re­gulación endócrina de los territorios que inervan (123).

1.3.3- EFECTOS DE LA GANGLIECTOMIA CERVICAL SUPERIOR (GCSX)

La GCSxprovopa alteraciones neuroendócrinas Fun­cionales de las estructuras que inerva. Estas modificacig

-38­

nes son de calibre muy diverso como la modificación delbalance de agua en ratas desprovistas de pituitaria, al­teraciones de la liberación de prolactina y de la condugta bebedora de las ratas y modificación del controlFotoperiódico de la reproducción en diversas especies (138).Modifica también la Función tiroidsa y el crecimiento encarneros (138).

Después de GCSx, cuando las terminales simpáticaseferentes se desintegran durante el proceso de degenera­ción neuronal, el contenido de las varicosidades, que in­cluye NE, es liberado en las zonas circundantes a las si­napsis (139-142). La NEliberada es capaz de activar losaceptores de las células efectoras. Esta activación hasido descripta en varios órganos y reproduce la actividaddel nervio intacto (140).

La liberación de NEcomienza 8-10 horas después de

la GCSxy se prolonga durante aproximadamente 16 horas

hasta que se completa la degeneración de las terminalesdependiendo estos tiempos del tejido inervado (132,140,141,143) (Fig. S). Esta liberación supraliminal tempora­ria ds neurotransmisor, al provocar hiperactividad tran­sitoria de los órganos inervados adrenórgicamente, resul­ta un procedimiento ótil para aclarar el significado fi­siológico de la inervación simpática en la regulación dela actividad de dichos órganos (14D). Por ejemplo, en es­tudios efectuados en ratas se ha encontrado que duranteel proceso de degeneración neuronal el GCSdesempeña unrol inhibidor sobre la respuesta de la tiroides a la TSH.Una vez que la GCSxse hace crónica, este efecto inhibi­torio desaparece (144). Ademásse ha detectado incremen­to de hipertrofia compensadorade la tiroides durante elproceso de degeneración neuronal (H.Romeo. Tesis presen­tada en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Fa­

-39­

FIGURA 6: ACTIVIDAD PDSTSINAPTICA EN DIFERENTES PERIODOS

DESPUES DE GCSx

INTACTO

ACTIVIDAD

POSTSINAPTXCA

l- En al periodo inmediatamente posterior a la GCSXocurreuna cesación de la actividad postsináptica debida a u­na parálisis neural.

2- En al lapso comprendido aproximadamente entre lÜ y 25horas después de GCSxocurre una liberación de neuro­transmisor por degeneración de las terminales nervio­sas, que mimetiza la actividad postsináptica del ner­vio intacto.

3- Después de este periodo, en ausencia de NE, cae la ac­tividad postsináptica y se pueden analizar los efectosque la denervación crónica causa en el tejido en estu­dio.

Estos tiempos son variables y dependen del tejido inerva­do, pudiendo extenderse el período de degeneración neuro­nal hasta 48 h después de la cirugía.

- 40 ­

cultad de Ciencias Exactas y Naturales UNBA;1987: "Modu­

lación ejercida por el sistema nervioso autónomosimpáti­co sobre el eje hipófiso-tiroideo")

La GCSXserá el modelo experimental que se utilizaráen la presente Tesis para valorar el rol que juega la presencia o ausencia de la inervación simpática sobre la ac­tividad de las células paratiroideas y C-tiroideas.

-41

1.4- AMINAS BIÜGENAS Y SECRECIÜN DE PTH Y CT

Comose ha discutido en la Sección 1.1, existe a­cuerdo general en que la concentración de calcio es elregulador dominante de la secreción de PTHy CT (1).

Sin embargo, en los últimos años se ha encontrado que

una variedad de compuestos no iónicos pueden actuar comopoderosos estimulantes o inhibidores de la secreción de

estas hormonas. Entre ellas el glucagón (75), prostaglag

dinas E2 y F (145,146) y las aminas biógenas (147).2

Se ha demostrado que las células secretoras de PTHy CT

contienen sistemas de adenilato-ciclasa que son fácilmegte excitados por las aminas biógenas y que la secreciónde ambas hormonas correlaciona directamente con la acti­vación de la enzima o la adición de AMPca las células.

Dichas células también poseen receptores de membranaes­pecíficas para ciertas aminas biógenas (147).

Esta información determinó la apertura de un nue­vo campode estudio que valora la posibilidad de la exigtencia de un mecanismo de regulación ejercido por aminasbiógenas de origen circulante o neural sobre la secreciónde PTH y CT.

A continuación se exponen algunos de los resulta­dos obtenidos hasta el momentoen este terreno.

1.4.1- SECRECIÜN DE PTH Y AMINAS BIÜGENAS

1.4.1.A- Estudios "in vitro"

Los agonistaslfigadrenórgicos incrementan tanto laacumulación de AMPcintracelular como la liberación de

PTHdel tejido paratiroideo (148,149). Comola adición

de pr0pranolol, antagonista ,31 yfl2,(150) bquuea la indu_c_

_ 42 ­

ción de estas respuestas por el iSOproterenol, se ha su­

gerido que las mismas ocurren por activación de los adrgnoceptores¡/;(150). Posteriormente Kukreja y col (151,152),adicionando agonistas y/o antagonistas específicos en cultivos de paratiroides, demostraron que la liberación de

PTHocurre después de la activación de receptores/g1.

Browny col (153) identificaron receptoresl/gadre­nérgicos en células aisladas y dispersas de paratiroidesy postularon la existencia de una estrecha correlación

entre la unión del agonistafi adrenórgico con su aceptor,la activación Subsecuente de la adenilato ciclasa y elposterior incremento de la secreción de PTH. En contrastecon los resultados de Kukreja, que en tejido bovino sólo

encuentra receptoreS/S1 (151,152), Broun y col describenque en preparaciones de paratiroides humanala mitad de

los receptores son/g1 y la mitad restante/g:2 (150).

Existen otras relaciones interesantes entre agonigtanB, AMPcy liberación de PTH. Si bien la hipocalcemiay el isoproterenol estimulan la secreción de PTH, la hi­pocalcemia puede incrementar los niveles intracelularesde AMPcsólo un 3%de lo que aumenta el isoproternol (154).

También se observó que el bloqueo de los receptores/¿anomodifica de manera consistente la secreción de PTHen res­

puesta a tenores disminuidos de calcio (154). Los autoresconcluyen que la estimulación de la secreción de PTHin­ducida por el calcio, no está mediada primariamente porel AMPC.

El agonistacá Fenilefrina inhibe la acumulación deAMPCy la secreción de PTHestimulada por agonistas/g (155).Ademásel btoqumoa(con fentolamina potencia el efectoestimulante de PTHejercido por una mezcla de agonistas

°¿)/fs, como la epineFrina y NE(155). Estqs resultadossugieren que las células paratiroideas podrían tener re­

CePtores akadrenérgicos cuya activación induce la inhibi­ción de la síntesis de AMPcy en consecuencia de la libe­ración de PTH.

Varios autores encontraron que las catecolaminasy los niveles disminuidos de calcio, movilizan diferentespools de hormona almacenada. En el primer caso se secretahormona almacenada en gránulos de reserva y en el segundo

hormona recientemente formada (29). Posteriormente Hanleyy col (156) confirmaron estos resultados demostrando quecuando la hormona de reserva se acaba, la secreción dePTHdeclina aunque se mantenga una activación continua dela adenilato ciclasa. En este caso, sólo una disminucióndel calcio circulante puede estimular la sintesis de nue­va hormona y su posterior secreción.

Estos resultados sugieren que tanto los agonistasadrenérgicos comolos nucleótidos poseen una capacidadlimitada para sostener la liberación de PTH.En definitiva,se requiere siempre la regulación por el calcio. Debe des­tacarse que la mayoría de estos experimentos utilizan con­centraciones de agonistas muyalejadas del rango fisioló­gico. El valor fisiológico de estos estudios será discu­tido más adelante.

1.4.1.8- Estudios farmacológicos "in vivo"

La mayor parte de la información "in vivo" referi­da a las acciones que los agonistas adrenórgicos ejercensobre la paratiroides fué obtenida mediante la infusión

o inyección de agonistas/g (generalmente isoproterenol),agonistasd.(fenilefrina), bloqueantesfiadrenórgicos (pro­pranolol) y antagonistas d.adrenórgicos (fentolamina).Los resultados obtenidos no son tan uniformes y reproduci­bles comolos obtenidos "in Vitro".

Fischer y col (157) demuestran que la infusión deepinefrina en vecunos incrementa la secreción de PTHenun 200 a 400%, según las dosis utilizadas. Coincidiendocon resultados "in vitro" la respuesta a la epinefrinafué suprimida por inyecciones simultáneas de propranololo calcio. Kukreja y col administrando isoproterenol a ratas (158) encuentran respuestas similares, además de una

falla de efecto del bloqueo de los sitios¡¿?sobre la se­creción de PTHregulada por calcio, coincidiendo con losestudios "in vitro". Blumy col (159) encuentran que lainfusión de agonistas u.en vacunos no modifica la PTHsérica. Sin embargo, el bloqueo vicon fentolamina provocóun incremento de la hormona circulante, presumiblemente

a través de la liberación de la acción de un agonista/g.Uilliams y col (160) muestran también que el b10que0 dereceptores OLpuede restablecer la secreción de PTH, inhi­bida previamente por infusiones de metoxamina.

Los estudios de Blum y col (161) coinciden con losresultados obtenidos "in vitro" apoyando la idea de queel calcio y las catecolaminas movilizan diferentes secto­res de hormona almacenada° Los resultados obtenidos porEpstein y col (162) y Body y col (163) aportan evidencias

de que la epinefrina circulante no es un regulador fisio­lógico de la secreción de PTHen humanos. El posible va­lor fisiológico de estos resultados se discutirá al fina­lizar la Sección 1.4.

1.4.1.C- Deprivación de catecolaminas y secreción de PTH

Para estudiar la hipótesis de que las catecolaminaspueden regular la secreción de PTHy la homeostasis delcalcio, se ha trabajado con animales sometidos a adrena­

lectomía quirúrgica (que remueve la fuente primaria deepinefrina) o tratados con 6-hidroxidopamina que provoca

- 45

simpatectomia quimica con la consiguiente eliminación de

NEoBajo ninguna de estas condiciones se observaron modiFicaciones importantes en la respuesta secretora de laPTHFrente a diversos estímulos (164). Vora y col (165)tampoco encuentran modificaciones en la calcemia basal

y la PTHdespués de la deprivación de catecolaminas. La

administración de propranolol a estos animales no modificó la secreción de PTH. Estos autores describen que laadrenalsctomia disminuye la respuesta de la paratiroidesa la hipocalcemia inducida por EDTA.

1.4.1.0- Estimulación de nervios adrenárgicos y secreciónde PTH

Comose ha descripto en 1.3.2.A, existen evidenciasmorfológicas de que Fibras nerviosas adrenérgicas prove­nientes del GCSinervan la paratiroides (128-131,166).Se ha utilizado la estimulación de dichos nervios por me­

dios químicos o eléctricos para valorar su rol sobre lafunción paratiroides.

Vora y col (167) aplicaron corrientes eléctricasal tronco nervioso del BCSen rata durante 1 hora y obser­varon un incremento de la PTH sérica menor que un 30%.

Sin embargo, el período de estimulación Fué muy prolonga­

do y el cambio en la secreción de PTHmuy pequeño. tosautores no efectuaron estudios para valorar si el efecto

eraoLo fladrenérgico, y/o colinárgico u otro. Ademáslaestimulación pudo haber afectado la reSpiración o modifi­

. . I .cado los niveles de calCio lOfllCO.

Heath (168) aplica una estimulación eléctrica me­nor en el tronco cervical vegosimpático derecho del perro

y encuentra que la liberación de NEno modifica la respuegta secretora de la paratiroides en condiciones normoo

-46­

suavemente hipocalcómicas. La secreción hormonal tampocose modifica después del tratamiento con el antagonistacá,fenoxibenzamina. La estimulación de la secreción de NE

por administración de tiramina tampoco modificó la reapuegta secretora de la paratiroides. Heath concluye que losagonistas Fadrene’rgicos de origen neural no son regula­dores de la secreción de PTH"in vivo". Los resultados

de este estudio deben ser tomados con precaución: los a­nimales permanecieron anestesiados durante todo el expe­rimento, factor que estimula la liberación de epinefrinay NEquienes pueden confundir la respuesta de la parati­roides a manipulaciones experimentales. Ademásla estimu­lación eléctrica aplicada afecta también la actividad delnervio vago, que puede modificar las respuestas específi­cas a la inervación simpática.

1.4.2- SECRECIÜN DE CT Y AMINAS BIÜGENAS

1.4.2.A- Estudios "in vitro"

En este campo se han efectuado pocos estudios.

Bell (169) detectó que la epinefrina incrementa la libe­ración de CT en cultivos de tiroides porcina. La NElohace en menor medida, en relación directa con su potencia

(¿g-agonista° El propranolol bloquea el efecto de la epine­frina sobre la secreción de CT. Por el contrario, Cooper

y col (170) encuentran que el isoproterenol no incrementala liberación de CTen cultivo de tiroides de rataoEn cambio si se modifican las concentraciones de calciose altera la secreción hormonal. Otros estudios efectua­dos con tiroides de rata (171) describen que el agonista

isoproterenol estimula la actividad de la adenilato ci­clasa de manera dosis dependiente. Por el contrario el

á

calcio inhibe esta enzima. Otros autores también encuen­

- 47

tran que los agonistas/g incrementan la secreción de CT(175,182-184).

1.4.2.8- Estudios Farmacológicos "in vivo"

Bates y col (172) en estudios efectuados en cerdos,encuentra que el isoproterenol no modifica la liberaciónde CT. El agregado de Fentolamina a una perfusión hiper­calcémica dobla la velocidad de secreción de CT. La admi­

nistración de epinefrina tampoco fué efectiva pero el a­gregado de Fentolamina incrementó 15 veces la secreción

de CTindicando que existe un efecto¡¿—inhibidor. Phillipoy col (173) encuentran en carneros que la epinefrina in­crementa la secreción de CT° Tanto la Fentolamina como el

propranolol bloquean este efecto.

Avioli y col (174) describen que la perfusión dellóbulo tiroideo derecho en perros con epinefrina o fento­lamina no modifica la liberación de CT. Sin embargo la a­

sociación de ambas drogas incrementa la liberación hormo­nal. Este último efecto es bloqueado por el propranololque también bloquea el incremento de la secreción de CTinducido por el isoproterenol. Estos resultados sugieren

que la activación de receptores fgestimula la liberaciónde CT.

Care y col (175) muestran que dosis pequeñas deNE incrementan la liberación de CT en cerdos. Cuando la

concentración de NEaumenta este efecto ya no se observa,

posiblemente porque en dosis mayores predomina la activi­dad inhibitoria arde la NE. Estudios efectuados en vacu­nos (176) mostraron que tanto la NE como el iSOproterenolincrementan la CT plasmática aunque la NE Fué menos acti­

va. En seres humanos Vora y col (177) encontraron que elisoproterenol incrementa la CTsérica. La infusión poste­

- 48

rior de propranolol reduce la concentración de CT en un

50%. Si se administra después el antagonista fentolamina, la CT aumenta nuevamente. Vora (177) y Metz (178)

postulan, en base a sus resultados, que los receptoresI . . . ­adrenergicos regulan pOSitiVamente la secreCión de CT.

Tambiénse ha estudiado el efecto del agonistaiijmetoxamina en humanos (160). Su administración disminuye

un 21% la secreción de CT. Este efecto es bloqueado por

la fentolamina. Los autores postulan que existe una relación positivo-negativo entre los agonistas adrenérgicos

¿y f sobre la secreción de CT. Los agonistas Festimulany los agonistaSqi inhiben la liberación de CT. Heath (147)observa que no resulta clara la relación que existe entreestos resultados "in vivo" y el efecto biológico de lascatecolaminas naturales que poseen una mezcla de especifi

cidad agonistaeL y/g. Harvey y col (179) encuentran quela administración de epinefrina y propranolol en rataspor períodos prolongados de tiempo, incrementan la secre­ción de CT en un 73%. El propranolol bquuea en un 51%.

1.4.2.C- Deprivación de catecolaminas y secreción de CT

Zileli y Gedik (180) trataron perros con reserpi­na para deprimir la liberación de NEde los nervios ter­minales y encuentran reducida la capacidad de respuestade las células C-tiroideas frente a un estímulo hipercalcómico. Por el contrario, Heath (164) encontró que la a­drenalectomía no modifica la secreción de CT en respuestaa diferentes estímulos. La simpatectomía química provocódisminución de la CT sólo durante el ayuno.

Vora y col (165) no encontraron modificaciones dela CT basal después de adrenalectomía y/o simpatectomíaquímica. El propranolol no disminuye la CT en ninguno delos 3 grupos. Finalmente, la deprivación de catecolaminas

incrementó la disminución de la CT inducida por EDTA.E2

tos resultados apoyan la hipótesis de que las catecolaminas adrenales y/o neuronales modulan la secreción de CT"in ViVO"en la rata, aunque no aclaran cuáles son losmecanismos que participan en esta modulación.

1.4.2.0- Estimulación de nervios adrenérgicos y secreciónde CT

La administración a ratas del agonista simpático­mimético tiramina, que actóa estimulando la liberación deNEde las terminales nerviosas, no provocó modificacionesconsistentes en la secreción ds CT a pesar de que en es­tos animales la inyección de dosis elevadas de epineFri­na incrementa la CTplasmática (147). Estos resultadossugieren que la secreción ds CT puede ser modificada porlas aminas biógsnas de origen adrenal y no neuronal.

1.4.3- RESUMEN

Los estudios mencionados permiten puntualizar lossiguientes resultados:1- En sistemas "in vitro" se ha encontrado que los agen­

tes que incrementan al AMPcintracelular (entre otros

agonistas/3 comoepinefrina, NEo isoproterenol) pue­den aumentar la secreción de PTH (149,150,154,181) yCT (175, 182-184). Por otra parte, los agentes que dis

minuyen la acumulación de AMPc(como antagonistasfi a­drsnérgicos o agonistasds) inhiben la secreción dePTH (146,181,185) y CT (175).

2- Los efectos de las aminas sobre la secreción de estas

¡hormonas son de menor duración que las que ejerce elcalcio.

3- La administración de dosis Farmacológicas de las ami­

nas biógenas altera la secreción de PTHy CT en animalesenteros de manera aún no aclarada.

Hasta el momentono es posible utilizar esta info;mación para la comprensión de la participación de las aminas neuronales en el control Fisiológico "in ViVO"de lasecreción de PTHy CT. En efecto, la mayor parte de loscompuestos utilizados "in vivo" son sintéticos y no exis­te seguridad de que mimeticen las acciones biológicas delas catecolaminas circulantes o neuronales. Por otra par­te los compuestos naturales pueden haber sido administra­dos en dosis o períodos de tiempo diferentes a las condi­ciones Fisiológicae reales.

Tampocopuede asumirse que la concentración plas­mática de un compuesto refleje con precisión sus nivelesen los sitios en los que ejerce su función biológica, porejemplo la sinapsis° Los experimentos en los que se hainducido deprivación de catecolaminas o estimulación denervios adrenérgicos no son en su mayoría específicos pa­ra la zona inervada y/o perturban la homeostasis globalde los animales utilizados durante el período de estudio.

En síntesis, los estudios efectuados hasta el mo­mento no permiten aclarar si las catecolaminas neuronalesjuegan un rol Fisiológico en el control Funcional del me­tabolismo paratiroideo y de las células C-tiroideas.

SO

1.5- OBJETIVOS DEL TRABAJO DE TESIS

1... Establecer el rol Fisiológico que desempeña la inervíción simpática local, provista por Fibras provenientesdel GES, sobre la secreción basal de PTH y CT. Para

ello se utilizó un modelo experimental (GCSx) que permite reproducir la actividad biológica del nervio in­tacto durante el período de degeneración uallerianaque deviene después de la cirugía y, transcurrido es­te lapso, Valorar los efectos de la ausencia de iner­vación.

Analizar el rol fisiológico que juega la inervaciónsimpática durante la estimulación de la secreción dePTHy CT. En este caso se administraron factores hipoo hipercalcemiantes respectivamente en animales GCSxo controles.

Identificación de los tipos de adrenoceptores que par­ticipan en la regulación neural de la secreción de PTHy CT, mediante la administración de bloqueantes espe­

cíficos de los adrenoceptoreSck 0/9 y el estudio pos­terior de los niveles circulantes de hormona.

Establecer si existe desarrollo de hipertrofia compen­sadora de la paratiroides y su posible regulación porel sistema simpático° Estos estudios se efectuaron enanimales simultáneamente GCSx-hemiPTxy controles hemiPTx.

Valorar los efectos de la deprivación de la inervaciónsimpática local sobre la secreción de PTHy CT median­te la utilización de ratas crónicamente GCSX.

CAPITULO 2

MATERIALES Y METODOS

-52;

-53­

2.1- ANIMALES Y TECNICAS QUIRURGICAS

Se utilizaron ratas Uistar, machos adultos de un

peso que osciló entre 180 y 220 g. Los animales permane­

cieron bajo luz en el periodo comprendido entre las 6-7 hy las 19-21 h, teniendo libre acceso al agua y al alimen­to.

2.1.1- GANGLIECTÜMIACERVICAL SUPERIOR

Las ratas se anestesiaron levemente con éter eti­lico. Posteriormente se efectuó una incisión ventral enel cuello y se expusieron las glándulas salivares° Estasse apartaron para divulsionar el músculo supraioideo has­ta la altura de la bifurcación de la carótida en sus ra­

mas interna y externa. AmbosGCS.. ubicados a este nivel,se extirparon totalmente por corte. Las ratas con opera­ción simulada recibieron el mismomanipuleo quirúrgico me­nos la extirpación bilateral del CCS.

Solo se utilizaron los animales que presentaron lasiguiente secuencia temporal de Fenómenos, que indicanla presencia de GCSXcompleta:

A- Ptosis palpebral bilateral entre el momentode la ope­ración y alrededor de lÜ h después de efectuada la mis­ma.

B- Retracción palpebral bilateral (debida a la actividadde las terminales en degeneración del CCS) a nivel delos músculos periorbitales entre 10 y 20 h deSpués dela Operación.

C- Ptosis palpebral irreversible después de 24 h.

Se ha demostrado que las ratas gangliectomizadas

-54­

de la manera descripta presentan una reducción de un 95%

en el contenido de NEde la tiroides (138).

2.1.2- PARATIRDIDECTÜMIA

La intervención se realizó bajo éter etílico uti­lizando un microscopio de disección. Se practicó una in­cisión ventral en el cuello y se retrotrajeron las glán­dulas salivares. Después de divulsionar el músculo exter­no tiroideo, se expuso la tráquea de manera de observarlos dos lóbulos tiroideos. Las paratiroides se encuentranen la porción apical de los mismos. La paratiroidectomía(PTx) se efectuó separando cuidadosamente las peratiroi­des del tejido tiroideo circundante. Junto con la parati­roides se removió alrededor de 1/4 de la porción superiordel lóbulo tiroideo ipsilateral.

Comocriterio para aceptar PTx completa, se toma­ron solamente aquellos animales cuya calcemia fué menorque 7.5 mg/dl° La hemiPTxse practicó sobre el lóbulo ti­roideo izquierdo° En este caso los animales mostraron undescenso de la calcemia superior a 0.7 mg/dl.

2.2- INDUCCIDN DE RESPUESTAS SECRETÜRAS EN LA PARATIRDIDES

Y CELULAS C-TIRÜIDEAS

Para incrementar le secreción de PTHy CT se apli­

caron estímulos hipo o hipercalcemiantes respectivamenteen animales GCSxo con operación simulada.

2.2.1- ESTIMULACIÜN DE LA SECRECIDN DE PTH

. . . . . . . . ISe lndUJO hipocalcemia mediante la administraCion

- SS

de ácido etilendiamino tetraacético (EDTA)disódico. Pa­ra ello se preparó una solución de EDTAen agua destila­

da de ZÜg/dl llevada a pH 7 con NaÜH SN.

En un primer experimento, la hipocalcemia fué pro­

vocada por inyecciones de 0.1 ml de esta solución, equi­valentes a lÜÜ mg de EDTA/Kgde peso, administradas cada

30 min durante 3 h por Vía intra peritoneal (i.p.). Parainducir una mayor estimulación de la secreción de PTHseutilizó una dosis doble, tóxica, de 200 mg de EDTA/Kgde

peso, manteniendo el esquema experimental descripto.

Se obtuvieron muestras de sangre inmediatamenteantes, 1 y 3 h después de comenzada la administración deEDTA.

2.2.2- ESTIMULACIÜN DE LA SECRECIÜN DE CT

La secreción de CT Fué inducida mediante la apli­cación de un estímulo hipercalcemiante. Para ello se pre­

paró una solución de ClZCaen solución fisiológica, de6.92 g/dl. En diferentes experimentos, ratas GCSxo conoperación simulada fueron inyectadas con una dosis de 0.2ml de esta solución (5 mg Ca/rata) por vía i.p. Las mues­tras de sangre se extrajeron inmediatamente antes, lÜ-lS

y 20 min deepués de la administración del ClZCa. Con elobjeto de inducir una estimulación mayor de la secreciónde CT se administraron dos dosis de 5 mg Ca/rata, separa­das por un intervalo de 15 min. En este caso se efectua­ron extracciones da sangre inmediatamente antes de la pri­mera y segunda dosis y 15 min después de esta última.

2.3- CARACTERIZACION FARMACÜLÜCICA DE RECEPTORES ADRENERCICÜS

La participación de los receptores d.y f3 adrenér­gicos sobre la regulación de la secreción estimulada dePTHy CT se analizó empleando agentes bloqueantes de di­

chos aceptores.

En estos experimentos, efectuados durante el perío­do correspondiente a la degeneración ualleriana que ocu­rre después de la CCSx, los animales se inyectaron conlos antagonistas adrenérgicos de la siguiente manera: Enel caso dela PTH, 4 h 30 min antes de proceder a la esti­

mulación de la secreción hormonal, y en el caso de la CT

30 min antes de la misma (Secciones 2.2.1 y 2.2.2).

Las drogas utilizadas Fueron preparadas cono sedescribe a continuación, empleandosolución Fisiológicacomodiluyente:

l- Antagonistas d adrenórgicos: A) Fentolamina: Soluciónde l g/dl. Se administraron dosis equivalentes alÜ mg/Kg. B) Fenoxibenzamina: Solución de 125 mg/dl.

Se administraron dosis equivalentes a 1.25 mg/Kg. Pa­ra estudiar la eficacia de dosis menores, se preparóuna solución de 25 mg/dl. En este caso la dosis admi­nistrada fué de 0.25 mg/Kg.

2- Antagonista [gadrenérgicoz Propranolol; las solucionesutilizadas Fueron de SÜÜo 625 mg/dl. Se administrarondosis de S o 6.25 mg/Kg.

En todos los casos las drogas se administraron porvía sub-cutánea (8.0.) en un volumen de 0.2 ml.

2.4- OBTENCION Y CONSERVACION DE SUERÜ

Las muestras de sangre se obtuvieron, previa anes­

- 57

tesia liviana con éter etílico, por corte del extremo dis­tal de la cola o por punción de la vena yugular. La mues­tra Final de cada experimento se recogió por decapitaciónde los animales. La sangre extraída se mantuvo a tempera­tura ambiente durante 30 a 60 min. Posteriormente se cen­

trifugó durante 15 min a 3000 r.p.m. El suero Fué separa­do y conservado a -709C hasta la realización de las deter­minaciones de laboratorio.

2.5- DETERMINACIONES DE CALCIO SERICÜ

Procedimientos utilizados:

A­ Métodocolorimétrico: Se utilizó un kit provisto porUiener Lab. (Rosario) (187). Reactivos: El buffer uti­lizado es una solución de aminometil propanol (AMP)

0.2 mol/l en metanol 35% v/v mantenida a pH ll. La re­acción colorimátrica se obtiene con una solución de

cresolftaleín complexona (CFx) 3.7 mmol/l. La solución

patrón es de C03Ca (lÜ mg Ca/dl). Procedimiento: Cadadeterminación se efectuó al menos por triplicado bajoel siguiente protocolo: l- 50 pl de CFx + 3.5 ml debuffer. 2- Lectura en espectroFotómetro a 570 nm. Es­ta lectura se utilizó comoblanco individual para ca­da muestra. 3- Agregado de 20 pl de muestra o de so­lución patrón. 4- Nuevalectura. Los resultados se cal­culan restando a la lectura de cada muestra o patrónsu blanco correspondiente. Los coeficientes de varia­ción intra e inter ensayo Fueron menores que el 5%(187).

Espectrofotometria de absorción atómica (188): Reacti­lga: Comodiluyente se utilizó una solución de óxidode lantano en agua destilada (0.1 g/dl) con el agrega­do de 0.5 ml/dl de ClH 12N. La solución patrón Fué de

CÜSCa(lU mg/ml). Procedimiento: 0.2 ml de suero o patrónse disolvieron en 3.8 ml del diluyente. Las lecturas seefectuaron al menos por duplicado en espectrofotómetrode absorción atómica (Metrolab).

2.6- RADIÜINMUNÜENSAYÜS

2.6.1- DETERMINACIÜNES DE pTH SERICA

Exceptuando los estudios realizados con ratas he­miPTx, las determinaciones de PTHsérica se realizaron

utilizando un kit para PTHhumana, modificado para ratas,provisto por ImmunoNuclear Co. (Stilluater, Minn.) (189).Este método provee un anticuerpo sensible a la región 44­68 de la PTHhumana que reconoce la región equivalente

de la PTHde rata. Comodiluyente se utilzó buffer bora­to con albúmina bovina sérica al 1%. Procedimento:l- In­

cubación de 50 pl de muestra con 100 pl del primer anti­cuerpo (suero de pollo anti PTH) a 20 - 259€ durante 15

min. 2- Agregado de 100 pl del marcador (1125-PTH) e in­

cubación durante 2 h a 20 - 259G. 3- Adición de 250 ulde complejo precipitante Formado por "suero de cabra oconejo contra suero de pollo + suero de pollo normal pre­precipitado + polietilenglicol" para separar el trazadorlibre del unido. 4- Nueva incubación a 20 - 259€ durante

15 min. Centrifugación a 760 g durante 20 min. 5- Una vezdescartado el sobrenadante, determinación de radioactivi­dad en el precipitado (contador Packard Instruments) du­rante un minuto. La curva fué efectuada utilizando un pa­

trón heterogéneo de PTHde rata y los resultados se expre­saron como pmol/l equivalentes a PTHhumana. La sensibi­

lidad Fué de 10 pmol/l o, en otras unidades, 0.1 ng/ml.

-59­

En todos los ensayos se colocaron muestras de sue­ro de ratas PTx cuyas calcemias Fueron inferiores a 7.5mg/dl. En este caso la actividad residual de PTHFué de

44 i 6 pmol/l; en cambio la PTHcirculante en ratas nor­

males resultó de 91 i 7 pmol/l (p ¿ 0.005). Estos resul­tados Fueron coincidentes con los mencionados por los pro­veedores. Se obtuvieron coeficientes de variación intra

e inter ensayo inferiores al 8%y al 15%respectivamente.

El procedimiento utilizado para valorar la PTHsé­rica en los experimentos efectuados con ratas hemiPTx Fuédesarrollado en el laboratorio del Dr. Eduardo Slatopols­ky, St. Louis, USA, a partir del método de Arnaud y col(190). Se utiliza un antisuero de pollo dirigido contraPTHbovina (191) que reconoce tanto la PTHpresente en sue­

ro de rata comoen extractos de paratiroides de este ani­mal (192). Comodiluyente se utilizó buffer barbital só­dico 0.l M de pH 8.6 conteniendo 500 U/ml de Trasylol (F

BAPharmaceuticals, Inc. Neu York). Procedimiento: l- In­

cubación a 49€ de 50 pl de anticuerpo con SO pl de mues­

tra durante 3 días. 2- Agregado de lÜÜpl del marcador(1131

Separación del complejo anticuerpo-PTH mediante el secues­-PTH) y nueva incubación a 49€ durante 3 dias. 3­

tro de la PTHlibre por carbón-dextrán. 4- CentriFugación,decantación y determinación de radioactividad en precipi­tado y sobrenadante (contador Packard Instruments Inc Dou­ver's Grose, I11). Los resultados se expresaron comopg/mly los coeficientes de variación intra e inter ensayo Fue­ron de 8% y 14% respectivamente.

2.6.2- DETERMINACION DE CT SERICA

Se utilizó un kit para CT humana provisto por Immu­

- 50 _

no Nuclear Co que incluye un anticuerpo de conejo dirigi­do contra CThumanasintética. Este anticuerpo es sensi­

ble a la región 17-32 de la hormona humana y también de

rata (193). Losproveedoreshan efectuado estudios que a­valan que la metodología es adecuada para medir CT de ra­ta. Comodiluyente se utilizó buffer borato conteniendoalbúmina bovina sérica al 5%. En este ensayo se incuban

100 pl de muestra o patrón con 200 pl del primer anticuer­po durante 16 - 24 h a 2 - BQC. Posteriormente se agregan

lÜÜ Pl de 1125—CTy se incuba a igual tiempo y temperatu­

ra. Finalmente se agregan 500 pl del segundo anticuerpo(complejo precipitante formado por "suero de conejo nor­mal pre-precipitado + suero de cabra anticonejo + polie­tilenglicol"), se centrífuga a 760 g durante 20 min a 20 ­259G, se descarta el sobrenadante y se determina la acti­vidad del precipitado.(contador Packard Instruments). Lacurva se realizó utilizando un patrón de CTsintética hu­mana y los resultados se expresaron como pg/ml. La sensi­bilidad Fué de 1.5 pg/tubo equivalentes a 15 pg/ml y loscoeficientes de variación intra e inter ensayo Fueron me­nores que 8% y 16% respectivamente.

2.7- ESTUDIOS HISTÜLÜGICÜS

Para valorar el indice mitótico en la paratiroidesremanente de animales hemiPTx, se desarrolló el siguienteprocedimiento: l- Ablación unilateral de la paratiroidessimultánea a GCSxo a operación simulada ipsilateral allóbulo remanente. 2- Transcurridas 48 h, inyección de col­chicina (Sigma) (2 mg/Kg), disuelta en solución Fisioló­gica (via i.p.) y sacrificio 2 h después. La colchicinaes un alcaloide antimitótico que se asocia a la proteina

\miorotubular interfiriendo en la Función de los husos mi­

- 61

tóticos provocando la desaparición de los microtúbulosy deteniendo el proceso mitótico generalmente en metafa­se. 3- Fijación de la paratiroides remanente en líquidode Bouin (solución acuosa saturada de ácido pícrico, 71%;Formol al 37%, 24%; ácido acético glacial, 5%) durantelÜ h y posterior deshidratación gradual pasando la piezadesde etanol 50%hasta etanol absoluto. Cada deshidrata­ción se efectuó durante 2 h a 379€. 4- Parafinado y cor­

tes de 4 a 6 ym. Tinción de contraste con hematoxilina­eosina.

El índice mitótico se valoró determinando el núme­

ro de mitosis presentes en 1000 células paratiroideas.

2.8- ESTADISTICA

Para el análisis estadístico de comparaciones múl­tiples se aplicó un análisis de la varianza (ANÜUA)segui­do por un Test de Dunnet (194). Para efectuar comparacio­nes simples de muestras independientes y apareadas se u­tilizó el Test de Student.

-62­

CAPITULOS

RESULTADOS

3.l- PARTICIPACION DE LA INERVACIÜN SIMPATICA EN LA

MDDULACIDN DE LA RESPUESTA BASAL DE LAS EELULAS

PARATIRDIDEAS Y C- TIRÜIDEAS

Comose ha descripto en la Introducción (Sección1.3.2), las glándulas tiroides y paratiroides reciben i­nervación simpática de Fibras provenientes del CCS. Paraestudiar el rol que juega el sistema simpático periféri­co sobre la regulación de la secreción basal de PTHy CT,

se han efectuado experimentos valorando la calcemia y losniveles séricos hormonales en diferentes períodos de tiem­po despuás de GCSX:antes de que ocurra la liberación su­praliminal de transmisores simpáticos que acompañaa ladegeneración anterógrada de las terminales nerviosas (8h post GCSx), durante la misma (período de degeneración

ualleriana) (16 o 24 h post GCSx) e inmediatamente después

de terminada ésta (28 h post GCSX). Estos períodos sondescriptos en detalle en la Sección 1.3.3.

3.1.1- CALCEMIA

En la Tabla I se muestran las calcemias de ratas

sacrificadas a diferentes tiempos luego de GCSX.La extir­pación quirúrgica bilateral del CCSno modificó los nive­les circulantes de calcio, que Fueron determinados antesy durante la degeneración ualleriana.

3.1.2- PARATHDRMÜNASERICA

Los niveles séricos de PTHen muestras obtenidas

durante la degeneración ualleriana se representan en lak

Fig. 7. Del mismo modo que la calcemia, la PTH sérica tam­

poco se modifica durante los momentos inicial y Final

de dicho periodo, 16 y 24 h después de la GCSxrepecti­

vamente, no presentando diferencias significativas res­pecto al grupo que recibió operación simulada.

3.1.3- CALCITÜNINASERICA

La Tabla II muestra que durante (16 h post GCSx)

y después (28 h post GCSx)del proceso de degeneraciónualleriana, los niveles de CTsárica no difieren de losque presenta el grupo control.

3.1.4”En síntesis, los resultados que se muestran en

la Fig. 7 y en las Tablas I y II indican que en condicio­nes Fisiológicas normales, los niveles séricos de calcio,PTH y CT no se modifican, ¡a sea durante como en los pe­

riodos inmediatamente previo y posterior a la sobreacti­vación simpática temporal que sigue a la GCSx.

64

-65­

TABLA I

NIVELES SERICÜS DE CALCIO EN RATAS GCSx

Horas despuésde GCSx Calcio sérico (mg/dl)

Operación simulada GCSx

8 9.5¿0.2 (a) 9.5¿0.1 (a)

16 9.1¿Ü.2 (7) 9.3¿Ü.4 (7)

24 9.6¿0.5 (10) 9.4¿0.4 (10)

Los valores representan la mediaiES del número de animalesindicado entre paréntesis.Nose observan modificaciones estadísticamente significa­tivas.

-55­

FIGURA 7: NIVELES DE PTH CIRCULANTE DURANTE LA DEGENERACIÜN

UALLERIANA POSTERIOR A LA GCSX

_. IN O I

(1)I———*"""I‘”17¡I——————————Irm¡

NIOl

I GCSxo Üpsr. sim.PTHSERICA(pmol/l)

o I 'L l l¡6 24 h

TIEMPO TRANSCURRIDÜ DESPUES DE GCSX

Cada punto representa la mediaiES del número de animalesindicado entre paréntesis.Nose observaron diferencias estadísticamente significa­tivas.

- 67 ­

TABLA II

NIVELES SERICÜS DE CT DURANTE (16 H) Y DESPUES (28 H)

DE LA DECENERACIÜN UALLERIANA POSTERIOR A LA GCSx

Horas deSpuésde GCSX Calcitonina sérica (pg/ml)

Operación simulada GCSx

16 188_+_18(11) 179115 (16)

28 178114 (a) 165¿14 (7)

Los valores representan la mediaiES del número de ratasindicado entre paréntesis. Las diferencias no son estadís­ticamente significativas.

- 68

3.2- MODULACIÜN POR LA INERVACIÜN SIMPATICA DE LA

RESPUESTA ESTIMULADA DE LAS CELULAS PARATIRDI­

DEAS Y C-TIRDIDEAS

Dado que la CCSxno modificó los niveles circulan­

tes basales de calcio, DTHy CT, el siguiente paso Fué

estudiar el rol modulador que pueden jugar las Fibras sim­páticas que inervan las células C-tiroideas y paratiroi­deas sobre la respuesta de las mismas después de la apli­cación de estímulos secretorios específicos.

3.2.1- MODULACIÜN DE LA SECRECIÜN ESTIMULADA DE PTH

Comoestímulo secretorio, se indujo hipocalcemiamediante la administración de EDTA(100 mg/Kg i.p.) cada30 min durante 3 h a ratas sometidas a GCSx23 h antes

(durante la estimulación simpática temporal provocada pordegeneración ualleriana de las terminales).

302.1.A'La Fig. 8 muestra las modificaciones individuales

de la calcemia en estos animales. El EDTAprovocó hipocal­cemia tanto en ratas controles como GCSx. Sin embargo,la disminución del calcio sérico Fué significativamentemayor en este último grupo. Los valores promedio de estosresultados se resumen en la Fig. 9.

3.2.1.8- Parathormonasárica

En la Fig. 10 se muestran los niveles individualesde PTHsérica en los mismos animales cuya calcemia se re­

.69.

sume en las Fig. B y 9. Las ratas sometidas a operaciónsimulada presentaron un incremento de la PTHsérica de

32% y 145%, l y 3 h después respectivamente de comenzar

las inyecciones de EDTA.En las ratas GCSx, en cambio,estos aumentos Fueron considerablemente menores o no seobservaron.

Por análisis de la varianza de datos apareados sedemuestra que, a diferencia de las ratas GCSx, los anima­les con operación simulada presentan un incremento sig­nificativo de la PTHsérica en Función del número de in­

yecciones de EDTA(p < 0.01). El promedio de estos valo­res se grafica en la Fig. ll en la que, con el objeto deFacilitar la integración de resultados, también se mues­tran los valores de la calcemia ya graficados en la Fig. 9.

3.2.2- MDDULACIÜN DE LA SECRECIÜN DE PTH DURANTE SU ESTI­

MULACIDN SUPRAMAXIMA

Con el objeto de averiguar si un estímulo hipocal­cémiante mayor era capaz de modificar la inhibición dela respuesta paratiroidea observada durante el períodode estimulación simpática correspondiente a la degene­ración ualleriana, un grupo de 7 ratas Fué tratado condosis dobles de EDTA(200 mg/Kg) manteniendo el mismo es­

quemaexperimental descripto en 3.2.1.

Solo 3 animales GCSxsobrevivieron a esta dosis

tóxica de EDTA.En este grupo, 1a PTHsórica se elevó sig­nificativamente en respuesta al EDTA,a diferencia de larespuesta provocada en ratas GCSxpor dosis menores deeste compuesto (Fig. 12). Es de destacar que las dosisde quelante utilizadas en este caso no provocaron caídas

\

mayores de la calcemia que las inducidas por dosis meno­

-70­

res de EDTAen animales GCSx.

3.2.3- RESUME

En conclusión, los resultados de las secciones3.2.1 y 3.2.2 indican que la estimulación de la secreciónde PTHinducida por hipocalcemia severa está Fuertementeinhibida después de la GCSx,durante el período correspon­diente a la degeneración ualleriana (situación experimen­tal que reproduce una estimulación simpática transitoriade la zona inervada).

La inhibición de la secreción de PTHen los ani­

males GCSxes revertida por dosis supramáximas de EDTA.

CALCIOscnrco(mg/dl)

n71!

INCREMENTO DE LA HIPOCALCEMIA INDUCIDA POR EDTA

DURANTE LA DEGENERACION UALLERIANA POSTERIOR

VALORES INDIVIDUALES

FIGURA 8:

A LA GCSX.

OPERACION SIMULADA GANGLIECTOMIZADAS

EDTA 1.o. (100 mg/Kg peso) EDTA 1.9. (100 mg/Kg paso)

l 1 1 l 1 l 1 1'3 l 1 1

10 10

e al

G G;

4- A

2 2L

Ó I 5.hs Ó í i áhsTIEMDO TRANSCURRIDO DESPUES DE LA PRIMERA INYECCION DE'EDTA

Los animales Fueron sometidos a cirugía 23 horas antesde la primera inyección de EDTA.

-72­

FIGURA 9: INCREMENTO DE LA HIPOCALCEMIA INDUCIDA POR EDTA

DURANTE LA DEGENERACION UALLERIANA POSTERIOR

A LA GCSX. VALORES PROMEDIO

E] oparaciánsimulada(7) p<QO1

4 7 B GCSx

. (I m I1- P<0,001

(7’

I ' pNS

_(m9/dl)

a. nn;

CALCIOSERICO

¿N

O ' 1 3 hs

TIEMPO TRANSCURRIDO DESPUES DE

LA PRIMERA INYECCION DE EDTA

Los animales fueron sometidos a cirugía 23 h antes de laprimera dosis de EDTA.

El EDTAdisódico (lOÜmg/Kg) se administró cada 30 min du­rante 3 h.

Las barras representan la mediaiES del número da animalesindicado entre paréntesis. La estadística entre gruposse efectuó por el Test de Student. Un análisis de varian­za efectuado por datos apareados muestra diferencias sig­nificativas dentro de cada grupo en Función del tiempo.(p 40.01).

PTHSERICA(ng/ml)

-73­

FIGURA 10: EFECTO DE LA DEGENERACIÜN UALLERIANA SOBRE LA

LIBERACION ESTIMULADA DE PTH.

VALORES INDIVIDUALES

4D4 EDTAi.p. EDTAi.p.¿¿¿¿J«¿. ¿¿¿¿¿¿300> .300

200- “zz/[zz -200

¡oo 400Operación simulada GCSx

0+ n 1 n 1 10 1 3 0 1 3

TIEMPO TRANSCURRIDÜ DESPUES DE LA PRIMERA INYECCION DE EDTA (H)

Los animales fueron sometidos a cirugía 23 h antesde la primera inyección de EDTA(lÜÜmg/Kg/dosis).

Por análisis de la varianza de datos apareados seencuentran diferencias significativas en Función del tiem­po en las ratas con operación simulada (p 4 0.001). Losanimales GCSxno presentan alteraciones en los nivelesséricos de PTHo

IIIIIIIIIIIIIIIIII

-74­

FIGURA ll: EFECTO DE LA DEGENERACION UALLERIANA SOBRE LOS

NIVELES SERICOS DE CALCIO Y PTH DESPUES DE

ESTIMULACION CON EDTA.

VALORES PROMEDIO

g

A 200'1 1 1 1 1 1

g É EDTALp.E 0|v 5g 5. x“ 2'50 Opar. sim.'an ccsx‘\ 5E “j Z:Z: EDTA1.p. ° É """ 'EEs'Ï-iU

T I I r I I wo]:01. . l 'fl l | l

0 I 3 0 l 3

TIEMPO TRANSCURRIDO DESPUES DE LA PRIMERA INYECCION DE EDTA (H)

Las dosis de EDTA(lOÜmg/Kg) comenzaron a administrarse23 h después de la cirugía.Cada punto representa la mediaiES de 7 ratas.* p¿;Ü.Ol si se compara el grupo GCSXcon el que recibió

operación simulada (Test de Student).Con el objetivo de facilitar la integración y comprensiónde los resultados, se incluyen los niveles séricos de cal­cio que ya Fueron graficados en la Fig. 9.

%DEVARIACIONRESPECTOALOS

TIEMPO

_ 75 ­

FIGURA 12: EFECTO DE LA GCSX SOBRE LOS NIVELES SERICOS

DE CALCIO Y PTH DESPUES DE ESTIMULACION

SUPRAMAXIMA CON EDTA. ESTUDIOS DURANTE LA

DEGENERACION UALLERIANA.

100[(PTH) [::] Op. simulada- GCSx

3 7/4 ,ccsx¿J (doble EDTA)(D<2cn

(0LIJ0:o_.|íD

-50­

(Ca)_100_WV¡h

TRANSCURRIDO DESPUES DE LA PRIMERA DOSIS DE EDTA

23 h después de GCSX,los animales recibieron inyeccionesi.p. de EDTA(DyN: lOOmg/Kg, : ZOOmg/Kg)cada 30min durante 3 h.

Las barras representan la mediaiES de 7 animales para lasratas que recibieron EDTAen dosis menores. De los 7 ani­males inyectados con doble dosis de EDTA,solo sobrevivie­ron 3 al Finalizar el experimentoo ILa estimulación supramáxima con EDTArestablece la respues­ta secretora de la paratiroides en las ratas GCSx.

- 76

3.2.4- MÚDULACIÜN DE LA SECRECIÜN ESTIMULADA DE CT

En la Tabla II se muestra cue durante y después

de la degeneración ualleriana que ocurre post GCSxlosniveles séricos basales de CTno se modifican. El siguien­

te punto que nos interesó estudiar fue valorar si la se­creción estimulada de CTera afectada durante dicho perío­do (al igual que la PTH), y posteriormente al mismo.

Para ello se estudió la respuesta secretora de lascélulas C-tiroideas Frente a estímulos hipercelcemiantesque Fueron aplicados a diferentes tiempos después de GCSx

u operación simulada en ratas. Los animales se inyectaron

con una dosis de C12Ca (Smg Ca/rata i.p.) 16, 21 o 28 hpost GCSx. Se obtuvieron muestras de sangre basales, lO,

15, 20 o 30 min después de administrar el C12Ca.

3.2.4.A- Calcemia

Comose observa en la Fig. 13, tanto los animales

GCSxcomo con operación simulada efectuadas 16, 21 o 28 h

antes, responden de manera similar a la administración de

C12Ca presentando incrementos de la calcemia de la mismamagnitud, indicando que la GCSxno afecta la distribucióny cinética del calcio.

3.2.4.8- Calcitonina sérica

Los niveles individuales de CTsérica en las ratas

que fueran GCSxo sometidas a operación simulada 16 h an­

tes se representan en la Fig. 14. Todos los animales con­troles presentaron incremento de la secreción de CTenrespuesta a la hipercalcemia. En cambio, en las ratas GCSx

-77­

este incremento Fué menor, mas lento y en algunos casosinexistente.

Los valores promedio de este experimento se resu­men en la Fig. 15 A, asi como los niveles de CT sérioa

en animales que recibieron el estimulo hipercalcemiante28 h después de GCSx(inmediatamente después de la cul­minación de la degeneración ualleriana) (Fig. lS B). Eneste último grupo de animales la CT sérica no presentó di­Ferencias respecto al grupo control.

3.2.5- MUDULACIÜN DE LA SECRECIÜN DE CT DURANTE SU ESTI­

MULACION SUPRAMAXIMA

Con el objeto de averiguar si un estímulo hipercal­csmiante mayor era capaz de revertir la depresión en larespuesta de las células C-tiroideas observada en anima­les GCSxdurante el proceso de degeneración neuronal, sedesarrolló el siguiente esquema experimental: Dos gruposde 8 ratas cada uno Fueron GCSxo 50metidos a operación

simuleda. Transcurridas 21 y 21h 15 min recibieron sendas

dosis de ClzCa i. p. (5 mg Ce/rata). Se obtuvieron mues­tras de sangre basales, 15 y 30 min después de la prime­

ra dosis de C1283.

La Fig. 16 muestra que después de la segunda inyec­

ción de ClZCa las ratas GCSxpresentaron una hipercaloe­mia significativamente mayor que las controles y que, coin­cidentemente con esta hipercalcemia, se observó una res­tauración de la liberación de CT.

3.2.6- RESUMEN

En conclusión, los resultados obtenidos en esta

serie de experimentos (3.2.4 y 3.2.5) indican que la li­beración de CT que ocurre después de aplicar un estímulohipercalcémico se encuentra deprimida durante el periodode actividad simpática provocado temporalmente por la GCSx.Tal efecto se revierte cuando la calcemia se incrementa

aún mas mediante la administración de inyecciones repeti­

das de ClzCa.

La secreción estimulada de CT no es deprimida por

la GCSxuna vez concluida la degeneración ualleriana.

-79­

FIGURA 13: NIVELES SERICÜS DE CALCIO DESPUES DE LA

INYECCION DE C12Ca EN ANIMALES GESX Ü CÜN

OPERACION SINULADA

¡4..lCl2Ca 1.p. ií: ¡Vil/[lll], láQ 133‘

V 12n- éOSm 11­% .

‘O_ o Up. 81m.OH a GCSx, 16 h

3 é¡ A GCSx, 21 hg 9'11. -GCSx, 28 h

¡9 l1

o K) 2°

TIEMPO TRANSCURRIDO DESPUES DE LA

INYECCÍÜN DE c12Ca (min)

Las ratas Fueron sometidas a cirugía 16, 21 o 28 h antes dela administración de C1283 (SmgCa/rata).Cada punto representa la media ¿ES para 8 ratas GCSxopara 16 con operación simulada.La GCSXno afecta la distribución y cinética del calcio.

FIGURA 14: EFECTO DE LA GCSX SOBRE LA LIBERACION ESTIMULADA

DE CT. ESTUDIOS DURANTE LA DEGENERACION UALLE­

RIANA.

VALORES INDIVIDUALES

q­ (_

ÍS'

CALCITÜNINASERICA(pg/m1)

Operación simulada

° ‘ ‘ zar-J ‘ ‘ °O K) 0 K) 20

TIEMPO TRANSCURRIDO DESPUES DE LA INYECCION DE c12Ca (min)

Las ratas Fueron sometidas a cirugía 16 h antes de la in­yección de ClZCa (Smg Ca/animal).La respuesta secretora a la hipercalcemia Fué menor en losanimales GCSx.

A“

CALCITONINASERICA(pg/m1)

-81­

FIGURA 15: EFECTO DE LA GCSX SOBRE LA LIBERACION ESTIMU­

LADA DE CT. ESTUDIOS DURANTE (A) Y DESPUES (g)

DE LA DEGENERACION UALLERIANA.

VALORES PROMEDIO

fl - e

16 h deSpues de cirugía 28 h después de cirugía

¡ooc' . :ooo

CÍZCa i.p. _CÏ2Ca i.p.GCSx

500_ _ Op. Sim. .500

o l 1 L L 1 1

o. IO zo o 10 _2o o

TIEMPO TRANSCURRIDO DESPUES DE LA INYECCION DE C12Ca (min)

Los valores representan la mediaiES de 12 u 8 anima­les cuando la cirugía fué efectuada respectivamente 16 o28 h antes del ClZCa (Smg Ca/rata).* p < 0.05 por análisis de la varianza de datos apareados

en los animales GCSX.** p < 0.0l si se comparan los animales GCSxcon el gru­

po que recibió Operación simulada (Test de Student).28 h después de la GCSx, una vez concluido el perío­

do de degeneración neuronal, ya no se observa inhibiciónde la secreción de CT.

-32­

FIGURA 16: RESTAURACION DE LA SECRECIÜN DE CT DESPUES DE

LA APLICACION DE DOBLE DOSIS DE ClZCa EN RATAS

GCSX° ESTUDIOS DURANTE LA DEGENERACIDN UALLE­

RIANA. í(Ip/6m)0313390131v3

CALCITONINASERICA(pg/ml)

UU8

O

TIEMPO TRANSCURRIDD DESPUES DE LA

PRIMERA INYECCION DE CIZCa

Los animales Fueron sometidos a cirugía 21 h antes de lainyección de la primera dosis de ClZCa (SmgCa/rata/dosis).Cada punto o barra representa la mediaiES de 8 ratas,* p 4 0.05 si se comparan los niveles de CT sérica de las

muestras obtenidas a los lS y 30 min (Test de Studentapareado) y los niveles de calcio sérico entre los ani­males con operación simulada (barras blancas) y GCSx(barras negras) (Test de Student)

- 83

3.3- PARTICIPACION DE LÜS RECEPTORES‘K Y ÁgADRENERGICDS

EN LA MODULACIDN NEURAL SIMPATICA DE LA SECRECIDN

DE PTH Y CT

En la Sección 3.2 se ha establecido que la GCSx

induce una depresión en los niveles circulantes de PTH

y CTdurante el período correspondiente a la degeneraciónda las terminales nerviosas. Tal depresión se produce enpresencia de estímulos secretarios para ambas hormonas.

Comose analizó en la Introducción (Sección 1.3.3,Fig. 6), la degeneración ualleriana está caracterizadapor un alto incremento de la liberación de NEde las ter­minales simpáticas en destrucción. Hemosinvestigado la

participación de los receptores al.y Fadrenárgicos en lamodulación neural de la secreción de PTH y CT mediantela administración de antagonistas a adrenórgicos: Fenoxi­benzamina ( 0.25 o 1.25 mg/Kg) o Fentolamina (10 mg/Kg)

y fgadrenérgicos: propranolol (5 o 6.25 mg/Kg) duranteel periodo de degeneración ualleriana. Los b10queantesFueron inyectados antes.de proceder a la estimulación dela secreción de PTH o CT.

3.3.1- EFECTO DE BLÜQUEANTES ADRENERGICÜS SOBRE LA SECRE­

CION ESTIMULADA DE PTH

18 h 30 min después de efectuada GCSxen tres gru­pos de ratas, los animales recibieron vía 9.o. 0.2 ml devehiculo, propranolol (S mg/Kg) o Fentolamina (10 mg/Kg)respectivamente. Transcurridas 4 h 30 min se inició laadministración de una serie de seis inyecciones de EDTA(100 mg/Kg/dosis, i.p.) separadas por intervalos de 30min.

3.3.1.A- Calcemia

Comose observa en la Fig. 17, la calcemia basal

se eleva 4 h 30 min después de administrar el propranolola animales GESx23 h antes. Un análisis de la varianza

de datos apareados estableció que la ratas GCSxtratadascon propranolol o Fentolamina presentan una hipocalcemiade menor magnitud en respuesta al EDTAque los animales

inyectados con vehículo (p 4.0.01).

3.3.1.8- Parathormonasárica

En la Sección 3.2 se ha demostrado que la secreciónde PTHestimulada por la administración de un agente hi­pocalcemiante, es inhibida durante la degeneración ualle­riana después de la GCSx. La Fig. 18 indica que duranteeste período, si las ratas son tratadas previamente conpropranolol o Fentolamina: 1- Los niveles basales de PTHcirculante no se modifican. 2- Se detecta un incremento

significativo de la PTHsérica l y/o 3 h después de comen­zar la estimulación con EDTA.Esta restauración de la se­

creción de PTHen respuesta al EDTAno se observa en losanimales GCSxtratados con vehículo.

3.3.2- RESUMEN

Los resultados detallados en el punto 3.3.1 indi­can que la respuesta de la paratiroides a un estímulo hi­pocalcémico (respuesta que permanece inhibida durante ladegeneración ualleriana posterior a la GCSx)puede serrestaurada mediante la administración de bloqueantesogy

[gadranérgicos en este intervalo.

- 35 _

FIGURA 17: EFECTO DE BLOOUEANTES ADRENERGICOS SOBRE LOS

NIVELES SERICOS DE CALCIO DESPUES DE LA ADMI­

NISTRACION DE EDTA EN RATAS GCSX. ESTUDIOS DU­

RANTE LA DEGENERACION UALLERIANA.

'üf‘ 10- propr3 .

É5' \S Veh fÉ EDTA1.P'

U J Í J I I Io 0 l 3

HORAS TRANSCURRIDAS DESPUES DE LA

PRIMERA DOSIS DE EDTA

La fentolamina (lOmg/Kg) o al propranolol (5mg/Kg)fueron administrados 4 h 30 min antes de la primera inyec­ción de EDTA(lOOmg/rata/dosis).

Cada punto representa la mediaiES de 6 - 9 ratas.Un análisis de varianza de datos apareados muestra dife­rencias significativas an función del tiempo en los anima­les tratados con propranolol y Fentolamina (p < 0.01).* p < 0.05 si se compara el grupo tratado con propranolol

con los animales inyectados cón vehículo (Test de Dunnet).

-86...

FIGURA 18: EFECTO DE BLUQUEANTES ADRENERGICDS SOBRE LA

SECRECIDN ESTIMULADA DE PTH EN RATAS GCSx.

ESTUDIQS DURANTE LA DEGENERACIDN UALLERIANA.

é

ZRo

PTHSERICA(ng/m1)

¡OOO

HORAS TRANSCURRIDAS DESPUES DE LA

PRIMERA DOSIS DE EDTA

La Fentolamina (lÜmg/Kg) o el propranolol (Smg/Kg) Fueronadministrados 4 h 3D min antes de la primera inyecciónde EDTA( lDDmg/rata/dosis).

Cada punto representa la mediaiES de 6-7 ratas. Un análi­sis de la varianza de datos apareados indica diferenciassignificativas en función del tiempo en los animales in­yectados con propranolol (p«<0.05). 3 h después de la pri­mera inyección de EDTA,las ratas tratadas con Fentolami­na difieren significativamente de su valor basal (p 4 0.05).* p < 0.05 si se comparan los animales tratados con pro­

pranolol con el grupo tratado con vehículo (Test de Dunnet).

-97­

3.3.3- EFECTO DE BLOQUEANTES ADRENERGICÜS SOBRE LA SECREn

CIÜN ESTIMULADA DE CT

Grupos de 6 ratas cada uno, GCSxo sometidos a ope­

ración simulada, Fueron inyectados con bloqueantes adre­nérgicos durante la degeneración ualleriana (15 h 30 mindespués de la cirugía). Las drogas utilizadas Fueron Fe­noxibenzamina (1.25 mg/Kg) y propranolol (6.25 mg/Kg) co­

mo bloqueantes a y figadrenérgicos respectivamente. 30 mindespués de la administración de estos antagonistas todos

los animales recibierOn una dosis i.p. de C12Ca (5 mgEa/rata).

3.3.3.A- Calcemia

En la Fig. 19 se observa que la Fentolamina y/oel propranolol no modifican la calcemia basal de los ani­males GCSxo con operación simulada. Estos bloqueantestampoco provocan cambios sobre la hipercalcemia inducida

por la administración de ClzCa.

3.3.3.8- Calcitonina sórica

La Fig. 20 indica que después de la administraciónde Fenoxibenzamina ocurre un incremento significativo delos niveles séricos de CT basal (p 4 0.01) que, por el con­trario, no es modificada por el propranolol. Los animalescon operación simulada tratados con cualquiera de estosbloqueantes no presentan cambios en la CT basal.

15 min después de una estimulación de la secreción

de CT por administración de Cl Ca, se observa que durante2

la degeneración ualleriana los animales GCSxpresentan ni­veles de CT sérica de menor magnitud que las ratas some­

. 88 .

tidas a operación simulada, coincidiendo con los resulta­dos descriptos en 3.2.4.8.

El bloqueo de los receptores d_por la Fenoxibenza­mina condujo a un incremento de la secreción estimuladade CT en animales GCSx, indicando una restauración de la

capacidad de respuesta de las células C-tiroideas a lahipercalcemia. Las ratas con operación simulada no presen­tan cambios significativos después de la inyección de Fe­noxibenzamina, aunque se observó un alto grado de varia­bilidad en los niveles de CTobtenidos. Por el contrario,la administración de propranolol no modificó la liberaciónbasal o estimulada de CT en ninguno de los grupos estudia­dos.

Comose ha visto, la Fenoxibenzamina estimuló lasecreción de CT basal y estimulada en ratas GCSxduranteel período de degeneración ualleriana. La administraciónsimultánea de Fenoxibenzamina y propranolol deprimió larespuesta inducida por la Fenoxibenzamina. Estos cambiosno se observaron en los animales sometidos a operaciónsimulada.

Con el objeto de valorar la eficacia de la Fenoxi­benzamina para revertir la depresión de la secreción deCT que ocurre durante la degeneración ualleriana, se en­sayaron dosis menores de la droga: 0.25 mg/Kg (1/5 de ladosis empleada anteriormente). Los resultados se observanen la Fig. 21. En las ratas GCSx, el bloqueo de los adre­noceptorescx por la Fenoxibenzaminarevierte tanto la de­presión en la respuesta secretora de CTFrente a la hiper­calcemia como el retardo para alcanzar su máxima respues­ta.

.89­

30304"

Los resultados obtenidos en estos estudios indican

que la respuesta de las células C-tiroideas a un estímu­lo secretorio, normalmentedeprimida durante la degenera­ción ualleriana, es restaurada mediante el bloqueo de losreceptores o(adrenérgicos por la Fenoxibenzamina. Esteefecto puede ser bloqueado por el propranolol.

-90­

FIGURA 19: HIPERCALCEMIA DESPUES DE UNA INYECCION DE ClzCaFALTA DE INTERFERENCIA DE ANTA­

ESTUDIDS DURANTE LA DE­

EN RATAS GCSX.

GDNISTAS ADRENERGICDS.

GENERACION UALLERIANA.

OPERACION SIMULADA

CJ Basal

II 15 min despuésdel C12Ca

CALCIOSERICO(mg/dl)

“Í 2FENDXIBENZAMINA ­

PRÜPRANOLOL - _ '+ + _ _ + +

La Fenoxibenzamina (1,25mg/Kg) y el propranolol (6.25mg/Kg)se administraron vía 3.o. 30 min antes de la inyección deClZCa (Smg Ca/rata i.p.)Las barras representan la mediaiES del número de animalesindicado dentro de cada una de ellas.

FIGURA 20: EFECTO DE LA DEGENERACIÜN UALLERIANA POSTERIOR

A LA GCSX SOBRE LA LIBERACION ESTIMULADA DE CT.

INTERFERENCIA PÜR ANTAGÜNISTAS ADRENERGICÜS.

GCSx OPERACION SIMULAQA

low. :1 8888.1

¡I 15 min despuesd al 012Ca

CALCITONINASERICA(pg/m1)

1

0..FENOXIBENZAMINA

PROPRANOLOL ' ’ + +

La fenoxibenzamina (1.25mg/Kg) y el propranolol (6.25mg/Kg)se administraron vía s.c. 30 min antes de la inyección deClZCa (Smg Ca/rata i.p.).Las barras representan la mediaiES del número de animalesindicado dentro de cada una de ellas.

* p < 0.05 por análisis de la varianza seguido del Testde Dunnet.

** p < 0.05 por el Test de Student.

- 92

FIGURA 21: EFECTO DE DOSIS MINIMAS DE FENOXIBENZAMINA SO­

BRE LA SECRECION ESTIMULADA DE CT. ESTUDIOS

DURANTE LA DEGENERACION UALLERIANA POSTERIOR

A LA GCSX.

E 700 612Ca i.p. -7oo\UICL

<= 500- -sooL)Hc:LnJ(n

<zz300- -3ooHZ .

E o GCSx3 ' o 0p. sim.É ¡00- A GCSX, FBZ -100U Agp. sim., FBZ

l l l° o ¡o 20

TIEMPO TRANSCURRIDO DESPUES DE LA INYECCION DE C12Ca (min)

Dosis administradas: C12Ca: 5 mg Ca/rata i.p., fenoxiben­zamina: dosis s.c. de Ü°25mg/Kginyectadas 30 min antesque el C12Ca.Cada punto representa la mediaiES para 6 animales.* p < 0.05 respecto a los 3 grupos restantes (por análi­

sis de la varianza seguido por el Test de Dunnet)a

Durante la degeneración ualleriana, dosis mínimas deantagonistas d‘adrenérgicos pueden restablecer la secre­ción de CT.

- 93

3.4- REGULACION DE LA SECRECIDN DE PTH DURANTE LA GCSX

CRONICA. ESTUDIOS EN RATAS HEMIPTX

Los resultados presentados en las Secciones 3.2y 3.3 indican que la estimulación simpática local provo­ca una depresión de la Función paratiroidee estimuladapor hipocalcemia. Asimismo, como se menciona en la Sección

1.3.3, existen antecedentes que demuestran que duranteGCSxcrónica se acentúa la hipertrofia compensadora dela tiroides remanente después de hemitiroidectomía. Porotra parte, en el punto l.l.2.A se ha señalado que aúnno existe acuerdo en relación al desarrollo de hipertro­fia compensadoraparatiroidee cuando se efectúa paratiroi­dectomía parcial. En consecuencia, en esta etapa nos hainteresado estudiar simultáneamente le presencia de hiper­trofia compensadoraparatiroidee y su posible modulaciónneural por las fibras provenientes del GCS.Para ello he­mos efectuado estudios en los que las ratas Fueron some­tidas a PTx izquierda + GCSxderecha o a PTx izquierda +

operación simulada del GESderecho.

3.4.1- NIVELES SERICDS DE CALCIO Y PTH

Comose muestra en la Fig. 22, la hemiPTx provocó

una disminución significativa de la calcemia 24 h despuésde la operación. Cuendo la hemiPTx se asoció con GCSxip­

silateral a la paratiroidee remanente, el descenso de lacalcemia se hizo significativo 15 h después de la cirugía.

La asociación de ambas operaciones conduce a unadisminución significativa de la PTHcirculante 15 h des­pués de la operación. En cambio la PTx no modifica la DTHsérica en este intervalo.

- 94

Transcurridas 24 a 72 h de la cirugía los niveles

circulantes de calcio y PTHpermanecen significativamen­te disminuidos respecto a los valores basales, tanto enlas ratas hemiPTx como hemiPIx + GCSx. Estos resultados,

graficados en la Fig. 22, no indican compensación Funcio­nal por la paratiroides remanente en ninguno de los gru­pos estudiados.

La Fig. 23 resume las modificaciones que la hemiPTx

y la hemiPTx asociada a GCSxprovocan sobre la calcemia

transcurridos 3 a 14 días de la operación. Durante todoeste período los niveles circulantes de calcio permanecensignificativamente disminuidos respecto a los valores ba­sales prequirúrgicos, resultado que respalda la ausenciade compensación Funcional después de ablación paratiroi­dea unilateral, independientemente de la presencia o au­sencia de inervación simpática local.

3.4.2- INDICE MITÜTICÜ - ESTUDIOS HISTÜLÜGICÜS

El análisis del índice mitótico efectuado en le.

paratiroides remanente de animales que Fueran sometidosa operación simulada, hemiPTx o hemiPTx + GCSx 48 h antes

(Tabla III); muestra quenoexisten diferencias significa­tivas entre los grupos estudiados, indicando la ausenciade hiperplasia compensadorade la paratiroides remanentedespués de hemiPTx, independientemente de la presencia o

ausencia de inervación simpática. Las Fig. 24 A y 24 Bmuestran el aspecto general de la glándula remanente deuna rata hemiPTx 48 h antes.

3.4.3- RESUMEN

Los resultados descriptos en el punto 3.4 demues­

tran que después de una hemiPTx no existe compensación

funcional y anatómica por parte de la paratiroides rema­nente.

La secreción de PTHpor la glándula no removida

se encuentra inhibida durante el período de sobreactiva­ción postsináptica coincidente con la degeneración ualle­riana (15 h después de GCSx). Por el contrario, durantela ausencia crónica de inervación simpática los nivelesséricos de calcio y DTHno presentan cambios relacionadoscon la denervación.

-95­

FIGURA 22: NIVELES SERICOS DE CALCIO Y PTH EN RATAS HEMIPTX.

ESTUDIOS DURANTE Y DESPUES DE LA DEGENERACION

UALLERIANA POSTERIOR A LA GCSX.

o—-o PTx

o

(Ca) --o.5

*--1.o

A 4.5g 1.00

OI3

8 20055cn

Éo 1 n n 1 n

o 15 24 1.a 72

HORAS TRANSCURRIDAS DESPUES DE LA CIRUGIA

(TP/5"!)031838omwaV

Los animales Fueron sometidos a hemiPTx izquierda + GCSXsimulada contralateral o a hemiPTx izquierda + GCSxdere­cha.

Cada punto representa la mediaiES de 6 a 7 ratas.* p < 0.05 respecto a los valores basales prequirúrgicos

(por análisis de la varianza).Durante la degeneración ualleriana se observa una disminu­

. l . l . .Clon temprana de los nlveles serlcos de ca1010 y PTH.

FIGURA 23:

EN RATAS HEMIPTX.

-97­

FALTA DE HIPERTRDFIA CDMPENSADDRA FUNCIONAL

ESTUDIOS DURANTE GCSX CRONICA

A CALCIOscarco(mg/dl)

l

5

O-———0 PTx

O---O PTx, GCSx

IJI““'"'“'T"““‘I""M-W?

l

á.

3 7 IO 14

DIAS TRANSCURRIDÜS DESPUES DE LA CIRUGIA

Los animales fueron sometidos a hamiPTx izquierda + GCSxderecha o a hemiPTx izquierda + GCSXsimulada derecha.

La calcemia disminuyó significativamente en ambos gruposde ratas, en relación a los valores basales praquirúrgi­cos (10.0¿Ü.7 mg/dl) (p 4.0.01 por análisis de la varian­za da datos apareados). Nose observan diferencias entregrupos.

-99­

\

TABLA IIIINDICE MITÜTICÜ EN LA PARATIRÜIDES REMANENTE DE RATAS

HEMIPTx

Opera°l°n HemiPTx HemiPTX+GCSxsimulada

N9 de mitosispor 1000 1.3¿0.5 (6) l.7¿0.6 (6) 2.3¿o.5 (6)células

Los animales fueron sometidos a hemiPTx izquierda + GCSxderecha, a hemiPTxizquierda o a operación simulada.48 h después de la operación los animales recibieron col­chicina (2mg/Kg, i.p.) y Fueron sacrificados 2 h después.Los valores representan la medialES del número de anima­les indicado entre paréntesis.Nose observan diferencias estadísticamente significati­vas entre grupos.

-99­

FIGURA 24: ASPECTO DE LA PARATIRÜIDES REMANENTE LUEGO DE

48 H DE EFECTUADA HEMIPTX.

f." ' I. .Q s. ‘ z". ‘Ï‘- ZA. u ’

‘ ¿‘ïïqf‘gfig{ X?vfl.Mag;ï: NFHÉMC;;. JÉÍ. ' . Ab.»

A- Campogeneral. B- Identificación de una mitosis. Losanimales Fueron inyectados con colchicina (2mg/Kgi.p.)2 h antes del sacrificio.Nose observan índices que indiquen hipertrofia.

- lÜÜ ­

3.5- ÉEGULACION DE LA SECRECIUN DE CT DURANTE GCSX

CRONICA

Los experimentos descriptos en el punto 3.4 demues­tran que la ausencia crónica de inervación simpática lo­cal no modifica la respuesta Funcional y anatómica de laparatiroides remanente Frente a un estímulo hipocalcémi­co endógeno provocado por la hemiPTxcontralateral. Paracompletar el estudio de las alteraciones que la denerva­ción simpática local crónica pueda producir sobre el me­tabolismo mineral, nos interesó evaluar la respuesta Fun­cional de las células C-tiroideas en animales sometidosa GCSxcrónica.

La Tabla IV muestra que la calcemia de dos grupos

de ratas (GCSxo con operación simulada respectivamente)valorada 3,7 y 14 dias después de la cirugía, no difie­re significativamente entre ambos grupos, indicando quela GCSxcrónica no modifica la distribución y cinéticadel calcio.

Para estudiar la reapuesta Funcional de las célu­las C-tiroideas de ratas crónicaments GCSx,después de la

inducción de hipercalcemia, se administraron dosis de C12Ca(S mg Ca/rata) en diferentes grupos de animales a los quese les practicó GCSxu operación simulada 5 u ll días an­

tes del C12Ca. Los resultados se presentan en la Fig. 25donde se observa que los niveles séricos basales de cal­cio y CT son similares en ambos grupos de ratas. Después

de la estimulación con C12Catodos los animales reSpondencon una elevación significativa de la calcemia y de 1a CTcirculantes. Estos incrementos son de la misma magnituden los animales GCSxo con operación simulada.

- 101­

3.5.1- RESUMEN

En conclusión,esta serie de experimentos muestraque la ausencia crónica de la inervación simpática localobtenida por GCSxno modifica la respuesta basal ds las

células C-tiroideas y tampoco su capacidad de respuestadespués de la aplicación de estímulos secretorios.

- 102 ­

TABLA IV

NIVELES CIRCULANTES DE CALCIO (mg/dl) DURANTE GCSx CRONICA

Días transcurridos después de la operación

3 7 14

GCSx 9.8¿o.1 (6) 9.9¿0.4 (6) 9.7¿0.2 (6)

Operaciónsimulada 9.6¿Ü.2 (6) 9.4¿Ü.2 (6) 9.6¿Ü.2 (4)

Cada punto representa la mediaiES del número de animalesindicado entre paréntesis.Nose observan diferencias estadísticamente significati­vas entre grupos.

- 103 ­

FIGURA 25: RESPUESTA FUNCIONAL DE LAS CELULAS C-TIRÜIDEAS

EN RATAS CRUNICAMENTE GCSX.

C12Ca (5 mg Ca/rata)“v ,. <7)_ (12) .—L" (10)

12' (18)

a ­g 10- (46

DU

E 8.5‘ :1

g SU 3

5' G« ÉZ

R

4. g

' 53‘2' >(15) o—-o up. SIM. _ "

*—0 GCSx

ó ' ¡B ÏoTIEMPO TRANSCURRIDO DESPUES

DE LA ADMINISTRACION DE C12C8

(min)

Los resultados (mediaiES del número de animales in­dicado entre paréntesis) corresponden a diferentes expe­rimentos en que las ratas fueron GCSxo sometidas a ope­ración simulada 5 - ll días antes de la estimulación conClzCa.

Para ambos grupos de ratas, los niveles séricos decalcio y PTHse elevan significatiVamente respecto al va­lor basal, deSpués de la estimulación con ClzCa: p<(0.001por el Test de Student.

Nose observan diferencias estadísticamente signifi­catiVas entre ambos grupos en ninguno de los parámetrosestudiados.

-104­

CAPITULO 4

DISCUSION

— 105 ­

Se ha mencionado en la Introducción (Sección 1.1)

que el calcio extracelular es el principal regulador dela secreción de PTHy CT. Dentro de los agentes iónicos,el Fósforoy el magnesio también desempeñan un rol modula­dor aunque este último es de menor importancia dentro de

su rango Fisiológico (1,47). En los últimos años se hanacumulado evidencias que indican que también ciertos com­puestos no iónicos pueden actuar comosecretagogos o inhi­bidores de la secreción de PTHy CT; entre ellos, los me­

tabolitos de la vitamina D (108), gastrina_y otras hormo­nas gastrointestinales (74,75,194), secretina (194), có­lecistoquinina (74), glucagón (14), prostaglandinas Ey F

2

.4 (145,146) y aminas biógenas (147). En este últimocasó, diversos estudios efectuados "in vitro" indican quelas catecolaminas que incrementan el AMPcintracelular(agonistas [gadrenérgicos) pueden estimular 1a secreciónde PTH(149,150,154,181) y CT (182-184). Por el contrario,las aminas que disminuyen el AMPcintracelular (agonistasokadrenórgicos) inhiben la secreción de PTH(181,185,186)

y CT (175).

La fuente de origen de las catecolaminas que poten­cialmente afectan la secreción de PTHy CT es variada.Pueden provenir de la circulación general o ser liberadaslocalmente a través de las terminales simpáticas que iner­van las células C-tiroideas y paratiroideas. En las Seccio­nes 1.4.1.8 - C y 1.4.2.8 - C se describen los estudios quese han efectuado hasta el momentopara evaluar el rol fi­siológico.que desempeñan las aminas biógenas sobre la se­creción de estas hormonas. Dichos estudios tienden Funda­

mentalmente a analizar 1a participación de las catecola­minas ciroulantes aunque no se han obtenido resultadosclaros al respecto (Sección 1.4.3). Por otra parte, los

- 106 ­

experimentos efectuados para evaluar la presencia de unaposible Función moduladora de las catecolaminas neurona­les sobre la secreción de PTHy CT son escasos (Seccionesl.4.l.C - D y 1.4.2.0 - D), utilizan técnicas de estimu­lación o deprivación neuronal no específicas para la zonaen estudio y/o además perturban la homeostasis globalde los animales en experimentación.

Unode los objetivos centrales de este Trabajo deTesis ha sido determinar el rol que juega la inervaciónsimpática local sobre la secreción de PTHy CT. En la Sec­ción 1.3.2.A se ha descripto que las células paratiroideasy C-tiroideas reciben inervación simpática provenientede Fibras que transitan el GES,sugiriendo que las cate­colaminas neuronales liberadas pueden ejercer un rol mo­dulador sobre la secreción de ambas hormonas. En esta Te­

sis hemos examinado esta cuestión utilizando por primeravez para tal Fin ratas deprivadas especificamente de lainervación simpática que reciben la paratiroides y lascélulas C-tiroideas mediante ablación quirúrgica del GES.Comose describe en la Sección 1.3.3, después de esta o­peración sobreviene un periodo de degeneración neuronalcaracterizado por una liberación supraliminal temporalde NEcapaz de activar los adrenocsptores de los diver­sos órganos inervados y reproducir la actividad del ner­vio intacto (140). En consecuencia, para establecer elrol Fisiológico que juega la inervación simpática que re­ciben tiroides y paratiroides, provista por Fibras prove­nientes del CCS, hemos utilizado un modelo experimentalque permite valorar después de GCSxla respuesta Funcio­nal de estas estructuras: 1- a la estimulación simpáticapor liberación de neurotransmisores durante la degenera­

ción neuronal y 2- a la deprivación neuronal que sobrevie­ne a la GCSx.

- 107 ­

El objetivo de la primera etapa fué determinar sila secreción basal de estas hormonas era modificada por

el estado Funcional de la inervación simpática. En el pun­to 3.1 (Tablas I y II,'Fig. 7) se demostró que la presen­cia o ausencia local de neurotransmisores liberados porlas terminales del GCS,no afecta la secreción basal deCT y PTHsi no se modifica la condición normocalcémicade los animales. Nuestros resultados concuerdan con los

estudios realizados por otros autores en condiciones ex­perimentales que no incluyeron estimulación de la secre­ción de PTHo CT. En efecto, la supresión de catecolami­nas circulantes en ratas, efectuada por adrenalectomíao por simpatectomía química inducida por inyección de 6­hidroxidopamina, no modifica los niveles séricos de cal­cio, PTH y CT (164,165). Asimismo, Heath y col (168) en­

cuentran que la estimulación eléctrica de los nervios sim­páticos cervicales en perros normocalcémicos no producecambios en la PTHcirculante, que tampoco se modifica des­pués de la estimulación química de la liberación de NEde las terminales nerviosas por inyección de tiramina (168).En contraposición con nuestros resultados, Vora y col (167)describen un pequeño incremento de los niveles séricos dePTHen ratas (menos de un 30%) cuando se aplica estimula­ción eléctrica en el tronco vagosimpético. Sin embargoel período de estimulación fué muy prolongado (l h) pudien­do afectar la respiración y modificar el calcio iónico(147).

En relación a la CT y también en coincidencia connuestros resultados, se ha encontrado que la estimulaciónde liberación de NEmediante la inyección de tiramina enratas normocalcémicas no modifica los niveles séricos de

esta hormona,(147).

e 108 ­

En consecuencia, nuestros datos y la mayoria delos de la literatura no avalan una Función primaria de

los terminales simpáticos C-tiroideos y paratiroideos enla regulación de los niveles basales (en condiciones nor­mocalcémicas) de PTHo CT. Fué por lo tanto de interés

evaluar si la respuesta secretora de ambas hormonas eraafectada por la manipulai'ín quirúrgica de dicha via sim­pática.

Los experimentos resumidos en al punto 3.2 se diseña­ron para analizar el rol regulador que juegan las cateco­laminas que se liberan después de CCSx,durante el proce­so de degeneración ualleriana, sobre la respuesta secre­tora de la paratiroides y las células C-tiroideas previa­mente estimulada mediante la inducción de hipo e hipercal­cemia respectivamente. Nuestros resultados indican quedurante este proceso, caracterizado por un incremento dela actividad postsináptica debido a la liberación aumen­tada de NE, se presenta una depresión de la respuesta Fun­cional de la paratiroides y células C-tiroideas cuando

ocurren cambios en los niveles séricos de Calcio. En efec­to, la Fig. ll muestra que, a pesar de la severa hipocal­cemia inducida por el EDTA,las ratas bajo GCSxaguda pre­

sentan niveles de PTHsérica significativamente deprimi­dos en relación a los animales controles. Asimismo, des­pués de la administración de Cl Ca los animales CCSxpre­

2sentan tanto una disminución de la máximaliberación de

CT como una demora en alcanzar la misma (Fig. lS A).

Si bien la CCSxaguda deprimió totalmente la secre­ción estimulada de PTH, en el caso de la CT esta inhibi­ción Fué solo parcial indicando una posible sensibilidaddiferencial de las células C y las células paratiroideasante cambios en la actividad neural. Un experimento pos­

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terior en el que se utilizó un modelo experimental dondelos animales Fueron simultáneamente hemiPTx y GCSxcontra­

lateralmente lS h antes de comenzar el experimento, per­mitió analizar el rol que juega la inervación simpáticalocal sobre la secreción de PTHcuando el estímulo hipo­

calcómico (provocado por la hemiPTx) es de origen endóge­no. Comose observa en la Fig. 22, durante la degeneración

neuronal ocurre una depresión temprana en la secreciónde PTHy en los niveles circulantes de calcio que no sepresenta en los animales controles. En consecuencia, cuan­do la hipocalcemia es provocada por la hemiPTx, la esti­mulación simpática inducida por GCSxaguda tamién provo­ca un deterioro en la respuesta de la paratiroides.

Los resultados presentados hasta el momentosugie­ren que la inervación simpática periférica ejerce un rolmodulador negativo sobre el control de las Funciones delas células C-tiroideas y paratiroideas.

Unade las características que definen a los pro­cesos modulatorios neurales es su posible reversión o de­saparición cuando se modifican las condiciones Funciona­les del vínculo principal. Nos pareció de interés exami­nar si un mayor estímulo podía revertir la depresión dela secreción de PTHo CTdurante la degeneración ualleria­na de los terminales simpáticos. En el caso de la PTHseutilizó una dosis doble de.EDTAadministrada a los mismos

intervalos de tiempo que los descriptos para las dosismenores. De 7 animales GCSxinyectados con doble dosisde EDTAsolo sobrevivieron 3. Sin embargo, como se obser­va en la Fig. 12, estas ratas presentaron un incrementosignificativo de la PTHsérica paralelamente a un suaveaumento de la hipocalcemia. En el caso de la CT se utili­

zó una inyección adicional de €12Ca. La Fig. 16 indica

- 110 ­

que después de esta última aplicación a ratas con GCSx

aguda, los niveles séricos de CTse recuperan hasta alcan­zar valores normales. Este incremento fué simultáneo a

una elevación aún mayor de la calcemia.

Se concluye que la inhibición de la reSpuesta delas células paratiroideas y C-tiroideas inducida por trans­misores adrenárgicos, puera revertirse mediante la apli­cación de estímulos aprop;Jdos. Estos resultados son com­patibles con el ya mencionado rol modulador de la NEso­

bre la liberación de PTH y CT.

Nuestros datos (Fig. 15 B) muestran también que

una vez completada la degeneración neuronal (28 h despuésde la GCSx, cuando la NEliberada desaparece del medio cir­

cundante) cesa la depresión de la secreción estimulada deCT. Asimismo, en la Fig. 22 se observa que los animales

hemiPTx, cuyos niveles séricos de PTHestán deprimidosdurante la degeneración ualleriana, alcanzan valores si­milares al grupo control sin GCSx-deSpuésde transcurri­das 24 - 48 h. Se concluye que, en ausencia reciente de

estimulación simpática, se restablece la respuesta normalde la paratiroides y células C-tiroideas a sus estímulos

I .espec1ficos.

Se pueden intentar varias interpretaciones paraexplicar la depresión de la respuesta normal de paratiroi­des y cólulas C-tiroideas durante la degeneración neuro­nal que sigue a la GCSx:

l- Existe información sobre la existencia de receptoresadrenérgicos Farmacológicamente revelablss sn las cé­lulas C-tiroideas y paratiroideas (Sección 1.4). En con­secuencia el efecto de la NEsobre la secreción de PTH

y CTpodría ejercerse por estimulación de tales recep­

tores o<y/o P .

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2- La Pared Vascular es también un sitio de alta concen­

tración de adrenoceptoresfi y fiadrene’rgicos (123,138).Se ha encontrado además que la liberación endógena de

NEque ocurre temporalmente durante la degeneraciónualleriana provoca una disminución en el Flujo de san­gre que llega a la tiroides, estimado por Rb86 (138).En consecuencia podria postularse que los cambios enla secreción de PTH y CT mediados por la NE serian se­cundarios a estos cambios vasculares.

3- La ablación del CCS, además de la denervación de las

glándulas tiroides y paratiroides, provoca denervaciónde las glándulas salivares y pineal, estructuras ocu­lares, cuerpo carotideo y denervación simpática peri­férica de la habánula o el hipotólamo basal (122,123)los que aisladaments o en conjunto podrian teóricamen­te afectar la homsostasis del calcio.

La posibilidad g es remota ya que no se ha descrip­to participación fundamental de otros sistemas neuroendó­crinos en la regulación del metabolismo del celcio,al me­nos compatible con la dramática disminución de la respues­ta que hemosencontrado. En relación a las posibilidadesl y g no estamos en condiciones de discriminar entre ellasen el momentoactual, aunque es probable que los cambiosdescriptos se deban tanto a efectos directos comovascu­lares locales de los neurotransmisores. En todo caso, lospresentes resultados avalan le existencia de una efectivamodulación neural de la respuesta endócrina de las cálunlas C-tiroideas y peratiroideas.

La siguiente serie de experimentos (Sección 3.3)Fué realizada para identificar los edrenoceptores que par­ticipan en la modulación neural de la secreción de PTHy CT y para estudiar su modo de acción. Con este objeto

- 112

se inyectaron antagonistas 9ky/o fiadrene’rgicos, aplica­dos durante el proceso de degeneración ualleriana. La ad­ministración de estos agentes descubrió varios mecanismosrelativos al origen de la inhibición de la-liberación dePTHy CT provocada por la inervación simpática local.

En efecto, el antagonista d.adrenoceptor Fentola­mina incrementó los niveles circulantes de PTHque se en­contraban deprimidos en las ratas con CGSxdurante la ad­

ministración de EDTA(Fig. 18). Estos resultados indicanque el bloqueo de los sitios okadrenoceptores provoca u­na restauración parcial de le capacidad de respuesta delas células paratiroidess ante un estimulo hipocalcémico,y concuerdan con observaciones previas referidas a la ac­ción de las catecolaminas circulentes que indican que envecunos (159) y humanos (160) le secreción de PTHes inhi­bida por la inyección sistémica de agentes u.adrenórgicos.

Asimismo, el bloqueo de adrenoceptores “¡inducidopor dosis apropiadas de fenoxibenzamina (169) incremen­tó tanto la CT basal (dosis elevadas) (Fig. 20) comola

CTliberada por estimulación hipocalcómica (dosis altasy mínimas del compuesto) (Fig. 20 y 21). Nuestros resul­

tados concuerdan con los trabajos de Vora y col (177) quie­nes encuentran en humanos que una infusión de Fentolami­na incrementa la CT sórica alrededor de un 32 %. Uilliams

y col describen también en el hombre (160), que la admi­nistración del agonista ¿metoxamina disminuye la CTsé­rica y que este efecto ss anulado por la Fentolamina.

Los resultados descriptos hasta este punto sugie­ren que la NEresultante de la liberación por destrucciónde los terminales simpáticos interactúa con adrenocepto­res a de las células C y de le peratiroides para inhibirsu respuesta normal.

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Cuando en un diseño experimental semejante al uti­

lizado para bloqueantes a_, se utilizó el bloqueante fia­drenérgico propranolol, los resultados fueron mas dificul­tosos para analizar. En el caso de la CT, la inyecciónde dosis de propranolol comunmenteutilizadas para bloquear

adrenoceptoresfg (116) no modifica la liberación basalo estimulada de esta hormona en ratas GCSx, según muestra

la Fig. 20. Este hecho podría ser tomado como indicador

de la ausencia de participación significativa de los adre­

noceptores/g en la liberación de CTdurante la degenera­ción neuronal. Sin embargo, cuando el propranolol y laFenoxibenzamina se administran juntos, se deprime el in­cremento de la liberación basal y estimulada de CTqueFuera provocado por la Fenoxibenzamina (Fig. 20).

Para explicar estos resultados resulta útil anali­zar previamente la bibliografía publicada al respecto.Se ha sugerido que las catecolaminae pueden modificar la

liberación de CTde lee células C-tiroideas "in vitro",e "in vivo" en el caso de lee aminee biógenas circulan­tes (147). La epinefrina, que es una catecolamina que mues­

tra mayor actividad sobre los adrenoceptores/g que sobrelos 04(116) incrementa la liberación de CT si se agregaa cultivos de tiroides porcina (169) o si se inyecta sis­temáticamente en carneros (173). Tal incremento existea pesar de la depresión concomitante del Flujo sanguíneoque irriga la tiroides (173). En este caso, el efecto dela epinefrina sobre la CTtambién es inhibido por el olo­

queante adrenérgico/e propranolOl. Por otra parte, la NE,que es un agonista mixto ab-/g aunque con mayor actividadsobre los adrenoceptores o<(116) puede inhibir la libera­ción de CT en cerdos y vacunos (175,176,195). Esta inhi­bición de la liberación de CTpor las catecolaminas cir­

— 114 ­

culantes, también sa he encontrado en el hombre (74,175).

En consecuencia, en el caso de la CT, nuestros re­sultados concuerdan con estudios Farmacológicos previosque indican que las catecolaminas circulantes afectan suliberación por acción sobre los edrenoceptores d inhibi­torios y fi estimulatorios (147,174,175,177,17a,195). Lacomparación de la actividad de la fenoxibenzamina y el

propanolol indica 1a existencia de un estímulo pgadreno­ceptor menor sobre 1a liberación de CT, solo reveladocuando se bloquea la inhibición predominante Guadrenórgi­ca. Lo antedicho concuerda también con el hecho de que la

NEdespliega mayor actividad sobre los edrenoceptores d

que sobre los; .En el experimento en el que se estimuló la secre­

ción de PTH con EDTA, comenzando 4 h 30 min después de

la inyección de propanolol, se observó un efecto hiper­calcémico de esta droga (revelado por los elevados ni­veles basales de calcio) (Fig. 17). Esta situación, com­patible con datos de la literatura en humanos (196)complicóel análisis ulterior del efecto astimulatoriodel EDTAsobre la secreción de PTH. La Fig. 18 muestra

que el propanolol incrementó la respuesta de la parati­roides a la hipocalcemia. Si bien estos reSUItedos concuer­dan con los experimentos de Christensen y col (197), quie­nes encuentran que en el hombre el propanolol bloquea elefecto depresor del isoproterenol sobre la secreción dePTH, 1a mayor parte de la literature publicada hasta elmomentono respalda estos resultados. En efecto, se ha

encontrado que los agonistas fi edrenárgicos, que incremen­tan la sintesis de AMPc,elevan la secreción de PTH"invitro" (149,154,156,198). A1 menos en lo qua respecta a1rol de las catecolaminas circulantes, también los estudios

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realizados "in vivo" indican una acción estimulante de

los aceptores F: E1 agonista F adrene'rgico isoproterenolaumenta la liberación de PTHen ratas intactas (158), ga­

nado (157,161,199) y humanos (196). La administración depropranolol disminuye la PTHsárica en vacunos (157), ra­tas (158) y en el hombre (196). Por otra parte, otros au­tores no encuentran efecto del propranolol sobre 1a secre­ción de PTHestimulada por hipocalcemia en la rata (200).

Es sabido que el propranolol tiene varios efectostóxicos no relacionados con el bloqueo de adrenoceptores

Ig, que incluyen perturbaciones de 1a membranalipidicay modificaciones en el transporte de calcio (116,201-204)así comoel ya mencionado efecto hipercalcámioo (196).La prolongada exposición a1 propranolol de los animales

GCSxtratados con EDTA(4 h 30 min) pudo Facilitar 1a ma­

nifestación de estos efectos tóxicos que no se observaronen los experimentos restantes en los que el propranololFué administrado 30 min antes de la toma de las muestras

de sangre. Tampocose descarta una posible interacciónquímica entre el EDTAy al propranolol que modifique susefectos biológicos.

En conclusión, los resultados hasta aquí presenta­dos indican que cuando se activan los nervios simpáticosque transitan por al GCSxy que inervan las células C-ti­roideas y 1a paratiroides, se produce una modificaciónsignificativa de la respuesta homeostática de 1a CTy laPTH. La NEliberada reacciona con adrenoceptores a inhi­bidores en las células de la paratiroides y C-tiroideas

y con receptores /3estimulatorios en estas últimas, predo­minando el primero de estos efectos. La posible Función

de los adrenoceptores/6 en las células paratiroideas esincierta a partir de nuestra experiencia.

— 116 ­

Una vez establecido al rol modulador negativo que

juega la inervación simpática sobre la Función paratiroi­daa y considerando los antecedentes que demuestran quael desarrollo de hipertrofia compensadorade la tiroidessa ve afectado por la supresión quirúrgica del CCS(Sec­ción 1.3.3) nos interesó estudiar simultaneamente la exis­tencia de compensación Funcional y/o anatómica de la para­tiroidas remanente después de hemiPTxy la posible parti­cipación del sistema simpático en este Fenómeno. Comoseha mencionado en la Introducción (Sección 1.1.2.A), losdatos de la literatura, en su mayoria estudios clínicos

post quirúrgicos, son contradictorios en relación a la ocu­rrencia de hipertrofia compensadoradespués de paratiroi­dectomia parcial. En el punto 3.4 se describen los estu­dios que hemosrealizado para aclarar estas cuestiones,utilizando animales hemiPTx sometidos a GCSxo a opera­ción simulada.

En las rates hemiPTx, los niveles séricos da cal­cio, determinados 3 - 14 días después de la cirugía (Fig.

23) y de PTH, 3 días después (Fig. 22) se mantuvieron sig­nificativamente disminuidos respecto e los valores basa­les prequirúrgicos, sin demostrar compensación. Tampocose registraron alteraciones morfológicas ni aumentos enel indice mitótico de la paratiroidas remanente (TablaIII). Pavlov (11), en el Único estudio experimental publi­cado hasta el momento, observó compensación histológicade la paratiroidas remanente en ratas hemiPTx. Los nive­les circulantes de calcio disminuyeron moderadamente2­3 dias después de la operación retornando al valor basalal cuarto dia del experimento. Sin embargo, en este tra­bajo el análisis de la compensación Funcional no es com­

pleto ya que los autoras no determinaron niveles circulan­tes de PTH .

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Nuestros estudios no avalan el desarrollo de hiper­trofia compensadora después de hemiPTx en la rata, comolo indican la valoración de los niveles séricos de calcio

y PTH, los estudios de la morfología celular paratiroideay la determinación del indice mitótico.

Masarriba hemosdiscutido las alteraciones indu­cidas por GCSxaguda en la respuesta Funcional de la pa­ratiroides. Los resultados descriptos en el punto 3.4 mues­tran que la denervación simpática local crónica no modifi­ca la reapuesta Funcional de la paratiroides remanenteen presencia de un estímulo hipocalcémico endógeno provo­cado por la hemiPTx. En efecto, los niveles séricos de PTH

y calcio en ratas simultaneamente GCSxy hemiPTx, estudia­dos respectivamente 3 y 3 —14 días después de la opera­

ción, no difieren de los controles hemiPTx (Fig. 22 y 23).Coincidentemente con estos resultados, aunque en condicio­nes experimentales manos especificas, Heath (164) encontróque la deprivación total crónica de catecolaminas provoca­da por la administración de 6 hidroxidopamina, no alterólas concentraciones sóricas de calcio ni la respuestahomeostática de le paratiroides en la rata.

Una vez establecido que el rol modulador del GCSsobre la secreción estimulade de PTHes compensado en a­nimales cronicamente GCSx,nos interesó estudiar si estefenómenotambién se registre en relación a la secreciónde CT. Los resultados se muestren en el punto 3.5 e indi­can que, coincidentemente con las observaciones efectua­das para PTH, no se modifican los niveles séricos de cal­cio y CT durante GCSxcrónica (Fig. 25, Tabla IV). La a­plicación de un estimulo hipercalcemiante elevó signifi­cativamente ambos parámetros tanto en animales GCSxcomo

con operación simulada aunque no hubo diferencias entre

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ellos (Fig. 25). De acuerdo con nuestros resultados seha descripto que la depleción de catecolaminas circulan­tee por adrenalectomía no modifica la respuesta basal delas células C-tiroideae ni su respuesta a la hipercalcemia.Asimismo, la eimpatectomía total química no modifica larespuesta al calcio (164) ni la CTbasal (165).

Se concluye que el GCSejerce un rol modulador so­bre la respuesta homeostática de las células C-tiroideasy paratiroideas que es sin embargo compensado en ausenciacrónica del mismo. En que medida la inervación colinérgi­ca (proveniente del nervio laringeo superior) o peptidér­gica (205) median esta compensación es un tema de interéspara futuras investigaciones.

Los resultados descriptos en esta Tesis permitencompletar el cuadro que muestra la regulación hormonal delmetabolismo del calcio presentado en la Fig. 3 de la In­traducción. En efecto, según se muestra en la Fig. 26 he­mos prasentado evidencias que demuestran que la respues­ta Funcional de las células paratiroideas y C-tiroideasa sus estímulos sepecíficos también está modulada por neu­ronas simpáticas que provienen del CCS. Esta modulaciónocurre a través de la interacción de los neurotransmiso­res liberados con adrenoceptores x.inhibitorios (PTH, CT)

y secundariamente de tipo /gestimulatorio (CT).

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FIGURA 26: REGULACION NEURAL DE LA SECRECIÜN DE PTH Y CT

NIVELDE NEURONASMODULACION PROVENIENTES

DEL GCS

RETROALIMENTACION FARAURmDEA cmRmDEA

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Las neuronas simpáticas que transitan el CCSmodulanla respuesta de las células C-tiroideas y paratiroideasa sus estímulos eSpecíficos. Esta modulación se ejercea través de adrenoceptores oiinhibitorios (PTH, CT) y se­cundariamente fi de tipo estimulatorio (CT).

Compárese con la Fig. 3.

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CONCLUSIONES

Los trabajos efectuados en esta Tesis estudianel rol que juegan las catecolaminas neuronales en la re­gulación de la secreción de PTHy CT, utilizando un mo­

delo experimental que incluye manipulación quirúrgicade la inervación simpática local (GCSx),que puede repro­ducir la actividad del nervio intacto.

Hemos encontrado que:

l- Durante el proceso de degeneración neuronal, que in­volucra un incremento de la actividad postsinápticapor liberación incrementada de NE, ocurre un deterio­ro de la secreción estimulada de PTHy CT.

2- Este deterioro puede revertirse mediante la aplicaciónde estímulos apropiados, avalando la existencia deuna modulación neural negativa de la respuesta endó­crina de las células paratiroideas y thiroideas.

3- La respuesta secretora de las células C-tiroideas es­tá regulada por un estímulo inhibitoriOo< adrenérgi­

co predominante y un estímulo fgadrenoceptor menor,solo revelado cuando se bloquea el efecto uk.

4- La respuesta secretora de las células paratiroideasestá regulada por estímulos a.inhibitorios.

5- No se manifiesta hipertrofia compensadora de la para­tiroides.

6- El rol modulador que el GCSejerce sobre la respues­ta homeostática de las células C-tiroideas y paratiroi­deas es compensado en ausencia crónica del mismo.

Finalmente, la comparación de las Fig. 3 y 26 ra­sume los aportes efectuados en esta Tesis: La Fig. 26

indica que la homeostasis del calcio estaría reguladapor dos niveles de acción sobre las células secretoras:l-Modulación neural por fibras simpáticas provenientesdel GCS.g-Retroalimentación ejercida por Factores humo­ralee ya descriptos, fundamentalmente agentes iónicos ymetabolitos de la vitamina D.

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