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04/03/2017
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Diagnose de doenças de plantasPatologia Florestal
Daniel Diego Costa Carvalho
Mestre em Fitopatologia (UFLA)
Doutor em Fitopatologia (UnB)
PFv004
Cada método é utilizado para diagnosticar?
Diagnose tradicional de doenças de plantas?
Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica?
Diagnose baseada em técnicas moleculares?
1. Diagnose tradicional de doenças de plantas
1.1. Diagnose de doenças conhecidas (já descritas)
SINTOMA x SINAL
SINTOMAS: manifestação das reações da planta a um agentenocivo
SINAIS: Estruturas do patógeno, ou o próprio patógeno, presentesnas plantas doentes
Bursaphelechus cocophilus
http://www.agrolink.com.br/agricultura/problemas/busca/anel-vermelho_2990.html
Cylindrocladium sp.
http://w3.ufsm.br/fitoflorestal/detalhador.php?id=55#sthash.lN7cFMWH.IYbVkNBi.dpbs
Citrus tristeza virus
Agrios, 2005.
Ralstonia sp.
Alfenas e Zauza, 2007.
Diagnose tradicional de doenças de plantas
Como as doenças de plantas são diagnosticadas?
SINTOMAS SINAIS
Carvalho, 2015.
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Descrição da sintomatologia de doenças:
Chaves de identificação publicadas em livros
Comparação entre as ilustrações e as plantas doentes
São suficientes para o diagnóstico de uma doença
Carvalho, 2015.
Procedimentos para a diagnose de doenças conhecidas
Procedimento para a análise de laboratório
Informações de campo +
Teste laboratoriais para identificação do patógeno
Literatura
Doença conhecida
Doença desconhecida
1.2. Diagnose de doenças desconhecidas:
Nenhuma evidência de doenças conhecidas nomaterial analisado, o que fazer?
Postulados de Kock: Teste de patogenicidade
POSTULADOS DE KOCH
1. ASSOCIAÇÃO CONSTANTEO microrganismo deve estar associado à doença em todas as plantas examinadas.
2. ISOLAMENTO E CULTIVOO microrganismo deve ser isolado da planta doente, cultivado em cultura pura e suas características descritas.
3. INOCULAÇÃO (Teste de patogenicidade)O microrganismo em cultura pura deve ser inoculado sobre plantas sadias (mesma espécies ou variedade) e produzir a mesma doença.
4. REISOLAMENTOO microrganismo deve ser novamente isolado em cultura pura e exibir as mesmas características.
Regras para análise de sementes, 2009.
1.3. Diagnose de doenças em sementes contaminadas
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
Aspergillus spp. e Cladosporium spp.
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blotter test para detecção de Aspergillus spp. eCladosporium spp. em sementes de feijoeiro.
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
blotter test para detecção de Aspergillus spp. eCladosporium spp. em sementes de feijoeiro – após 7 diasa 20ºC.
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
Kobayasti et al., 2011.
Aspergillus sp.
Cladosporium sp.
- Lâminas microscópicas semi-permanentes
- para confirmação de cada gênero fúngico
Guimarães & Carvalho, 2014.
Foto: D.D.C.Carvalho (2009).
1.4. Diagnose de doenças que requer o isolamento dopatógeno
http://www.ipef.br/eventos/2009/rtprotef14/VM_%20Ceratocystis_Bianca.pdf http://www.ipef.br/eventos/2009/rtprotef14/VM_%20Ceratocystis_Bianca.pdf
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http://www.ipef.br/eventos/2009/rtprotef14/VM_%20Ceratocystis_Bianca.pdfOliveira, 2010.
https://www.uoguelph.ca/~gbarron/Misc2009/newadd5.htm
Carvalho et al., (2008).
Vasconcelos et al., (2014).
Vasconcelos et al., (2014).
1.5. Exemplos de Doenças de fácil Diagnose
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Botrytis em eucalipto
Alfenas e Zauza, 2007.
Cylindrocladium pteridis
Foto: D.Carvalho (2017).
http://www.missouribotanicalgarden.org/gardens-gardening/your-garden/help-for-the-home-gardener/advice-tips-resources/pests-and-problems/diseases/fungal-spots/black-spot.aspx
Foto: D.Carvalho (2017).
1.6. Extração de nematóides para diagnóstico
Agrios, 2005.
Anel vermelho do coqueiro: Bursaphelenchus cocophilus
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2. Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica
2.1. Microscopia eletrônica de transmissão para auxílio na diagnose de vírus
Tobacco mosaic virusAlfalfa mosaic virus
Cucumber mosaic virus
Agrios, 2005.
Citrus tristeza virus
Coconut cadang-cadang viroid
Agrios, 2005.
Cell inclusion bodies observed with an electron microscope.
Indicative of the presence of one or more viruses and, often, are diagnostic of the genus of the virus.
Typical pinwheel-like inclusion bodies diagnostic of potyviruses
Agrios, 2005.
Agrios, 2005.
Clorose Variegada do Citros - CVC: Xylella fastidiosa
2.2. Microscopia eletrônica de transmissão e varredura para auxílio na diagnose de micoplasmas. 3. Diagnose baseada em técnicas moleculares
3.1. Hibridização molecular
Imobilização do ácido nucléico em um suporte sólido e formação de híbridos
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Ácido Nucléico Imobilizado
Ácido Nucléico Imobilizado
Sonda
Sonda
Sondas Radioativas ** ** * * *
nucleotídeo radioativo (P-32)
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTASHibridização molecular
Membrana
Membrana
Sondas Não Radioativas Digoxigenina/PA
EY YYE EE YEY
Revelar
NBT-BICPColorimetria
ECLQuimioluminescência
3.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Desenvolvido por Kary Mullis (Mullis & Faloona, 1987)
Amplifica fragmentos de DNA in vitro milhares de vezes
Reação:
DNA genômico
Tampão
Primers (~20 bases) “forward” e “reverse”
dNTPs (nucleotídeos A, T, C, G)
Taq (polimerase de DNA)
MgCl2 (Cofator da Taq)
H2O ultra pura
http://www.bio-rad.com/en-us/product/mj-mini-thermal-cycler
http://biomol.com.br/produto/amplitherm-termociclador-sem-gradiente-96-microtubos
http://pt.depositphotos.com/45206661/stock-photo-loading-samples-into-gel-for.html
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http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php
VISUALIZAÇÃO DO DNA EM LUZ ULTRAVIOLETA
Análise eletroforética em gel de agarose (1%) dos produtos amplificados por PCR para confirmação da identidade dos isolados de Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens
Regras para análise de sementes, 2009.
Aplicações da PCR:
Detecção
Identificação
Quantificação (PCR real time)
Fitopatógenos
Cada método é utilizado para diagnosticar?
Diagnose tradicional de doenças de plantas?Doenças conhecidas e doenças não conhecidasFungos, Bactérias, Micoplasmas, vírus, nematóides
Diagnose com auxílio de microscopia eletrônica?MEV e METMicoplasmas (Spiroplasmas), vírus...
Diagnose baseada em técnicas moleculares?Fungos, Bactérias, vírus...
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Bibliografia citada e recomendada:
AGRIOS, G.N. Plant Pathology. 5 ed. San Diego, Academic Press, 2005, 948p.
ALFENAS, A.C.; ZAUZA, E.A.V. Doenças na cultura do eucalipto.Viçosa: SIF. 1 ed. 2007, 164p.
CARVALHO, D.D.C. Herbário de Doenças de Plantas – FitopatologiaAplicada. Ipameri: Universidade Estadual de Goiás, 2017, 32 p.
CARVALHO, D.D.C.; ALVES, E.; BATISTA, T.R.S.; CAMARGOS, R.B.;LOPES, E.A.G.L. Comparison of methodologies for conidia production byAlternaria alternata from citrus. Brazilian Journal of Microbiology, v.39,p.792-798, 2008.
GUIMARÃES, G.R.; CARVALHO, D.D.C. Incidência e caracterizaçãomorfológica de Cladosporium herbarum em feijão comum cv. ‘Pérola’.Revista Brasileira de Biociências, v.12, n.3, p.137-140, 2014.
KOBAYASTI, L.; ADORIAM, A.I.; PAIVA NETO, V.B.; ALVES, C.Z.;ZUFFO, M.C.R. Incidência de fungos em sementes de pinhão-manso.Pesquisa Agropecuária Tropical, v.41, n.3, p.385-390, 2011.
OLIVEIRA L.S.S. Agressividade de isolados de Ceratocystisfimbriata em clones de Eucalyptus spp. Viçosa: Programa de PósGraduação em Fitopatologia - Universidade Federal de Viçosa, 29 p.(Dissertação de mestrado).
REGRAS PARA ANÁLISE DE SEMENTES. Ministério da Agricultura,Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária.Mapa/ACS, Brasília, 2009, 399p.
VASCONCELOS, C.V.; SILVA, D.C.; CARVALHO, D.D.C. Ocorrência deAlternaria alternata (Fr.:Fr) Kessil. em tubérculos de batata, no Brasil.Pesquisa Agropecuária Tropical , v.44, n.2, p.219-222, 2014.
Leitura Obrigatória:
REZENDE, J.A.M.; MASSOLA JUNIOR, N.S.; BEDENDO, I.P.;KRUGNER, T.L. Conceito de doença, sintomatologia e diagnose. In:AMORIM, L.; REZENDE, J.A.M.; BERGAMIN FILHO, A. Manual deFitopatologia: Princípios e conceitos . 4ed, Piracicaba, AgronômicaCeres, v.1, 2011, p.37-60.
Este material é gratuito para download
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