PathoBasic Molekularpathologie Teil 1 · Vemurafenib (Zelboraf) B-Raf Melanoma Crizotinib (Xalkori) EML4/ALK, Met NSCLC Vandetanib (Caprelsa) EGFR, VEGFR, Ret TyroidCa mTor-Hemmer

PathoBasic

MolekularpathologieTeil 1

Michel Bihl

Plan

1- Molekularpathologie interaktiv

2- Molekularpathologie dynamisch

3- Molekularpathologie methodisch

• Sanger Sequenzierung

Molekularpathologie interaktiv

Molekularpathologie interaktiv

Martini et al. Nature Reviews Clinical Oncology 201 1

Molekularpathologie interaktiv: Kolonkarzinom

Martini et al. Nature Reviews Clinical Oncology 201 1

KRAS G13 = 10%

KR

AS

K14

6 =0

.5%

PIK3CA E545 = 5%

KRAS G12 = 30%

KRAS/BRAF/PIK3CA WT = 10-20%

KR

AS

Q61

=1%

PIK3CA H1047=3%

BRAF V600 = 5-10%

KRAS/BRAF/PIK3CA WT = 10-20%

Responder

Non-Responder

NR

AS

<1%

Molekularpathologie dynamisch

Labor-Aktivität

2005 �� Lunge �� 1 Gen (2 Exone = 8 Sequenzen)

�� Kolon �� 1 Gen (1 Exon = 4 Sequenzen)

Heute �� Lunge �� 4 Gene (9 Exone = 36 Sequenzen)

�� Kolon �� 3 Gene (8 Exone = 36 Sequenzen)

+ Translokation (FISH)

Morgen �� 1 Patient �� Gene Panel (> 20 Gene)

HS2

Folie 7

HS2 was wurde dann bei Lunge 2005 untersucht? EGFR ex19 und 21?Hoeller Sylvia; 23.06.2014

Neue Möglichkeiten durch NGS

FFPE Gewebe, Zytologie-Material ?

gDNA Gesamt RNA Ampliseq

Cancer Panel

DNA Extraktion

Amplifizierung

Kalibrierung

Sequenzierung

Analyse

RNA Extraktion

Amplifizierung

Kalibrierung

Sequenzierung

Analyse (Gen+t(:)

KIT for 46 Onkogen und

Tumor-Suppressor

PCR und Sequenzierung (Sanger oder Pyrosequenzierung)Mutationsspezifische Real-Time PCRs (Qiagen, Roche, Entrogen, etc.)PCR and High-Resolution-Melting AssayPCR, Primerextension und MALDI-TOFPCR, Primerextension und DNA-Chip Analyse (z.B. Infinity)PCR mit Mutationsanreicherung und SequenzierungPCR und Next-Generation-Sequencing (454, Illumina, IonTorrent , etc.)IHC mit mutationsspezifischen monoklonalen Antikörpern

10-20%1-15%

5-10%10%

0.1-1%10%

variabeln.a. M

inim

aler

Tum

orze

llant

eil

Mutations-Screening versus gezielte Mutationsdetektion

Untersuchungstechniken

Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Zimmermann, Zürich

Zytologie (nicht fixiert): BAL, Pleuraflüssigkeit, ZervikalabstrichDNS Extraktion: - Mikrolaser Capture (MLC)

- Abkratzen- Zentrifugation

Hämatologie: Blut, Knochenmark AspiratDNS Extraktion: - Mikrolaser Capture (MLC)

- Abkratzen- Zentrifugation

Histologie (fixiert): Biopsie, Feinnadelbiopsie, Bronchoskopie, Koloskopie

DNS Extraktion: - Mikrolaser Capture (MLC)- Abkratzen- Paraffin-Schnitt/Stanzen

Proben in der Pathologie

Molekularpathologie methodisch

Abkratzen

Stanzen


Mikrolaser Capture

1- Erhitzen (95 °C)= Denaturierung

BeginnendeDenaturierung

FortgeschritteneDenaturierung

Einzelstrang

Duplex



Fluorescently labeled DNA fragments move through a capillary .

Dideoxysequencing

Molekularpathologie methodischProblem: Heterogenität der Tumorproben

Teilweise sehr hoher Anteil nicht-mutierter Zellen (z.B. Entzündungszellen)

10 20 40 100Tumorzellanteil (%)

5 10 20 50

mut. Allelanteil (%)


BRAF Exon 15 WT


BRAF Exon 15 WT BRAF Exon 15 p.V600E


GNAS1 Exon 8 WT


GNAS1 Exon 8 WT GNAS1 Exon 8 p.R201C


CKIT Exon 9 p.A502-Y503Dup

CKIT Exon 11 WT?


CKIT Exon 9 p.A502-Y503Dup

CKIT Exon 11 p.W557-V559delinsF (homozygot!)

Vielen Dank

Molekularpathologie dynamisch

Therapeutische Antikörper

Cetuximab (Erbitux)

Trastuzumab (Herceptin)

EGFR

EGFR

ERBB2/HER-2/NEU

Panitumumab (Vectibix)

Bevacizumab (Avastin)

CRC, HNSCC

CRC

MammaCa

VEGF CRC, MammaCa, NSCLC, RCC, etc.

Ipilimumab (Yervoy) CTLA-4 Melanoma

Pertuzumab (Perjeta) ERBB2/HER-2/NEU MammaCa

Zugelassene Target-Drugs bei soliden Tumoren

Zielmolekül(e) Zieltumore

Prof. Zimmermann, Zürich

EGFR Pathway und Medikamente

Kinase-Hemmer (niedermolekulare Hemmstoffe)

Gefitinib (Iressa)EGFREGFRcKit, PDGFRImatinib (Glivec)

Erlotinib (Tarceva)

Sunitinib (Sutent) VEGFR, PDGFR, cKit, Flt3, Ret

Sorafenib (Nexavar) VEGFR, PDGFR, B-Raf, C-Raf, Flt3RCC, GIST

HCC, RCC

NSCLCNSCLCGIST, Melanoma

Lapatinib (Tyverb) EGFR, ERBB2/HER-2/NEU MammaCa

Pazopanib (Votrient) VEGFR, cKIT, PDGFR RCC

B-Raf Vemurafenib (Zelboraf) Melanoma

Crizotinib (Xalkori) EML4/ALK, Met NSCLC

Vandetanib (Caprelsa) EGFR, VEGFR, Ret TyroidCa

mTor-HemmerTemsirolimus (Torisel) mTor RCC

Everolimus (Afinitor) mTor RCC, pancreatic NET

Zielmolekül(e) Zieltumore



OS und KRAS Kodon 12/13 Mutationsstatus

Zlobec et al. 2010

Wo sind die Mutation (COSMIC ref.)

Exon 2 Exon 3 Exon 4

Kodon 1283% von mut.

Kodon 1315% von mut.

Kodon 611.68% von mut.

Kodon 1460.41% von mut.

A146T=81A146P = 5A146V = 25A146G = 1K147N = 1

Q61K = 40Q61E = 10Q61P = 12Q61R = 59Q61L = 77Q61H = 256Q61D = 1

G12S = 1359G12R = 853G12C = 3177G12N = 1G12 I = 4G12 Y = 2G12F = 50G12W = 3G12D = 9267G12A = 1484G12V = 6196G12E = 3

G13C = 230G13S = 62G13R = 47G13N = 1G13I = 1G13D = 3500G13A = 28G13V = 37G13E = 4G13N = 2

KRAS Gen

KRAS Untersuchungen

RAS und KIT Untersuchungen am Universitätsspital

Basel

2010 2011 2012 TendenzBRAF 24 41 50

BRAF-KRAS 0 5 8BRAF-NRAS 0 0 2CKIT-BRAF 0 2 6

CKIT 0 10 8CKIT-Exon17 0 12 25

CKIT-PDGFRA 70 35 30EGFR-KRAS 376 497 377

KRAS 85 89 94Mikrosatelliten 15 31 27

NRAS 0 1 4

KRAS Untersuchungen

Problem: Heterogenität der Tumorproben

Teilweise sehr hoher Anteil nicht-mutierter Zellen (z.B. Entzündungszellen)

10 20 40 100Tumorzellanteil (%)

5 10 20 50

mut. Allelanteil (%)

KRAS Untersuchungen

Tumorheterogenität

Intratumorale Heterogenität von KRAS und BRAF Mutationen in primären kolorektalen Karzinomen und korrespondierenden Metastasen

KRAS Untersuchungen

MutationsAnalyse für KRAS (Kodon 12/13) und BRAF (Kodon 600) von48 primären kolorektalen Karzinomen und 32 dazugehörendenMetastasen.

Tumorheterogenität für KRAS

PRIMARY TUMOR- KRAS METASTASIS- KRAS# 1 2 3 4 5 Result 1 2 3 4 5 Result

10 wt wt wt wt . wt G12V G12V G12V G12V G12V G12V

16 wt wt wt wt wt wt wt wt G12C wt wtwt/G12

C

18 G13C G13C G13C G13C G13C G13C wt wt wt wt wt wt

20 wt . G12D G12D G12Dwt/

G12D . G13C G13C G13C G13C G13C

21 wt wt wt wt G13Dwt/G1

3D wt wt wt wt wt wt

36 G12C G12C G12C G12C G12C G12C wt wt wt wt wt wt

37 wt wt wt wt . wt G12D G12D G12D G12D G12D G12D

KRAS Untersuchungen

MetastasePrimärtumor

KRAS Untersuchungen


KonkordanzPrimär vs Metastase

CONCORDANT

DISCORDANT

Mix an WT und MUT ?(Intratumoral)

12.5% der Primärtumore und

12.5% der Metastasenzeigten einen Mix aus

wt/mut

KRAS Untersuchungen


Heterogenität von primären vs metastasierenden CRC existiert

-> führt zu nicht korrekter Klassifizierung in >10%

Konsequenzen für die Therapie nicht bekannt

Mechanismen der Entwicklung von Tumoren mit hetero-genem Tumormarker nicht bekannt

KRAS Untersuchungen


Tumorheterogenität für BRAFPRIMARY TUMOR- BRAF METASTASIS- BRAF

# 1 2 3 4 5 Result 1 2 3 4 5 Result

12 wt wt wt wt wt wt V600E V600E V600E V600E V600E V600E

20 V600E wt wt wt wt wt/V600E wt wt wt wt wt wt

21 wt wt wt wt wt wt V600E V600E V600E V600E V600E V600E

33 V600EV600

E V600E wt . wt/V600E wt wt wt wt wt wt

Mix an WT und MUT ?Konkordanz

DISCORDANT

CONCORDANT

KRAS Untersuchungen

6,3% der Primärtumoreund 0% der Metastasenzeigten einen Mix aus

wt/mut

KRAS-Mutationsanalyse

Untersuchungsgut:- Primärtumor-Resektate- Metastasen

Formalin-fixiertes und Paraffin-eingebettetes Gewebe (auch ältere Archivblöcke).

Untersuchungsdauer:5 - 10 Arbeitstage (wird z.Z. zweimal pro Woche durchgeführt)

Kosten:DNA-Sequenzierung (Tarmed Position 37.0570) + Beurteilung (> 30 min)Total 664 Taxpunkte (1 Taxpunkt entspricht z.Z. 0.91 CHF.)

Indikation:Metastasiertes kolorektales Karzinom(metastasiertes nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom)


DNA Extraktion

Paraffin-Schnitt / Stanze

Entparaffinieren+trocknen (Speed-Vac)

Skalpeldissektion LCM

„Rohverdau“DNA-Extraktionskit

(Promega)


Beispiel einer Labororganisation

Entwicklung der Molekularpathologie

Pyrosequencing Q24

1- Seq. Primer hybridization 2- addition of dNTP, rele ase PPi

3- ATP sulfurylase converts PPi to ATP - ATP drives conversion of luciferin to oxyluciferin- production of light proportional [ATP]- The light is detected by a CCD chip and seen as a peak Pyrogram

4- apyrase degrades unincorporated dNTPs and ATP.

5- example of Pyrogram trace

Sequenzierungsmethoden

Keine Sequenzierungsfehler durch:

— Modifizierte Basen

— Fluoreszierende Basen

— Laserdetektion

— Enzymatische Amplifizierungs-

kaskaden

H+

Next Generation Sequencing (NGS)Example of Ion Torrent


Next Generation Sequencing (NGS)Example of Ion Torrent


Example für Diagnostik AmpliSeq Cancer Panel

• nur 10 ng DNA �� kompatibel mit FFPE Gewebe

• 190 Amplikons im selben Röhrchen (multiplex PCR

Assay)

• von der extrahierten DNA zum Resultat in 9.5 Stunden

• molekulare Barcodes reduzieren den Preis und

erlauben “Proben-multiplexing”

• quantifizierbare Resultate für “deep sequencing”

• detektiert Mutationen in heterogenen Proben


NGS: AmpliSeq Cancer Panel

46 Gene, 739 Mutationen

ABL1 EGFR HRAS NOTCH1 SMARCB1

AKT1 ERBB2 IDH1 NPM1 SMO

ALK ERBB4 JAK2 NRAS SRC

APC FBXW7 JAK3 PDGFRA STK11

ATM FGFR1 KDR PIK3CA TP53

BRAF FGFR2 KIT PTEN VHL

CDH1 FGFR3 KRAS PTPN11

CDKN2A FLT3 MET RB1

CSF1R GNAS MLH1 RET

CTNNB1 HNF1A MPL SMAD4


Surveyor und Sequenzierung

SURVEYOR Mutation Detection Kits


EU RAS Mutation Detection Options

Test IVD

Status

KRAS

ex2

KRAS

ex3

KRAS

ex4

NRAS

ex2

NRAS

ex3

NRAS

ex4

TBIO^ Surveyor scan KRAS (RAScan)* CE-IVD

TBIO^ Surveyor scan NRAS (RAScan)* CE-IVD

Sanger Sequencing RUO only

Qiagen therascreen KRAS RGQ PCR

Kit

PMA, CE-IVD,

IVD (Japan)

c12,6xMT

c13,1xMT

TBIO^ Surveyor scan KRAS * CE-IVD

Qiagen PyroMark KRAS CE-IVD c12,6xMT

c13,1xMT

c61, 4xMT

not c59

Qiagen PyroMark NRAS CE-IVD c12,6xMT c13,1xMT

c61, 4xMT

not c59

Randox

KRAS,BRAF,PIK3CA

CE-IVD c12,6xMT

c13,3xMT

c61, 4xMT

not c59

c146,

2xMT

NGS (LifeTech) Ampliseq Panel RUO only not c59 not c117

NGS (Illumina) TruSeq Panel RUO only

49

Green shaded panels represent exons interrogated – if alleles defined, shown in black font; specific alleles not measured shown in in red font^= Transgenomic Biotechnologies*= Requires Sanger sequencing to confirm a positive screening result (primers generate product that can be sequenced directly)


Testing Strategy Paradigms

1. Reflex approach: Conduct existing KRAS testing and for those ~60% of patients

that are wild-type, reflex to test for any exons/codons not tested

a. Reflex option, CE-IVD: Transgenomic (TBIO) RAScan (requires confirmation of MT by

Sanger sequencing, expect this to occur on average in one exon per six patients)

b. Reflex option, RUO/Laboratory Developed Test: Sanger sequencing of all exons not

tested

2. Test for all KRAS and NRAS exons in parallel:

a. CE-IVD: Transgenomic (TBIO) RAScan (requires confirmation of MT by Sanger

sequencing, expect this to occur on average in one exon for 50% of patients)

i. On average, 1 exon to be subjected to Sanger sequencing for each two patients

b. RUO/Laboratory Developed Test: Sanger Sequencing of all exons (requires 7 amplicons

to be sequenced)

i. Seven sequencing runs per patient (unless staging of exons conducted)

c. RUO/Laboratory Developed Test: Next Generation Sequencing of all exons in parallel

i. Exons tested in parallel (together with additional oncogenes) (NB: Currently LifeTech panel

missing NRAS c59 and c117; Illumina missing NRAS exon 4)

50


©Transgenomic-2013 Prepared for internal use and for European operations only 51

Surveyor Scan Analysis Results in >90% Fewer Sequencing Runs than Sanger

Alone (#’s based on replicate analyses)

Pt. Method First Results Repeats/

Patient

Repeat

Process

Repeat

Results

Total

Sequencing

Runs

$

Cost

Time

10 Sequencing

(10 samples, 7

amplicons, 2 x

bidirectional )

280 seq.

Runs

Re-

extraction

due to

insufficient

DNA

1 sample, 7

amplicons x 2

bidirectional/

re-extracted

sample

28 seq.

runs/sample

re-extracted

280 + (#

reanalyzed

patients x

28)

High ++++

Pt. Method First Results First

Results

Repeat

Process

Repeat

Results

Total

Sequencing

Runs

$

Cost

Time

10 WAVE screen

(10 samples, 7

amplicons, 2 x

SURVEYOR

Nuclease

digestion)

140 SURVEYOR

Scan Analyses:

Detects mutations

in amplicons, only 1

amplicon needs to

be sequenced per

patient

20 seq rxns

assuming

50%

negative

for KRAS

Exon 2

1 sample, 7

amplicons, 2 x

SURVEYOR

digestion.

Only positive

amplicon

sequences 2 x

bidirectional

0-4 seq.

runs/sample

re-extracted

(dependent

on KRAS

Exon2 status)

20 + (number

reanalyzed

that are not

KRAS Exon 2

mutant

positive x 4)

Low +


©Transgenomic-2013 Prepared for internal use and for European operations only 52

Features and Benefits of 551

1. Simple to use

2. Not allele-specific

3. Sensitive and specific

4. Only CE-IVD kit currently available

5. Rapid turn around time

6. Cost-effective

1. CEIVD Patients and clinicians can rely on

results from validated test

2. Highly trained personnel not needed;

assay results easy to interpret

3. Can detect all mutations in region of

interest

4. Identifies patients most likely to benefit

from panitumumab and those best

suited to alternate regimens

5. Patients can be treated in a timely

manner

6. Scanning technology identifies only those

samples that need to be sequenced

Features Benefits


Extraction Load and GoAmplification Results

Hands on Time

Process Time

Pyrosequencing: 24 samples/run< 15 min

25 min

30

230

Hands on Time

Process Time

Infinity®: 24 samples/run< 5 min

Hands on Time

Process Time

Dideoxysequencing: 192 samples/runs40 min

360 min

~35 min

< 5 min

~35 min

< 5 min

~35 min

< 5 min

~85 min< 5 min

240 min

< 5 min

~85 min2x

< 5 min

~85 min2x

1.2

9

total min/sample

15

360

0.6

15

55

565

0.3

2.9

Hands on Time

Process Time

Surveyor Detection Kit: 24 samples/runs (estimation)

45 min?

< 5 min

~35 min< 5 min

~85 min

15

165

0.6

6.88

< 5 min

Wenn mutiert, Pyroseq. : 25 min 275~85 min 11.5


Pyrosequencing INFINITI ® Dideoxysequencing

Neg0. 0154G1 3V Neg023G1 3S Neg0. 0315 5G1 3R

Neg0. 0168G1 3D Neg0. 0131G1 3C Neg07G1 3A

018 61G1 3

Neg0. 0154G1 3V Neg023G1 3S Neg0. 0315 5G1 3R

Neg0. 0168G1 3D Neg0. 0131G1 3C Neg07G1 3A

018 61G1 3

Pos0. 1574 0G1 2V Neg0. 0133G1 2S Neg0. 0169G1 2R Neg010G1 2F Neg0. 0629 0G1 2D Neg0. 0134G1 2C Neg0. 0165G1 2A

019 47G1 2

Pos0. 1574 0G1 2V Neg0. 0133G1 2S Neg0. 0169G1 2R Neg010G1 2F Neg0. 0629 0G1 2D Neg0. 0134G1 2C Neg0. 0165G1 2A

019 47G1 2

RFU rati o

G12V 15%WT

REVEAL Kit KRAS Exon 2

?

SURVEYOR Scan K-RAS


Zusammenfassung

RAS Untersuchungen besonders die KRAS Mutations-Analyse ist nötig für die Planung von vielen neuen Therapiestrategien (personalized medicine)

KRAS Mutationsanalyse muss insbesondere bei CRCmit neuen molekularen Biomarkern ergänzt werden (zusätzlich zu PIK3CA und BRAF)

KRAS Mutationen beeinflussen das Ansprechen auf Cetuximab oder Panitumumab (Martini et al.)

Unterschiedliche KRAS Mutationen beeinflussen das OS unterschiedlich (Zlobec et al.)

Vielen Dank

Documents

PathoBasic Molekularpathologie Teil 1 · Vemurafenib (Zelboraf) B-Raf Melanoma Crizotinib (Xalkori) EML4/ALK, Met NSCLC Vandetanib (Caprelsa) EGFR, VEGFR, Ret TyroidCa mTor-Hemmer