PATHOLOGIES DIGESTIVES DES VOLAILLES

Balloy Dominique

RESEAU CRISTAL, Zac de la Buzenière, 85500 Les Herbiers Résumé Ces deux dernières années, les évènements alimentaires successifs d'interdiction des farines et graisses animales ainsi que le retrait voire l'arrêt total d'utilisation des facteurs de croissance ont favorisé un climat d'instabilité digestive dans les élevages de volailles majeures (poulet, dinde) à l'origine d'une maîtrise plus difficile du problème communément appelé "litières grasses".Après une description de la prévalence des différentes pathologies digestives identifiées sur le poulet et la dinde , les différentes conséquences sont analysées ainsi que la recherche des solutions sur le terrain. Dans ce contexte, l'écart de performances se creuse entre les producteurs selon le niveau de maîtrise du problème et les basiques en élevage restent plus vrais que toujours. Introduction Ces deux dernières années, plusieurs types d'évènements alimentaires sont venus interférer dans la gestion de l'équilibre digestif des volailles. Que ce soit l'interdiction des farines de viande et des graisses végétales pour un régime végétal, la réduction des anticoccidiens utilisables, la réduction voire l'arrêt délibéré d'utilisation de facteurs de croissance ; tous ces évènements contribuent à une vigilance accrue de tous les acteurs de terrain (éleveurs, techniciens, vétérinaires et laboratoires d'analyses) devant une plus grande difficulté à gérer des pathologies digestives pour les espèces majeures que sont le poulet et la dinde. Nous décrirons tout d’abord les différentes pathologies digestives ayant fait l’objet de consultations en 2002 des laboratoires d’analyses LABOVET ( Les Herbiers et Challans en Vendée et Beaupréau dans le Maine et Loire ) . Nous passerons ensuite successivement en revue les différentes conséquences que nous avons pu observer sur le terrain ces deux dernières années et la recherche des solutions. 1. Prévalence des différentes pathologies digestives du poulet et de la dinde digestives représentent une cause de consultation majeure de nos laboratoires que ce soit pour les productions de poulet standard et label ou pour la production de dinde standard ( respectivement 48 % , 38 % et 38 % ) .( Voir tableaux 1, 2, 3 ) .

2. Conséquences sur l'équilibre digestif Les travaux des nutritionnistes pour l'amélioration de la digestibilité des substitutifs à l'emploi des farines de viande et des graisses animales sont indéniables depuis ces deux dernières années. Néanmoins, les périodes se suivent et ne se ressemblent pas où l'état des fientes peut être jugé plus ou moins humide. La meilleure façon de l'objectiver est d'utiliser un moyen simple par exemple l'ELANCOBOX. Il s'agit d'une boîte de 60 cm x 40 cm avec fond plein et couvercle grillagé. Le fond reçoit un papier buvard (renouvelable tous les jours) qui permet d'objectiver le degré d'humidité des fientes des poulets qui se seront posés sur la boîte et auront émis des déjections. Quelques élevages sentinelles peuvent ainsi permettre par organisation de suivre la digestibilité d'un aliment ou de suivre un élevage plus sensible. En effet, malgré les efforts des nutritionnistes, l'arrêt d'utilisation des facteurs de croissance a eu pour conséquence une maîtrise plus difficile de la flore de type gram positif, preuve en est l'utilisation de macrolides pour rétablir l'équilibre digestif ou l'augmentation du nombre de cas d'entérites nécrotiques par période. Sur ce dernier point, la relation avec la coccidiose n'est jamais innocente comme on peut en juger sur l'âge du pic d'apparition de la maladie chez la dinde (de 4 à 6 semaines) ou la gestion qui peut en être faite par le changement d'anticoccidien (effet anticoccidien ou effet antibactérien de certains coccidiostats du type ionophores ?) sur le poulet.

La prévalence est sous estimée pour les entérites non spécifiques et l’entérite nécrotique du fait d’un nombre important de cas faisant l’objet du diagnostic

directement en élevage sans avoir recours à l’aide du laboratoire.

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

3. Conséquences sur la maîtrise sanitaire Le risque entérite nécrotique ci-dessus cité en est un premier. Le risque histomonose avec l'arrêt du Nifursol programmé au 31 mars 2003 n'est pas à écarter. Il s'agira de prévoir, si cela n'est pas déjà fait, des vermifugations régulières sur la dinde et les productions label pour écarter les hétérakis reconnus pouvant héberger l'histomonas et lui assurer sa résistance dans le milieu extérieur des bâtiments d'élevage et parcours. Le niveau sanitaire de l'élevage risque aussi d'être un facteur de différenciation pour le risque histomonose à l'arrêt du Nifursol. Les pathologies digestives qualifiées d'entérite non spécifique sont un facteur de déséquilibre de l'organisme qui participe vraisemblablement à constituer un environnement bactérien (notamment E. Coli pathogène) plus propice à la surinfection des pathologies respiratoires d'origine virale du poulet ou de la dinde. Par ailleurs, les dégradations de litière sont reconnues comme étant la source des dégagements d'ammoniac irritants pour l'appareil respiratoire. 4. Conséquences indirectes Ce sont les conséquences des problèmes de maîtrise de la litière sur la qualité du produit :

Saisies d'animaux pour cachexie ou arthrites suite aux troubles locomoteurs particulièrement pour la dinde

Saisies pour impropreté suite à du plumage ou les tarses sales particulièrement sur le poulet voire ampoules du bréchet ou pustules sur la peau.

C'est aussi en élevage les effets du stress accentué. En effet, la démonstration a été faite depuis de nombreuses années d'un effet indirect sur la flore digestive des volailles soumises à un régime alimentaire intensif. Cet effet ne sera plus compensé en l'absence des antibiotiques régulateurs de flore. L'effet "anti-stress" absent, la maîtrise des pathologies intercurrentes devient de ce fait plus importante avec le risque d'une médicalisation accentuée des lots de volailles. 5. Conséquences sur les performances L'augmentation du rapport eau/aliment est à l'origine du problème d'élevage communément appelé "litières grasses". Pour le maintien des performances, les augmentations des charges chauffage et litière sont nécessaires. De ce fait, on observe un écart plus

important entre bonnes et mauvaises performances (intra et inter éleveurs). 6. Conséquences sur la recherche des solutions médicales Les dysbioses digestives ont plusieurs effets :

Le risque de médicalisation excessive Le manque de méthodes adoptées pour

l'analyse des troubles digestifs dans le cadre d'une antibiothérapie raisonnée

Le risque des solutions alternatives Le risque économique Le risque résidus.

Aujourd'hui, l'engouement pour les solutions alternatives par la voie alimentaire ou eau de boisson (huiles essentielles, phytothérapie …) doivent faire l'objet de sécurisation quant à leur composition (régularité des composants), l'assurance qualité de la fabrication, l'efficacité et le risque de résidus comme un médicament. Le projet européen d'AMM allégé pourra peut-être permettre d'y voir plus clair à l'avenir. 7. La recherche des solutions zootechniques Différentes solutions sont testées en élevage afin de diminuer les consommations d'eau pour une meilleure maîtrise des litières :

Innovations dans le matériel d'abreuvement Diminution du nombre de points d'eau (dinde) Diminution de la hauteur d'eau dans les

abreuvoirs (dinde) Déplacement régulier des points d'eau Contrôle des quantités d'eau consommées par

: programmes lumineux et coupures

d'eau programmes de coupures d'eau sur

électrovanne avec horloge La nécessité d'une surveillance optimale et d'un comportement animalier pour éviter les risques de tri, hétérogénéité, baisses de consommation d'aliment et les griffures (dinde) sont nécessaires. Par ailleurs, une vigilance supérieure sera demandée sur l'état des sols et le drainage des eaux de pluie. Enfin, l'optimisation chauffage – ventilation est plus que jamais nécessaire. 8. La qualité de l’eau C’est le paramètre d’élevage qui a été le plus fréquemment évoqué parmi les facteurs de risque des pathologies digestives. La plupart des chartes sanitaires ( contrat de progrès CIDEF , cahiers de charges abattoirs ) exigent une

analyse minimum par an. Le prélèvement en général effectué au point d’arrivée dans le bâtiment d’élevage est insuffisant quand un prélèvement complémentaire en bout de ligne d’abreuvement n’est pas effectué. L’utilisation de captages privés est plus importante que l’utilisation de l’eau distribuée par le réseau public. Les moyens de sanitation des captages privés qui le nécessitent sont divers ( chloration avec hypochlorite de sodium , dioxyde de chlore voire Troclosène, peroxydes d’hydrogène, iodophores, ammoniums quaternaires) . La directive Européenne annoncée est toujours attendue pour réglementer l’emploi de ces moyens de désinfection de l’eau de boisson . Quoi qu’il en soit ces moyens de sanitation manquent en général de contrôle de leur présence en continu jusqu’en bout des canalisations de distribution de l’eau dans l’élevage. L’état de propreté des canalisations interfère bien souvent sur l’efficacité des traitements désinfectants de l’eau de boisson utilisés. L’utilisation d’acides organiques en séquentiel ou en continu dans le but de la diminution du PH de l’eau pour la maîtrise des dysbioses digestives , discutable pour cet effet , a eu au moins l’intérêt en général l’amélioration de la propreté des canalisations en cours d’élevage. Le nettoyage indispensable des canalisations au vide sanitaire a généralement été pris en compte avec l’utilisation de la combinaison alcalins forts et acides forts d’origine minérale mais le manque de rinçage en volume et sous pression insuffisante peut produire des effets contraires comme l’excellente étude de Félix MAHE (GDS 22) le démontre. Quant à la qualité chimique de l’eau des captages privés , elle est bien entendue dépendante de la nature des sols dans lesquels sont pompées ces eaux fossiles avec deux types principaux ; des eaux dures avec un PH élevé dans les sous-sols calcaires et des eaux acides chargées parfois en fer ou en manganèse pour les eaux pompées dans les roches cristallines . Pour être complet , il faudrait y ajouter les eaux chargées en chlorures pour les eaux pompées dans les zones côtières. Si les effets sur la santé (notamment l’équilibre digestif) sont difficiles à objectiver , l’effet de ces diverses charges minérales sur l’état des canalisations est indéniable et favorise l’établissement d’un biofilm à l’origine d’une contamination bactériologique des eaux de boisson mis à la disposition des volailles au point de consommation qu’il s’agisse d’abreuvoirs ou de pipettes. Conclusion Les basiques en élevage sont plus vrais que toujours dans un système de production où le filet a disparu pour l'éleveur acrobate. L’éleveur devra espérer sur les efforts des nutritionnistes dans la recherche des alternatives à la disparition des additifs antibiotiques régulateurs de

flore et des anti-histomoniques et sur les efforts des laboratoires d’analyses et vétérinaires pour mieux identifier les différentes dysbioses digestives notamment celles dénommées en l’absence d’identification plus précise entérites non spécifiques. Mais en premier lieu il aura à charge d’améliorer encore plus l’état sanitaire global de son élevage qu’il s’agisse de la protection sanitaire , de la décontamination au vide sanitaire , de la gestion de l’état des litières par la maîtrise des quatre paramètres abreuvement-litière-chauffage-ventilation et de la qualité de l’eau. Références bibliographiques Félix MAHE – FDGDS 22 Etude de la variation des paramètres physico-chimiques et microbiologiques de l'eau dans les circuits de distribution en élevage de volailles et influence des moyens de traitement. Bulletin N° 47 – Avril 2002 – GDS Avicole Zoopole – Tél 02 96 01 37 00 – fax 02 96 01 37 95 – e.mail : gds22@gds22.asso.fr

TABLEAU 1 PATHOLOGIE DIGESTIVE POULETS

STANDARDS ( Source : autopsies & parasitologies LABOVET 2002)

%

812

2852

Ent érit es nonspécif iques

Ent érit e Nécrot ique

Coccidiose

Aut res pat hologies

TABLEAU 2 PATHOLOGIE DIGESTIVE POULETS LABELS ( Source : autopsies & parasitologies LABOVET 2002 )

%

6 3

26

1

2

62

Entérites nonspécifiques

Entérite Nécrotique

Coccidiose

Flagellés

Parasites ( Ascaris ,Capillaires , Hétérakis )

Autres pathologies

TABLEAU 3 PATHOLOGIE DIGESTIVE DINDES STANDARDS

( Source : autopsies & parasitologies LABOVET 2002 )

%

126

12

2

24

62

Ent ér it es nonspécif iques

Ent ér it e Nécrot ique

Coccidiose

Flagellés

Ascaris

Ent ér it e hémorragique

Aut res pat hologies

ESTIMATION DE LA SENSIBILITE DES SOUCHES DE E. COLI A L’ASSOCIATION TRIMETHOPRIME – SULFADIMETHOXINE PAR L’UTILISATION D’UN DISQUE TMP/SULFAMETHOXAZOLE 19/1 EN ANTIBIOGRAMME EN MILIEU GELOSE.

Gavaret Thierry 1, Marcelot Nathalie²

1 Cabinet Vétérinaire - 53 Rte de Nantes, 85300 Challans

2 Laboratoire COOPHAVET - Saint-Herblon, 44513 Ancenis

Résumé L’étude compare, sur un échantillonnage de 28 souches de E coli, la valeur de la CMI estimée en milieu gélosé par les techniques de routine à celle mesurée en milieu liquide avec une solution titrée de TMP – sulfadiméthoxine. Introduction L’association Trimethoprime (TMP) - sulfadiméthoxine est souvent prescrite en médecine vétérinaire. Des résistances à cette association antibiotique sont parfois rencontrées parmi des populations de E.coli. La méthode de mesure de la sensibilité habituellement pratiquée par le laboratoire de diagnostic est un antibiogramme réalisé en milieu gélosé avec mesure du diamètre d’inhibition et estimation de la CMI. Il n’existe pas de disques imprégnés avec l’association TMP-sulfadiméthoxine. Les tests étant réalisés avec un disque imprégné de TMP + sulfaméthoxazole, il nous a paru intéressant de comparer, sur un échantillonnage de souches, la valeur de la CMI estimée en milieu gélosé à celle mesurée en milieu liquide avec une solution titrée de TMP - sulfadiméthoxine.

Après incubation pendant 2 heures à 37°C, une dilution 70 µl dans 3 ml d’eau physiologique est effectuée. 1.1.2. Ensemencement On ensemence sur milieu Mueller Hinton par inondation de la gélose avec les 3 ml d’inoculum, égouttage et élimination de l’excédant puis, répartition des disques. Pour la mesure de sensibilité, le disque utilisé est un disque TMP-sulfaméthoxazole dans les proportions 1/19 fourni par la société BIORAD. La charge du disque est 25 µg (soit 1,25 µg de TMP et 23,75 µg de sulfamethoxazole). On laisse diffuser l’antibiotique pendant 30 mn, puis incubation pendant 24 h à 37°C. 1.1.3. Lecture et mesure de la CMI Les diamètres d’inhibition sont mesurés au pied à coulisse électronique lors de la lecture des antibiogrammes. Une traduction des diamètres en CMI est faite par informatique (Logiciel Toucan version 6.0 BIORAD). L’équation utilisée par ce logiciel pour cette correspondance est représentée graphiquement sur la figure 1. Cette mesure de CMI n’est donc qu’une indication.

1. Matériels et méthodes Les observations faites sont basées sur les résultats des analyses réalisées par le laboratoire de biologie vétérinaire LABOVET, situé en Vendée (85) FRANCE. De nombreuses souches de E. coli ont été isolées (en aviculture et en porcs) au cours de l’année 2000. 28 ont été testées (Tableau 1) afin de comparer les résultats de CMI en milieu gélosé à celles obtenues en milieu liquide.

1.2. Mesure des CMI en milieu liquide 1.2.1. Principe On ensemence faiblement des bouillons avec une souche bactérienne contenant une concentration décroissante de l’antibiotique dont on veut étudier l’effet. Après 24 H d’incubation, on détermine la CMI comme étant la quantité la plus faible d’antibiotique produisant une inhibition de la croissance bactérienne (absence de trouble).

Les techniques d’ensemencement, d’isolement, d’identification et de réalisation des antibiogrammes sont les techniques habituelles de la bactériologie. 1.1. Antibiogrammes en milieu gélosé 1.2.2. Réalisation de l’inoculum On prélève une colonie sur culture pure, après

identification, puis on ensemence en bouillon nutritif ordinaire (BNO).

1.1.1 Réalisation de l’inoculum Une colonie est prélevée sur culture pure après identification, puis ensemencée en bouillon nutritif ordinaire (BNO) afin d'obtenir un inoculum calibré.

Après incubation pendant 24 heures à 37°C, on opère une 1ère dilution en eau physiologique afin d’obtenir

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

une opacité de Mac Farland de 0,5 (soit 1 goutte de bouillon dans 3 ml d’eau physiologique). On opère une 2ème dilution au 1/500 ème en bouillon Mueller Hinton, soit 22 µl pour 11 ml. 1.2.3. Préparation de l’antibiotique L’antibiotique est dilué dans du bouillon Mueller Hinton à partir d’une solution mère titrant 6,4 mg/ml obtenu par mélange des 2 principes actifs dans les proportions du TRISULMIX à savoir TMP : 4g/ml ; sulfadiméthoxine sodique : 20 g/ml. Une gamme de 10 concentrations décroissantes de demi en demi est réalisée. 1.2.4. Ensemencement - Incubation On réalise une galerie de 11 tubes, en mélangeant 1 ml d’inoculum à 1 ml de solution antibiotique. Le 11ème tube ne contient pas d’antibiotique et sert de témoin. Les concentrations finales s’étalent de 32 µg/ml à 0,0625 µg / ml. On laisse incuber 24 heures à 37°C. 1.2.5. Lecture Observation du tube témoin. La présence de trouble valide la galerie. La CMI est la concentration du dernier tube dans lequel on n’observe pas de trouble, la lecture se faisant dans l’ordre décroissant des concentrations.

2. Résultats Comparaison CMI milieu gélosé / milieu liquide : Le Tableau 1 présente les résultats des CMI. Une ligne correspond à une même souche. Les deux dernières colonnes indiquent le typage du colibacille et l’espèce sur laquelle il a été isolé. La corrélation entre les mesures des CMI faites en milieu liquide ou gélosé est bonne avec un coefficient de corrélation r² de 0,69. La figure 5 montre que cette corrélation non-parfaite n’est pas le fruit d’une imprécision des mesures mais est due à 3 souches dont la sensibilité à l’association TMP/sulfadiméthoxine 5/1 est plus grande que celle à l’association TMP/sulfamethoxazole 19/1. Si on retire de l’étude les 3 souches en question, la corrélation est excellente avec r²=0,99.

3. Analyse et discussion Comparaison CMI milieu gélosé / milieu liquide :Les Figures 5 et 6 ont montré que la corrélation entre les mesures des CMI faites en milieu liquide ou gélosé est bonne (r² de 0,69) et même excellente (r²=0,99) lorsque l’on retire de l’étude les 3 souches dont la sensibilité à l‘association TMP/sulfadiméthoxine 5/1 est plus grande que celle à l’association TMP/sulfamethoxazole 19/1. La sensibilité de certaines souches est donc sous estimée par la technique habituelle des antibiogrammes en milieu gélosé. Ces trois souches ont été testées vis à vis de leur sensibilité au TMP seul (il n’existe pas de disque sulfadiméthoxine seule). Elles présentaient toutes une bonne sensibilité à cette molécule. Le fait que la proportion de TMP dans la solution soit plus importante que dans les disques d’antibiogramme peut être une explication à cette observation. Conclusion Cette étude permet de valider l’utilisation d’un disque TMP/sulfamethoxazole 19/1 en antibiogramme en milieu gélosé pour l’estimation de la sensibilité des souches de E. coli à une association TMP sulfadiméthoxine en proportion 5/1, tout en sachant que la sensibilité de certaines souches sera sous-estimée. Références bibliographiques BALLOY, 11th European Symposium on Waterfowl, Nantes, Sept 8-10, 1997 J. LECOANETt, Colibacilloses Aviaires in Manuel de Pathologie Aviaire, 1992 Sulfonamides and Sulfonamide combinations, 1998, in The Merck Veterinary Manual, 8th ed., pp 1765- 1771. CLOUD et coll. In vitro and in vivo characterization of avian Escherichia coli. I. serotypes, metabolic activity and antibiotic sensitivity. Avian Diseases, 1985, 29, 4, 1084-1093. BRANDT et MAESTRONE Therapeutic efficacy of Sulfadimethoxine and Ormethoprim in the treatment of porcine colibacillosis. Proceedings of the International Pig Veterinary Society Congress, 1980, 170.

FIGURE 1 : Correspondance entre le diamètre d’inhibition et la CMI estimée pour l’association sulfadimétoxazole TMP utilisée par le logigiel TOUCAN version 6.0 BIORAD ND

y = 80,784e -0,231x R2 = 0,9983

0,01

0,1

1

10

100

0 5 10 15 20 25 30 35 Diamètre d'inhibition (mm)

CMI (mg/l)

FIGURE 2 : Corrélation des CMI en milieu liquide et en milieu gélosé

R2 = 0,687

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25

CMI milieu gélosé mg/l

CMI milieu liquide mg/l

2 points

FIGURE 3 : Comparaison des CMI liquide et en milieu gélosé

R2 =

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25

CMI milieu gélosé mg/l

CMI milieu liquide mg/l

TABLEAU 1

Souche CMI gélose CMI liquide Sérotypage Espèce

1 0,16 0,5 O78K80 Poules 2 0,25 1 O78K80 Poules 3 0,31 1 Négative Poules 4 0,13 2 O2 Canards 5 0,8 2 Négative Poules 6 4 4 O78K80 Poules 7 2 4 O78K80 dindes 8 4 8 O78K80 Poules 9 8 8 O78K80 Poules

10 20 2 O78K80 Poules 11 20 32 Négative oies 12 20 32 O78K80 Poules 13 20 32 O2 dindes 14 20 32 O78K80 Poules 15 13 1 O78K80 Poules 16 20 2 O78K80 Poules 17 20 32 Négative Porcs 18 1 4 Négative Porcs 19 20 32 K88 Porcs 20 20 32 O10KV50 Porcs 21 20 32 O35KV79 Porcs 22 20 32 O35KV79 Porcs 23 0,16 1 autre Porcs 24 0,1 2 O115KV165 Porcs 25 0,31 2 Négative Porcs 26 20 32 O35KV79 Porcs 27 20 32 O35KV79 Porcs 28 20 32 Négative Porcs

UTILISATION DE L’ELANCOBOX CHEZ LE POULET COMME OUTIL DE DIAGNOSTIC PRECOCE DES ENTERITES – BILAN ET PERSPECTIVES

Bostvironnois Christophe

LILLY France département ELANCO, 13 rue Pagès, 92158 Suresnes Cedex

Résumé L’ELANCOBOX est un nouvel outil de détection précoce des entérites chez le poulet de chair développé par ELANCO. Il permet grâce à un papier absorbant spécial placé sous une boîte munie d’un caillebotis de récupérer les fientes en élevage de poulet de chair. L’humidité des fientes peut être visualisée par la présence d’un diamètre d’humidité présent sous les fientes. Ce procédé mis en place dans une organisation a permis de valider la relation entre le degré d’humidité des fientes et la clinique observée dans l’élevage. Il s’est avéré qu’en dessous de 20% de fientes humides, dans 95% des cas il n’y avait pas de problème de litière dans l’élevage ; qu’au-delà de 50% de fientes humides pendant deux jours consécutifs, dans 100% des cas l’élevage était en voie de développer un syndrome entéritique ; entre les deux, il n’était pas possible de conclure et il fallait poursuivre la notation et le suivi avec l’ELANCOBOX. Introduction L’Elancobox permet d’estimer le degré d’humidité des fientes de poulet de chair. La mise en place des boîtes de diagnostic dans une importante organisation a permis de visualiser l’importance du score et de valider la relation entre la qualité des litières et le pourcentage de fientes humides révélé par la boîte. 1.Matériels et méthodes 1.1. Matériels L’Elancobox est constituée d’une boîte de 60 cm x 40 cm et d’une quinzaine de cm de haut munie en son sommet d’un caillebotis permettant aux fientes de passer au travers. L’originalité du système réside dans un papier absorbant spécial quadrillé que l’on place sous la boîte et qui permet de recueillir les fientes des poulets qui sont montés sur la boîte. Pour les y aider, il est possible d’y ajouter des petites passerelles latérales pour les oiseaux dans le jeune âge (photos 1 et 2). L’ELANCOBOX est en général placée au centre de l’élevage dans une zone éloignée de l’entrée du bâtiment, loin des chaînes d’abreuvement, d’alimentation et de zones de condensation ; elle est idéalement placée dans une zone de passage des oiseaux.

1.2. Lecture des résultats Le critère de jugement d’une fiente humide est défini par l’auréole d’humidité qui apparaît autour de la fiente : si cette auréole est inférieure à 0,5 cm alors la fiente est normale, sinon celle-ci est jugée comme étant humide. Au terme du comptage, il est donc possible de définir quotidiennement un pourcentage de fientes humides. Ce pourcentage sera traduit ensuite chaque jour en score de fiente quotidien (SFQ) selon la règle : SFQ = % de fientes humides/100 Ex : 34% de fientes humides = Score de fiente de 0,34 (SFQ). L’objectif est de recueillir entre 10 et 20 fientes intestinales (les fientes cæcales ne sont pas retenues dans le comptage) : ceci peut être obtenu en général entre deux et trois heures de présence de la boîte dans l’élevage quand les oiseaux y sont habitués. De la même façon, les fientes qui seraient tombées au même endroit et qui ne seraient pas dissociables sont exclues du comptage. Le papier est changé tous les jours et la lecture se fait quotidiennement afin de préserver la réactivité du système et la fiabilité des relevés. 1.3. Elevages enquêtés Chaque élevage a été vu individuellement afin d’harmoniser les notations entre les différents intervenants.

Près de 170 élevages ont ainsi été classés selon la note moyenne la plus élevée sur deux jours consécutifs observée dans chacun des sites. Chaque élevage a été classé, grâce à un guide de jugement de la qualité des litières (Tableau 2), dans la catégorie « affecté » par un problème de litière ou « non affecté » par un problème de litière si celle-ci n’était pas apparue dégradée pendant plus de deux jours consécutifs au cours de la bande. 2. Résultats Dans l’objectif de cette manipulation, à chaque élevage a été attribué un score de fiente maximum (SFMax) arrondi à la première décimale, égal à la moyenne des plus hauts scores de fientes humides (SFQ) obtenu sur deux jours consécutifs. Les sites étaient classés « affectés » ou « non affectés » par l’éleveur s’il constatait une dégradation de la litière durant deux jours ou plus au cours de la bande, selon le guide fourni (Tableau 2) Pour chaque score (SFMax), le nombre d’élevage « affecté » ou « non affecté » a été relevé. Les résultats figurent sur le Tableau 1. Les informations ont été analysées et traitées statistiquement en utilisant le logiciel Win Episcope 2.0 nd. Cette étude statistique a montré qu’un score (SFMax) inférieur à 0,2 (maximum de 20% de fientes humides deux jours consécutifs au cours de la bande) donne dans 95% des cas une indication d’absence de syndrome digestif et de dégradation de litière, par contre un score (SFMax) supérieur à 0,5 (plus de 50% de fientes humides deux jours consécutifs) révèle dans 100% des cas une relation positive avec la présence de litière humide dans l’élevage. 3. Discussion et conclusions La présence d’une flore digestive anormale quantitativement ou qualitativement dans l’intestin grêle (dysbactériose) peut causer une diarrhée, un syndrome malabsorption et des fientes humides ce qui conduira à l’apparition d’une litière humide secondaire. L’origine de ce dérèglement digestif peut être multiple : bactérien, viral, parasitaire, nutritionnel, lié aux conditions et/ou à la technique d’élevage.

Un guide décisionnel a ainsi pu être établi :

1. Calculer le pourcentage de fientes humides tous les jours pendant deux à trois heures de mise en place de l’ELANCOBOX afin d’obtenir entre 10 et 20 fientes intestinales individualisables et interprétables.

2. Si le pourcentage de fientes humides est inférieur à 20% il n’y a aucun risque de litière humide dans l’élevage.

3. Si le pourcentage de fientes humides est supérieur à 50% pendant deux jours consécutifs ou plus alors la litière risque de devenir humide et une intervention immédiate sur le lot est à envisager.

4. Entre 20 et 50 %, il n’est pas possible de conclure et il est nécessaire de suivre ce comptage dans les jours suivants afin de surveiller toute augmentation du pourcentage.

Nos connaissances actuelles montrent que l’ELANCOBOX est un nouvel outil de diagnostic qui est un moyen d’objectiver, de quantifier, de visualiser dans le temps la qualité des fientes et permet ainsi de mettre en relation précocement une dégradation de litière avec une augmentation de l’humidité des fientes. Des perspectives de développement de la technique sont en cours soit dans le cadre d’une surveillance globale au sein d’une organisation de production, soit sur d’autres espèces de volailles. Références bibliographiques Mortimer, I. The detection of dysbacteriosis. Proceedings of ELANCO Symposium, Cambridge 2002. Panneman, H. Clostridial enteritis/dysbacteriosis. Fast diagnosis by T-RLFP, a novel diagnostic tool. Proceedings of ELANCO Symposium, Montreal 2000. Van der Strom, J. Geelen J Pipers A, Mal-digested feces in relation to intestinal aspecific bacterial overgrowth in broilers. In press.

TABLEAU 1 : Répartition des élevages « affectés » et « non affectés »

Score des fientes (SFMax) Nb d'élevage "affecté" Nb d'élevage "non affecté"0 0 180,1 0 220,2 5 290,3 26 190,4 22 30,5 11 00,6 4 00,7 6 00,8 3 00,9 2 01 0 0

Total 79 91

TABLEAU 2 : Notation de l’évolution de la litière

Critères d’interprétation de la litière

Note de litière Interprétation

Excellente 1 Elevage « non affecté » Croûtée au niveau des points

d'abreuvement 2 Elevage « non affecté »

Croûtée sous tout le matériel 3 Elevage « non affecté » Croûtée même au centre 4

Dégradation générale de la litière, litière humide

5 Elevage « affecté » si note 4 ou 5 deux jours consécutifs ou plus

au cours de la bande

PHOTO 1 : : ELANCOBOX en élevage

PHOTO 2 : ELANCOBOX en élevage

LA DECONTAMINATION : METHODOLOGIE POUR COMPARER L’ACTIVITE DE DIFFERENTS DESINFECTANTS SUR CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

Léorat Jean1, Martin Damien2

1 Groupe Chéne-vert ; 2 Bio-Chêne-Vert, ZI de Bellevue 2, 35220 Chateaubourg

Résumé La désinfection du sol est probablement l’étape clé dans la décontamination d’un élevage de volailles. Afin de comparer l’activité désinfectante de 6 produits déjà utilisés sur le terrain, nous avons élaboré un protocole par rapport à la destruction des spores de Clostridium perfringens. Les dénombrements de spores de Clostridium perfringens ont eu lieu avant et après application du désinfectant sur le sol. La profondeur de pénétration du désinfectant a aussi été mesurée. Il en ressort qu’aucun produit ne permet une excellente décontamination en surface et en profondeur. Le protocole proposé pour décontaminer efficacement le sol est une première application de Soli K suivi d’un épandage de chaux vive (500kg / 1000m²) éteinte par 500 litres d’eau pour 1000m². Introduction Le sol des bâtiments de volailles en France est majoritairement constitué de terre battue, plus ou moins compactée et perméable en fonction de la nature des matériaux (roche, sol argileux) et de son compactage. Ces sols ont pour effet une meilleure qualité d’ambiance (moins d’ammoniac) (Réf. Influence du type de sol sur les performances des poulets, la gestion de l’ambiance et l’aptitude à la décontamination du poulailler, 4e journées de la Recherche Avicole, Nantes, Mars 2001, Valancony et ass.) Mais leur aptitude à obtenir une surface propre et décontaminée après les différentes étapes de nettoyage/désinfection est plus délicate. Depuis 3 ans, l’entérite nécrotique en volailles de chair est devenu la pathologie digestive la plus présente. Clostridium perfringens, agent de l’entérite nécrotique est une bactérie anaérobie sulfito-réductrice à pouvoir sporulant. Cette forme de résistance dans le milieu extérieur et la multiplication intense de la bactérie dans le tube digestif des volailles fait que le principal réservoir de Clostridium perfringens est le sol des bâtiments d’élevage. Il convenait alors d’établir une méthode pour comparer objectivement les qualités décontaminantes des désinfectants utilisés couramment en élevage. 1. Matériels et méthodes 1.1. Choix du sol et de l’élevage L’élevage est composé de 5 bâtiments dont un de 800 m². Les 2 derniers lots de volailles étaient des poulets ayant subi un passage d’entérite nécrotique de faible intensité. Ceci a permis de prédire une contamination

relativement élevée du sol. Le sol est de nature argileuse, très bien compactée avec de la chaux. De consistance très dure, le sol est plat : on observe très peu de relief (dépression et bosse). Le sol est balayé mécaniquement (le résultat était excellent car nous n’avons pu observer que quelques rares traces de fumier). 1.2. Choix des désinfectants Les désinfectants (Tableau 1) testés ont été choisis en fonction :

- de leur commodité d’utilisation - de leur pouvoir théorique bactéricide et

sporicide - de la nature de leur principe actif - de leur utilisation sur le terrain - de leur pouvoir mouillant

1.3. Application des désinfectants Pour chaque désinfectant, 1 carré de 1 mètre de côté est délimité par des baguettes en bois. Les produits C et E sont appliqués par saupoudrage puis pulvérisation de 0,5 L d’eau . Les produits A, B, D et F sont mélangés à 0,5 L d’eau puis pulvérisation sur le sol à basse pression avec un pulvérisateur de jardin. L’emplacement des prélèvements (Figure 1) est éloigné d’un mètre du bord (afin d’éviter une trop grande variabilité de contamination). Les carrés sont espacés de quelques centimètres afin d’éviter tout risque de mélange de désinfectants.

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

1.4. Prélèvements Avec :

N :nombre de colonies de Clostridium perfringens C : somme des colonies comptées sur les deux tubes retenus de deux dilutions successives,

Dans chaque carré de 1 m², on effectue à l’aide d’une spatule de 10 cm de section, 10 prélèvements de terre sur une surface de 100 cm² (10 cm x 10 cm) et sur une profondeur de 2 à 3 mm (en fonction de la dureté du sol). Ces prélèvements ont lieu juste avant la décontamination (prélèvement noté T) et 24 heures après la décontamination.

V : volume de l’inoculum (1 ml) n : nombre de tubes de chaque dilution (1 ou 2) d : taux de dilution de la première dilution retenue Ici, il y a un tube par dilution, donc la formule va être :

Figure 1 : Emplacements des prélèvements avant et

aprés le traitement au sein d’un carré.

La disposition des 10 prélèvements témoins de 100 cm² dans le cadre de 1 m² est aléatoire mais :

- on prend garde à les réaliser de façon représentative de toute la surface.

Nous avons recommencé plusieurs fois certains dénombrements car nous n’avions pas de résultats. Le poids de terre au départ est égal à la somme du contenu et le nombre de fois où 30 g de terre ont été prélevés pour chaque manipulation.

- les prélèvements de terre après application du désinfectant ont lieu juste à côté des carrés témoins avant désinfection.

La lame de la spatule est nettoyée, stérilisée au chalumeau puis refroidie avant chaque prélèvement.

Exemple : pour TC4 : poids au départ 125,02 g ; son contenu est 65,02 g. La différence est de 60 g, nous avons pris 2 fois 30 g de terre.

Les 10 prélèvements de chaque carré, avant et après désinfection, sont regroupés dans un pot stérile et identifiés :

Le poids total par produit est l’addition des quatre prélèvements de ce produit. Ces calculs ont été faits pour pouvoir exprimer les résultats en nombre de germes par unité de surface. Ensuite, les résultats vont être ramenés en nombre de germes par dm², connaissant le poids de chacun des échantillons et la surface prélevée.

- Avant traitement : TA (1 à 4), TB (1 à 4), TC (1 à 4), etc.

- Après traitement : A (1 à 4), B (1 à 4), etc.

Nous disposons alors de 24 flacons témoins et 24 flacons post-désinfections représentant au total 480 prélèvements. 1.5. Dénombrement des bactéries Anaérobies Sulfito-Réductrices

1.6.2. Nombre de micro-organismes par dm² Les prélèvements des produits C après traitement, non dénombrés car inférieurs au seuil de détection (10 germes/10cm² de sol), ont été arbitrairement affectés de la valeur 5.

La terre de chaque flacon est fractionnée et mélangée pour assurer une meilleure homogénéité de l’échantillon. Pour chaque flacon, 30 g de terre sont prélevés. Lors des manipulation, aucun neutralisant de désinfectant n’a été utilisé car les mises en culture ont été réalisées dans les 3 semaines suivant les prélèvements et les différences d’efficacité des neutralisants auraient pu engendrer une discordance dans les résultats. Après ajout de 270ml d’eau peptonée et homogénéisation , le surnageant est prélevé. Des dilutions sériées sont effectuées de 10-1 à 10-5. Après ensemencement sur gélose TSN à raison un tube par dilution, les souches sont identifiées et dénombrées pour ne compter que les anaérobies sulfito-réducteurs.

« Le nombre de Clostridium perfringens par quantité de terre prélevée » est le produit de « Nombre de C1ostridium perfrigens par gramme de terre » multiplié par « la quantité totale de terre prélevée ». « N/dm² » est le quotient du « nombre de C1ostridium perfringens par quantité de terre prélevée » divisé par 40 (4 coins du bâtiment fois 10 prises d’essai). Tableau 2 : Dénombrements de bactéries anaérobies sulfito-réductrices 1.7. Pénétrations des désinfectants dans le sol

1.6. Expression des résultats Tous les produits ont été appliqués, additionnés de 500 ml d’eau par m².

1.6.1. La moyenne pondérée Nous avons apprécié : La formule de la moyenne pondérée est : 1) la vitesse de pénétration Somme des C 2) l’absence de ruissellement N=

V (n1 + 0.1n2) d 3) la profondeur de pénétration dans le sol (en mm)

C N = 1.1d

Tableau 4 : Pénétration des désinfectants dans le sol. Synthèse des résultats : - excellente activité bactéricide de la chaux vive

(produit C) : 98% de réduction La vitesse de pénétration dans le sol est une appréciation permettant d’évaluer si la solution pulvérisée est rapidement absorbée par le sol :

- résultats de bactéricidie très bons et assez comparables des produits A, B, D et F

-la note « 0 » est un standard - des capacités mouillantes et donc pénétrantes -la note «- »signifie que la solution a mis du temps pour être absorbée

- aucune pénétration de la chaux vive - excellente pénétration du produit F (SOLI-K®)

-la note «+ »signifie que la solution a été trés rapidement absorbée

- des coûts des produits au m² (meilleures avec le produit F)

- de la commodité d’application de ces produits. L’absence de ruissellement caractérise le pouvoir mouillant de la solution et si l’eau est bien absorbée et ne reste pas en surface :

Le protocole proposé de décontamination d’un sol est (pour une surface de 100 m²) :

-la note « 0 » est un standard -la note «- »signifie que la solution a tendance à ruisseler et qu’il a fallu attendre quelques minutes pour pulvériser toute la solution

1/ mélanger 5 kg de SOLI-K® dans 50 litres d’eau 2/ Pulvériser 3/ Laisser agir :

-la note «+ »signifie qu’aucun ruissellement n’est observé

24 heures par temps humide 12 heures par temps sec

4/ Epandre 50 kg de chaux vive La profondeur de pénétration dans le sol est appréciée en réalisant des mesures de la zone de terre humide en surface, sachant que le sol était parfaitement sec avant l’expérience. Pour chaque produit, nous avons réalisé 20 mesures (5 mesures par secteur fois 4 secteurs ).

5/ Arroser de 50 litres d’eau (30 à 100 litres en fonction de l’hygrométrie) Ce protocole est proposé à partir des résultats obtenus dans cette étude dans l’objectif d’effectuer une désinfection en profondeur (quelques millimétres avec l’application de SOLI-K® ) et une désinfection de surface avec la chaux vive.

2. Résultats Afin de pouvoir comparer le pouvoir désinfectant des produits, nous déterminons un coefficient de réduction :

Limites de l’étude : Cette étude a été réalisée avec un nombre limité de produits.

- par gramme de terre Afin d’être plus significatifs, ces tests devraient être à nouveau réalisés : - par dm² de terre

Cf. Tableau 3 : Coefficients de réduction bactériens - sans regrouper les échantillons afin de pouvoir réaliser des tests statistiques

Ces 2 éléments sont intéressants car on peut estimer que les ASR (Anaérobies Sulfito-Réductrices) sont majoritairement posés sur la surface de la terre mais aussi que le pouvoir mouillant et pénétrant du produit est un critère d’appréciation important.

- dans les mêmes conditions - avec d’autres bactéries ou parasites (ookystes)

- sur d’autres natures du sol - en testant d’autres molécules et d’autres associations de produits

Le poids total par produit varie beaucoup. Quelques difficultés ont été rencontrées lors de la récolte de la terre car elle était très sèche. Après la diffusion des désinfectants, la terre était plus humide, rendant les prélèvements plus faciles.

Nous nous sommes limités à Clostridium perfringens, agent de l’entérite nécrotique car cette pathologie est aujourd’hui très présente dans les élevages de volailles.

Références bibliographiques 3. Conclusion Valancony et ass.,4éme journée de la recherche

avicole, Nantes, mars 2001,Influence du type de sol sur les performances des poulets, la gestion de l’ambiance et l’aptitude à la décontamination du poulailler.

Ces tests (480 prélèvements de terrain, environ 420 ensemencements car certains ont été réalisés plusieurs fois, identifications, dénombrements), permettent d’établir une base chiffrée pour comparer l’activité de différents désinfectants du sol.

TABLEAU 1 : Les désinfectants

Code Principe Actif Quantité / m² (+ 0,5 L d’eau)

Présentation

Produit A Chloramine 5 g Poudre

Produit B Phenol 100 ml Liquide

Produit C Chaux vive 500 g Poudre

Produit D Hydroxyde de sodium Hydroxyde de potassium

100 ml Liquide

Produit E Hydroxyde de sodium 100 g Poudre

Produit F (SOLI-K®)

Hydroxyde de sodium Hydroxyde de potassium Mouillants et séquestrants

50 ml liquide

TABLEAU 2 : Dénombrement de bactéries Anaérobies Sulfito-réductrices

Avant traitement Après traitement

Produit Moyenne / essai (N de

Cl p / g)

Quantité totale de terre

prélevée en g

Nbre de Cl p / Quantité de

terre prélevéeN / dm2

Moyenne / essai (N de

Cl p / g)

Quantité totale de terre prélevée

Nbre de Cl p/ Quantité de

terre prélevéeN /dm2

A 626 667,81 418049 10451 68 404,91 27534 688 B 1173 405,39 475421 11888 184 444,13 81720 2043 C 209 468,98 98017 2450 5 390,14 1951 49 D 129 335,36 43261 1081 15 347,77 5217 130 E 128 300,08 38410 960 29 436,7 12664 317 F 1060 446,06 472824 11821 134 490,03 65664 1642

TABLEAU 3: Coefficients de réduction bactérienne

Produit Coefficient

1 - (N aprés / N avant) avec N / gr

Coefficient 1 - (N aprés / N avant) avec N /

dm2

A 0,89 0,93 B 0,84 0,83 C 0,98 0,98 D 0,88 0,88 E 0,77 0,67 F 0,87 0,86

TABLEAU 4 : Pénétration des désinfectants dans le sol

Produit Vitesse de pénétration

Absence de ruissellement

Profondeur de pénétration dans le sol (en mm) Remarques

A 0 - 1 à 2 mm

B - -- 1 à 2 mm Pulvérisation lente pour permettre l’absorption

C +++ +++ 0 mm Absorption totale de l’eau par la chaux vive. Le sol est resté sec.

D + + 2 à 3 mm

E + + 1 à 2 mm

F +++ +++ 4 à 5 mm Absorption de la solution désinfectante par le sol au fur et à mesure de son application.

FIGURE 1 : Emplacements des prélèvements avant le traitement

TF2 TE2 TA2 TB2 TC2 TD2

TF3 TE3 TD3 TA3 TC3 TB3 TF4 TE4 TD4 TC4 TB4 TA4

TF1 TE1 TD1 TC1 TB1 TA1

FIGURE 2 : Différentes prises d’essai avant et après traitement

54

321

6 7

98 10

Avant traitement

Après traitement

PRESENTATION D'UN MODELE PERMETTANT DE DETERMINER LA DATE DE VACCINATION CONTRE LA MALADIE DE GUMBORO DU POULET DE CHAIR UTILISANT UN VACCIN

VIVANT A SOUCHE « INTERMEDIAIRE »

Lemière Stéphane

Laboratoire Merial, Antenne aviaire et cunicole, Saint-Herblon 44153 Ancenis Résumé L’objectif de l’étude est de vérifier expérimentalement chez le poulet standard et le poulet label si les dates cibles de vaccination contre la maladie de Gumboro, recommandées par le fabricant pour un vaccin à souche intermédiaire, sont bien adaptées. La vérification consiste à déterminer les titres ELISA moyens, minima et maxima des anticorps d’origine maternelle anti-Gumboro autour de J1 puis d’en déduire, à partir d’abaques de décroissance de ces taux d’anticorps, la date cible de vaccination à encadrer. Les élevages recrutés pour l'étude proviennent de différentes régions de production avicole en France. Aucun critère de recrutement n'est proposé si ce n'est la prescription par le vétérinaire traitant du vaccin Gumboro produit par le laboratoire Merial. La date cible recommandée de J14 pour le poulet standard correspond parfaitement au résultat expérimental obtenu dans les conditions du terrain de J15+/-0,5 jours (95% des valeurs moyennes comprises dans cet intervalle.) Chez le poulet label la recommandation de vaccination aux dates de J21 et J28 seront révisées pour mieux correspondre au résultat expérimental et seront J20 et J24 correspondant respectivement aux résultats de J20+/-0,6 et de J24+/-0,6 (95% des valeurs moyennes comprises dans cet intervalle.) Néanmoins en l'absence de données historiques en sérologie Gumboro sur un site de production il sera recommandé d'établir vers J1 (entre J1 et J3) un diagnostic sérologique afin de contrôler le statut immunitaire des poussins mis en place. Introduction La maladie de Gumboro est une maladie virale du poulet due à un Birnavirus. Il s'agit d'un virus à ARN double brin non enveloppé d'un diamètre d'environ 60 nm. On décrit deux sérotypes de Birnavirus, le sérotype 1 et le sérotype 2. Le pouvoir pathogène des virus est éminemment variable. Ce virus omniprésent est très persistant dans le milieu extérieur des volailles. Il est très résistant aux agents physiques (pH extrêmes, température élevée, etc…) et chimiques (désinfectants usuels non virucides.) Le virus se transmet par voie orale et se multiplie in vivo dans les organes lymphoïdes du poulet, notamment la bourse de Fabricius, source des lymphocytes B chez les oiseaux. Les lymphocytes B sont les cellules effectrices de l'immunité à médiation humorale et sont les cellules souches des plasmocytes producteurs d'anticorps. La maladie de Gumboro se manifeste cliniquement suivant deux formes et selon la date de contamination : immunodépression plutôt durant les deux premières semaines d'âge et forme clinique classique de la maladie de Gumboro plutôt entre 3 et 6 semaines d'âge. L'immunodépression est due à une atteinte sélective de la lignée lymphocytaire B. Les conséquences cliniques de l'immunodépression sont l'apparition d'affections à germes opportunistes, à virus ou bactéries, la diminution de l'efficacité des vaccinations et les retards de croissance. Dans la forme classique de la maladie de Gumboro il est

décrit chez le poulet une diarrhée profuse à l'origine d'une dégradation de la litière et une baisse de performances. Le tableau lésionnel est caractéristique : les masses musculaires sont maculées de pétéchies dues à des hémorragies et la bourse de Fabricius présente une inflammation aiguë dans les jours suivant la multiplication virale puis s'atrophie. La vaccination contre la maladie de Gumboro du poulet standard s'effectue par voie orale via l'eau de boisson en élevage à l'aide d'une souche vaccinale dite "intermédiaire." Dans le cas de la souche proposée par le laboratoire Merial il s'agit de la souche atténuée S706 (Mazariegos L.A. et Al., 1990.) Le titre de la dose vaccinale du vaccin est tel qu'il permet d’obtenir dans les conditions de laboratoire sur poussins SPF 100% de protection contre la souche hypervirulente de référence F52/70 et une souche terrain hypervirulente Algérie 93. Les témoins contemporains non vaccinés montrent une totale absence de protection (0% dans les deux cas.) En comparaison à l’aide d’une souche « intermédiaire » classique la protection obtenue est respectivement de 70% contre la souche F52/70 et de 35% contre la souche Algérie 93 (données expérimentales Merial non publiées.) 1. Matériels et méthodes Le programme de vaccination des bandes incluses dans l'étude en poulet standard est basé sur l'administration dans les conditions habituelles d'un vaccin vers J14, voire de deux vaccins si nécessaire, en cas de mise en place d'un programme

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

en milieu à risques. Le programme de vaccination en poulet label est basé sur l'administration de deux vaccins vers J21 puis J28. En effet l'âge de la vaccination dépend du titre en anticorps d'origine maternelle du poussin, à cause de la neutralisation in vivo par les anticorps des virus vaccinaux, et de la vitesse d'élimination de ces anticorps. Les anticorps anti-Gumboro sont titrés à partir de prélèvements de sérum au laboratoire par la technique ELISA. Quel que soit le kit ELISA utilisé, la cinétique d'élimination des anticorps d'origine maternelle chez le poulet standard est modélisée par la technique dite des "demi-vies." Le titre en anticorps ELISA du poussin durant les premiers jours de vie diminue suivant le modèle proposé. Des abaques de détermination de date cible ont été à cette fin mis au point (figures 1 et 2.) La demi-vie estimée chez le poulet standard est égale à 4 jours. Tous les 4 jours le titre initial diminue de moitié. Ainsi par exemple à J5 le titre est la moitié de celui présent à J1 et ainsi de suite. Le seuil retenu quel que soit le kit ELISA utilisé est de 500. La valeur du seuil retenu dans le cadre de l’étude est justifiée en théorie par les résultats de protection obtenus in vivo chez le poussin EOPS (cf. § Introduction.) La date à laquelle ce seuil est atteint est la date cible de vaccination. La demi-vie estimée chez le poulet label est égale à 6 jours. La date théorique chez le poulet standard correspond à J14 s'il est issu de reproducteurs « chair » vaccinés à l'aide d'un vaccin inactivé Gumboro en émulsion huileuse avant l'entrée en ponte. Les dates théoriques sont dans ce cas J21 et J28 chez le poulet label. Si une sérologie est effectuée à J1 pour affiner le calcul, il est déterminé la date cible de vaccination (Jvaccination) que l'on encadrera de 2 jours au cas où le coefficient de variation serait inférieur à 30%. La première vaccination sera pratiquée à Jvaccination - 2 jours et la seconde à Jvaccination + 2 jours. Au cas où le coefficient de variation serait supérieur à 30%, la date de vaccination est encadrée de 3 jours. Dans ce cas la première vaccination sera pratiquée à Jvaccination - 3 jours et la seconde à Jvaccination + 3 jours.

Les élevages recrutés pour l'étude proviennent de différentes régions de production avicole en France. Aucun critère de recrutement n'est proposé si ce n'est la prescription par le vétérinaire traitant du vaccin Gumboro produit par le laboratoire Merial. Les données relatives au suivi clinique des lots vaccinés sont transmises par le vétérinaire au laboratoire Merial. 2. Résultats Pour les poulets standard (n = 79) : a) moyenne arithmétique des titres ELISA =

5249+/-360 (risque alpha = 5%), b) moyenne arithmétique des titres minimum =

2846 et moyenne arithmétique des titres maximum = 8243,

c) moyennes arithmétique des coefficients de variation = 28%,

d) jour cible moyen = J15+/-0,5 jour (risque alpha = 5%.)

47 % des analyses sont effectuées à l'aide du kit Idexx, 30 % en KPL et 23 % en Guild'Hay. Pour les poulets label (n = 88) : a) moyenne arithmétique des titres ELISA =

5331+/-275 (risque alpha = 5 %), b) moyenne arithmétique des titres minimum =

3735 et moyenne arithmétique des titres maximum = 7119,

c) moyenne arithmétique des coefficients de variation = 20 %,

d) jour cible moyen = J22 donc jour moyen de la première vaccination = J20+/-0,6 jour et jour moyen de la deuxième vaccination = J24+/-0,6 jour (risque alpha = 5 %.)

76% des analyses sont effectuées à l'aide du kit Guild'Hay, 8% en KPL, 3% en Idexx et 11% avec un autre kit non pris en compte dans l’analyse des résultats pour cause d’effectif trop faible (11 moyennes sur 167 au total.)

Les paramètres de suivi sont les suivants : La moyenne arithmétique des moyennes des titres ELISA Idexx, KPL et Guil’Hay quel que soit le type de production, standard ou label, est respectivement de (risque alpha = 5 %) : 5526 +/- 543 (n = 44), 5698 +/- 498 (n=27) et 5217 +/- 231 (n=85.)

a) moyenne arithmétique des titres ELISA à J1 suivant utilisation de kits disponibles au laboratoire (Idexx, KPL, Guild'Hay, voire CIV dans le cadre de l'étude) pour poulets standard et label, b) moyenne arithmétique des titres ELISA minimum et maximum au même âge de l'ensemble des séries pour poulets standard et label,

Aucun échec de vaccination n’est rapporté dans le cadre de l’étude, que ce soit en poulet standard ou en poulet label, dégradation de performances ou maladie de Gumboro clinique.

c) moyenne arithmétique des coefficients de variation de l'ensemble des séries pour poulets standard et label, d) jour cible moyen pour poulets standard ou jour moyen de la première vaccination et de la deuxième vaccination pour poulets label.

3. Discussion La modélisation de la décroissance des anticorps anti-Gumboro d'origine maternelle a déjà fait l'objet de recherches et a montré que celle-ci était possible

(Kouwenhoven B. et Al., 1992.) Selon cette méthode, à la base, chez le poulet standard, il est considéré que la racine carrée des titres calculés en anticorps anti-Gumboro à J1 ou J2 diminue en moyenne de 2,82 par jour. Le seuil de titre à atteindre est de 500. Seul le titre le plus élevé des trois premiers quartiles correspondant au titre du sérum situé en position ¾ de la série de sérums classés par ordre croissant de titre est pris en compte pour le calcul de la date cible de vaccination. Cinq exemples sont présentés dans le tableau 1. Les résultats montrent la similitude entre les deux modèles chez le poulet standard. Les résultats de sérologies proviennent de la mise en œuvre au laboratoire de différents kits de diagnostic ELISA Gumboro. L'étude prend en compte un échantillon représentatif de la répartition par types de kits d'analyses proposés en sérologie Gumboro vers J1 dans les laboratoires d'analyses vétérinaires en France. Les résultats obtenus provenant de régions diverses et de sites de production tout venant montrent une homogénéité remarquable aussi bien en production standard qu'en production label. Cette homogénéité des titres ELISA vers J1 liée au statut immunitaire des reproducteurs "chair" permet de mettre à l'épreuve des conditions du terrain la définition des dates théoriques de vaccination. La moyenne des titres moyens et l’intervalle de confiance (risque alpha = 5 %) dans lequel se trouvent les moyennes des 3 kits pris en compte montrent que le calcul de la date cible de vaccination à l’aide des abaques se fera dans 2 cas sur 3 cas à partir de la valeur arrondie de 5500 et dans l’autre cas à partir de la valeur 5000. Le résultat ne variera que d’un jour cible pour un

ensemble de 156 élevages de poulets standard et label, ce qui dans les conditions diverses d’élevage est le signe d’une remarquable homogénéité. Conclusion La recommandation des dates cibles de vaccination des bandes de poulets en production standard ou label est confirmée par les résultats de l'étude. La date recommandée de J14 correspond parfaitement à la date de J15+/-0,5 jours (95 % des valeurs moyennes comprises dans cet intervalle.) Chez le poulet label la recommandation de vaccination aux dates de J21 et J28 seront révisées pour mieux correspondre à la prédiction de basée sur les titres des anticorps à 1 jour d’âge et seront J20 et J24 correspondant respectivement aux résultats de J20+/-0,6 et de J24+/-0,6 (95 % des valeurs moyennes comprises dans cet intervalle.) Néanmoins en l'absence de données historiques en sérologie Gumboro sur un site de production il sera recommandé d'établir vers J1 (entre J1 et J3) un diagnostic sérologique afin de contrôler le statut immunitaire des poussins mis en place. Ces résultats seront interprétés à l'aide des abaques de détermination de date cible de vaccination à encadrer. Références bibliographiques Mazariegos L.A., Luckert P.D. & Brown J., 1990, Avian Dis., 34, 203-208. Kouwenhoven B. & van den Bos J., 1992, World Poultry Congress, Amsterdam, the Netherlands, 465-468.

Exemple 1 Exemple 2 Exemple 3 Exemple 4 Exemple 5 817* 2248 1723 3613 2294 1049 3570 1744 3657 2556 1582 3680 2270 4707 2821 2227 3990 2270 4922 3030 2246 4146 2654 5157 3287 2381 4956 2676 5194 3322 2672 5206 3066 5285 3415 2602 5251 3175 5330 3439 2828 5548 3570 5547 3451 3461 5685 4191 5674 3462

3601** 5845** 4213** 6133** 3698 4285 6121 4370 6168 3900 4631 6863 4572 6260 4007 4672 7212 5024 7389 4126 4754 7329 15216 9876 4584**

5174 5247 5259 5300

5304 Moyenne arithmétique 2927 5177 4049 5659 3884 Titre le plus élevé des trois premiers quartiles** (cf § Discussion) 3601 5845 4213 6133 4584 Date cible selon calcul Merial J11 ou J12 J14 ou J15 J13 ou J14 J14 ou J15 J12 ou J13 Date cible encadrée pour deux vaccinations selon calcul Merial J10 puis J14 J13 puis

J17 J12 puis

J16 J13 puis

J17 J11 puis

J15 Date cible selon calcul Deventer J10 ou J11 J13 ou J14 J12 ou J13 J13 ou J14 J11 ou J12 * moyenne des titres ELISA d’anticorps anti-Gumboro par ordre croissant pour chaque série de sérums

TABLEAU 1 : Exemples de calculs de dates de vaccination selon modélisation Merial et Deventer

.

ABAQUE DE DETERMINATION DE DATE CIBLE DE VACCINATION GUMBOROPOULET STANDARD*

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

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5000

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8000

8500

9000

9500

10000

J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14 J15 J16 J17 J18 J19 J20

titr

es E

LISA G

um

bor

o en

tre

J1 e

t J3

FIGURE 1 : Abaque de détermination de date cible de vaccination

Gumboro en production poulet standard

ABAQUE DE DETERMINATION DE DATE CIBLE DE VACCINATION GUMBOROPOULET LABEL*

500

1000

1500

2000

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10000

J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14 J15 J16 J17 J18 J19 J20 J21 J22 J23 J24 J25 J26 J27 J28 J29 J30

titr

es E

LISA G

um

bor

o en

tre

J1 e

t J3

FIGURE 2 : Abaque de détermination de date cible de vaccination

Gumboro en production poulet label

EFFICACITE D’UN VACCIN RECOMBINE HVT-VP2 CONTRE LA MALADIE DE GUMBORO, EN PRESENCE D’ANTICORPS PARENTAUX

Goutebroze Sylvain1, Curet Marianne1, Jay Marie-Laure1, Roux Claude1, Le Gros François-Xavier2

1MERIAL SAS, Opérations Cliniques Aviaires, PIPA, Allée des Cyprès, 01150 Saint-Vulbas

2MERIAL SAS, Laboratoire de Lyon Gerland, 254 rue Marcel Mérieux, 69007 Lyon Résumé L’efficacité d’un vaccin recombiné exprimant la protéine VP2 du virus de la maladie de Gumboro et utilisant le vecteur herpès virus HVT (virus vHVT013-69) a été testée contre une épreuve hypervirulente de la maladie de Gumboro. Le vaccin, présenté sous forme congelée et associée à la cellule, est administré par voie sous-cutanée, à l’âge d’un jour. L'efficacité est évaluée par un suivi clinique selon les recommandations de la Pharmacopée Européenne, et par sérologie. En conditions expérimentales, 100% de protection a été observée sur poulets EOPS et sur poulets de type chair conventionnels porteurs d'anticorps d'origine maternelle, dès l'âge de 14 jours et jusqu'à leur âge d'abattage (42 et 56 jours). Une nette séroconversion a également été obtenue sur les animaux vaccinés. Ces résultats ont été confirmés au cours d'un essai pratiqué sur environ 36000 poulets de chair, vaccinés et élevés en conditions terrain puis éprouvés en conditions expérimentales, démontrant une protection plus précoce et plus forte que celle obtenue au moyen d’une souche vaccinale classique. Le virus recombiné vHVT013-69 permet donc une immunisation efficace contre la maladie de Gumboro, après une administration unique pratiquée à l’âge d’un jour en présence d’anticorps parentaux. Introduction La maladie de Gumboro ou bursite infectieuse (en anglais, infectious bursal disease ou IBD) est une maladie virale hautement contagieuse, qui touche principalement les poulets de moins de 7 semaines. Elle provoque une immunodépression importante (tropisme marqué pour la bourse de Fabricius, lieu de formation et de maturation des lymphocytes B), et cause de lourdes pertes économiques. La plupart des élevages présents dans les zones d'élevage intensif du globe sont vaccinés en routine contre cette maladie. L'un des problèmes majeurs de cette vaccination est l'interférence des souches vaccinales classiquement utilisées avec les anticorps maternels, et donc la difficulté à induire une protection précoce. La vaccination est ainsi généralement réalisée vers l'âge de 2 à 3 semaines, en 2 administrations ou plus. L'émergence au milieu des années 1980 de nouveaux variants antigéniques du virus, appelés hypervirulents (very virulent IBD ou vvIBD) et induisant des pertes économiques graves y compris chez des animaux vaccinés, a rendu la nécessité d'une immunisation précoce encore plus cruciale (Chettle et al., 1989). Un vaccin recombiné exprimant la protéine VP2 du virus de la maladie de Gumboro et utilisant le vecteur herpès virus HVT, le virus vHVT013-69, a été construit dans le but de permettre une vaccination en présence d'anticorps maternels. Le vaccin se présente sous forme congelée en azote liquide. L'immunité conférée par le vHVT013-69 vis à vis d'une souche vvIBD a été testée en conditions expérimentales sur poulets de chairs EOPS et conventionnels vacciné à l'âge de 1 jour par voie sous-

cutanée, et lors d'un essai terrain réalisé en conditions industrielles. Les résultats de ces études sont rapportés dans cet article. 1. Matériels et méthodes 1.1. Schéma expérimental Essai 1 : Efficacité et durée d'immunité contre une épreuve vvIBD chez le poulet EOPS Deux groupes de 20 poussins EOPS de 1 jour sont vaccinés avec vHVT013-69, administré à la dose de 3.0 log10 PFU par voie sous-cutanée (SC). Une épreuve précoce est réalisée à 2 semaines sur un des groupes vaccinés et sur des témoins ; une épreuve tardive est effectuée 8 semaines après vaccination chez le second groupe d'animaux vaccinés et un groupe témoin. A chaque épreuve, les groupes témoins comportent 20 animaux du même âge et de même origine que les vaccinés. La souche d'épreuve utilisée est la souche vvIBD 91168, isolée en France en 1991 (Eterradossi et al., 1997). L'épreuve est effectuée par instillation oculaire. Le suivi des animaux après épreuve est réalisé selon les recommandations de la monographie sur les vaccins vivants de la maladie de Gumboro de la Pharmacopée Européenne (Pharmacopée Européenne, 2000) : un relevé de la morbidité et de la mortalité est réalisé pendant une période de 10 jours, à l'issue de laquelle les animaux sont abattus et une autopsie est réalisée. Les bourses de Fabricius sont ensuite prélevées et soumises à un examen histologique individuel.

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

La réponse en anticorps des animaux contre la maladie de Gumboro est mesurée par une technique de séroneutralisation à 2, 4, 6 et 8 semaines d'âge. Essai 2 : Efficacité et durée d'immunité contre une épreuve vvIBD chez le poulet conventionnel. Deux groupes de 20 poussins conventionnels de type chair sont vaccinés avec 3.0 log10 PFU du vaccin vHVT013-69 à l'âge de 1 jour (voie SC). Une épreuve précoce est réalisée à 3 semaines sur un des groupes vaccinés et sur des témoins ; une épreuve tardive est effectuée 6 semaines après vaccination chez le second groupe d'animaux vaccinés et un groupe témoin. A chaque épreuve, les groupes témoins comportent 20 animaux du même âge et de même origine que les vaccinés. La méthodologie d'épreuve et son suivi sont identiques à ceux décrits pour l'essai 1. Lors de cet essai, la taille de la bourse de Fabricius de chaque poulet est de plus mesurée à l'autopsie J+10 après épreuve. Le statut sérologique initial des animaux vis à vis de la maladie de Gumboro est déterminé au moment de la vaccination, puis le niveau d'anticorps est mesuré à 3 et 6 semaines d'âge par séroneutralisation. Essai 3 : Efficacité et durée d'immunité contre une épreuve vvIBD chez le poulet conventionnel vacciné en conditions terrain. L'essai a été réalisé de Juillet à Octobre 1999 dans un élevage Rhône-Alpin, sur 2 lots successifs d'animaux de même origine, incluant 18000 animaux pour le premier lot, et 17280 pour le second. Pour chacun de ces lots, la moitié des animaux – soit respectivement 9000 et 8640 poussins – reçoit le virus vHVT013-69 à l'âge de 1 jour au moyen d'un appareillage de vaccination sous-cutanée classique à l'échelle industrielle (appareil ACCUVAC). L'autre moitié des animaux du lot est utilisée comme poulets témoins, et élevés dans un bâtiment indépendant de celui des vaccinés. Ces animaux témoins font l'objet d'un programme de vaccination standard contre la maladie de Gumboro, consistant en 2 administrations de la souche de virulence intermédiaire S706 par eau de boisson à quelques jours d'intervalle au cours de la 2ème semaine de vie (dates déterminées en fonction du niveau d'anticorps maternels à un jour d'âge). Une centaine d'animaux issus des groupes vaccinés vHVT013-69 et des groupes témoins est rapatriée en animalerie confinée sur le site de MERIAL France à Lyon, juste après la vaccination à 1 jour, pour la réalisation ultérieure des épreuves virulentes. Par ailleurs, une vingtaine des vaccinés vHVT013-69 et des témoins conservés sur le site d'élevage (vaccination standard) sont rapatriés avant chaque épreuve en animalerie protégée pour être également éprouvés. Les épreuves précoces et tardives, réalisées respectivement à 3 et 5 semaines, sont effectuées sur 20 poulets par groupe, selon la méthodologie décrite précédemment. Le niveau des anticorps maternels est mesuré à l'âge de 1 jour, puis un suivi sérologique est réalisé à 2, 3 et

5 semaines (10 sérums par date et par groupe, obtenus sur les animaux du terrain). Les analyses sérologiques sont effectuées par séroneutralisation. Un suivi zootechnique classique (mortalité, poids, IC, pourcentage de saisie à l'abattoir) est par ailleurs mené dans l'élevage, permettant la comparaison des animaux ayant reçu le virus recombiné vHVT013-69 et ceux vaccinés selon des modalités standards. 1.2. Analyse des résultats Essai 1 L'analyse des résultats d'épreuve est effectuée selon les recommandations de la monographie de la Pharmacopée Européenne pour les vaccins vivants contre la maladie de Gumboro (Pharmacopée Européenne, 2000) : "Le vaccin est satisfaisant si 90% au moins des poussins EOPS vaccinés survivent sans présenter de symptômes de la maladie ni de lésions graves de la bourse de Fabricius, et si la moitié au moins des témoins manifestent des symptômes caractéristiques de la bursite infectieuse aviaire et que tous les témoins survivants présentent des lésions sévères de la bourse de Fabricius; un animal est considéré comme atteint de lésions sévères si 90% au moins des follicules présentent plus de 75% de déplétion de lymphocytes". Essai 2 Le pourcentage d'animaux protégés est calculé, en appliquant aux poulets conventionnels de cet essai les critères d'interprétation de la Pharmacopée Européenne prévus pour les animaux EOPS (voir ci-dessus). De plus, les tailles des bourses de Fabricius à l'autopsie chez les animaux vaccinés et chez les témoins, pour chaque épreuve, ont été comparés par une analyse de variance au risque α=5%. Essai 3 Le pourcentage d'animaux protégés est calculé, en appliquant aux poulets conventionnels de cet essai les critères d'interprétation de la Pharmacopée Européenne prévus pour les animaux EOPS (voir ci-dessus). Les résultats de protection des 2 lots successifs sont cumulés pour chaque groupe et sont comparés globalement par un test du chi-deux au risque α=5%. Des comparaisons 2 à 2 sont ensuite effectuées au risque réduit α'=1.7% (réduction du risque selon la méthode de Bonferroni). 2. Résultats 2.1. Essais en conditions expérimentales Essai 1 : Efficacité et durée d'immunité contre une épreuve vvIBD chez le poulet EOPS. Une nette séroconversion est observée chez les animaux vaccinés dès l'âge de 2 semaines (Figure 1).

Le pourcentage d'animaux protégés selon les critères de la Pharmacopée Européenne, pour chaque épreuve, est mentionné dans le Tableau ci-dessous. TABLEAU 1. Protection conférée par le vaccin vHVT013-69 chez le poulet EOPS contre une épreuve vvIBD

Protection (%) Age d'épreuve Vaccinés Témoins 2 semaines 100% 0%

8 semaines 100% 6%* * 1 poulet sur les 5 survivants à l'issue de l'épreuve présentait des lésions intermédiaires de la bourse de Fabricius (soit 50 à 90% des follicules présentant plus de 75% de déplétion lymphocytaire), et non sévères. Essai 2 : Efficacité et durée d'immunité contre une épreuve vvIBDV chez le poulet conventionnel. Les poussins vaccinés avec le vaccin recombiné présentent à l'âge de un jour un taux d'anticorps neutralisants d'origine maternelle élevé (1/28000ème en moyenne). Après une phase de décroissance des titres en anticorps, une nette séroconversion est observée, les titres en anticorps passant du 1/316ème au 1/8910ème entre 3 et 6 semaines après vaccination (Figure 1). Le pourcentage d'animaux protégés – calculé en appliquant aux animaux conventionnels les critères de la Pharmacopée Européenne - est mentionné dans le Tableau ci-dessous. TABLEAU 2. Protection conférée par le vaccin vHVT013-69 chez le poulet conventionnel contre une épreuve vvIBD.

Protection (%) Age d'épreuve Vaccinés Témoins 3 semaines 100% 30%

6 semaines 100% 30% Les bourses de Fabricius observées à l'autopsie chez les témoins après épreuve sont significativement plus petites (atrophie due à la déplétion lymphocytaire) que celles des vaccinés avec le virus recombiné vHVT013-69, pour les 2 épreuves réalisées (p = 0.00 dans les 2 cas). 2.2 Essai réalisé sur le terrain (essai 3) Les résultats zootechniques obtenus sont comparables chez les poussins vaccinés à un jour avec vHVT013-69 et les témoins vaccinés par eau de boisson avec la souche classique (mortalité des lots : 4.11% vs 3.87% ; poids moyen à l'abattage: 1.833 kg vs 1.758 kg ; pourcentage de saisie : 0.68% vs 0.59% ; IC : 2.060 dans les 2 groupes). Sur le plan sérologique, les titres obtenus confirment que le vaccin recombiné a été administré en présence de forts taux d'anticorps neutralisants d'origine maternelle (1/31000ème en moyenne). Une séroconversion est observée chez tous les vaccinés (vaccin recombiné et vaccin classique), à partir de l'âge de 3 semaines. Les résultats obtenus (Figure 2) après l'épreuve précoce mettent en évidence une protection significative (p = 0.00) contre l'épreuve vvIBD chez

les poulets vaccinés avec vHVT013-69 dès l'âge de 3 semaines, tandis que le schéma vaccinal classique ne produit encore aucune protection à cette date. A l'épreuve tardive, le vaccin recombiné vHVT013-69 et le vaccin classique souche S706 induisent tout deux une protection significativement plus élevée (p = 0.00) que chez les témoins non vaccinés, mais la protection conférée est statistiquement meilleure (p = 0.015) avec vHVT013-69. Ces observations sont reproductibles d'un lot à l'autre. Les résultats cliniques et sérologiques obtenus chez les poulets vaccinés vHVT013-69 élevés sur le terrain et rapatriés en animalerie juste avant les épreuves et ceux rapatriés à l'âge de 1 jour après la vaccination et élevé en conditions confinées sont comparables, ce qui permet d'écarter l'hypothèse d'un biais des résultats lié à la diffusion d'un virus de la maladie de Gumboro dans l'élevage. La protection observée vis à vis de l'épreuve peut donc être attribuée à l'administration du virus recombiné. 3. Discussion La vaccination est la principale méthode de contrôle de l'infection par le virus de la maladie de Gumboro. L'impact économique de cette maladie est lié à ses effets directs (mortalité, baisse du GMQ, augmentation de l'IC) et indirects, suite à l'immunosuppression induite lors de l'infection des poussins lors des 3 premières semaines de vie. La maîtrise de l'infection précoce par le virus de la maladie de Gumboro est longtemps passée par la transmission d'une immunité passive d'origine maternelle, mais l'émergence dans les années 1980 des souches vvIBD, capable de passer outre cette immunité passive, a montré les limites de cette méthode (Lukert et al., 1997). Actuellement, la vaccination contre la maladie de Gumboro doit donc être effectuée le plus tôt possible pour éviter l'apparition de formes graves dues aux souches hypervirulentes. Des souches vaccinales atténuées, dites "chaudes", sont parfois utilisées pour lutter contre les formes vvIBD, mais ces souches vaccinales peuvent poser des problèmes d'innocuité et d'immunodépression, tout en nécessitant plusieurs administrations. Contrairement aux vaccins existants, le vaccin recombiné vHVT013-69 peut être administré au poussin à l'âge de 1 jour. L'utilisation du vecteur HVT - classiquement utilisé pour la vaccination contre la maladie de Marek à 1 jour - permet en effet de vacciner en présence d'une immunité maternelle. La protéine VP2 exprimée est une protéine de capside du virus qui induit une immunité protectrice contre la maladie de Gumboro, par l'induction d'anticorps neutralisants. Par ailleurs, la complète innocuité du virus vHVT013-69 a été démontrée ; Contrairement aux souches classiques dites "chaudes", il ne provoque aucune déplétion lymphocytaire au niveau de la bourse de Fabricius (résultats non présentés ici).

Références bibliographiques 4. Conclusions

Chettle N.J., Stuart J.C. and Wyeth P.J., 1989. Vet. Rec. 125 : 271-272.

Les essais réalisés ont démontré l'efficacité du vaccin vHVT013-69 administré par voie sous-cutanée chez des animaux présentant de forts niveaux d'anticorps lors de la vaccination, y compris lors d'inoculation en conditions terrain. Une administration unique du vaccin pratiquée à l'âge d'un jour permet une protection efficace contre la forme hypervirulente de la maladie de Gumboro. L'immunisation conférée apparaît rapidement et se maintient jusqu'à l'âge d'abattage des poulets de chair, sans nécessiter de rappel. La protection induite est plus précoce et plus forte que celle obtenue au moyen d'une souche vaccinale de virulence intermédiaire.

Eterradossi N., Rivallan G., Toquin D. and Guittet M., 1997. Arch. Virol. 143 : 1627-1636. Lukert P.D. and Saif Y.M., 1997. In: Diseases of Poultry. 10th edition. Iowa State University Press, Ames,IA., pp. 721-738. Pharmacopée Européenne, 2000. Monographie 2000:0587

Poulets conventionnels

0

1

2

3

4

5

0 2 4

Age en semaines

Ac

sero

neu

tral

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Poulets EOPS

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8

Age en semaines

Ac

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ts (

log10)

6

FIGURE 1 : Résultats sérologiques observés lors d'essais d'efficacité du vaccin recombiné vHVT013-69 en animalerie confinée sur poulets EOPS (à gauche) et conventionnels (à droite). Taux d'anticorps neutralisants contre la maladie de Gumboro observés chez les vaccinés ( ) et chez les témoins ( ). La vaccination est réalisée à 1 jour par voie sous-cutanée

45%

0 0

82.5%

55%

12.5%

0

20

40

60

80

100

Pro

tect

ion (

%)

Epreuve 1 Epreuve 2

FIGURE 2 : Essai d'efficacité Terrain. Protection observée chez les animaux vaccinés avec VHVT013-69 à 1 jour et élevé sur le terrain jusqu'à l'épreuve (en blanc), chez ceux ayant reçu un programme vaccinal classique avec la souche S706 (en gris) et chez les témoins (en noir). Les animaux protégés sont ceux n'ayant pas montré de signes cliniques suite à l'épreuve vvIBD et ne présentant pas de lésions sévères (90% des follicules lymphoïdes ayant plus de 75% de déplétion lymphocytaire) de la bourse de Fabricius, 10 jours après épreuve. Les données correspondent au cumul des résultats obtenus sur 2 bandes d'animaux (20 animaux éprouvés par traitement et par bande, pour chaque épreuve). Les épreuves 1 et 2 sont réalisées respectivement 3 et 5 semaines après vaccination

EFFICACITE DU DICHLOROMETHYLENE BIPHOSPHONATE (Cl2MBP) POUR LA DEPLETION FONCTIONNELLE EN MACROPHAGE IN VIVO CHEZ LE POULET

Quéré Pascale1, Rivas Christelle1, van Rooijen Nico2

1INRA, BioAgresseurs, Santé et Environnement, 37380 Nouzilly,

2Department of Cell Biology and Immunology, Faculty of Medecine, Vrije Universiteit, Amsterdam, Pays-Bas. Résumé L’objectif de cette étude est de déterminer si le traitement par le dichloromethylène biphosphonate (Cl2MBP), encapsulé dans des liposomes (Lip/ Cl2MBP) déplète efficacement les macrophages chez le poulet. Trois jours après l’injection intraveineuse de Lip/ Cl2MBP, la réponse proliférative des lymphocytes aux mitogènes T in vitro est fortement réduite dans la rate. La production de NO (monoxyde d’azote) par les macrophages de la rate, spontanée ou inductible par l’interféron-γ, diminue. Néanmoins, la capacité des monocytes à produire du NO in vitro n’est pas modifiée. En parallèle, la capacité globale de l’organisme à produire du NO dans le sang, mesurée par le taux de nitrates sériques après injection de lipopolysaccharide (LPS), s’avère réduite de moitié de 3 à 9 jours après le traitement. Le traitement intraveineux par les Lip/ Cl2MBP augmente, par contre, la réponse systémique en anticorps contre un antigène thymo-dépendant. En conclusion, les Lip/ Cl2MBP injectés par voie intraveineuse chez le poulet sont capables d’affecter transitoirement les macrophages et leur fonction, au niveau de la rate essentiellement, et d’inhiber la réponse effectrice en NO. NO étant une molécule inhibant la réplication de nombreux virus, cette méthode de déplétion en macrophages in vivo présente un intérêt pour définir le rôle du NO et du macrophage dans certaines affections virales chez le poulet.

Introduction L’élimination des virus par l’hôte dépend des mécanismes d’immunité innée et acquise. Les effecteurs non-spécifiques tels que interférons, cellules NK, monocytes du sang et macrophages tissulaires limitent la réplication virale durant la phase précoce d’infection avant la génération de la réponse immune spécifique des antigènes (anticorps et lymphocytes T cytotoxiques). Les macrophages sont des cellules multifonctionnelles qui ont en particulier un rôle clef dans l’orchestration des réponses immunes innées et spécifiques. Outre leur rôle important dans le processus de l’inflammation et comme cellules phagocytaires éliminant les agents infectieux, les macrophages stimulent l’activité antivirale des cellules NK et les lymphocytes T via la sécrétion de cytokines et de chimiokines. La déplétion sélective des macrophages in vivo est une approche employée pour étudier leurs divers rôles. Chez le poulet, comme chez la souris, l’injection de différents composés a été employée comme la silice, le bleu de trypan, les carraghénanes et les sérums anti-macrophage. Néanmoins, certains composés peuvent affecter d’autres cellules, en particulier les lymphocytes, et donc les effets de ces traitements ne seraient pas dus à la seule action sur le macrophage. De plus, ces composés peuvent n’avoir qu’une action variable, n’affectant que certaines fonctions du macrophage (Wirth et al., 1980 ; Kagan and Hartman, 1984 ; Pinto et al., 1989). Van Rooijen et collègues (1989) ont donc développé une nouvelle stratégie de déplétion des macrophages, plus

spécifique et plus efficace, reposant sur la phagocytose ciblée d’un composé toxique pour le macrophage (le dichlorométhylène biphosphonate, Cl2MBP) car encapsulé dans des liposomes (van Rooijen et Sanders, 1994). L’injection intraveineuse de liposomes contenant du Cl2MBP élimine physiquement de façon efficace les macrophages de la rate et du foie. Néanmoins, la suppression est transitoire. En particulier au niveau de la rate, différentes catégories de macrophages sont affectées avec un temps de repopulation différent après le traitement selon la sous-population considérée (van Rooijen et al., 1989). L’objectif de cette étude est d’évaluer, chez le poulet, la capacité d’un traitement intraveineux par les liposomes contenant du Cl2MBP à dépléter la fonction macrophagique au niveau de la rate et à affecter les réponses immunes. 1. Matériels et méthodes 1.1. Animaux Les poulets Leghorn blancs (SPF) des lignées histocompatibles B13/B13 et B21/B21, respectivement très sensibles et résistants à la maladie de Marek, sont utilisés à l’âge de 4-6 semaines. 1.2. Schéma expérimental Les poulets sont répartis en deux lots de 10-12, l’un traité par les liposomes contenant du Cl2MBP (Lip/ Cl2MBP) (0.3 ml/poulet) et l’autre par des liposomes (Lip). L’effet du traitement sur la fonction

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

macrophagique est testé 3 et 9 jours après (5-6 poulets par lot et par jour). 1.3. Préparation des cellules de rate Les rates sont broyées sur une grille métallique. Les suspensions cellulaires sont centrifugées à 400g pour éliminer les érythrocytes (Djeraba et Quéré, 2000). 1.4. Mesure de la production de monoxyde d’azote (NO) La production de NO par les splénocytes est mesurée par la quantité de nitrites (NO2-) produits dans le milieu de culture. Les splénocytes sont stimulés par de l’IFN-γ de poulet (50 U/ml) ou de la PHA (Phytohémagglutinine : 10 µg/ml) pendant 48h (Djeraba et Quéré, 2000). La mesure des nitrates (NO3-) sériques est effectuée avant et 5h après injection du stimulant LPS (Lipopolysaccharide). Les nitrates sont réduits en nitrites par du cadmium (Djeraba et Quéré, 2000). Les nitrites sont dosés par la méthode de Griess. 1.5. Mesure de la réponse proliférative aux mitogènes T Les splénocytes sont stimulés avec les mitogènes Concanavaline A (Con A : 2,5 et 5 µg/ml) ou PHA (5 et 20 µg/ml) pendant 48h. La prolifération lymphocytaire est quantifiée par l’incorporation de thymidine tritiée (Djeraba et Quéré, 2000). 1.6. Mesure de la réponse spécifique anti-KLH Les poulets sont immunisés par injection intraveineuse de KLH (Keyhole limpet hemocyanin : 100 µg/poulet). Le sérum et la rate sont prélevés 7 jours après. Les anticorps (IgM et IgG) spécifiques anti-KLH sont dosés dans le sérum par ELISA (Quéré et Girard, 1999). La prolifération spécifique anti-KLH des lymphocytes de rate est mesurée par incorporation de thymidine tritiée 4 jours après restimulation in vitro (5 µg/ml) (Quéré et Girard, 1999). 1.7. Analyse statistique Les résultats sont exprimés par la moyenne des valeurs (écart type de la valeur). L’analyse de variance et la comparaison des moyennes sont effectuées par un test non-paramétrique (Simstat, N. Peladeau, Provalis Research, Canada). 2. Résultats NO est une molécule qui a de puissantes propriétés antivirale et antitumorale (Liew et Cox, 1991). NO est produit en grande quantité par le macrophage à partir de la L-arginine sous l’action de l’enzyme NO synthase activée par des stimuli comme LPS et l’ IFN-γ (Xie et Nathan, 1994). NO a un temps de demi-vie très bref : il est immédiatement transformé en nitrites dans le surnageant de culture et en nitrates dans le sérum. Le taux de nitrates sériques après activation par le LPS permet d’évaluer la réponse

systémique en NO reflétant la capacité globale d’activation des macrophages (Smith et al., 1997). La rate et le foie sont les organes impliqués majoritairement dans cette production de NO (Salkowski et al., 1997). Nous avons observé une forte réduction, mais incomplète (de moitié), de la quantité de nitrates sériques en réponse au LPS 3 et 9 jours après le traitement par le Cl2MBP à la fois pour les poulets B13/B13 et B21/B21 (Tableau 1), comme chez la souris (Salkowski et al., 1997). Au niveau de la rate, la production de nitrites par les macrophages, spontanée ou en réponse à l’IFN-γ, apparaît significativement réduite au 3ème jour post-traitement (Tableau 2). Par contre, la capacité de production en NO est récupérée au 9ème jour post-traitement. En parallèle dans la rate, la réponse aux mitogènes T, comme la PHA pour les poulets B13/B13 et la Con A pour les poulets B21/B21, est drastiquement réduite au 3ème jour post-traitement, mais retourne aussi à la normale au 9ème jour post-traitement (Tableau 3). La réponse aux mitogènes T est en effet dépendante de la présence des macrophages en culture, qui produisent des cytokines. Par contre, la réponse spécifique en anticorps, IgM et IgG, dans le sérum après immunisation par un antigène thymo-dépendant, apparaît augmentée significativement (Tableau 4). Ceci avait déjà été observé par Jeurissen et al. (1998), chez le poulet, après traitement par le Cl2MBP. La réponse proliférative des lymphocytes de rate en réponse à l’antigène immunisant KLH reste fortement inférieure chez les poulets traités par les liposomes contenant du Cl2MBP comparativement à ceux traités par les liposomes seuls 3 et 9 jours post-traitement. Ce défaut de prolifération pourrait être le résultat d’un défaut de présentation de l’antigène en culture lors de la restimulation in vitro du fait d’un déficit numérique en macrophages, alors que les lymphocytes répondants sont bien présents. Conclusion Le traitement intraveineux par les liposomes contenant le Cl2MBP apparaît efficace chez le poulet pour dépléter majoritairement les macrophages de la rate. Jeurissen et al. (1998) avait observé une disparition physique des macrophages spléniques dès 48h post-traitement avec un début de repopulation dès la première semaine post-traitement. Nos résultats montrent que cette disparition des macrophages s’accompagne fonctionnellement d’un défaut drastique de production de NO in vivo et in vitro, accompagnée d’un défaut in vitro de stimulation dans la réponse aux mitogènes ou de présentation de l’antigène. Elle est transitoire, le défaut étant maximum au 3ème jour post-traitement. Cette méthode de déplétion en macrophages in vivo pourrait donc présenter un intérêt pour définir le rôle du NO et du macrophage dans certaines affections virales chez le poulet.

Références bibliographiques Djeraba A., Quéré P., 2000. Int. J. Immunopharmacol., 22, 365-372. Jeurissen S.H.M., Jansen E.M., van Rooijen N., Claassen E., 1998. Immunobiol., 198, 385-395. Kagan E., Hartman D.P., 1984. Methods Enzymol., 108, 325-335. Liew F.Y., Cox F.E., 1991. Immunol. Today, 12, A17-21. Pinto A.J., Steward D., Volkman A., van Rooijen N., Morahan P.S., 1989. In : Lopez-Berestein G. Fidler I (Eds) Liposomes in the therapy of infectious diseases and cancer. Liss, New York, pp441-451.

Quéré P., Girard F., 1999. Vet. Immunol. Immunopathol., 70, 135-141. Salkowski C.A., Detore G., McNally R., van Rooijen N., Vogel S.N., 1997. J. Immunol., 158, 905-912. Smith S.R., Manfra D., Davies L., Terminelly C., Denhardt G., Donkin J., 1997. J. Leukoc. Biol., 61, 24-32. van Rooijen N., Kors N., Kraal G., 1989. J. Leukoc. Biol., 45, 97-104. van Rooijen N., Sanders A., 1994. J. Immunol. Methods, 174, 83-96. Wirth J.J., Carney W.P., Wheelock E.F., 1980, J. Immunol. Methods, 32, 357-373. Xie Q., Nathan C., 1994. J. Leukoc. Biol., 56,

576-582

TABLEAU 1 : Effet du traitement intraveineux par le Cl2MBP sur la production de nitrates sériques Lip Lip/Cl2MBP

NO3-+NO2

- (µM) Poulets B13/B13 J+3 0

LPS 15,2 (± 1,7)

286,1 (± 16,1) 14,6 (± 2,7)

207,8 (± 19,1)∗∗ J+9 0

LPS 11,2 (± 1,1)

269,7 (± 31,3) 20,1 (± 3,0)∗∗

143,2 (± 19,8)∗∗

Poulets B21/B21 J+3 0 LPS

9,2 (± 0,7) 138,5 (± 10,7)

6,0 (± 0,2)∗∗ 75,2 (± 5,9)∗∗

J+9 0 LPS

9,3 (± 0,9) 147,0 (± 12,5)

8,2 (± 0,9) 75,4 (± 7,9)∗∗

3 et 9 jours après l’inoculation intraveineuse de Cl2MBP (Lip/Cl2MBP) ou de liposomes seuls (Lip), le taux de nitrate sérique est mesuré avant et 5 heures après injection intraveineuse de LPS (5 à 6 poulets par lot). Les différences significatives sont indiquées par comparaison avec le lot Lip (∗p≤0.05 ; ∗∗ p≤0.01).

TABLEAU 2 : Effet du traitement intraveineux par le Cl2MBP sur la production de NO par les monocytes et splénocytes

Traitement Lip Lip/Cl2MBP

NO2- (µM)

Monocytes B13/B13

J+3 0

IFN-γ LPS

2,7 (± 0,7) 20,9 (± 3,5) 4,8 (± 0,5)

4,5 (± 0,7) 24,2 (± 4,3) 5,4 (± 1,2)

J+9

0 IFN-γ LPS

3,0 (± 0,5) 39,6 (± 4,2) 4,4 (± 0,8)

2,6 (± 0,5) 33,6 (± 8,2) 3,1 (± 0,5)

Splénocytes B13/B13 J+3

0 IFN-γ PHA

5,2 (± 1,1) 14,3 (± 1,7) 12,0 (± 1,2)

2,5 (± 0,9) 8,22 (± 1,1)∗ 5,6 (± 0,5)∗∗

J+9

0 IFN-γ PHA

3,4 (± 2,2) 12,7 (± 1,6) 9,2 (± 1,4)

8,5 (± 0,9)∗ 12,4 (± 1,4) 11,3 (± 1,3)

3 et 9 jours après l’inoculation intraveineuse de Cl2MBP encapsulé dans des liposomes (Lip/Cl2MBP) ou de liposomes seuls (Lip) (5 à 6 poulets par lot), les leucocytes du sang et de la rate sont mis en culture, puis stimulés pendant 48 heures avec de l’IFN-γ (SnREV, 50 U/ml) ou du mitogène PHA (10 µg/ml). La production de nitrite (NO2-) est mesurée par la réaction de Griess. Les différences significatives sont indiquées par comparaison avec le lot Lip (∗p≤0.05 ; ∗∗ p≤0.01).

TABLEAU 3 : Effet du traitement intraveineux par le Cl2MBP sur la prolifération lymphocytaire induite par les mitogènes T

Traitement (µg/ml) Lip Lip/Cl2MBP

Incorporation de thymidine-H3 (CPM +/-SEM)

splenocytes B13/B13 J+3

0 PHA 5

PHA 20

677 (± 120) 12062 (± 1801)

102822 (± 7628)

392 (± 29)∗ 5573 (± 459)∗∗

58704 (± 4241)∗∗

J+9 0 PHA 5

PHA 20

784 (± 111) 24996 (± 4801)

128210 (± 12197)

568 (± 94) 24634 (± 6483)

129479 (± 20200)

splenocytes B21/B21

J+3

0 PHA 5

PHA 20 Con A 2 Con A 5

125 (± 11) 5052 (± 492)

25868 (± 2513) 16140 (± 5674)

68220 (± 11340)

132 (± 3) 4293 (± 1159) 20745(± 4267) 1669 (± 901)∗

18829 (± 4267)∗∗

J+9 0 PHA 5

PHA 20 Con A 2 Con A 5

257 (± 48) 4895 (± 975)

33686 (± 5935) 15004 (± 62064) 68025 (± 16064)

154 (± 10) 4095 (± 595)

39470 (± 6418) 20478 (± 8209)

81127 (± 14692)

3 et 9 jours après l’inoculation intraveineuse de Cl2MBP encapsulé dans des liposomes (Lip/Cl2MBP) ou de liposomes seuls (Lip) (5 à 6 poulets par lot), les leucocytes de la rate sont mis en culture, puis stimulés pendant 48 heures avec les mitogènes PHA ou Con A. La prolifération lymphocytaire est mesurée par l’incorporation de thymidine tritiée. Les différences significatives sont indiquées par comparaison avec le lot Lip (∗p≤0.05 ; ∗∗ p≤0.01). TABLEAU 4 : Effet du traitement intraveineux par le Cl2MBP sur la réponse immune spécifique contre un antigène

T-dépendant (KLH) Lip Lip/Cl2MBP

Réponse sérique en anticorps anti-KLH DO

J+3 IgM (1 :80) IgG (1 :2560)

0,578 (± 0,076) 0,434 (± 0,110)

0,601 (± 0,079) 0,629 (± 0,165)∗

J+9 IgM (1 :80) IgG (1 :2560)

0,698 (± 0,056) 0,925 (± 0,140)

0,842 (± 0,110) 1,548 (± 0,133)∗∗

Réponse proliférative splénique anti-KLH Incorporation de thymidine-H3 (CPM +/-SEM)

J+3 0 + KLH

480 (± 99) 34234 (± 5385)

338 (± 86) 15432 (± 3689)∗∗

J+9 0 + KLH

564 (± 54) 18487 (± 5612)

290 (± 72)∗ 9586 (± 4386)∗

3 et 9 jours après l’inoculation intraveineuse de Cl2MBP encapsulé dans des liposomes (Lip/Cl2MBP) ou de liposomes seuls (Lip) (5 à 6 poulets par lot), l’antigène KLH (100 µg/poulet) est injecté par voie intraveineuse. Le sérum et la rate sont prélevés 7 jours après. Les anticorps spécifiques anti-KLH sont mesurés par ELISA (IgG, phosphatase ; IgM, peroxydase). Les résultats sont exprimés en densité optique (DO). Les leucocytes de la rate sont mis en culture et stimulés pendant 4 jours avec KLH. La prolifération lymphocytaire anti-KLH est mesurée par l’incorporation de thymidine tritiée. Les différences significatives sont indiquées par comparaison avec le lot Lip (∗p≤0.05 ; ∗∗ p≤0.01).

INTERET DES ANTICOCCIDIOGRAMMES POUR UNE PREVENTION EFFICACE DE LA COCCIDIOSE DU POULET

Naciri Muriel1, De Gussem Koen2, Fort Geneviève1, Bernardet Nelly1, Nérat Fabienne2, Chaussé Anne

Marie1

1 INRA – UR 86 Bio-Agresseurs Santé et Environnement, 37380 Nouzilly – France 2 ALPHARMA Uitbreidingstraat 86, B-2600 Antwerpen – Belgique

Résumé Un anticoccidiogramme ou AST pour Anticoccidial Sensitivity Test, est un test effectué chez des poulets élevés en cages pour évaluer la sensibilité d'un isolat de coccidies du terrain à différents anticoccidiens. Au préalable, une identification et une quantification des espèces de coccidies présentes sont nécessaires ; elles permettent d’appréhender le pouvoir pathogène de l’isolat. L'interprétation des résultats de l’AST, en fonction de l'historique des anticoccidiens utilisés dans les élevages, permet d'établir une stratégie à mettre en place pour le contrôle de la coccidiose sur le terrain (rôle prédictif de l'AST). Au cours des années 2001 et 2002, 30 souches de coccidies provenant d'Europe (27), d'Afrique (2) et du Moyen Orient (1) ont été testées pour leur sensibilité à 6 anticoccidiens. Narasin 70 ppm, maduramicine 5 ppm, monensin 100 ppm, salinomycine 60 ppm, robénidine 33 ppm et lasalocide 90 ppm étaient le plus souvent testés, mais l'un d'eux était parfois remplacé par la nicarbazine 125 ppm ou la nicarbazine-narasin 40-40 ppm. Un bilan sur ces 2 années permet de dégager un profil d'activité des différents anticoccidiens. Introduction La coccidiose est une maladie parasitaire toujours d’actualité dans les élevages de poulets quel que soit le type d’élevage considéré. Si des mesures hygiéniques très rigoureuses peuvent réduire le risque de coccidiose, elles sont le plus souvent insuffisantes ; l’élevage industriel s’est développé et existe encore aujourd’hui grâce à l’utilisation d’anticoccidiens dans l’aliment (produits de synthèse et ionophores). Cependant, 50 années d’utilisation de ces produits ont conduit à l’apparition de souches résistantes et compte tenu de l’absence de nouvelles molécules, leur utilisation sur le terrain doit être raisonnée pour éviter une usure trop rapide. Des procédés empiriques, de rotation ou d’alternance des anticoccidiens (shuttle program) ont montré leur efficacité. Pour optimiser ces procédés et pour aider l’éleveur dans la sélection de programmes anticoccidiens optima, des anticoccidiogrammes ou tests de sensibilité aux anticoccidiens (AST) des souches terrain peuvent être réalisés. Ils consistent à tester l'efficacité du ou des anticoccidiens utilisés, et de les comparer aux autres molécules existant sur le marché. En fonction des résultats, l’éleveur décide s’il peut poursuivre avec le programme qu’il utilise, ou s’il est préférable de changer pour un autre programme montrant une meilleure efficacité. Pendant 2 ans (2001 - 2002), nous avons testé la sensibilité aux anticoccidiens de 30 isolats de coccidies provenant d'Europe (27/30), d'Afrique (2) et du Moyen Orient (1). Nous présentons des résultats et

les discutons illustrant l'intérêt de l'utilisation de ce test. 1. Intérêt d'un AST Un AST permet : a - d'identifier les différentes espèces de coccidies présentes dans des échantillons du terrain, b – de les quantifier, c - d'évaluer leur pouvoir pathogène, d - d'évaluer et comparer l'efficacité de différents anticoccidiens, e - et enfin, d'établir une stratégie d'action contre la coccidiose dans les élevages concernés. 2. En bref, procédure d'un AST 2.1. Préparation de l'inoculum A réception des échantillons du terrain, provenant de différents élevages d'une même intégration, les oocystes sont comptés à l'aide d'une cellule de MacMaster. Ils sont ensuite isolés des matières fécales, mis en suspension dans du bichromate de potassium à 2% puis mis à sporuler à 27-28°C dans un bain marie agité pendant 48h. Les oocystes sont identifiés par morphométrie et PCR et le pourcentage des différentes espèces est calculé. Après sporulation, les oocystes sont à nouveau comptés, pour préparer un inoculum et les multiplier chez des poulets naïfs recevant un aliment sans anticoccidien afin d'obtenir un nombre suffisant d'oocystes pour l'AST.

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

2.2. AST Lors de chaque AST, 6 lots traités sont comparés entre eux et comparés à deux lots témoins non traités : l’un inoculé et l’autre non inoculé. Les anticoccidiens le plus souvent testés sont : la robénidine (produit de synthèse) et 5 ionophores : le narasin 70 ppm, la maduramicine 5 ppm, le monensin 100 ppm, la salinomycine 60 ppm et le lasalocide 90 ppm. L'un d'entre eux est parfois remplacé par la nicarbazine 125 ppm (produit de synthèse), ou la nicarbazine-narasin 40-40 ppm. Des poussins mâles d'1 jour (Ross), vaccinés contre la bronchite infectieuse, sont achetés à un couvoir puis élevés en batterie chaude avec un aliment démarrage du commerce sans anticoccidien jusqu'à 11 jours. A 11 jours, les poulets sont répartis en fonction de leur poids afin que le poids moyen de chaque lot soit identique. Chaque lot est constitué de 3 répétitions de 6 poulets. Les aliments témoins et supplémentés sont fabriqués à la Station de Recherches Avicoles de l’INRA de Nouzilly. Ils sont distribués ad libitum de 11 à 26 jours aux poulets. Ces derniers sont inoculés à 18 jours, par voie orale, avec la souche terrain. A 18 et 25 jours, les poulets et l’aliment sont pesés. A 25 jours la moitié des poulets est tuée pour noter (de 0 à 4) les lésions coccidiennes intestinales selon la méthode des scores lésionnels de Johnson et Reid 1970 ; l'autre moitié est conservée 1 jour pour mesurer l'excrétion d'oocystes de J23 à J26. La sensibilité des coccidies aux anticoccidiens est évaluée par des critères parasitologiques (mortalité, scores lésionnels et excrétion d'oocystes), et zootechniques (gain de poids, consommation d'aliment et indice de conversion). Une analyse statistique des résultats est effectuée : GLM ANOVA du logiciel Simstat à p<0.05 pour les données zootechniques et test de Kruskall-Wallis pour les lésions, suivis d’un test de comparaison de moyennes (test de Newman Keuls). 3. Identification et quantification des espèces d'Eimeria Avant la réalisation de l’AST proprement dite, les différentes espèces de coccidies présentes dans l’isolat doivent être identifiées et comptées afin de tenir compte du pouvoir pathogène de chacune d’elles pour la préparation de l’inoculum. Elles sont identifiées par observation, au microscope optique, de la morphologie des oocystes et par la mesure de leur taille (longueur x largeur en µm). Les tailles des 7 espèces de coccidies, reconnues comme valides chez le poulet, se chevauchent et rendent difficile l'identification. Sachant que les trois principales espèces rencontrées sur le terrain sont E. acervulina, E. maxima et E. tenella un premier classement dans ces 3 catégories est effectué puis l'identification des espèces est confirmée, ou améliorée par l'observation des lésions chez les

poulets servant à la multiplication des coccidies de l'isolat. S’il est vrai qu’en infection monospécifique chaque espèce à une localisation précise dans l’intestin et des lésions caractéristiques (excepté E. praecox et E. mitis), les lésions d’E. maxima sont parfois difficiles à noter dans les cas d’infections multiples. Alors, au cours des ASTs, pour juger de l’efficacité des anticoccidiens sur cette espèce, les lésions sont notées mais en plus, les oocystes, faciles à reconnaître par leur grande taille, sont distingués parmi les oocystes totaux excrétés. Afin d’améliorer l'identification des espèces, nous utilisons depuis quelques mois la technique de PCR. L’ADN des coccidies présentes dans l’isolat est amplifié en présence d’amorces spécifiques complémentaires de la séquence ITS1 comprise entre les gènes codant pour les ARN ribosomaux 16S et 5,8S des Eimeria. Un marqueur de taille (absent sur la Figure 1) et des témoins positifs de chaque espèce (ADN d’une souche pure) sont utilisés pour s’assurer de la fiabilité de la réaction. Nous ne disposons pas encore de témoins positifs pour E. mitis et E. praecox. Les résultats (Figure 1) montrent que l’isolat analysé renferme des oocystes de 4 espèces : E. maxima, E. tenella, E. acervulina et, probablement, E. mitis. FIGURE 1 : Identification des espèces d’Eimeria par

PCR E. ma E. a E. n E. b E. mi E. p E. t

AST AST + AST + AST +AST +AST + AST

Quelques points techniques restent encore à mettre au point, cependant, d’ores et déjà, la PCR qualitative a permis de confirmer la présence d'E. mitis (non pathogène) et d'E. brunetti (pathogène) dont la présence en faible nombre dans certains échantillons était soupçonnée. La quantification est réalisée par comptage au microscope d’une centaine d’oocystes. Le pourcentage « approximatif » (compte tenu du chevauchement des tailles) de chaque espèce est alors calculé. Nos efforts portent à présent sur la mise au point d’une PCR quantitative. 4. Estimation du pouvoir pathogène Le pouvoir pathogène des coccidies dans un élevage est fonction des espèces présentes et des quantités qui seront ingérées ; il dépend aussi de la réceptivité du poulet et de l’environnement. Pour chaque AST, l’inoculum est préparé en fonction des espèces présentes et le pouvoir pathogène est estimé par

l'importance des lésions et la chute de poids induite chez les poulets infectés non traités (INT) par rapport aux poulets non infectés non traités (NINT). L'inoculum est préparé pour induire une chute significative du gain de poids (d'au moins 20%) sans induire de mortalité excessive (<20%). 5. Evaluation et comparaison de l'efficacité des anticoccidiens : rôle prédictif de l’AST Un isolat de coccidies prélevé en mars 2002 aux Pays Bas est pris comme exemple. Les espèces présentes ont été identifiées et quantifiées comme E. acervulina à 55%, E. maxima à 14% et E. tenella à 31%. Les résultats zootechniques et parasitologiques sont synthétisés Tableau 1. L’inoculum a induit chez les poulets du lot INT une chute du gain de poids de 42.6% sans mortalité. Deux poulets sont morts, l’un 5 Jpi dans le lot salinomycine, le deuxième à 6 Jpi dans le lot nicarbazine-narasin. Les gains de poids journaliers des lots traités avec le lasalocide, la robénidine et la nicarbazine-narasin sont significativement améliorés (p<0.05) par rapport au lot INT ; ils restent cependant significativement différents du lot NINT (p<0.05). Les indices de conversion sont numériquement diminués dans tous les lots traités mais ne sont pas significativement différents du lot INT. Les lésions dues à E. acervulina sont significativement réduites par tous les anticoccidiens. Seul le lasalocide réduit significativement les lésions dues à E. tenella. Contre E. maxima, le monensin, la salinomycine, le lasalocide et surtout la robénidine réduisent significativement les lésions. La robénidine réduit l’excrétion d’oocystes d’E. maxima à un niveau inférieur au seuil de détection. L’excrétion totale d’oocystes est numériquement augmentée dans certains lots traités ; elle est numériquement réduite par la nicarbazine-narasin et la salinomycine. La sensibilité de chaque espèce de coccidies aux anticoccidiens testés est mentionnée Tableau 1. Selon la définition de McDougald et al (1986) une souche de coccidies est résistante si la réduction du score lésionnel par rapport au lot INT est inférieure ou égale à 30%, elle est partiellement résistante ou sensible si la réduction est supérieure à 30 % et inférieure à 50% et elle est pleinement sensible si la réduction est égale ou supérieure à 50%. Chapman (1980) définit un isolat comme résistant à un anticoccidien si le gain de poids des poulets traités n’est pas significativement différent de celui des poulets du lot INT et de sensibilité réduite si le gain de poids est significativement différent des 2 lots témoins INT et NINT. Au vu des résultats de l’AST, quelle stratégie envisager pour améliorer les performances ? L’intégrateur avait observé des baisses de performances sans problème de coccidiose grave. Il utilisait depuis 3 ans un shuttle program nicarbazine/salinomycine. Les 2 morts ont été

observés dans les lots nicarbazine-narasin et salinomycine. Si ces 2 produits utilisés sur le terrain sont encore efficaces contre E. acervulina, ils se révèlent complètement inefficaces contre E. maxima et E. tenella (espèce très pathogène présente à 31% dans l’isolat). Si l’on considère la définition de Chapman l’isolat est résistant à la salinomycine, le monensin et la maduramicine et partiellement résistant à la nicarbazine-narasin. Parmi les anticoccidiens testés, le choix d’un programme efficace est restreint ; les résultats de l’AST indiquant plutôt dans le cas de cet isolat les anticoccidiens à ne pas utiliser. L’isolat est partiellement résistant aux 2 produits de synthèse testés (nicarbazine-narasin et robénidine). Compte tenu des 3 années d’utilisation de la nicarbazine, un changement pour la robénidine pourrait être bénéfique compte tenu de ses résultats sur le développement parasitaire (absence de mortalité, suppression de l’excrétion d’E. maxima) et du gain de poids numériquement légèrement supérieur. L’amélioration du gain de poids apportée par la robénidine est de 45.5% vs 33.0% pour la nicarbazine-narasin. D’autres produits de synthèse comme l’halofuginone ou le diclazuril peuvent être utilisés mais ils n’ont pas été testés. Parmi les ionophores, seul le lasalocide réduit les lésions induites par les 3 espèces et améliore significativement le gain de poids de 58.3%. 6. Bilan de 30 AST : profil d’activité des anticoccidiens Nos résultats portant sur l'examen de 30 isolats du terrain confirment que l'espèce la plus prévalente est E. acervulina retrouvée dans tous les isolats. Elle est rarement seule (1/30), parfois associée à E. tenella (2/30), à E. maxima (3/30), à E. maxima et E. brunetti (1/30), à E. maxima, E. tenella et E. brunetti (5/30) mais le plus souvent associée à E. maxima et E. tenella (18/30). Sachant que peu d’intérêt est porté à E. mitis, considérée comme non pathogène, les 3 principales espèces rencontrées sur le terrain sont donc bien E. acervulina, E. maxima et E. tenella mais il faut noter l’émergence d’E. brunetti. Dans les isolats mixtes, E. acervulina est généralement prédominante (58%) suivie par E. tenella (27%) puis en plus faible nombre E. maxima (11%) et E. brunetti (4%). E. brunetti espèce pathogène, est retrouvée dans 20% des isolats (6/30). Elle est présente en moyenne à 10% dans ces 6 isolats ; il sera intéressant de suivre son évolution. Concernant le pouvoir pathogène des isolats, le nombre moyen d’oocystes inoculés par poulet était de 200 000 E. acervulina, 20 000 E. maxima et 21 000 E. tenella. Ces inoculums ont toujours induit des coccidioses sévères puisque la chute de gain de poids moyenne est de 53% comprise entre 34.3% et 69.5%. Le profil moyen d’activité des anticoccidiens testés est montré Figure 2. Narasin, nicarbazine-narasin et nicarbazine ont été testés dans seulement 19, 7 et 6 AST respectivement. Des réductions de plus de 30%

Cette synthèse montre l’amplitude de la résistance sur le terrain mais son interprétation est limitée car

des scores lésionnels sont observées avec le lasalocide et la nicarbazine contre E. tenella, et E. maxima, avec tous les anticoccidiens excepté la narasin et la maduramicine contre E. acervulina.

les résultats doivent être discutés en fonction des anticoccidiens utilisés.

Seuls la nicarbazine et le lasalocide diminuent fortement l’excrétion d’oocystes d’E. maxima. Les excrétions totales d’oocystes ne sont pas fortement diminuées par les ionophores ; elles sont même parfois plus élevées. Aucun anticoccidien ne comble la chute du gain de poids engendrée par le développement parasitaire. Les meilleures améliorations sont notées pour les anticoccidiens de synthèse et pour le lasalocide.

L’AST est un outil précieux au sein d’une intégration pour inventorier les coccidies et décider d’un programme anticoccidien en fonction des résultats et des produits utilisés au préalable. Références bibliographiques Chapman H.D., 1998. Intern.J.Parasitol., 28:1141-4 Johnson J., Reid W.M. 1970. Exp. Parasitol.28:30-6 McDougald L.R., Fuller L., Solis J. 1986. Avian Dis. 30:690-69

TABLEAU 1 : Résultats zootechniques et parasitologiques d’un AST obtenus à J25 chez des poulets Ross

inoculés à J18 avec 237 000 oocystes sporulés (200 000 E. acervulina, 20 500 E. maxima et 16 500 E. tenella) provenant d’un isolat Néerlandais

GP/P/J 2* (g)

J18-25 Scores lésionnels

(J25) Lots 1*

1R %

²AA %

Al/P/J 3* (g)

J18-25

IC 4*

18-25 E. a E. m E. t

Ooc/P/J x 106

E. m Ooc/P/J x 106

Mort Mort

NINT NINT INT INT Nic-Nar Nic-Nar Mad. Mad. Mon. Mon. Sal. Sal. Rob. Rob. Las. Las.

73.2 a 73.2 a 42.0 d 42.0 d 52.3 bc 52.3 bc 48.7 cd 48.7 cd

50.2 bcd 50.2 bcd 49.0 cd 49.0 cd 56.2 bc 56.2 bc 60.2 b 60.2 b

42.6 42.6 28.6 28.6 33.6 33.6 31.4 31.4 33.1 33.1 23.2 23.2 17.8 17.8

33 33 21.5 21.5 26.3 26.3 22.4 22.4 45.5 45.5 58.3 58.3

113.7 ab3113.7 ab3

94.3 c 94.3 c 102.5 abc102.5 abc101.2 abc101.2 abc99.0 bc 99.0 bc 94.8 c 94.8 c

110.9 abc110.9 abc117.6 a 117.6 a

1.55 b1.55 b2.25 a 2.25 a 1.96 a 1.96 a 2.08 a 2.08 a 1.97 a 1.97 a 1.93 a 1.93 a 1.99 a 1.99 a 1.97 a1.97 a

- - 3.8 3.8

2.0 SR4 2.0 SR4 2.1 SR 2.1 SR 1.8 S 1.8 S 1.7 S 1.7 S 1.9 S 1.9 S 1.4 S 1.4 S

- - 2.5 2.5

2.8 R 2.8 R 2.0 R 2.0 R

1.4 SR 1.4 SR 1.6 SR 1.6 SR 0.6 S 0.6 S

1.6 SR 1.6 SR

- - 3.1 3.1

3.3 R 3.3 R 3.2 R 3.2 R 2.4 R 2.4 R 3.2 R 3.2 R 3.1 R 3.1 R

1.9 SR 1.9 SR

- - 338.9 338.9 235.5 235.5 339.4 339.4 334.7 334.7 272.6 272.6 421.0 421.0 504.4 504.4

- - 3.7 3.7 6.4 6.4 9.1 9.1

11.8 11.8 15.7 15.7 0.0 0.0 2.4 2.4

0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0

Chaque lot comporte 3 répétitions de 6 poulets. NINT = Non inoculé non traité ; INT = Inoculé non traité ; Les 6 autres lots sont inoculés traités : Nic-Nar = nicarbazine 40 ppm + narasin 40 ppm ; Mad. = maduramicine 5 ppm ; Mon. = monensin 100 ppm ; Sal. = salinomycine 60 ppm ; Rob. = robénidine 33 ppm ; Las. = lasalocide 90 ppm. 1* GP/P/J = gain de poids par poulet et par jour. 2* Al/P/J = aliment consommé par poulet et par jour. 3 * IC = indice de conversion. E. a = E. acervulina; E. m = E. maxima ; E. t = E. tenella. Ooc/P/J = nombre d’oocystes excrétés par poulet et par jour. 1 R : réduction du gain de poids (GP) moyen de chaque lot en pourcentage du GP du lot NINT (NINT = 100%). ² AA : amélioration apportée par le traitement (NINT – INT = 100%) . 3 Test de Newman Keuls : dans une colonne, les valeurs suivies d’une lettre différente sont significativement différentes (p<0.05). 4 S = sensible ; R = résistante ; SR = sensibilité réduite

Chaque lot comporte 3 répétitions de 6 poulets. NINT = Non inoculé non traité ; INT = Inoculé non traité ; Les 6 autres lots sont inoculés traités : Nic-Nar = nicarbazine 40 ppm + narasin 40 ppm ; Mad. = maduramicine 5 ppm ; Mon. = monensin 100 ppm ; Sal. = salinomycine 60 ppm ; Rob. = robénidine 33 ppm ; Las. = lasalocide 90 ppm. 1* GP/P/J = gain de poids par poulet et par jour. 2* Al/P/J = aliment consommé par poulet et par jour. 3 * IC = indice de conversion. E. a = E. acervulina; E. m = E. maxima ; E. t = E. tenella. Ooc/P/J = nombre d’oocystes excrétés par poulet et par jour. 1 R : réduction du gain de poids (GP) moyen de chaque lot en pourcentage du GP du lot NINT (NINT = 100%). ² AA : amélioration apportée par le traitement (NINT – INT = 100%) . 3 Test de Newman Keuls : dans une colonne, les valeurs suivies d’une lettre différente sont significativement différentes (p<0.05). 4 S = sensible ; R = résistante ; SR = sensibilité réduite

FIGURE 2 : Profils d’activité des anticoccidiens vis-à-vis de 30 isolats du terrain : amélioration des gains de poids et réduction des scores lésionnels

FIGURE 2 : Profils d’activité des anticoccidiens vis-à-vis de 30 isolats du terrain : amélioration des gains de poids et réduction des scores lésionnels

0

20

40

60

nar mad mon sal rob las nic-nar nic

% d

'am

élio

ratio

n*

GP

E. t

E. a

E. m

En ordonnées : Pourcentages d’amélioration apportés par l’utilisation des anticoccidiens : réduction de la chute de gain de poids (GP) et réduction des scores lésionnels par rapport au lot infecté non traité. E. a = E. acervulina; E. m = E. maxima ; E. t = E. tenella

MECANISMES DE RESISTANCE AUX QUINOLONES DES ESHERICHIA COLI AVIAIRES

Baucheron S., Mouline C., Payot S., Cloeckaert A., Chaslus-Dancla E.

INRA, UR86 BASE, 37380, Nouzilly, France Résumé Les mécanismes de résistance aux quinolones ont été recherchés pour 45 isolats cliniques issus d'une collection de 1601 souches d' E. coli et représentatifs des phénotypes de résistance à cette famille d’antibiotiques. Deux mécanismes de résistance ont été mis en évidence, un mécanisme spécifique aux quinolones, dû à un cumul de mutations dans les gènes cibles gyrA et parC, ainsi qu'un mécanisme pluri-spécifique d’efflux conférant une résistance multiple à différentes familles d’antibiotiques, caractérisé par l’expression du système d’efflux AcrAB-TolC. L’implication de ce système d’efflux a été confirmée à l’aide d’un inhibiteur de pompe d’efflux. Introduction La colibacillose est une des premières pathologies bactériennes en élevage avicole, entraînant des conséquences économiques importantes. L’antibiothérapie qui est une des stratégies de contrôle, peut être à l’origine de la sélection de bactéries résistantes.

Les quinolones sont des substrats pour les systèmes d’efflux, représentés principalement par le système AcrAB-TolC chez E. coli. (Nikaido, 1996). Ce dernier est composé de 3 protéines : (i) le transporteur, AcrB, est une protéine de la famille RND qui est insérée dans la membrane cytoplasmique, (ii) une protéine de la membrane externe, TolC, constituant un tunnel entre le périplasme et l’extérieur, (iii) la lipoprotéine périplasmique, AcrA, permettant la liaison entre AcrB et TolC. Dans le cadre du projet européen « Escherichia coli

pathogenic for poultry (APEC) : molecular approaches for improved diagnosis and control » (Dho-Moulin et al., 2001), le phénotype de résistance à 14 antibiotiques appartenant à 6 familles différentes a été déterminé pour 1601 souches d’E. coli. Ces souches provenaient de 3 pays, Belgique (91), Espagne (536), France (974) et ont été principalement isolées de poulets (974), dindes (408), canards (159), entre les années 1991 et 2000. Cette étude a confirmé les hautes fréquences de résistance aux tétracyclines (83,8%), streptomycine (52,8%), triméthoprime (45,7%), amoxicilline (44,8%) et acide nalidixique (38,3%). L'évolution de la résistance aux quinolones a été analysée sur 2 groupes de souches isolées soit avant, soit après 1995. En France, la fréquence de résistance à toutes les quinolones a diminué (résistance à l'enrofloxacine de 7,1% à 2,5%). En Espagne, une augmentation a été observée pour toutes les quinolones (résistance à l'enrofloxacine de 10,3% à 41,9%) (Chaslus-Dancla et al., 2002).

Chez E. coli, un haut niveau de résistance aux fluoroquinolones est corrélé à la présence de mutations multiples dans les QRDR des gènes cibles et à la surproduction du système d'efflux AcrAB-TolC. L'objectif de cette étude était de déterminer les mécanismes de résistance aux quinolones pour des souches d'E. coli appartenant à cette collection européenne. 1. Matériels et méthodes 1.1. Souches bactériennes - 40 souches ont été sélectionnées sur le critère de résistance à l’acide nalidixique (diamètres des zones d’inhibition de 6 à 9 mm), puis sur des valeurs croissantes de concentration minimale inhibitrice (CMI) d’enrofloxacine, correspondant à différents phénotypes de sensibilité ou de résistance à cet antibiotique.

Les cibles des quinolones sont l'ADN gyrase et la topoisomérase IV qui sont composées de 2 fois 2 sous-unités codées respectivement par les gènes gyrA, gyrB et parC, parE. La résistance aux quinolones est généralement corrélée à des mutations au niveau de la région appelée Quinolone Resistance Determining Region (QRDR) des gènes gyrA et parC. Les substitutions les plus fréquemment détectées sont Ser83 (en Leu, Tyr, ou Ala) et Asp87 (en Asn, Gly, His ou Tyr) pour gyrA (Everett et al., 1996), Ser80 (en Arg ou Ile) et Glu84 (en Gly ou Lys) pour parC (Heisig, 1996).

- 5 souches témoins ont été choisies pour leur sensibilité à l’acide nalidixique. 1.2. Détermination des CMI Les CMI ont été déterminées en gélose Mueller-Hinton, en utilisant des dilutions sériées de raison 2 des antibiotiques à tester et avec des inocula bactériens de 104 UFC. La CMI est définie comme la

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

2. Résultats plus faible concentration d’antibiotique inhibant toute croissance visible après 18 H d’incubation à 37°C. Les antibiotiques ont été utilisés seuls ou en présence de l’inhibiteur de pompes d’efflux (EPI) Phe-Arg beta naphthylamide (Sigma) à la concentration optimale de 80 milligrammes par litre (mg/l) (tableau 1).

La détection des mutations au niveau des QRDR des gènes cibles, par AS-PCR-RFLP et leur identification par séquençage a permis de classer les souches en 5 groupes, de 0 à 4 mutations (tableau 3) : Les concentrations critiques (c et C, en mg/l) définies

par le Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CASFM) ou par les fabricants, permettent de classer les souches comme sensibles (CMI ≤ c), intermédiaires (c < CMI ≤ C), ou résistantes (CMI > C) (tableau 1).

- le groupe ne comportant aucune mutation dans les gènes cibles correspond aux souches témoins, sensibles à l’acide nalidixique et à l’enrofloxacine, - les souches ayant acquis 1 mutation au niveau de gyrA, sont résistantes à l’acide nalidixique et sensibles à l’enrofloxacine, - les souches portant 1 mutation au niveau de gyrA et 1 mutation au niveau de parC, montrent un haut niveau de résistance à l’acide nalidixique et sont de sensibilité intermédiaire à l’enrofloxacine,

1.3. Amplifications par PCR et séquençage des QRDR des gènes gyrA et parC Les PCR ont été réalisées à partir de cultures développées à 37°C sur gélose BHI, pendant 18 heures.

- les souches ayant 2 mutations dans gyrA et 1 ou 2 mutations dans parC montrent un haut niveau de résistance à l’acide nalidixique et à l’enrofloxacine, Une colonie a été mise en suspension directement

dans 25 µl du mélange réactionnel composé de 25 pmoles de chacune des amorces (tableau 2), 200 µM de chaque dNTP (Promega), 1,5 mM de MgCl2 et 0,25 unité de Taq polymérase (Promega). Après une dénaturation initiale de l’ADN à 94°C pendant 3 min, 30 cycles d’amplification ont été réalisés, chacun consistant en 1 min de dénaturation à 94°C, 1 min d’hybridation (températures tableau 2) et 1 min d’élongation à 72°C, se terminant par une étape d’extension de 10 min à 72°C.

- deux souches seulement portent 2 mutations dans gyrA et 2 mutations dans parC. Les modifications sont acquises successivement et de façon cumulative au niveau du codon 83 (gyrA), puis du codon 80 (parC) et enfin au niveau du codon 87 (gyrA), selon le modèle ping-pong (Heisig, 1996).

Après purification (Qiaquick spin PCR purification kit, Qiagen S.A.), les produits PCR ont été séquencés (Génome Express, Grenoble, France). L’analyse des séquences a ensuite été réalisée à l’aide des programmes suivants: BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), FASTA (http://www2.ebi.ac.uk/fasta3/), et CLUSTALW (http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/).

La part de l’efflux a été mesurée à l’aide de l’inhibiteur de pompe d’efflux (EPI) Phe-Arg beta naphthylamide qui, ajouté aux fluoroquinolones et en particulier à l’enrofloxacine, a permis de diminuer les CMI d’un facteur de 8 à 64 (tableau 3). Pour les souches ne portant pas plus de 3 mutations dans les gènes cibles, l’utilisation de l’EPI en association avec l’enrofloxacine, permet de retrouver des phénotypes de sensibilité ou intermédiaire à l’enrofloxacine. Les immuno-empreintes comparées de la protéine AcrA permettent de conclure à un niveau équivalent d’expression pour l’ensemble des souches sensibles ou résistantes (tableau 3).

1.4. Détection des mutations dans les gènes gyrA et parC, par AS-PCR-RFLP

Les plus hauts niveaux de résistance (CMI >1024 pour l’acide nalidixique et CMI de 128 pour l’enrofloxacine) correspondent à l’accumulation des 4 mutations dans les gènes cibles (2 dans gyrA et 2 dans parC) et à la participation du mécanisme d’efflux.

Les amplifications du fragment de gyrA ont été réalisées comme décrit ci-dessus mais avec 3 amorces, 25 pmoles de chacune des amorces GyrA1 et ECAS-81 et 50 pmoles de ECGyrA-HinfI/87. Les produits d’amplification digérés par HinfI et non digérés ont été analysés comme décrit précédemment (Giraud et al., 1999). De même les modifications du codon 80 de parC ont été détectées après digestion par HaeII du fragment amplifié, une mutation à ce niveau provoquant la disparition d’un site de restriction (Giraud et al., 1999).

Conclusion Les mécanismes de résistance aux quinolones ont été déterminés pour un ensemble de souches représentatives des différents phénotypes de résistance aux quinolones des souches de la collection européenne d'E. coli aviaires. Ils correspondent aux mutations dans les gènes cibles gyrA et parC, ainsi qu'à la surexpression du système d’efflux AcrAB-TolC. Il a été confirmé qu’un haut niveau de résistance aux fluoroquinolones est associé à la fois à la présence de mutations cumulées dans les QRDR des gènes cibles gyrA et parC et au système d'efflux

1.5. Mesure de l’expression de la protéine AcrA du système d’efflux par Western blot Le western blot a été réalisé comme décrit précédemment (Giraud et al., 2000).

Références bibliographiques actif AcrAB-TolC. Il semble toutefois que le mécanisme principal de résistance aux quinolones corresponde aux mutations dans les gènes cibles, comme pour Campylobacter chez qui une seule mutation dans gyrA induit un haut niveau de résistance (Payot et al., 2002), alors que l’efflux serait un mécanisme secondaire, contrairement à la situation décrite chez Salmonella (Giraud et al., 2000 ; Baucheron et al., 2002).

- Baucheron S., Imbrerechts H., Chaslus-Dancla E. et Cloeckaert A., 2002, Microb. Drug Resist., 4, sous presse. - Chaslus-Dancla E., Baucheron S., Biet F., Blanco J., Mainil J., Oswald E., Dho-Moulin M., 2002, 11th European Poultry Conference, p.57.

L’usage des fluoroquinolones en élevage peut conduire à la sélection de souches exprimant des mécanismes pluri-spécifiques et leur conférant des propriétés de résistance multiple.

- Dho-Moulin M., Chaslus-Dancla E., Oswald E., Blanco J., Mainil J., Biet F., 2001, 4è J.R.A., 427-429. - Everett M.J., Jin Y.F., Ricci V. et Piddock L.J., 1996, Antimicrob. Agents Chemother., 40, 2380-2386. Ces résultats soulignent la nécessité de maintenir la

surveillance de la résistance aux antibiotiques, et, en particulier, de suivre l’émergence de souches à haut niveau de résistance aux fluoroquinolones qui pourraient éventuellement passer dans la chaîne alimentaire. Cependant, afin d’éviter cette émergence, il faudrait tendre vers une utilisation raisonnée des antibiotiques.

- Giraud E., Brisabois A., Martel J.L., Chaslus-Dancla E., 1999. Antimicrob. Agents Chemother., 43, 2131-3127. - Giraud E., Cloeckaert A., Kerboeuf D., Chaslus-Dancla E., 2000. Antimicrob. Agents Chemother., 44, 1123-1228. - Heisig P., 1996. Antimicrob. Agents Chemother., 40, 879-885.

- Nikaido H., 1996. J. Bacteriol., 179, 5853-5859. - Payot S., Cloeckaert A., Chaslus-Dancla E., 2002. Microb. Drug Resist., 4, sous presse.

- Webber M., Pïddock L.J.V., 2001, Vet. Res., 32, 275-284.

TABLEAU 1: valeurs des concentrations critiques des antibiotiques utilisés

Concentrations critiques (mg/l) Antibiotiques c C

Acide nalidixique (Sigma, Steinheim, Germany)

8 16

Fluméquine (Sigma)

4 8

Enrofloxacine (Bayer AG)

1 2

Ciprofloxacine (Bayer AG)

1 2

Florfénicol (Schering-Plough Animal Health, Kenilworth, N.J)

8 16

TABLEAU 2 : amorces utilisées pour les PCR et le séquençage

Amorces Séquences Utilisation Températures d’hybridation

Nombre de nucléotides des fragments amplifiés

GyrA12 CGTTGATGACTTCCGTCAG séquençage GyrA1 TGTCCGAGATGGCCTGAAGC séquençage et PCR ECAS-81 GGTAAATACCATCCCCATG PCR ECGYRA-HinfI/87

ATATAACGCAGCGAGAATGGCTGCGCCATGCGGACGATCGAG

PCR

55

57

470

195 et 80

ParC1 ATGAGCGATATGGCAGAGCG PCR et séquençage ParC2 TTCACGCAGGTTATGCGGTGG PCR et séquençage

55 560

TABLEAU 3 : résultats des CMI, mutations dans les gènes cibles et expression de AcrA

Gammes de CMI (mg/l) Mutations des gènes cibles Nombre de mutations Acide

nalidixique

Enrofloxacine Enrofloxacine

+ EPI

gyrA

parC

Niveau d’expression

de AcrA

Nombre de souches testées

0 < 4 0,06 – 0,125 < 0,015 - - + 5 1 64 – 256 0,5 – 1 0,03 S 83 L - + 9 2 > 1024 1 – 8 0,06 – 0,25 S 83 L S 80 R + 9 3 > 1024 8 – 64 0,5 – 2 S 83 L – D 87 N S 80 R + 20 4 > 1024 128 8 S 83 L – D 87 N S 80 R – E 84 G + 2

PREMIERES DONNEES SUR LE CYCLE VIRAL DE L’ADENOVIRUS CELO CHEZ SON HOTE : LE POULET

Le Goff Frédérick, Langlois Patrick

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments, Zoopôle, les Croix BP53, 22440 Ploufragan

Résumé Les principaux organes infectés in vivo par l’adénovirus aviaire CELO ont été déterminés par PCR et RT-PCR. Trois sites de multiplication ont été identifiés : la trachée, les cæca et la bourse de Fabricius. L’utilisation de deux virus recombinants possédant les gènes rapporteurs de la luciférase et de la SEAP (Secreted Alcaline Phosphatase) ont permis de confirmer ces résultats et de montrer la clearance du virus. Des infections in vitro par un virus recombinant produisant la GFP (Green Fluorescent Protein) sur des isolements de populations lymphoblastiques à partir d’amygdales cæcales et du sang total ont montré qu’un type cellulaire était infectable. Les cellules, dont la fréquence d’infection est faible, ont une morphologie proche de celle des macrophages, monocytes, ou de cellules dendritiques. de la VP2, ainsi que des virus recombinants exprimant

les gène rapporteurs codant pour la GFP (Green Fluorescent Protein) et la luciférase. 107pfu de chacun ont été inoculés à chaque poussin. Un dernier virus recombinant porteur du gène codant pour la SEAP (SEcreted Alkaline Phosphatase) a été inoculé par voie orale et par dermojet à des poulets (SPF de Ploufragan) de six semaines à la dose de 107pfu par poulet. Les poulets (PA12) utilisés pour les isolements lymphocytaires proviennent de l’INRA de Jouy en Josas.

Introduction Comme les adénovirus humain de type 2 et 5, l’adénovirus aviaire de sérotype 1 ou CELO (Chicken Embryo Lethal Orphan) possède toutes les caractéristiques nécessaires pour être utilisé comme vecteur de transfert de gènes, pour la vaccination avicole. Ce virus à ADN double brin linéaire est déjà décrit (Laver, 1971 ; Chiocca, 1996 ; Chiocca, 1997 ; Lehrmann, 1999 ; Michou, 1999). Stable, sous forme d’épisome, il se prête facilement aux manipulations génétiques in vitro, et n’est associé à aucune pathologie majeure du poulet. Des travaux précédents ont permis d’établir la séquence des 43804 pb du CELO (Chiocca, 1996) et la carte de transcription de son génome (Payet, 1998). Des outils moléculaires nécessaires à la fabrication de virus recombinants à partir de cosmides ont été mis au point au laboratoire (François, 2001). Enfin, des essais in vivo ont mis en évidence un effet vaccinant d’un virus recombinant exprimant le protéine majoritaire de la capside (VP2) du virus de Gumboro (François, résultats non publiés). Dans le cadre de l’utilisation du virus comme vecteur, il est essentiel aujourd’hui de savoir quelles sont les cellules cibles in vivo chez le poulet, ceci pour le virus sauvage et/ou les virus recombinants utilisés.

1.2. Fabrication des virus recombinants La Figure 1 décrit la méthode d’obtention des virus recombinants. Le génome du CELO peut être divisé en quatre parties. Des délétions ont été effectuées dans le Fragment A et le Fragment D et les gènes d’intérêts (VP2, GFP, SEAP et luciférase) y ont été insérés. 1.3. Analyses effectuées Des analyses par PCR et RT-PCR ont été effectuées sur les ADN et ARN des organes des poussins inoculés par les virus wt et les virus recombinants VP2. Les gènes rapporteurs de la luciférase et de la SEAP ont été analysés sur les organes et le sérum des poulets par chimiluminescence. Les isolements lymphocytaires sont réalisés sur gradient de ficoll à partir d’amygdales cæcales et de sang total de poulets non infectés. Après mise en culture, les cellules sont infectées in vitro par un recombinant GFP à une MOI de 10 pour les amygdales cæcales et de 22 pour le sang.

1. Matériels et méthodes 1.1. Animaux et virus utilisés Des poussins SPF (Specific Pathogen Free) de 1 jour du troupeau de Ploufragan ont été inoculés par voie orale avec du virus CELO de type sauvage (wt), des virus CELO recombinants porteurs du gène

2. Résultats Les analyses par PCR et RT-PCR sur des organes de poussins infectés par la souche sauvage, puis des

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

virus recombinants VP2 ont permis d’établir trois sites de multiplication du virus : la trachée, les cæca et la bourse de Fabricius (Tableaux 1, 2 et 3). Ceci a été confirmé par l’utilisation de virus recombinants exprimant le gène codant pour la luciférase (Tableau 4), et la SEAP (Figure 2) comme rapporteur, ainsi que l’établissement de la clearance du CELO. L’ensemble de ces résultats indiquent que le CELO se multiplie avec un pic 5 à 6 jours après infection. Dix jours après infection, du virus est encore détecté puis il n’est plus retrouvé. Des infections in vitro, par un virus recombinant GFP, réalisées sur des isolements de populations lymphocytaires à partir des amygdales cæcales et du sang ont montré que peu de cellules sont infectées au niveau des cæca (Photo 1a et 1b) ; des constructions en rosette ont été observées dans le sang (Photo 2a et 2b). Le type de cellules infectées reste encore à être identifié. Discussion Le virus CELO et ses recombinants sont réplicatifs in vitro sur LMH (Leghorn Male Hepatoma, Kawaguchi, 1987 ), mais qu’en est-il natur-ellement ? Les résultats d’infection avec le CELO wt et les virus recombinant VP2 (Tableau 1, 2 et 3) montrent une présence et des sites de multiplication virale évidents, parfaitement similaires. Il apparaît donc que les virus recombinants construits (Figure 1) n’ont pas un comportement différent évident in vivo, du virus sauvage. Les organes (cæca, bourse de Fabricius) où la multiplication du virus sauvage et des virus recombinants est détectée, possèdent en commun la présence de cellules de type lymphocytaire ou épithélial. Des cellules de type lymphocytaire comme cibles du virus est une possibilité. En effet il a été montré que certains adénovirus humains et les virus dérivés de ceux-ci peuvent soit persister, soit activer ce type cellulaire, et notamment des cellules présentatrices d’antigènes comme les cellules dendritiques

(Zhong, 1999) d’où leur utilisation pour le développement de vaccins (Arrbillaga, 2002 ; Masanori, 2002 ; Osquel, 2002). Pour confirmer ou infirmer cette hypothèse, des essais d’infections in vitro par un virus recombinant porteur du gène codant pour la GFP, sur les populations de cellules isolées à partir des cæca et/ou du sang (gradient de ficoll) ont été réalisés. Des cellules produisent de la GFP et ont une morphologie spécifique : cellules rondes de grande taille de type monocyte ou cellules dendritiques. Le nombre d’événement est cependant faible (1 pour 10000). Il reste donc à préciser le type exacte de cette cellule et de vérifier que l’on retrouve bien in vivo les résultats de ces infection in vitro. Conclusion Des organes où la présence du virus a été détectée, ont été identifiés mais le type cellulaire exact reste encore à être déterminé. Une cellule de type macrophage, monocyte, cellule dendritique est une possibilité. Les travaux vont se poursuivre par de nouvelles études in vitro (isolements) et in vivo (nouveaux rapporteurs), mais également par des études immunohistologiques. Références bibliographiques Arribillaga L., 2002. Vaccine, 21 pp 202-210. François A., 2001. J. Virol., 75 (11), pp 5288-5301. François A., 2002 Thèse. Laver W., 1971. Virology, 45 pp 598-514. Lehrmann H., 1999. J. Virol., 73 pp 6517-6525. Masanori M., 2002. Vaccine, 21 pp 211-220. Michou A.I., 1999. J. Virol., 73 pp1399-1410. Payet V., 1998. J. Virol., 72 (11), pp 9278-9285. Osquel B.H., 2002. Vaccine, 21 pp231-242. Zhong L., 1999. Eur J Immunol., 29 pp964-972.

FIGURE 1 :

Fabrication des virus recombinants A-, D-, et insertion des gènes de la VP2, des ORF 9 et 11 et des gènes

rapporteur de la GFP (Green Fluorescent Protein) de la luciférase et de la SEAP (Secreted Alkaline Phosphatase)

A B C DGénome du Celo: 43804 pb

Génome du Celo délété (A-, D-)

Celo rec(A-)/ D-(VP2)VP2

Celo rec A-(ORF9) / D-(VP2)

Celo rec A-(ORF11)/D-(VP2)

Celo rec A-(ORF9+11) /D-(VP2)

Celo rec GFP

Celo rec Luciférase

ORF9

ORF11

GFP Luciférase

TABLEAU 1:

Détection du CELO par PCR et de sa multiplication par RT-PCR sur les organes de poussins infectés à la dose 107pfu

Temps SangAnalyse PCR RT-PCR PCR RT-PCR PCR RT-PCR PCR RT-PCR PCR RT-PCR PCR2 heures + - + + - + + - +4 heures + - + - + + + - + - +8 heures + - + - + + + - + - +

1 jour + + + + + - + +2 jours + + - + + + - + + +3 jours + + + - + + + - + + +6 jours + + + - + + - - + + +10 jours - - + - + + - - - - +20 jours - - + - + - - - - - +30 jours - - - + - - - - - -40 jours - - - + - - - - - -50 jours - - - - - - - -

Bourse de F.Trachée Rate Caecum Rein

+

TABLEAU 2 et 3 :

PCRTemps 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 41 jour + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + - +2 jours + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +3 jours + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + +6 jours + + - + - - - - + + + + - + - - + + - - + + + +10 jours + + - + - - - - + + + + - - - - - - - - + - + +20 jours - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -30 jours - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Bourse de F. sangTrachée Rate Caecum Rein

Détection des virus recombinants CELO par PCR (2) et de leur multiplication par RT-PCR (3) sur les organes de poussins infectés à la dose 107pfu :1:D-(VP2); 2: CELO/A-(ORF9)/D-(VP2); 3: CELO/A-(ORF11)/D-(VP2); 4:

CELO/A-(ORF9 + ORF11)/D-(VP2)

RT-PCRTemps 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 41 jour + + + - + - + + - + - -2 jours + + + + + + + + + + + +3 jours + + + + + + + + + + + +6 jours + + + - + + - - - - + -10 jours - - - - - - - - - - - -20 jours - - - - - - - - - - - -

Trachée Caecum Bourse de F.

TABLEAU 4:

Rapport des intensités lumineuses relatives des échantillons testés pour la luciférase, avec l’intensité relative des

témoins négatifs (positif > 2)

Temps Trachée Rate Caecum Bourse de F.1jour 41,5 2,9 0,7 162jours 2,7 2,3 1,4 22,53jours 19,3 1,3 7,6 1,74jours 7,9 1,2 1,2 3,66jours 1,7 1,2 0,7 110jours 1,2 1 1,2 0,720jours 1 1 1,1 0,730jours 0,6 0,9 1 0,640jours 0,6 0,8 0,5 0,7

Rapport RLU/témoin

FIGURE 2 :

A Quantités moyennes de SEAP (x10-4mg) sécrétées au cours du temps suivant le mode d’inoculation (voie orale ou sous cutanée par dermojet) (Tableau)

B Représentation de l’évolution de la quantité de SEAP sécrété suivant le mode d’inoculation (• : voie orale ; : sous cutanée par dermojet) (Graphique)

Temps (Jours) Dermojet Orale0 0 03 14,8 20,84 20,75 16,85 32,2 26,26 34,8 24,57 0,73 0,8410 0,41 0,211 0,06 0,2312 0,188 0,3813 0,11 0,104

Voie d'inoculationA EVOLUTION de la QUANTITE de SEAP

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 3 4 5 6 7 10 11 12 13

JoursQ

uant

ité d

e SE

AP

(x 1

0-4

mg)

B

PHOTO 1a et 1b :

Isolement de cellules lymphocytaires à partir d’amygdales caecales de poulet (PA12, 19 jours) :

infection par du CELO GFP (10 MOI), grossissement X40

a b

PHOTO 2a et 2b :

Isolement de cellules lymphocytaires à partir du sang total de poulet (PA12, 15 jours) : infection par du CELO GFP (22MOI), grossissement X40

a b

METHODOLOGIE DE SUIVI DES POPULATIONS DE DERMANYSSUS GALLINAE EN

ELEVAGE DE PONDEUSE AVEC PARCOURS EXTERIEUR

Bon Guillaume1,2, Dernburg Ann1, Chauve Claude1, Lubac Sophie2, Zenner Lionel1

1 Unité Mixte de Recherche ENVL / INRA 958 « Protozoaires Entéricoles des Volailles », Service de

Parasitologie, Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, 1 avenue Bourgelat, 69280 Marcy L’Etoile, France 2 Institut Technique Avicole (ITAVI), 5 rue Hermann Frenkel, 69364 Lyon, France.

Résumé Le pou rouge des volailles ou Dermanyssus gallinae est le parasite externe le plus important pour toute la filière des poules pondeuses en Europe. Parasite hématophage, il se trouve aussi bien dans des élevages fermiers, des élevages biologiques ou des élevages de type industriel. Un problème difficile lors des études de terrain est d’évaluer l’importance de l’infestation et la distribution des parasites dans l’élevage. Le but de notre étude était donc la comparaison de diverses méthodes d’évaluation quantitative d’une charge parasitaire ainsi que la localisation des sites à tester pour un bâtiment d’élevage alternatif. Nous avons recherché une méthodologie simple et reproductible et ceci même avec des bâtiments peu standardisés sur le plan architectural comme le sont ceux des productions alternatives. Des populations de D. gallinae ont été étudiées dans 5 fermes de type alternatif avec des pièges en carton d’emballage, des pièges en feuille cartonée et une technique basé sur l’examen de fientes sèches. Les acariens ont été comptés dans différentes parties des bâtiments, à savoir les perchoirs, les nids et le sol. Nous concluons que l’utilisation de feuilles de papier cartonné pliées, associé à l’examen des fientes donne de bons résultats et que l’examen des trois types de localisation apporte des résultats complémentaires. Cette méthodologie a pu être ensuite utilisée pour les suivis de population et l’effet de traitements dans des élevages.

Introduction Dermanyssus gallinae ou « pou rouge des volailles » est un acarien hématophage responsable de pertes économiques importantes en élevage avicole. Ce parasite touche principalement la filière poule pondeuse mais peut infester les autres productions avicoles telles les poulets de chair mais également la dinde, le pigeon et diverses autres espèces d’oiseaux domestiques ou sauvages (Arends, 1997). L’impact économique de ce parasite est très élevé du fait de son rôle pathogène direct mais aussi du déclassement d’œufs tachés et du coût des traitements répétés dans l’espoir de maîtriser la prolifération de cet acarien. Les dermanysses ne parasitent leur hôte que pendant le repas sanguin. Le reste du temps, ils restent cachés à l’abri de la lumière dans les anfractuosités des murs, du sol et sous les perchoirs. Dans les conditions optimales, leur cycle biologique complet peut s’effectuer en moins de 10 jours, ce qui explique la très grande prolifération du parasite dans les élevages. Par contre, ces parasites sont très résistants et peuvent ainsi survivre sans hôte pendant plusieurs mois reprenant leur cycle lors de la

réintroduction de nouveaux animaux (Chauve, 1998 ; Reynaud et al., 1997).

Si on le trouve fréquemment en élevage industriel, il est également fréquent en élevage fermier et en élevage alternatif sur parcours, de type biologique ou non. Ces derniers se développent de plus en plus du fait des pressions sociétales et sont le plus souvent caractérisés par des possibilités de traitements limités avec l’application d’un cahier des charges, du matériel d’élevage en bois avec des implantations variables et non standardisées et bien sûr un accès à un parcours extérieur pour les volailles. Parmi ces élevages, les poux rouges arrivent en 4ème position comme nuisibles pour les éleveurs, après les chiens et les renards, les rapaces et les rongeurs (Lubac S. 2003). L’évaluation du taux d’infestation d’un bâtiment d’élevage par ces acariens n’est pas une chose aisée. En effet, il est le plus souvent caché à l’abri de la lumière et peu accessible. Pourtant une telle évaluation, même semi-quantitative, est importante pour plusieurs raisons : l’évaluation d’une méthode de lutte, la prise de décision pour traiter à la période optimale et les études in situ du parasite. Le but de notre étude était donc la comparaison de diverses méthodes d’évaluation d’une charge

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

D. Bâtiments 4 et 5 parasitaire ainsi que la localisation des sites à tester pour un bâtiment d’élevage alternatif. Nous présentons ici les résultats préliminaires issus de cette étude.

P1

N6 N5 N4

N3N2N1

P4P5P6

P3P2

1. Matériels et méthodes 1.1. Les élevages

L’étude a été réalisée dans 5 bâtiments différents de 4 élevages de poules pondeuses situés dans la région sud-est de la France. Trois élevages étaient des élevages label et l’autre était biologique. Tous étaient infestés par Dermanyssus gallinae. Chaque élevage a été divisé en 6 zones de prélèvement pour la localisation des pièges et de l’examen des fientes dans le bâtiment (Figure 1).

1.2. Les pièges Deux types de pièges ont été testés. Le premier, décrit par Nordenfors (2000) est composé d’un carton d’emballage de 7 X 10 cm. Le second type de piège est composé d’une feuille de carton bristol de 7 X 20 cm pliée en deux et maintenue fermée par deux agrafes (Figure 2). Les pièges obtenus font donc tous 7 X 10 cm et sont protégés des poules par une feuille de plastique rigide. Ils sont fixés pendant 24 heures dans les nids (Figure 3) ou sur les perchoirs, à proximité des lieux où les acariens se réfugient. Ils sont fixés aux perchoirs par un fil métallique et dans les nids avec du ruban adhésif double face. Après 24 heures, les pièges sont ensuite placés dans des sacs hermétiques puis congelés 24 heures à –20°C pour tuer les poux. Ils sont ensuite ouverts, vidés de leurs poux dans une boite de pétri et les acariens sont comptés sous loupe binoculaire.

FIGURE 1 : les différents bâtiments étudiés lors de l’étude. N1 à N6 : emplacements des pièges

dans les nids ; P1 à P6 : emplacements des pièges sur les perchoirs

A. Bâtiment 1

N1 N2 N6N5N4N3

P6P5P4P3P2P1c

FIGURE 2 : Piège type « feuille bristol » ouvert

B. Bâtiment 2

N2N1 N3

N6 N5 N4

P6 P5 P4

P1 P2 P3

1.3. Examen des fientes

Plusieurs fientes, sèches mais non déshydratées, sont retournées pour examiner leur face inférieure où se cachent les acariens (Figure 4). A partir de cet examen visuel, une note est donnée selon le barème suivant : 0 : pas de pou ; 1 : de 1 à 20 poux, 2 : de 20 à 200 poux et 3 : plus de 200 poux. Une moyenne de ces notes est réalisée pour la notation de chacune des 6 zones examinées.

C. Bâtiment 3

N6 N4N3

N1 N2 N3

P2P1

P4P5P6

P3

FIGURE 3 : Pièges dans un nid De même, le suivi des variations d’infestation au cours du temps d’une même localisation donne des résultats identiques avec les deux pièges (Figure 6).

FIGURE 6 : Suivi comparatif de la population de poux piégés en fonction des deux types de

pièges (les prélèvements ont été réalisés à plusieurs moments lors d’une bande)

FIGURE 4 : Fiente examinée

0

200

400

600

800

1000

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70

Temps(jours)

Nom

bre

de p

oux

dans

les

pièg

es

Carton Feuille cartonée

Ces résultats sont donc bien en faveur du fait que les quantités de poux récoltés dans un piège sont proportionnelles à la quantité de poux présents dans la zone où se trouve ce piège, puisque les résultats ne dépendent pas du type de piège. Des deux modèles testés, nous préférons le piège de type « feuille cartonnée » qui nous semble plus facile d’utilisation surtout lors de la récolte et du dénombrement des poux au laboratoire. Nous avons également comparé l’utilisation des pièges à la technique d’évaluation par examen des fientes. En effet cette technique pourrait permettre d’attribuer un indice d’infestation sur des zones peu propices au dépôt de pièges cartonnés (sol, caillebotis,...). Les profils observés dans une zone avec les trois techniques (pièges ou fientes) donnent des indications assez proches, même s’il est difficile de relier un indice à un comptage de poux.

Résultats et Discussions Peu de travaux ont été réalisés concernant ces aspects méthodologiques de suivis et d’évaluation de la charge parasitaire dans les bâtiments d’élevage. L’examen de 6 zones de prélèvement pour

chaque élevage apporte aussi des indications précieuses. Une zone de prélèvement peut être définie comme un ensemble élémentaire comprenant une zone de nids, une zone de perchoirs et une zone de caillebotis, le tout dans un espace restreint. Cet ensemble élémentaire pourra être retrouvé dans tout élevage type label quelque soit son architecture. En effet, on peut constater à travers les plans des bâtiments étudiés une grande diversité quant à la localisation des nids par rapport aux perchoirs et aux caillebotis (Figure 1). Les résultats préliminaires de l’étude montrent une variabilité importante des résultats en fonctions des zone de prélèvements (Figure 7). Ceci démontre la grande difficulté qu’il y aura à analyser une infestation dans un bâtiment sans multiplier à l’extrême les prélèvements dans l’espace et le temps.

Dans un premier temps, nous avons donc comparé les deux types de piège « carton d’emballage » et « feuille bristol ». Sur 76 paires de pièges situés à moins de 20 cm sur un même type de support, les résultats obtenus montrent une très forte corrélation et montre également que l’utilisation de l’un ou de l’autre donne des résultats similaires, ceci indépendamment du degré d’infestation de la zone étudiée (Figure 5).

FIGURE 5 : Comparaison des deux types de pièges

0

0,51

1,52

2,53

3,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5log(nb de poux dans les feuilles)

log(

nb d

e po

ux d

ans

les

cart

ons)

FIGURE 7 : Représentation de la moyenne des pièges relevés sur les perchoirs en fonction de la

zone et de l’élevage Conclusions préliminaires En terme d’infestation des bâtiments, on peut déjà voir que les poux rouges sont toujours plus présents sur les perchoirs que dans les nids. L’infestation des nids pouvant peut être représenter un marqueur de seuil intéressant. Un autre élément important est la disparité géographique de l’infestation dans le bâtiment. Cette disparité n’est bien sûr pas surprenante en élevage fermier ou alternatif où les animaux sont libres d’aller préférentiellement dans certaines zones du bâtiment. Ainsi, la présence du parasite est très fortement corrélée à la présence des animaux. Par exemple, nous avons observé un perchoir dans une zone de prélèvement avec des résultats toujours négatifs. En observant le comportement des animaux dans l’élevage, nous nous sommes aperçu par la suite que les poules ne venaient jamais sur ce perchoir !

En terme de méthodologie de suivi, plusieurs conclusions sont déjà possibles. D’une part, les résultats observés lors de notre étude sont totalement différents de ceux observés au sein d’élevages industriels beaucoup plus standardisés et dans lesquels les poules sont captives (Höglund et al., 1995 ; Nordenfors, 2000). Ceci justifie donc bien l’intérêt de la mise au point d’une méthodologie rigoureuse pour les élevage fermier ou alternatifs, indépendamment de la structure architecturale du bâtiment. C’est pour cette raison que nous avons défini le concept de « zone de prélèvement ». La deuxième conclusion concernant la méthodologie est que celle ci devra être adaptée à la question initiale de l’étude : on ne pourra pas définir une méthodologie optimale de suivi pouvant répondre à toutes les questions. On peut d’ores et déjà distinguer trois types de problématiques. La première est de diagnostiquer, de détecter une infestation dans un élevage à un stade précoce. Pour cela, des examens de fientes ou quelques pièges placés dans des sites privilégiés tels des perchoirs ou des trappes de sortie sembleraient intéressant.

Dans le cas d’un suivi de populations des dermanysses pour une étude épidémiologique ou d’efficacité de traitement, il nous semble que la définition d’un certain nombre de zones de prélèvement réparties dans tout le bâtiment soit intéressante en utilisant des pièges et des examens de fientes. Selon la finesse attendue du résultat, le nombre de ces zones devra être plus ou moins grand. Enfin, une problématique pourrait être de posséder un seuil d’alerte déclenchant un traitement par exemple. Dans ce cas, l’utilisation de pièges uniquement dans les nids pourrait être prometteuse.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 1 2 3 4 5 6

élevage1élevage2élevage3élevage4élevage5

Néanmoins, ces premiers résultats, même s’il faut rester prudent, confortent l’intérêt d’une mise au point d’une méthodologie standardisée de suivi de population de Dermanyssus gallinae en élevage fermier ou alternatif. L’utilisation d’une telle technique aurait en effet l’intérêt de pouvoir permettre la comparaison de résultats provenant de multiples élevages et devrait nous faire progresser dans la connaissance de ce parasite et l’évaluation des méthodes de lutte. Références bibliographiques. Arends J.J., 1997. In : Diseases of poultry, Iowa State University Press, Iowa, 785-813. Chauve C., 1998. Vet. Parasitol., 8, 364-376. Höglund et al., 1997. Poultry Sci., 74, 1793-1798. Lubac S. et al. 5ème JRA, Tours 26-27 mars 2003. Nordenfors H. 2000. Doctoral Thesis, Uppsala, Sweden. Reynaud M.C. et al., 1997. Rev. Méd. Vét., 148, 433-438.

L'HISTOMONOSE EN ELEVAGE AOC DINDE FERMIERE DE BRESSE

Callait-Cardinal Marie-Pierre, Chossat Ludovic, Chauve Claude, Zenner Lionel

ENVL Unité Mixte de Recherche / INRA 958 "Protozoaire Entéricoles des Volailles", Service de Parasitologie, École Nationale Vétérinaire de Lyon, 1 avenue Bourgelat, 69 280 MARCY L'ÉTOILE, France

Résumé Responsable de baisses de performances ou de fortes mortalités, suivant la sensibilité des espèces atteintes, l'histomonose s'était faite quelque peu oublier, mais l'interdiction de l'utilisation de toutes les molécules actives, en traitement comme en additif, pourrait en refaire une pathologie majeure. En France, les productions de volaille les plus touchées sont les dindes "Bio", AOC et Label, mais les élevages industriels peuvent également être atteints. L'étude du déroulement de la maladie en conditions naturelles, par le suivi de six élevages AOC "Dinde Fermière de Bresse", a permis de montrer que l'histomonose clinique est à dissocier de la présence du parasite et donc que d'autres facteurs jouent probablement un rôle important dans la manifestation clinique de la maladie. De plus, la présence d'Histomonas meleagridis n'est pas systématiquement liée à celle d'Heterakis gallinarum, ce qui laisse supposer plusieurs modes de transmission du flagellé. A partir de ces résultats, il nous paraît nécessaire d'approfondir les connaissances sur l'épidémiologie de l'histomonose, pour identifier les différents facteurs de risque liés à la pathologie clinique. Introduction

L'étude suivante a permis d'appréhender les modalités de circulation du parasite sur le terrain et d'apparition de la maladie, par le suivi de six élevages AOC "Dindes Fermière de Bresse" utilisant différents protocoles de prophylaxie.

L'histomonose est une maladie parasitaire affectant les galliformes. Provoquée par un protozoaire flagellé, Histomonas meleagridis, elle se traduit par une typhlo-hépatite, avec hypertrophie et nécrose des cæca et du foie (McDougald, 1997; Zenner et al., 2002). Les pertes économiques peuvent être importantes, c'est pourquoi une prophylaxie était quasiment systématiquement mise en œuvre dans les élevages à risque. La disparition, maintenant complète, des produits classiquement utilisés, le Dimétridazole (DMZ) depuis mai 2002 et le Nifursol à partir de mars 2003, laisse un vide thérapeutique, car aucune molécule n'a, à ce jour, fait preuve d'une efficacité comparable. Pour pallier ce manque, il est intéressant de tester de nouvelles molécules, de façon raisonnée en fonction de leur mode d'action (Callait et al., 2002), mais aussi d'approfondir les connaissances actuelles en matière d'épidémiologie. En effet, les particularités de survie et de dispersion du parasite dans le milieu extérieur conditionnent les risques d'infestation des animaux. Ainsi, d'après McDougald & Reid (1978), H. meleagridis est très sensible au froid et meurt rapidement dans le milieu extérieur ou après la mort de l'hôte. Or, il a été montré qu'il est capable d'infester un nématode parasite des cæca, Heterakis gallinarum, et de se retrouver ensuite dans ses œufs (Ruff et al., 1970; Lund, 1972). La transmission d'H. meleagridis est, alors, rendue possible par l'ingestion d'œufs larvés d'H. gallinarum, très résistants dans le milieu extérieur (Gibbs, 1962).

1. Matériels et méthodes 1.1. Élevages étudiés De juillet à décembre 2000, six élevages (numérotés de A à F) de dindes fermières de Bresse utilisant différents protocoles de prophylaxie ont participé à cette étude. Dans les normes de l'AOC, tous utilisent la dinde "noire", souche Bettina GB 191. Cette souche a été sélectionnée à Plouguenast (Côte d'Armor – France) et est démarrée en bâtiment pendant 10 semaines jusqu'au début du mois de juin. Pendant la période de croissance (15 semaines), les animaux ont accès à des parcours, avant la période de finition (3 semaines) à nouveau en bâtiments d'élevage. Durant la période de croissance, en plus des ressources du parcours, l'aliment est composé de céréales, provenant de l'aire d'appellation (avec au moins 50% de maïs) associées à des sous-produits laitiers. Tout complément est interdit (Décret du 27/05/1998). Dans le cadre de la prophylaxie contre l'histomonose, les élevages A (1400 dindes), B (1250 dindes), C (900 dindes) et D (1300 dindes) ont utilisé un composé à base de plantes, de façon continue ou discontinue. L'élevage E (600 dindes) a utilisé le Dimétridazole (DMZ) à 200 ppm dans la ration. L'élevage F (650 dindes) n'a pas utilisé de prophylaxie médicale, mais seulement des procédés de prophylaxie sanitaire traditionnels (acidification de l'eau par exemple). Les animaux ont aussi reçu un anticoccidien au cours des

Ce mode de contamination, ainsi que le rôle porteur des vers de terre (Lund, 1972), est actuellement considéré comme prépondérant, par rapport à une transmission directe, plutôt anecdotique.

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Les élevages A et C ont présenté des symptômes caractéristiques d'histomonose, rapidement après l'accès aux parcours. Le diagnostic a été confirmé par autopsie, avec des lésions cæcales et hépatiques, et par examen direct. Dans l'élevage A, de la roxarsone (3 Nitro®W) a été administrée rapidement après les premiers symptômes, puis pendant 12 jours; les animaux les plus atteints ont été isolés et traités au DMZ. Après cet épisode, le composé phytothérapeutique a été de nouveau ajouté à la ration. Dans l'élevage C, du DMZ a été utilisé immédiatement et de façon continue jusqu'à la fin de la période de croissance. Le DMZ a aussi été utilisé dans l'élevage B, associé au produit phytothérapeutique, après une légère baisse de performances, sans apparition de signe d'histomonose. Un épisode de mortalité, d'origine inconnue, a eu lieu dans l'élevage D au cours de la 25ème semaine.

semaines de vie 3 à 9 et ont été vermifugés (lévamisole ou flubendazole) régulièrement toutes les 4 semaines jusqu'à leur 28ème semaine de vie. L'efficacité des différents protocoles a été évaluée de plusieurs manières dans chaque élevage: des visites d'élevages, aux 10èmes, 14èmes, 18èmes et 22èmes semaines, ont permis de relever les poids vifs de dix dindes et de récolter dix échantillons de fientes fraîches en vue d'examens coproscopiques. Au cours de la semaine 20, cinq dindes ont été prélevées en vue d'un examen nécropsique. Enfin, les données de mortalité ont été collectées auprès des éleveurs. La Figure 1 résume les différents protocoles et prélèvements réalisés dans chaque élevage. 1.2. Examens coproscopiques Les échantillons collectés ont été analysés par technique de flottation, utilisant un liquide de densité élevé (Iodomercurate de potassium; d = 1,44) au laboratoire de Parasitologie de l'ENVL. Un comptage semi-quantitatif sur 5 g de fèces a été réalisé en utilisant l'échelle suivante: (P) = moins de 10 œufs; (+) = entre 10 et 100 œufs; (++) = entre 100 et 200 œufs; (+++) = entre 200 et 1000 œufs; (++++) = plus de 1000 œufs.

2.2. Courbes de poids En fin de période de croissance, les pesées de la semaine 22 révèlent que les dindes de l'élevage F étaient significativement plus lourdes que celles des élevages A, C et D. À l'abattage, les animaux des élevages A et D étaient les plus légers (poids effilé < 3,9 kg), ceux de l'élevage B les plus lourds (poids effilé = 4,36 kg). Les pourcentages de dindes déclassées ont en général été faibles, excepté pour l'élevage A (13,6 %).

1.3. Examens nécropsiques Les lésions macroscopiques caractéristiques de l'histomonose dans chaque cæcum et dans le foie ont été classées selon un indice lésionnel croissant de (0) à (4) selon la sévérité et l'étendue des observations. La présence d'H. meleagridis a été recherchée par examen direct du contenu caecal et observation au microscope, immédiatement après la mort des animaux. Dans cette localisation, le parasite présente une forme sphérique ou ovale, dite "forme luminale flagellée", mesurant environ 15-20 µm de diamètre. Des bilans parasitaires totaux ont été réalisés pour rechercher les autres parasites (helminthes ou protozoaires) éventuellement présents.

2.3. Examens coproscopiques Excepté dans l'élevage D, les œufs d'helminthes ont été rarement observés. Les œufs d'hétérakidés ont été rapportés dans 2 élevages (élevages A et D) avec toujours des numérations faibles (moins de 10 œufs par gramme de fèces). D'autre part, les coccidies ont été trouvées dans tous les élevages mais généralement avec de faibles dénombrements et aucun signe clinique. 2.4. Examens nécropsiques 1.4. Courbes de poids Les résultats des 30 autopsies montrent que, globalement, 36,7% des dindes examinées (11/30) présentaient des lésions caractéristiques de l'histomonose: parmi elles, 27,3% présentaient seulement des lésions cæcales et 72,7% à la fois des lésions cæcales et hépatiques. La présence d'H. meleagridis a été détectée dans 50% des contenus cæcaux, avec ou sans lésions macroscopiques.

La croissance des animaux dans les 6 élevages a été évaluée par le relevé des poids vifs de 10 dindes au cours des visites d'élevage et par les résultats de pesées à l'abattoir. 1.5. Procédure suivie en cas d'épisode clinique Lors de forte suspicion d'histomonose, avec abattement, diarrhée "jaune soufre", amaigrissement rapide, ailes tombantes, inappétence et mortalité, la même procédure d'examen nécropsique a été utilisée. Les éleveurs ont alors été autorisés à utiliser un autre produit afin de traiter les animaux.

L'étude de la distribution des résultats parmi les 6 élevages montre que des lésions cæcales et hépatiques ont été détectées dans 83% des élevages; H. meleagridis était présent partout, dans 20 à 80% des contenus cæcaux. Donc, dans l'élevage D, même si aucune lésion macroscopique n'était visible à l'autopsie des animaux prélevés, le parasite était présent dans les contenus cæcaux de deux dindes sur cinq (Figure 3).

2. Résultats 2.1. Épisodes cliniques Aucun signe clinique d'histomonose n'a été rapporté dans les élevages B, D, E et F (Figure 2). Les indices lésionnels moyens des cæca et du foie

étaient significativement inférieurs dans les deux

élevages témoins (E et F) par rapport aux élevages A, B et C utilisant le produit phytothérapeutique. Les deux élevages A et C, qui ont présenté un épisode clinique d'histomonose, ont aussi des indices lésionnels très élevés pour les cæca; par contre dans l'élevage C, aucune lésion hépatique n'était visible à l'autopsie. Il faut noter que le parasite, associé à des lésions hépatiques et cæcales légères, était aussi présent dans l'élevage E, utilisant le DMZ en continu; et que l'élevage F, n'utilisant aucune prophylaxie médicale,

ne présentait pas de lésion significativement plus importante que l'élevage E. Les bilans parasitaires ont montré que d'autres parasites infestaient les dindes autopsiées (Tableau 1). Ils sont comparables aux résultats des analyses coproscopiques: l'élevage D présentait la plus grande diversité parasitaire avec H. gallinarum, Ascaridia sp., Capillaria sp. et Syngamus trachea dans 3 à 5 dindes; tous les élevages, sauf le A, présentaient des coccidies.

1 4 7 10 14 18 22 35

AbattageTransition

Démarrage

Visites d'élevages

Autopsies

Composé phytothérapeutique

Dimétridazole (DMZ)

Élevages A - B

Élevages C - D

Élevage E

Élevage F

Mise en place

Croissance Finition

Semainesd'élevage

1 4 7 10 14 18 22 35

AbattageTransition

Démarrage

Visites d'élevages

Autopsies

Composé phytothérapeutique

Dimétridazole (DMZ)

Élevages A - B

Élevages C - D

Élevage E

Élevage F

Mise en place

Croissance Finition

Semainesd'élevage

FIGURE 1: protocole théorique de suivi des six élevages

1 4 7 10 14 18 22 35

AbattageTransitionMise en place

Élevage A

Élevage C

Élevage E

Élevage F

Élevage B

Élevage D

Roxarsone

DMZ 200 ppm

DMZ 200 ppm

Épisodes d'histomonose clinique

Traitements

Mortalité d'origine inconnue

Démarrage Croissance Finition

Semainesd'élevage

Visites d'élevages

Autopsies

Composé phytothérapeutique

Dimétridazole (DMZ)

1 4 7 10 14 18 22 351 4 7 10 14 18 22 35

AbattageTransitionMise en place

Élevage A

Élevage C

Élevage E

Élevage F

Élevage B

Élevage D

Roxarsone

DMZ 200 ppm

DMZ 200 ppm

Épisodes d'histomonose clinique

Traitements

Mortalité d'origine inconnue

Démarrage Croissance Finition

Semainesd'élevage

Visites d'élevages

Autopsies

Composé phytothérapeutique

Dimétridazole (DMZ)

FIGURE 2: historique réel dans chaque élevage

0

0,5

1

1,5

2

A B C D E FElevages

ICM

0%

20%

40%

60%

80%

100%

ED

d'

H.

mel

eagr

idis

(%)Cæca

Foie

FIGURE 3: résultats des examens nécropsiques réalisés sur 5 dindes par élevage, concernant H. meleagridis

Élevages A B C D E F

H. meleagridis 4 3 2 2 3 1 Blastocystis sp. 5 3 2 1 2 2

Trichomonas sp. 5 5 2 4 4 3 Eimeria sp. 0 2 2 2 3 4

H. gallinarum 1 0 0 3 0 0 Ascaridia sp. 0 0 0 3 0 0

Syngamus trachea 0 0 0 3 0 0 Capillaria sp. 0 0 0 5 0 0

TABLEAU 1: résultats généraux des bilans parasitaires réalisés sur 5 dindes par élevage

3. Discussion

H. meleagridis est un parasite pathogène actuellement fréquent en élevage AOC "dinde fermière de Bresse". Pour appréhender les modalités d'apparition de la maladie au sein de ce type d'élevage, nous avons donc suivi six élevages de juin à décembre 2000. Ce type d'enquête présente certains inconvénients. Du fait des examens réalisés, le nombre d'élevages suivi a dû être limité. Contrairement à des essais en laboratoire, il n'y a pas eu d'inoculation expérimentale. Il était donc tout à fait possible que la maladie n'apparaisse dans aucun élevage. De plus, l'analyse des données est toujours délicate du fait de la diversité des élevages (taille des bandes différentes, conduite d'élevage, qualité des parcours, alimentation, dates de mises en place …). Malgré ces inconvénients, ce type d'étude a l'avantage de permettre l'analyse de l'apparition de la maladie dans des conditions réelles et permet d'approfondir ou de réformer des connaissances épidémiologiques incomplètes. Ainsi, nous avons pu montrer deux phénomènes importants: le parasite H. meleagridis est présent dans tous les élevages, même dans l'élevage utilisant le DMZ, produit de référence, avec des prévalences réelles (% de dindes parasitées) probablement très

variables; sa présence est dissociée de celle du nématode H. gallinarum, rencontré seulement dans un petit nombre d'élevages, et de l'histomonose maladie, qui semble n'apparaître que lors de la conjonction de conditions favorables. Il apparaît donc que la transmission latérale directe du parasite est, non seulement, possible (McDougald, 1997), mais aussi très probablement fréquente, dans les conditions telles que celles présentées dans cette étude. L'étude approfondie des conditions de cette transmission est donc nécessaire. D'autre part les conditions favorables à la maladie, ou facteurs de risque, peuvent être de nature très diverses: climat, météorologie locale, densité des animaux, âge, utilisation concomitante ou alternée des mêmes parcours par des volailles d'espèce et de sensibilité différentes … (McDougald et Reid, 1978). Il convient, par une étude multifactorielle rigoureuse, d'identifier les éléments prépondérants parmi ceux-ci, pour tenter de les éviter au maximum. Dans une éthique d'élevage des animaux dans des conditions naturelles, répondant aux aspirations du public, il semble en effet essentiel de chercher à contrôler une maladie telle que l'histomonose, à la fois, en recherchant une prophylaxie médicale adaptée et en limitant les facteurs de risque d'apparition des signes cliniques.

Références bibliographiques

Callait M.-P., Granier C., Chauve C. et Zenner L., 2002. Poult. Sci., 81, 1122-1127. Gibbs B.J., 1962. J. Protozool., 9, 288-293. Lund E.E, 1972. In: Diseases of Poultry, 6th ed. B. W. Calnek ed. Iowa State University Press, Ames, pp 990-1006. McDougald, L. R., 1997. In: Diseases of Poultry. 10th ed. B. W. Calnek ed. Iowa State University Press, Ames. pp 890-895.

McDougald L.R. et W.M. Reid, 1978. In: Parasitic Protozoa, vol. II; Ed. J.P. Kreier, New-York, U.S.A., pp 139-161. Ruff M.D., McDougald L.R. et M.F. Hansen, 1970. J. Protozool., 17, 10-11. Zenner L., Chossat L. et C. Chauve, 2002. Bull. GTV, n°15, 155-158.

ÉTUDE EXPÉRIMENTALE DE LA RÉSISTANCE A LA MALADIE DE MAREK CHEZ DES POULETS VACCINÉS OU NON, INFECTÉS SUBCLINIQUEMENT AVEC LE VIRUS DE L'ANÉMIE

INFECTIEUSE AVIAIRE

Picault Jean-Paul1, Ragland William3, Novak Renata3, Lamandé Josiane1, Allée Chantal1, Guillemoto

Carole1, Morin Yannick2, Jestin Véronique1

1, 2 AFSSA, Site de Ploufragan, B.P. 53, Zoopôle Les Croix, 22440 PLOUFRAGAN 1 Unité Virologie, Immunologie, Parasitologie Aviaires et Cunicoles

2 Service d'Elevage et d'Expérimentation en Pathologie Aviaire 3 Institut Ruder Bosković, Division of Molecular Medicine, 10000 Zagreb, CROATIA

Résumé Une étude expérimentale a été réalisée sur poulets exempts d’organismes pathogènes spécifiés (EOPS) pour rechercher si l’infection subclinique par le virus de l’anémie infectieuse aviaire (CIAV) a un effet significativement aggravant lors de contamination par un virus de la maladie de Marek (MDV). Pour cela des groupes de 40 poulets EOPS vaccinés ou non à la naissance à l’aide du vaccin bivalent HVT/Rispens de la maladie de Marek ont été inoculés ou non avec la souche virulente CUX-1 du CIAV à 4 semaines d’âge. Les poulets ont tous été éprouvés avec la souche hypervirulente RB1B du MDV sept jours plus tard, c'est-à-dire au moment de la diffusion maximale du CIAV dans l'organisme, tel que pré-déterminé par amplification de l'ADN (PCR) du CIAV à partir du sang et de plusieurs organes-cibles. A l’issue d’une période d’observation de plus de 10 semaines après l’épreuve virulente RB1B, aucun des poulets vaccinés éprouvés n’a présenté de symptômes ou lésions macroscopiques de maladie de Marek, qu’ils aient été pré-infectés avec le CIAV ou non. A l’inverse, chez les poulets non vaccinés, 59 % de ceux doublement infectés CIAV et MDV contre 41 % de ceux infectés seulement avec le MDV ont présenté des manifestations clinico-lésionnelles de maladie de Marek. Ces résultats suggèrent que l’infection subclinique à CIAV pourrait bien aggraver le bilan clinique de la maladie de Marek mais sans perturber de manière conséquente l’immunité Marek consécutive à une vaccination réalisée plusieurs semaines auparavant. Introduction Le CIAV est présent à large échelle dans les troupeaux de l'espèce Gallus gallus. Le pouvoir pathogène direct et indirect de ce virus, qui se multiplie aux dépens des cellules souches du système hématopoïétique, a été largement démontré chez le jeune. Alors que dans les deux premières semaines de vie de l'oiseau, la synergie d'effet des pouvoirs pathogènes du CIAV et de certains autres virus est bien connue (Engström et al., 1988 ; Rosenberger et al., 1989 ; Jeurissen et de Boer, 1993), au delà de 3 semaines d'âge, et parfois même avant, le poulet infecté spontanément n'exprime plus cliniquement l'anémie infectieuse, rendant difficile l'établissement d'un lien éventuel entre des troubles pathologiques de nature diverse et la présence du CIAV. Les experts européens de l'Action COST 839 ("Maladies immunosuppressives des volailles") avaient d'ailleurs déploré l'absence de démonstration expérimentale de l'effet négatif (par effet synergique ou autre) de l'infection inapparente à CIAV, qui pourrait expliquer

le bilan sanitaire et économique préjudiciable associé à la présence d'anticorps anti-CIAV chez les poulets de chair, tel qu'observé à grande échelle au Royaume Uni en 1989 (McNulty et al., 1991). De plus, nous avons nous-mêmes été amenés à suspecter fortement l'intervention synergique du CIAV lors de l'étude d'un cas spontané de maladie de Marek chez des poulettes de 16 semaines (Picault et al., 1999), et d'autres observations ont été faites (Ragland et al., 1998) qui renforcent la présomption de conséquences défavorables de l'infection subclinique à CIAV, conséquences qui pourraient aussi découler d'une action sur la capacité de réponse immunitaire (Box et al., 1988). Compte tenu de la fréquence des infections à virus de la maladie de Marek (MDV) sur le terrain et du nombre grandissant de cas pathologiques rapportés chez les poules malgré la mise en œuvre quasi systématique de la vaccination, un premier modèle d'étude a été réalisé, visant à rechercher une influence éventuelle de l'infection subclinique à CIAV sur le bilan clinique de la maladie de Marek reproduite

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expérimentalement chez des poulets vaccinés ou non à la naissance contre cette dernière. Pour s'assurer que l'infection Marek ait bien lieu en période optimale de l'infection silencieuse à CIAV, une première étape de travail devait permettre de préciser la cinétique de diffusion du CIAV dans l'organisme, dans les mêmes conditions opératoires (souche virale, lignée de volailles, âge à l'infection …) que celles envisagées pour l'étude de l'interaction virale. 1. Matériels et méthodes Les poulets étaient de souche White Leghorn et provenaient des reproducteurs exempts d'organismes pathogènes spécifiés (EOPS) du Service d'Elevage et d'Expérimentation en Pathologie Aviaire (SEEPA) de l'AFSSA, site de Ploufragan. Ils ont été élevés en batterie, dans des animaleries protégées munies d'un sas de douche, d'un système de filtration absolue de l'air et d'une ventilation dynamique permettant de maintenir les locaux en dépression ou surpression plus ou moins forte, selon les besoins. Le vaccin de la maladie de Marek administré aux poussins à l'âge d'un jour était le Cryomarex (Rispens + HVT) de Mérial, comportant deux souches vaccinales représentant respectivement les sérotypes 1 et 3 du MDV. Le titre infectieux du vaccin a fait l'objet d'un contrôle préalable sur cultures de fibroblastes d'embryons de poulet : il s'est avéré satisfaisant. Après reconstitution, le vaccin a été administré par injection intramusculaire dans la cuisse à raison d'une dose (telle que définie par le fabricant) sous un volume de 0,2 ml par poussin. Le CIAV était représenté par la souche de référence CUX-1 de virus de l'anémie infectieuse du poulet multipliée sur poussins EOPS dont le surnageant du broyat des foies et moelles osseuses, récolté 10 jours après l'inoculation, a constitué l'inoculum. Celui-ci a été administré dans le muscle du bréchet des poulets âgés de 29 jours, à raison de 0,1 ml par sujet. Le MDV ayant servi pour l'épreuve virulente était la souche hypervirulente RB1B de virus de la maladie de Marek. L'inoculum, administré aux poulets âgés de 36 jours par voie intrapéritonéale sous un volume de 0,1 ml, était représenté par le sang total hépariné de poulets EOPS pré-infectés à l'âge d'un jour et se trouvant en phase symptomatique (à 5 semaines après l'inoculation). L'appréciation de la cinétique de diffusion du CIAV dans l'organisme chez le poulet EOPS inoculé à l'âge de 4 semaines par voie intra-musculaire a été réalisée par amplification génique (PCR) à partir des principaux organes ou tissus-cibles connus du virus, à savoir la moelle osseuse (prélevée au niveau du tibia),

le thymus, le foie et le sang total hépariné de trois poulets sacrifiés juste avant l'inoculation et à 3, 6, 8, 10 et 13 jours après l'inoculation. L'ADN viral a été extrait à l'aide du Dneasy Tissue Kit de Qiagen. Un couple d'amorces spécifiques a permis d'amplifier un segment génomique de 521 paires de bases correspondant au deuxième tiers du gène codant la protéine virale VP1 (nucléotides n° 1376 à 1896, selon Noteborn et al., 1991). Des mesures d'hématocrite ont été réalisées parallèlement pour objectiver l'aspect subclinique de l'infection expérimentale. L’infection CIAV a été également vérifiée grâce au maintien en observation pendant 5 semaines de 24 poulets inoculés et par la recherche d'anticorps ELISA-CIAV (trousse Idexx) chez ces derniers à 4 et 5 semaines après l'inoculation. L'étude expérimentale de l'interaction virale éventuelle a concerné quatre groupes de 40 poulets EOPS dont deux ont été vaccinés à la naissance contre la maladie de Marek à l'aide du vaccin bivalent HVT/Rispens. Un lot vacciné et un lot non vacciné ont été inoculés avec le CIAV à l'âge de 29 jours. Tous les lots ont été éprouvés à l'âge de 36 jours avec la souche hypervirulente RB1B du MDV. Les symptômes, la mortalité et les lésions macroscopiques de maladie de Marek ont été enregistrés 3 fois par semaine pendant une période de 73 jours après l'épreuve virulente. En fin de période d'observation, les poulets survivants ont été euthanasiés et autopsiés pour faire l’objet d’une recherche de lésions macroscopiques viscérales ou nerveuses. 2. Résultats 2.1. Cinétique de diffusion du CIAV Aucun des poulets inoculés avec le CIAV à 4 semaines d'âge n'a présenté de signe clinique au cours de la période d'observation de 5 semaines, mais les 24 sujets sacrifiés à l'issue de cette période ont tous présenté une forte réponse en anticorps ELISA-CIAV. De plus, aucun des 18 poulets sacrifiés régulièrement au cours de 13 premiers jours post-inoculation (PI) n'a présenté de valeur hématocrite anormale (Tableau 1). L'infection réalisée dans les conditions expérimentales décrites a donc bien été subclinique. Au 3ème jour PI, le génome viral a été détecté dans le sang de deux poulets sur trois ainsi que dans le foie d'un d'entre eux, mais ni dans la moelle osseuse, ni dans le thymus (Tableau 1). Du 6ème au 13ème jour PI , tous les prélèvements testés se sont avérés positifs. Au vu de ces résultats, et considérant que la période optimale pour réaliser l'épreuve MDV dans ces conditions expérimentales devait se situer en début de présence du CIAV dans les principaux organes-cibles du virus, nous avons opté pour une infection MDV au 7ème jour PI par le CIAV.

2.2. Résultats de la double infection CIAV puis MDV Des poulets des deux lots non vaccinés Marek ont présenté de l'asthénie, voire de la prostration, entre le 7ème et le 15ème jour post épreuve (PE) RB1B, puis se sont provisoirement rétablis. Un petit échantillon de poulets sacrifiés alors n'a pas permis de mettre en évidence de lésion macroscopique autre qu'une sévère atrophie thymique. La valeur de l'hématocrite des mêmes sujets était, par ailleurs, tout à fait normale (34 à 37 %). L'implication d'un contaminant CIAV dans ces symptômes très précoces ayant pu être exclue à l'issue de tests PCR (tout au moins pour le lot n'ayant pas été inoculé avec le CIAV), nous avons conclu qu'il s'agissait là d'une manifestation déjà décrite du pouvoir pathogène particulier de la souche hyper-virulente de MDV utilisée. La mortalité consécutive à l'épreuve Marek a commencé entre 3 et 4 semaines PE dans les deux lots non vaccinés (Figure 1). L'évolution de la mortalité a été comparable jusqu'à la 6ème semaine PE, puis elle s'est accélérée dans le lot ayant été pré-inoculé avec le CIAV. En incluant les sujets malades et porteurs de lésions macroscopiques de maladie de Marek à l'abattage, le nombre de poulets affectés à l'issue de l'étude a été de 22 sur 37 (59,5 %) dans le lot doublement infecté CIAV puis MDV, contre 15 sur 37 (40,5 %) dans celui n'ayant reçu que le MDV (Tableau 2). Au test de chi2, ces chiffres apparaissent significativement différents au seuil de 10 %. L'écart observé entre les deux lots est apparu confirmé par le bilan lésionnel, qui s’est avéré nettement plus sévère chez les poulets concernés du lot doublement infecté, avec en moyenne deux fois plus d'organes présentant des lésions macroscopiques que chez les poulets éprouvés uniquement avec le MDV (Tableau 2). Dans les deux lots, les organes les plus fréquemment atteints ont été les reins, puis la rate et les organes génitaux. Les tumeurs au niveau des nerfs ont été également beaucoup plus fréquentes dans le lot doublement infecté (15 sujets concernés, contre seulement 2 dans le lot infecté uniquement avec le MDV). Dans les deux lots vaccinés Marek, aucun symptôme ni aucune lésion n'ont été enregistrés au cours de la période d’observation de 73 jours après l'épreuve Marek (Figure 1 et Tableau 2). Conclusion Au cours de cette étude, l'immunité consécutive à la vaccination Marek à 1 jour n'a pas été affectée (tout au moins de manière appréciable) chez les poulets infectés à l'âge de 4 semaines par le CIAV. Cette

observation ne vaut, bien sûr, que pour les conditions expérimentales décrites (il en aurait probablement été autrement si l’infection à CIAV avait été réalisée peu après la vaccination Marek, mais ce n’était pas le but de la présente étude). Il semblerait, par contre, que l’infection subclinique à CIAV aggrave le bilan clinique de la maladie de Marek chez les sujets non vaccinés. Bien que significative seulement au seuil de 10 %, la différence observée entre les bilans cliniques des lots pré-infectés CIAV ou non a été, en effet, confirmée au niveau des bilans lésionnels, à l’évidence plus sévères chez les poulets pré-infectés avec le CIAV. Des études complémentaires devraient permettre de vérifier ces observations, tout comme la recherche (en cours) des réponses en interférons alpha et gamma à partir des sangs prélevés avant et après les inoculations CIAV et MDV : ces deux cytokines sont évaluées à l’aide d’une méthode publiée, basée sur l’hybridation compétitive des ARN messagers respectifs (Novak et al., 2001). Références bibliographiques Box P.G. et al., 1988. Av. Path., 17 : 713-723. Engström B.E. et al., 1988. Av. Path., 17 : 33-50. Jeurissen S.H.M. et de Boer G.F., 1993. Vet. Quart., 14 : 81-84. McNulty M.S. et al., 1991. Av. Dis., 35 : 263-268. Noteborn M.H.M. et al., 1991. J. Virol., 65 : 3131-3139. Novak R. et al., 2001. J of Interferon and Cytokine Res., 21 : 643-651. Picault J.P. et al., 1999. Comptes-rendus 3èmes JRA, 249-252. Ragland W.L. et al., 1998. Av. Path., 27 : 200-204. Rosenberger J.K. et Cloud S.S., 1989. Av. Dis., 33 : 753-759. Remerciements A Mme Marie-Odile Le Bras et à Mrs Louis Le Coq, Guy Jarnet, Pierre Le Bihannic, Elie Quintin et Denis Bonnion pour leur excellente contribution technique ainsi qu'à Mme Claudie Moras pour la présentation des résultats.

TABLEAU 1 : Diffusion du CIAV dans l'organisme des poulets EOPS infectés à l'âge de 4 semaines

Nb de Nb de poulets Hématocrite Résultats des PCR-CIAV pour chaque prélèvement(2) jours post malades/testés (1) Sang Moelle Thymus Foie

inoculation osseuse 0 0/3 31 à 34 0/3 0/3 0/3 0/3 3 0/3 30 à 32 2/3 0/3 0/3 1/3 6 0/3 32 à 34 3/3 3/3 3/3 3/3 8 0/3 30 à 34 3/3 3/3 3/3 3/3

10 0/3 30 à 32 3/3 3/3 3/3 3/3 13 0/3 30 à 34 3/3 3/3 3/3 3/3

(1) valeurs extrêmes obtenues chez les 3 poulets. Des valeurs ≤ 25 refléteraient une anémie (2) nombre de cas positifs sur le nombre de poulets testés

FIGURE 1 : Evolution de la mortalité Marek (prise en compte des lésions à l'abattage)

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0

A g e e n jo u r s

% d e m o r ta lité

M D V

V A C /M D V V A C /C IA V /M D V

C IA V /M D V

Abattage à J109

MDV à J36

CIAV à J29

VAC* à J1

* VAC = vaccin Marek (HVT + Rispens)

TABLEAU 2 : Bilan clinique Marek de la double infection CIAV puis MDV

Traitement Nombre de sujets Sujets atteints de Marek (3) Nombre moyen (1) pris en compte Nombre % d'organes atteints par

(2) (4) sujet affecté (5) MDV 37 15* 40,5 3,0

CIAV/MDV 37 22* 59,5 6,0

VAC/MDV 39 0 0 0

VAC/CIAV/MDV 40 0 0 0

(1) VAC (vaccin Marek HVT + Rispens) à J1, CIAV (CUX-1) à J29, MDV (RB1B) à J36 (2) après déduction de la mortalité non spécifique (3) mortalité et lésions macroscopiques à l’issue d’une période d’observation de 73 jours après l’épreuve Marek (4) les deux valeurs munies d’un astérisque diffèrent significativement au seuil de 10 % au test de chi2 (5) lésions macroscopiques de maladie de Marek, uniquement

UN MODELE EXPERIMENTAL D’EPREUVE AVEC UNE SOUCHE DE VIRUS INFLUENZA AVIAIRE DE SOUS-TYPE H7N1 «FAIBLEMENT» PATHOGENE POUR EVALUER LA

PROTECTION CONTRE L’INFECTION PAR CES VIRUS

Cherbonnel Martine1, Rousset Johan1, Le Bras Marie-Odile1, Morin Yannick2, Jestin Véronique1

AFSSA-Site de Ploufragan, 1 Unité Virologie Immunologie Parasitologie Aviaires et Cunicoles, 2 Service d'Elevage et d'Expérimentation en Pathologie Aviaire, BP 53, 22440 Ploufragan, France

Résumé Un modèle expérimental d’épreuve sur poulets exempts d’organismes pathogènes spécifiques (EOPS), prenant comme critère l’excrétion maximale par voies respiratoire et digestive de la souche de virus influenza aviaire (AIV) faiblement pathogène (LP) H7N1 (A/Chicken/Italy/1067/99), a été mis au point. La pré-infection avec Salmonella Enteritidis et la co-infection avec Mycoplasma gallisepticum exacerbent (significativement p<0.05) l’excrétion par voie cloacale des AIV H7N1. Ces conditions ont été retenues pour évaluer la protection contre l’infection H7N1 conférée par des préparations vaccinales consistant en des associations d’ADN plasmidiques codant l’hémagglutinine HA H7, la protéine de matrice M1 et la nucléoprotéine NP de la souche H7N1 précitée. Ainsi après infection d'épreuve selon les modalités précitées, des poulets vaccinés avec HAH7/M1 ont présenté une suppression totale de l’excrétion du virus influenza alors que les poulets vaccinés avec HAH7/NP présentaient seulement une suppression de l'excrétion par voie cloacale.

Introduction plus l’efficacité de tous ces vaccins H5/H7 a été

surtout mesurée par la protection clinique vis-à-vis d’une épreuve létale avec un AIV HP. Or, ce critère est tout à fait insuffisant car des volailles vaccinées n’exprimant pas de signes cliniques après infection, peuvent néanmoins excréter du virus et constituer une source de contamination pour d’autres volailles sensibles. De plus, la vaccination d’urgence est plus recommandée pour éviter la diffusion des souches LP alors que le contrôle des souches HP se fait par la mise en œuvre stricte des mesures sanitaires dont l’abattage. Pour mieux évaluer l’efficacité de ces vaccins H5/H7 vis-à-vis des souches AIV LP, il est donc nécessaire de disposer des modèles expérimentaux d’infection correspondants. Aucune description de ce type de modèles n’existant, nous avons commencé, compte tenu du contexte épidémiologique en Italie, par développer un modèle d’infection expérimentale avec une souche de sous-types H7. De plus, la distinction entre volailles vaccinées AIV H7 et infectées par un AIV H7 est délicate et requiert la surveillance sérologique de volailles sentinelles non vaccinées. Il est donc nécessaire de développer un vaccin AIV H7 marqueur n’incorporant que les constituants viraux strictement indispensables à la protection.

Les oiseaux sauvages aquatiques constituent un réservoir de virus influenza aviaires (AIV) de type A de sous-types d'hémagglutines (HA) : H1 à H15 et de neuraminidases (NA) : N1 à N9, associés selon de multiples combinaisons HxNy. De façon plus exceptionnelle, les volailles peuvent être infectées par certains d'entre eux. L'infection peut être asymptomique ou s'exprimer cliniquement de manière faible à sévère, selon les virus en cause, l'espèce concernée, les infections intercurrentes… (Alexander, 2000). Jusqu'à présent seuls des virus de sous-types H5 et H7 ont été responsables de l'influenza aviaire (AI) hautement pathogène (HP) réglementé au plan international. Toutefois, les virus de sous-types H5/H7 ne sont pas d'emblée HP mais il est à présent admis que tous les virus initialement faiblement pathogènes (LP) appartenant à ces sous-types ont la propriété de muter (après un temps variable de circulation sur les volailles) et de générer des virus HP. Tous les virus H5/H7 sont donc potentiellement pathogènes. Cette conclusion est tirée des observations effectuées suite aux épizooties d'AI HP en Pennsylvanie (1984-1985), au Mexique (1994-1995) et récemment en Italie (1999-2000). Alors que HA est un immunogène majeur elle induit

cependant une protection trop restreinte et parfois insuffisante pour prévenir l’infection (Swayne et al., 2000b). Les protéines virales internes : la nucléoprotéine et la protéine de matrice (NP et M1 respectivement) contribuent à diminuer le portage chez la souris (Bot et al., 1998) et confère une protection élargie vis-à-vis d'infection hétérologue

Des vaccins à virus inactivé ou recombinants ciblant des AIV de sous-types H5 ont été développés et utilisés aux USA (Swayne et al, 2000b, 2001). Par contre, les travaux publiés relatifs à la mise au point et à l'évaluation de vaccins ciblant les AIV de sous-types H7 sont très réduits et seuls des vaccins AIV H7 à virus inactivé sont disponibles en cas d'urgence. De

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

chez le furet (Donnelly et al., 1997). De plus, il a été observé que la pré-infection naturelle par des virus H9N2 conférait à des poulets une protection partielle vis-à-vis d’une surinfection par des virus H5N1 HP ; ces données suggèrent ainsi le rôle immunogène pour le poulet d'autres protéines virales que les glycoprotéines d'enveloppe HA et NA (Séo et al., 2001). Les objectifs de notre étude sont donc : - La mise au point d'un modèle d'épreuve utilisant

un AIV H7 LP et la détermination des pics d'excrétion par voies respiratoire et digestive dans les 3 à 6 jours consécutifs à l’infection.

- La mesure de l'efficacité de la vaccination avec de l'ADN plasmidique codant HAH7, NP et/ou M1, dans la prévention de l'excrétion après infection de poulets EOPS dans les conditions du modèle précédemment optimisé.

1. Matériels et méthodes 1.1. Souches de microorganismes - Virus Influenza aviaire H7N1 :

A/Chicken/Italy/1067/99, faiblement pathogène, fourni par Dr I. Capua (Istituto Zooprofilattico sperimentale delle venezie, Legnero-Padova, Italy) multiplié en liquide allantoïque d'œufs embryonnés de poule et titrant 109 DIE50/ml.

- Salmonella enteritidis, référence 7629 (AFSSA-Site de Ploufragan) titrant 4,1 107 UFC/ml.

- Mycoplasma gallisepticum, référence 41-91 (AFSSA-Site de Ploufragan) titrant 3.105 UFC/ml.

1.2. Clonage dans un vecteur d'expression Les gènes codant les protéines d'intérêt HA, NP, M1 ont été, après amplification, clonés dans un plasmide d'expression sous contrôle du promoteur du gène précoce du cytomégalovirus humain (CMV) (Invitrogen). Les produits issus du clonage, après vérification par séquençage et par transfection transitoire de cellules de lignée continue de caille QT35, ont été amplifiés à l'aide de kits "Endofree Plasmid Giga" (Qiagen). Ceux-ci assurent un faible niveau de contamination d'endotoxines. 1.3. Test d'inhibition de l'hémagglutination Le test d'inhibition de l'hémagglutination (IHA) a été réalisé selon le principe de la norme NFU 47-011, Juin 2000, "Recherche d'anticorps contre la maladie de Newcastle par la technique de l'inhibition de

l'hémagglutination" mais en utilisant comme antigène un AIV H7N3. 1.4. Test ELISA NP par compétition Il s’agit d’une technique par compétition. Brièvement sur des plaques sensibilisées soit avec un AIV inactivé soit avec le placebo correspondant, a été déposé un mélange constitué volume à volume du sérum à tester et d'un anticorps monoclonal de souris anti-NP, dérivé de l'hybridome HB65 (ATCC). La fixation de ce dernier a été révélée par un conjugué anti-immunoglobuline de souris marqué à la phosphatase alcaline et l’utilisation d’un substrat spécifique dont la dégradation était inversement proportionnelle à la quantité d'anticorps présents dans le sérum. 1.5. Dosage des écouvillons Chaque écouvillon trachéal ou cloacal, après reprise respectivement par 1 ml de milieu MEM-h ou par 1 ml d'une solution tamponnée au phosphate, pH 7,2, a été titré par dilution logarithmique de raison 10, sur œufs embryonnés de 9 jours issus de poules exemptes d'organismes pathogènes spécifiques EOPS (AFSSA-Site de Ploufragan), selon la technique de référence VA10, révision 00 du programme 112 du Cofrac "Myxovirose à virus hémagglutinant : isolement par ovoculture et recherche de l'activité hémagglutinante". Le calcul du titre a été réalisé à partir de tous les œufs dont le liquide allantoïque était hémagglutinant, selon la méthode de Reed et Muench. 1.6. Calcul statistique Pour comparer les nombres de poulets excréteurs et les moyennes des titres de virus excrétés, un test de χ² et un test t de Student ont été utilisés respectivement. 1.7. Expérimentation animale Essai 1 : Choix du modèle d'épreuve Des poulets EOPS (AFSSA-site de Ploufragan), âgés de 7 semaines au moment de l'épreuve ont été éprouvés selon deux modalités (Figure 1). - Soit ils n'ont reçu que la souche H7N1 (108,2

DIE50 par voie oro-nasale et trachéale). - Soit ils ont reçu 107,6 UFC de Salmonella

Enteritidis par voie orale 2 jours avant l'administration de la souche H7N1 (selon les mêmes modalités que précédemment) et en même temps que H7N1, 104,6 UFC de Mycoplasma gallisepticum par voie trachéale.

L'excrétion virale par voie respiratoire et cloacale est mesurée en titrant la quantité de virus présente dans des écouvillons trachéaux et cloacaux respectivement collectés 3 à 6 jours post infection.

FIGURE 3 : Résultats de l'essai 1 FIGURE 1 : Evaluation du modèle d'épreuve faiblement pathogène

0

1

2

3

4

5

Jours après inoculation J+3 J+4 J+5 J+5 J+6

Pouletsexcréteurs

(sur 5)

Trachée Cloaque

3,4*

3,6

1,5

2,3

1,1

*Titre moyen en DIE50/ml

(log10)

Sans pré-infection SE ni Co-infection MGAvec pré-infection SE et co-infection MG

3,4 3,7 1,8

0,4 0,7

Protocole : 5 poulets EOPS âgés de 7 sem.

Avec ou sansPré-infectionS. Enteritidis

107,6 UFCpar voie Or

Avec ou sansCo-infection

M. Gallisepticum104,6 UFCpar voie T

Infection à raison de108,2 DIE50 de la souched’épreuve homologue

par voie T et O.N

J0

Animalerie P3

J-2 J+3 J+4 J+5 J+6 Jours

Trachée et Cloaque

Titrageindividuel

Dilution

( 1 ml )

L'excrétion virale par voie trachéale sur la période considérée n'a pas présenté de différence significative quelles que soient les modalités d'épreuve.

Voie Or : voie orale Voie T : voie trachéale Voie ON : voie oculo-nasale En revanche, par voie cloacale, les poulets ayant été

pré-infectés avec Salmonella Enteritidis et co-infectés avec Mycoplasma gallisepticum, ont présenté une excrétion virale significativement supérieure (moyenne des titres supérieure au seuil 5 % sur la période d’observation) par rapport aux poulets ayant reçu la souche d'épreuve AI seule.

Essai 2 : Effet de la co-administration de plasmides sur l'excrétion virale (Figure 2) Pour chaque association de plasmides, 4 combinaisons de doses ont été testées recourant à 50 ou 100 µg d'un des 2 plasmides par injection. En parallèle 5 sujets du même âge et de la même origine non vaccinés ont été éprouvés de la même façon et ont constitué le lot témoin.

C'est pourquoi dans l'essai 2 mesurant l'effet de la co-administration de plasmides sur l'excrétion virale, la pré-infection avec Salmonella Enteritidis et la co-infection avec Mycoplasma gallisepticum ont été maintenues et l'excrétion par voies trachéale et cloacale a été mesurée respectivement 4 et 6 jours après infection AIV.

FIGURE 2 : Effet de la co-administration de

plasmides sur l'excrétion virale

Protocole : Poulets EOPS de 5 semaines (5 /lot).Animalerie

P3

PS PS

Dosage Ac

anti-HA anti-NP

anti-M1

S0 S3 S4 S4,5 J4 J6

Epreuve homologueIdem Essai 1

après épreuve

Vaccination (MJV)

1ère 2ème

Associations différentesHA/NPHA/M1

Doses différentes 50 à 100 µg/plasmide

Mesure de

l’excrétion virale

EcT EcC

Essai 2 La vaccination à ADN plasmidique a permis de démontrer :

- une forte séroconversion en anticorps anti-HA (titre moyen de 7,5 en log2, 4 semaines après la première vaccination) significativement supérieure (p=0,00) pour les lots HAH7/M1 par rapport aux lots HAH7/NP

MJV : système Medi-Ject Vision - une séroconversion en anticorps anti-NP uniquement dans les lots vaccinés avec le plasmide codant NP

PS : prise de sang EcT : écouvillons trachéaux Ecc : écouvillons cloacaux

So, Sx…: semaines après la primovaccination - au niveau cloacal, une suppression totale de l'excrétion virale chez tous les animaux vaccinés, significativement différente (p<0,05) par rapport aux animaux du lot témoin.

2. Résultats

Essai 1 - une diminution après infection de l'excrétion virale par voie trachéale pour les sujets de tous les lots vaccinés HAH7/NP et HAH7/M1 (de -2,4 log10 à –3,5 log 10 DIE50/ml) voire pour les poulets des lots HAH7/M1 une suppression totale (différence significative p<0,05) par rapport aux poulets du lot témoin.

L'objectif de cet essai était de déterminer le modèle permettant d'induire une excrétion maximale de virus influenza de manière à pouvoir mesurer ensuite l'efficacité de la vaccination à réduire l'excrétion. Les résultats de l'excrétion virale par voies trachéale et cloacale sont représentés en titre moyen (DIE50/ml) dans la Figure 3.

Discussion-Conclusion La présente étude a pour objectifs ultimes la prévention de la diffusion des AIV H7 LP, en recourant à la vaccination d’urgence à l’aide d’un vaccin marqueur. Au préalable la mise au point d’un modèle expérimental a été nécessaire. Des données de la littérature montrent qu'une exacerbation de maladies aviaires est possible en réalisant des co-infections (Ex pneumovirose de la dinde exacerbée par une co-infection avec E. coli ou le virus de la maladie de Newcastle, Turpin et al., 2002). Aucune donnée équivalente n’existant pour l’influenza aviaire, nous avons donc cherché à savoir si la pré-infection ou la co-infection par des agents ayant le même tropisme respiratoire et digestif que les AIV ne permettrait pas d'aggraver l'infection et de conduire à une excrétion supérieure d'AIV. C'est pourquoi nous avons comparé l'excrétion d'AIV après infection de poulets par l'AIV seul ou après pré-infection par Salmonella Enteritidis et co-infection avec Mycoplasma gallisepticum. Nous avons pu observer que l'excrétion virale par voie trachéale n'a pas présenté de différence significative quelles que soient les modalités d'épreuve. En revanche, par voie cloacale, les poulets ayant été pré-infectés avec Salmonella Enteritidis et co-infectés avec Mycoplasma gallisepticum, ont présenté une excrétion virale significativement supérieure (seuil 5 %) par rapport aux poulets ayant reçu la souche d'épreuve AI seule. C'est pourquoi dans l'essai 2 mesurant l'effet de la co-administration de plasmides sur l'excrétion virale, la pré-infection avec Salmonella Enteritidis et la co-infection avec Mycoplasma gallisepticum ont été maintenues. A des fins d’investigations expérimentales des propriétés protectrices de différentes protéines virales, nous avons recouru à la vaccination ADN car nous maîtrisons bien ce procédé chez les volailles (Cherbonnel et al, 2001, Cherbonnel et al. sous presse) lequel nous permet d’évaluer in vivo de nombreuses constructions génétiques administrées avec le système d’injection (à insuline) Medi-Ject Vision. De plus, ce procédé permet de transférer en toute innocuité à l’organisme receveur (ici le poulet) l’information génétique lui permettant de fabriquer une (des) protéine(s) virale(s) exactement similaires à la (aux) protéine(s) virale(s) normale(s) , sans administrer d’organismes génétiquement modifiés (type recombinant pox aviaire sans efficacité chez des poulets présentant une immunité antivariolique Swayne et al, 2000a). La mise en évidence de réponses humorales vis-à-vis des protéines virales ainsi produites (résultats non présentés pour M1) permet de valider les constructions génétiques en même temps qu’elle fournit des outils de diagnostic permettant à terme la distinction entre volailles vaccinées et infectées. Cependant il reste à explorer les réponses

immunitaires à médiation cellulaire, de manière à déterminer lesquelles sont importantes dans la protection contre l’infection. L’essai présenté se place dans une approche de criblage de manière à sélectionner les conditions (combinaisons de doses et d’associations de constructions) susceptibles d’intérêt. Ainsi s’explique le faible nombre de sujets par lot. Cependant à des fins d’étude statistique des regroupement ont permis de mettre en évidence l’intérêt de la co-administration à des poulets de plasmides codant M1 et l’hémagglutinine H7 pour supprimer l’excrétion de virus H7N1 après infection expérimentale. Bien que ce résultat soit aussi tout à fait inédit chez les volailles, il conviendra bien sûr de le vérifier sur un plus grand nombre de sujets en conditions d’épreuve homologue (comme ici) mais aussi hétérologue (avec des souches AIV H7 plus ou moins éloignées phylogénétiquement). Il reste aussi à valider ce résultat dans d’autres espèces la dinde notamment qui est la plus sensible à l’infection par les AIV. Bien que la vaccination ADN ne soit pas utilisée sur le terrain, nous pensons que pour des indications bien ciblées où la manipulation individuelle des volailles est déjà pratiquée (vaccins administrés par voie parentérale, vaccination d’urgence avec des vaccins à virus inactivé), elle peut avoir sa place à condition par exemple qu’un industriel adapte le système Medi-Ject Vision et nous travaillons à la rendre transférable. Néanmoins, à partir de ces travaux, nous nous employons aussi à initier d’autres approches vaccinales. Remerciements Les auteurs remercient le personnel SEEPA pour leur excellente collaboration technique. Références bibliographiques Alexander D.J., 2000. Vet. Microbiol. 74, 3-13. Bot A., Bot S., Bona C., 1998. Vaccine, 16, p 1675-1682. Cherbonnel, M. and Jestin V., 2001, abstracts of Journées Francophones de virologie, p45, A118. Cherbonnel, M., Rousset, J., and Jestin, V. Avian Diseases (sous presse) Donnelly J.J., Friedman A., Ulmer J.B. and Liu M.A., 1997. Vaccine, 15, p 865-868. Seo S.H., Webster R.G.,2001. J. Virol., 75, 2516-2525. Swayne, D.E., Beck, J.R. and Kinney, N. 2000a, Avian Diseases, 44, 132-137. Swayne D.E., Garcia M., Beck J.R., Kinney N.,Suarez D.L., 2000b. Vaccine, 18, 1088-1095. Swayne D.E., Beck J.R., Perdue M.L., Beard C.W., 2001. Avian Diseases, 45, 355-365. Turpin, E.A., Perkins, L.E., and Swayne D.E., 2002. Avian Diseases, 46, 412-422.

MARQUEURS IMMUNOLOGIQUES D’ESPÈCES DE COCCIDIES PARASITES DU POULET

Répérant Jean-Michel, Ribot Julie, Thomas-Hénaff Martine, Morel Henri, Morel Jeannine, Jestin Véronique

Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments, Unité de Recherche Virologie, Immunologie, Parasitologie

Aviaires et Cunicoles (VIPAC), Zoopôle Les Croix, BP 53, F-22440 Ploufragan Résumé Les coccidies sont des parasites très fréquents dans les élevages de volailles. L’identification des espèces d’Eimeria est primordiale pour appréhender le risque de coccidiose. Nous avons recherché des marqueurs immunologiques présents au niveau du stade oocyste, spécifiques des espèces potentiellement pathogènes du poulet. Ainsi, des antigènes spécifiques d’E. acervulina, E. tenella, E. maxima et E. necatrix de masses moléculaires respectives de 27, 27,5, 28,5 et 30 kDa ont été sélectionnés après immunisation de poulets et analyse en western-blot-immunoblot. Les travaux sont en cours avec E. brunetti. La spécificité de la réponse à ces antigènes a été vérifiée avec les sérums des poulets immunisés, et chez la souris pour les antigènes d’E. acervulina et E. tenella. Un test immunofluorescent est envisagé pour se substituer à l’immunoblot, trop lourd pour être transféré vers les laboratoires vétérinaires. Introduction 1. Matériels et méthodes

Les coccidies – E. acervulina et E. tenella ont été clonées en 1999 à partir d’un oocyste d’isolats anciens du laboratoire régulièrement entretenus par passages sur poulets. E. necatrix a été obtenue d’un prélèvement issu d’un cas sévère de coccidiose à cette espèce sur le terrain en 2001. Elle a été remultipliée plusieurs fois mais non clonée, aucune autre espèce ne s’étant exprimée lors des remultiplications. E. maxima a été clonée à partir d’un échantillon issu du terrain en 2000. Ces quatre espèces ont servi aux immunisations des animaux et aux électrophorèses en gel de polyacrylamide.

Les coccidies parasites du poulet appartiennent au genre Eimeria. Sept espèces ont été identifiées : E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox et E. tenella. Deux d’entre elles ne sont pas pathogènes : E. mitis et E. praecox, et deux entraînent morbidité et mortalité : E. necatrix et E. tenella. Les trois autres espèces ont des effets néfastes sur les performances zootechniques des oiseaux, et peuvent parfois provoquer des symptômes : diarrhées, frilosité, prostration. L’identification des différentes espèces n’est pas possible par un simple examen microscopique. Seules les lésions typiques et leur localisation dans le tube digestif permettent de les nommer avec certitude. La présence d’oocystes dans des prélèvements de fientes ne permet donc pas de mesurer le risque potentiel de coccidiose.

Antigènes – Des suspensions d’oocystes stérilisés avec de l’hypochlorite de sodium ont été broyées avec des billes de verre (3 cycles de 5 mn entrecoupées de congélation à –20°C – décongélation). Le pourcentage de destruction des oocystes et sporocystes a été vérifié au microscope. Plus de 99% des oocystes des grosses espèces (E. tenella et E. maxima) et plus de 90% de ceux des petites (E. acervulina et E. necatrix) étaient détruits par ce traitement.

Afin de différencier et de quantifier les espèces présentes dans un prélèvement de fientes ou de litière, nous avons recherché des antigènes présents sur les stades oocystes qui soient spécifiques de chaque espèce potentiellement pathogène. Des coquelets ont été immunisés par voie intramusculaire avec des suspensions antigéniques préparées à partir d’oocystes, et les réponses ont permis d’identifier en immunoblot des antigènes à potentiel diagnostique. Les antigènes sélectionnés d’E. acervulina et E. tenella ont été validés chez la souris BALB/c.

Les suspensions obtenues ont servi aux immunisations ou aux électrophorèses. Immunisations – Des coquelets frères de la poule Isabrown ont reçu les suspensions d’antigènes mélangées volume à volume avec de l’adjuvant de Freund, dans le muscle du bréchet. Un ou deux rappels ont eu lieu à 7 jours d’intervalle, et le sérum de chaque oiseau a été prélevé 21 ou 22 jours, 28 ou 30 jours, et 42 ou 43 jours après la première immunisation.

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Des souris Balb/c mâles ont reçu l’antigène électroélué d’E. acervulina avec de l’adjuvant de Freund ou l’antigène d’E. tenella en acrylamide, à la base du cou, avec un rappel sept jours plus tard. Le sang a été prélevé jusqu’à 21 jours après la première immunisation. Immunoblot – Les suspensions antigéniques ont été séparées sur gel de polyacrylamide réticulé à 12% et le contenu des gels a été transféré sur nitrocellulose. Les immunoempreintes ont été réalisées avec les sérums des oiseaux ou des souris dilués au 1/100 en tampon Tris-NaCl-Tween 20 selon un protocole déjà décrit (Répérant et al., 1994). Les anticorps anti-poulets couplés à la phosphatase alcaline ont été incubés à température ambiante pendant 1 heure, et la révélation des bandes reconnues a été effectuée avec un kit Sigma NBT-BCIP. 2. Résultats Plusieurs antigènes de chaque espèce de coccidie étudiée ont été reconnus par les sérums immuns homologues. Les profils sont présentés sur la figure 1. Les antigènes les mieux reconnus étaient: une bande à 27 kDa pour E. acervulina, une bande à 28,5 kDa pour E. maxima, une bande à 30 kDa pour E. necatrix et une bande à 27,5 kDa pour E. tenella. La reconnaissance de ces antigènes s’est faite avec les sérumsprélevés à J21-22 pour E. maxima et E. tenella. Les bandes d’E. acervulina et E. necatrix n’ont été reconnues qu’à partir de J28-30 après la première immunisation. Des immunoblots avec des extraits antigéniques de chaque espèce et les sérums immuns hétérologues ont permis de montrer la spécificité de la reconnaissance de ces antigènes. Les sérums des souris immunisées avec les antigènes d’E. acervulina et E. tenella isolés à partir des gels de polyacrylamide ont permis de montrer que ces antigènes sont encore reconnus après migration électrophorétique et que la réponse est spécifique.

Conclusion Des antigènes spécifiques du stade oocyste ont été mis en évidence pour quatre des cinq espèces pathogènes du poulet. Ces antigènes ne sont pas reconnus par les sérums d’oiseaux immunisés avec d’autres espèces de coccidies, indiquant la bonne spécificité des sérums immuns et leur intérêt pour le diagnostic. Les anticorps reconnaissant ces antigènes sont de bons outils pour une identification des espèces présentes dans un échantillon. Cependant, l’identification des espèces par immunoblot est lourde et uniquement qualitative : elle ne permet pas de déterminer les proportions relatives des différentes espèces lorsque plusieurs d’entre elles sont présentes. Des tests en immunofluorescence ont été réalisés avec les sérums immuns, avec des oocystes en suspension ou fixés en acétone glacial, mais nous nous heurtons à des problèmes de bruit de fond (marquage non spécifique) et de localisation précise des antigènes sur les constituants de l’oocyste : paroi, sporocyste ou sporozoïte… Nous n’avons cloné E. brunetti que récemment d’un isolat terrain, et la recherche d’un antigène spécifique de cette espèce est en cours. Le développement de ces nouveaux outils pour la meilleure connaissance des espèces présentes dans les élevages et de leurs proportions relatives devrait permettre de mieux appréhender le risque de coccidiose afin de limiter les recours aux anticoccidiens de traitement lorsque le risque est faible (espèces non pathogènes très représentées, espèces très pathogènes peu nombreuses…). Référence bibliographique Répérant J-M. et al, 1994. Vet. Parasitol., 55, 1-13

Figure 1 : Masses moléculaires des quatre antigènes sélectionnés de quatre espèces pathogènes de coccidies du poulet

L’immunoblot a été réalisé à partir d’un même gel, ce qui permet de vérifier que les quatre antigènes migrent à des distances différentes

ETUDE EXPERIMENTALE COMPAREE DE LA SENSIBILITE DU CANARD DE BARBARIE AUX DIFFERENTS SOUS GROUPES DE PNEUMOVIRUS AVIAIRES ISOLES DE DINDE ET DE CANE

Toquin Didier, Allée Chantal, Morin Yannick, Jestin Véronique, Eterradossi Nicolas

AFSSA – Site de Ploufragan, Zoopôle, BP 53, 22440 Ploufragan

Résumé Six souches de pneumovirus aviaire (Metapneumovirus, Paramyxoviridae) isolées dans des élevages de dindes de chair ou de canes reproductrices et appartenant aux sous-groupes antigéniques A, B, C et D ont été inoculées à dose constante et par voie naturelle à des canetons de barbarie EOPS. Des symptômes respiratoires nets (toux et jetage nasal) n’ont été observés qu’après inoculation du virus 99178 (sous-groupe C, origine cane barbarie / France), déjà connu comme pathogène pour le canard de barbarie. Les seules séroconversions détectées en ELISA avec des antigènes homologues aux virus d’épreuves ont été observées après inoculation des virus de sous-groupe C isolés chez la dinde aux Etats-Unis ou chez la cane (pékin ou barbarie) en France. A partir des écouvillons trachéaux effectués à J4 et J7, seuls les virus de sous groupe C ont pu être réisolés à J4 et/ou J7 sur cellules Vero. Les tests de RT-PCR se sont révélés négatifs pour les sujets témoins et les sujets inoculés avec deux des virus de sous groupes C. Ils sont en cours pour les autres lots. Introduction Chez le caneton de barbarie EOPS, l’inoculation

d’une des souches isolées chez la cane barbarie (référence 99178) entraîne des symptômes respiratoires et une séroconversion sur l’antigène homologue (Jestin et al., 2000).

Depuis les années 80, de nombreuses souches de pneumovirus (APV) ont été isolées chez différentes espèces aviaires faisant l’objet d’un élevage intensif (dinde, poule, pintade, canard), espèces chez lesquelles ces virus provoquent des troubles respiratoires de type rhinotrachéite infectieuse (RTI) et/ou des chutes de ponte (pour revue, voir Cook, 2000). La caractérisation antigénique et moléculaire de ces virus a conduit à définir quatre sous groupes notés A, B, C et D (pour revue, voir Cook and Cavanagh, 2002). Les sous groupes A, B et D correspondent à des virus isolés chez la dinde en Europe, et coexistaient dans les années 85-86 en Bretagne. Plusieurs enquêtes sérologiques ont montré que le sous-groupe B est actuellement largement dominant en Europe (Eterradossi & Toquin, communications personnelles). Le dernier sous-groupe, C, regroupe des virus isolés en 1997 aux Etats-Unis chez des dindes atteintes de RTI (Senne et al., 1997) et en 1999 en France chez des canes pékin ou barbarie présentant des chutes de ponte (Toquin et al., 1999).

En revanche, la sensibilité du canard aux différentes souches de pneumovirus isolées chez la dinde reste mal connue. L’objet de cette étude était donc de vérifier dans des conditions expérimentales standardisées comment réagissaient des canetons de barbarie EOPS à l’inoculation de pneumovirus aviaires appartenant aux différents sous-groupes A, B, C et D. 1. Matériels et méthodes 1.1. Virus : Les souches de pneumovirus inoculées, leurs pays et espèce animale d’origine ainsi que leur sous groupe sont indiqués au Tableau 1. Tous les virus ont été multipliés et titrés sur cellules Véro avant inoculation. 1.2. Animaux : Six lots de 20 canetons de barbarie EOPS âgés de 18 jours ont été inoculés avec les différents virus à la dose constante de 103.70 DICT50, administrée pour moitié par voie intra nasale et pour moitié par voie intra oculaire (2 x 0.1ml).

Chez le dindonneau exempt d’organismes pathogènes spécifiés (EOPS), il a été expérimentalement démontré que les virus des sous-groupes A, B ou D entraînent des signes caractéristiques de RTI accompagnés d’une séroconversion détectée de façon optimale sur un antigène ELISA préparé à partir d’un virus homologue. En revanche, différents virus de sous-groupe C isolés chez la cane n’induisent qu’une séroconversion non accompagnée de signes cliniques (Toquin et al., 2000).

Les canetons du lot témoin ont été inoculés de même avec un surnageant de cellules Véro non infectées. 1.3. Prélèvements : Pour chaque lot, des écouvillons trachéaux ont été réalisés sur 5 sujets identifiés, à J+4 et J+7 après inoculation (PI). Les écouvillons ont été placés dans 2 ml de milieu de culture cellulaire (MEMH) additionné de sérum de veau fœtal.

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Une prise de sang pour analyse sérologique a été réalisée avant inoculation sur 5 sujets par lot et en fin d’expérimentation (J+28 PI) sur 11 sujets par lot. 1.4. Suivi clinique : Chaque sujet a fait l’objet d’une observation quotidienne de J+3 à J+14 PI. Les symptômes ont été quantifiés selon le Tableau 2. Pour un individu donné, l’indice symptomatique correspond au total des scores mesurés un jour donné. Il varie de 0 à 6. Chaque jour, l’indice symptomatique moyen du lot est calculé. Il est égal au total des indices individuels journaliers divisés par le nombre total de sujets vivants dans le lot. 1.5. Isolement viral : Les surnageants d’écouvillon ont été centrifugés et additionnés d’antibiotiques (pénicilline-streptomycine, fungizone et gentalline) puis ont été inoculés sous 0.5 ml sur cellules Véro. Les cultures ont été observées quotidiennement pour recherche de l’effet cytopathogène. Les cultures négatives ont fait l’objet de 2 subcultures successives à 7 jours d’intervalle. A chaque passage, les résultats de l’observation microscopique ont été confirmés par un test d’immunofluorescence indirecte réalisé avec un sérum de dinde homologue de la souche virale recherchée et un conjugué anti immunoglobuline de dinde / fluorescéine. 1.6. RT-PCR : L’ARN viral a été extrait à partir de 0.4 ml du surnageant de chaque écouvillon à l’aide du kit commercial RNeasy mini Kit (Qiagen). Un surnageant de culture inoculée avec le virus recherché a été traité de manière identique à titre de témoin positif. L’ARN extrait a été rétrotranscrit à 42°C pendant 60 minutes avec la Superscript IITM RT (Invitrogen) et avec des amorces antisens spécifiques de chaque sous groupe viral inoculé (TRTG2- pour le virus 85051, TRTG12- pour 86004, G-1005 pour le virus 85035 et N-899 pour les APV-C) La PCR a ensuite été réalisée avec le kit « Expand High Fidelity PCR System » (Roche Diagnostic Gmbh), les amorces antisens déjà citées et les amorces sens Ga (APV-A et -B), G+50 (APV-D) et N+793 (APV-C) (Bäyon-Auboyer et coll. 1999, 2000 ; Freymuth et coll., 2002).. Le programme de la PCR comprenait un premier cycle de dénaturation à 94°C pendant 2 minutes, suivi de 35 cycles incluant chacun une dénaturation à 94°C pendant 15 secondes, un appariement adapté à chaque paire d’amorce pendant 30 secondes et une extension à 72°C pendant 1 minute. Une extension finale à 72°C pendant 7 minutes a été finalement réalisée. Les produits amplifiés ont été visualisés en gel d’agarose additionné de bromure d’éthidium. 1.7. ELISA : La technique utilisée a été mise au point pour la sérologie pneumovirus chez la dinde, la poule et la pintade (Giraud et al., 1987) et a été modifiée pour la sérologie chez le canard (Jestin et al., 2000). Les antigènes mis en œuvre ont été préparés à partir de pneumovirus appartenant aux différents sous-groupes, calibrés avec des sérums mono-spécifiques homologues préparés sur dinde EOPS et ont été utilisés aux dilutions établies dans le système dinde.

La technique modifiée pour la sérologie du canard met ensuite en œuvre un conjugué anti immunoglobuline de canard / peroxydase (Nordic Immunology) et l’o-phénylènediamine (Sigma) en tampon citrate/eau oxygénée comme substrat. L’absorbance est mesurée avec le double filtre 490/630 nm. 2. Résultats 2.1. Suivi clinique : Aucune mortalité n’a été observée durant toute la durée de l’essai et aucun symptôme n’a été observé chez les sujets ayant reçu le surnageant de cellules non infectées. Les canards inoculés avec les virus 85051 (APV-A), 86004 (APV-B) et 193ADV9802 (APV-C, origine dinde) n’ont pas présenté de symptômes. Dans le lot inoculé avec le virus 85035, un écoulement nasal discret a été observé à J+4 PI chez 3 des 20 sujets inoculés et à J+5 chez un seul sujet. Dans le lot inoculé avec le virus 99214 (APV-C, origine canard pékin), seul un sujet sur 20 a présenté une toux discrète à J+3. Dans le lot inoculé avec le virus 99178 (APV-C, origine canard barbarie), au moins 41% des sujets observés chaque jour entre J+4 et J+10 ont présenté des symptômes (écoulement nasal, croûtes nasales et principalement toux) avec un maximum à J+6 date à laquelle 82% des sujets présentaient des symptômes. L’index symptomatique de ce lot a varié de 0.6 à J+4 à 0.76 à J+6, pour redescendre à 0 à J+11. 2.2. Isolement viral : Les résultats des essais d’isolement sont présentés au Tableau 3. Aucun virus n’a été isolé chez les canetons témoin ni dans les lots inoculés avec les virus 85051 (APV-A), 86004 (APV-B) ou 85035 (APV-D), quelle que soit la date de prélèvement. Dans le lot ayant reçu le virus 193ADV9802 (APV-C dinde), 4 écouvillons ont été trouvés positifs à J+4 et 2 à J+7. Dans le lot ayant reçu le virus 99214 (APV-C canard), un seul écouvillon a été trouvé positif à J+4 et aucun à J+7. Dans le lot ayant reçu le virus 99178 (APV-C canard), le virus inoculé a été réisolé chez les 5 sujets prélevés à J+4 et chez aucun sujet à J+7. 2.3. RT-PCR : La RT-PCR a pour l’instant été réalisée dans les lots témoin ou inoculés avec les virus 193ADV/9802 ou 99214 (Tableau 3). Aucun des écouvillons analysés n’a permis la mise en évidence du génome viral, pourtant détectable dans les surnageants de cultures infectées utilisés à titre de témoins positifs. 2.4. Sérologie par ELISA : Les sérums prélevés avant inoculation, comme ceux récoltés à J+28 PI chez les canards du lot témoin, ont produit des valeurs d’absorbance négligeables quel que soit l’antigène ELISA mis en œuvre (maximum 0,033, Tableau 4). Dans chacun des lots inoculés avec les virus de sous-groupes A, B ou D, les absorbances moyennes mesurées sur l’antigène ELISA homologue du virus

inoculé (0,024 à 0,077) ne différaient pas significativement de celles mesurées dans le lot témoin avec les mêmes antigènes (0,019 à 0,033). Pour autant, un sujet dans chacun des lots inoculés avec les virus 85051 ou 86004 présentait une absorbance nettement supérieure (respectivement 0,363 et 0,428). Par contre, dans les 3 lots inoculés avec les virus de sous-groupe C isolés de dinde ou de cane, les absorbances mesurées à J+28 PI avec les antigènes ELISA de sous groupe C ont été trouvées très significativement supérieures à celle du lot témoin (en moyenne 0,311 à 0,614 contre 0,000 à 0,004, p<0.001). 3. Discussion et Conclusions La présente étude avait pour objectif d’étudier dans des conditions standardisées la sensibilité du caneton de barbarie EOPS à différentes souches de pneumovirus aviaires isolées chez la dinde ou la cane et appartenant aux sous groupes A, B, C ou D.

L’inoculation des virus 85051, 86004 et 85035, isolés chez la dinde et appartenant respectivement aux sous groupes A, B et D, n’a induit ni signes respiratoires (si ce n’est un écoulement nasal limpide chez trois des 60 sujets inoculés), ni séroconversion nette. Les données sérologiques sont à interpréter avec précaution car le seuil de positivité pour ces antigènes ne peut être validé chez le canard du fait de l’absence de sérum post infectieux de référence. Il reste que les niveaux immunitaires moyens observés dans les trois lots inoculés ne différaient pas significativement de ceux mesurés dans le lot témoin. La spécificité de réponse des deux sérums produisant une absorbance plus élevée mériterait d’être vérifiée par d’autres techniques comme l’immunofluorescence ou la séroneutralisation sur cellules (travaux en cours).

L’absence de séroconversion après inoculation de ces trois virus semble cohérente avec l’impossibilité de les réisoler sur cellules Vero à partir d’écouvillons trachéaux. Une réplication virale dans un autre organe se traduirait sans doute par une séroconversion. Les résultats semblent donc plutôt indiquer un état réfractaire du canard à l’infection. Les travaux de mise en évidence du génome viral par RT-PCR sont en cours, mais il conviendra d’en interpréter les résultats en prenant en compte la possibilité de détection de génomes viraux apportés par l’inoculum, et non issus de la réplication du virus inoculé. La détection de particules virales non infectieuses a par exemple déjà été envisagée par Bäyon-Auboyer et coll. (1999).

A l’inverse, les trois virus de sous-groupe C étudiés semblent bien infecter le caneton de barbarie EOPS : - Le virus 99178 isolé de cane de barbarie a entraîné des symptômes respiratoires accompagnés

d’une séroconversion homologue et a pu être réisolé au niveau trachéal à J+4 mais non J+7, comme l’avaient déjà montré Jestin et coll. (2000). - Le virus 99214 isolé de cane Pékin n’a induit aucun symptôme respiratoire, mais a induit une séroconversion nette vis à vis des seuls antigènes de sous–groupe C d’origine dinde ou canard. Le virus d’épreuve n’ayant pu être réisolé qu’à partir d’un écouvillon prélevé à J+4, il semblerait cependant que ce virus se réplique moins au niveau trachéal que le virus 99178. La présence éventuelle du virus dans d’autres organes cibles serait à vérifier. Une spécificité d’espèce étant aussi envisageable, le pouvoir pathogène de la souche 99214 sur des canetons pékin pourrait également être étudiée avec profit. - Enfin, le virus 193ADV9802 (isolé chez la dinde aux USA) n’a pas induit de symptôme mais a induit une séroconversion homologue et a pu être réisolé jusqu’à J+7 PI. Ces résultats sont comparables à ceux obtenus aux USA chez le canard colvert, avec des virus de sous groupe C pathogènes pour la dinde et inoculés expérimentalement (Shin et al., 2001) ou transmis par infection naturelle au canard sentinelle placés à proximité d’un élevage de dindes infecté (Shin et al. 2002).

Les essais de dépistage du génome viral par RT-PCR restent à réaliser pour l’un des virus de sous-groupe C inoculés (99178). L’absence de détection des virus 99214 et 193ADV/9802 à des dates où ces virus peuvent être isolés apparaît cependant d’ores et déjà en contradiction avec les résultats obtenus antérieurement (Bäyon-Auboyer et coll., 1999) et suggère un défaut de sensibilité de la technique employée ici. Les causes susceptibles d’expliquer ce résultat peuvent être multiples (rendement différent des techniques d’extraction de l’ARN viral utilisées dans les deux études, présence d’inhibiteurs de la PCR dans les prélèvements trachéaux issus de canard…) et restent à approfondir.

Les résultats présentés ici, à compléter en ce qui concerne les résultats de RT-PCR, suggèrent donc que les pneumovirus aviaires de sous groupes A, B et D pourraient ne pas être infectieux pour le canard, alors que les virus de sous-groupe C, qu’ils aient été isolés chez la dinde aux USA ou chez le canard en France, se répliquent effectivement au niveau respiratoire chez le caneton barbarie, comme cela avait déjà été montré chez le dindonneau (Toquin et al., 2000). Il conviendrait de confirmer ces premiers résultats par l’étude d’autres pneumovirus aviaires, sauvages ou vaccinaux. L’ELISA utilisant un antigène viral de sous-groupe C apparaît comme un outil disponible et facile à mettre en œuvre pour étudier la prévalence des pneumovirus chez le canard. La mise au point d’une RT-PCR destinée à détecter les APV de sous groupe C chez cette espèce et à partir d’écouvillonnages trachéaux se poursuit.

Références bibliographiques Bäyon-Auboyer M.H., Jestin V., Toquin D., Cherbonnel M. and Eterradossi N. (1999) Arch Virol. 144, 1091-1109. Cook, J.K. (2000). Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics) 19(2), 602-613. Cook JK & Cavanagh D. (2002) Avian Path. 31, 117-132 Freymuth F., Eterradossi N., Toquin D., Jestin V., Vabret A., Petitjean J., Gouarin S. (2002) Virologie. Vol. 6. Numéro spécial. S14. Giraud P., Bennejean G., Guittet M., Toquin D. (1986) Vet. Rec. 119, 6. Giraud P., Toquin D., Picault J.P., Guittet M., L'Hospitalier R., Kles V., Bennejean G. (1987). Bull. Inf. Lab. Serv. Vét., 27-28.

Jestin V., Toquin D., Le Bras M.O., Amenna N. (2000) Proceedings of the 5th International congress of the European Society for Veterinary Virology. Brescia. 27-30 August 2000. 341-342. Senne, D.A., Edson, R.K., Pedersen, J.C. & Panigraphy B. (1997). Proceedings of the 134th annual congress of the Ameracan Veterinary Medical Association, p. 190. Reno, NV, USA. Shin HJ, Njenga MK, Halvorson DA, Shaw DP, Nagaraja KV. (2001). Am. J. Vet. Res. 62(7), 991-4. Shin HJ, Nagaraja KV, McComb B, Halvorson DA, Jirjis FF, Shaw DP, Seal BS, Njenga MK. (2002) Virus Res. 83(1-2):207-12. Toquin D., Bäyon-Auboyer M.H., Jestin V., Eterradossi N., Morin H. (1999). Vet. Rec. 145, 23, 680. Toquin D., Eterradossi N., Jestin V. (2000) Filières Avicoles. 627, 55-57.

TABLEAU 1 : Caractérisitiques des souches utilisées dans l’essai d’inoculation expérimentale à des canetons de barbarie

EOPS agés de 18 jours Code Sous groupe Espèce Pays Référence 85051 A Dinde France Bäyon-Auboyer et al. 1999 86004 B Dinde France Giraud et al. 1986 85035 D Dinde France Bäyon-Auboyer et al. 1999

193ADV9802 C Dinde Colorado (U.S.A) Senne et al. 1997 99178 C Cane Barbarie France Toquin et al. 1999 99214 C Cane Pékin France Toquin et al. 2000

TABLEAU 2 : Codification des symptômes relevés chez les animaux inoculés

E1 / Score = 1 E2 / Score = 2 T1 / Score = 1 T2 / Score = 2 C1 / Score = 1 C2 / Score = 2 écoulement nasal limpide

écoulement nasal épais et visqueux

toux ou râle discret toux ou râle marquée

croûte nasale unilatérale

croûte nasale bilatérale

TABLEAU 3 : Résultats de l’isolement viral et de la RT-PCR réalisés sur 5 écouvillons par lot, à J+4 et J+7 après

inoculation Isolement viral RT-PCR

LOTS J+4 J+7 J+4 J+7 Témoins VERO 0+/5 0+/5 0+/5 0+/5 Inoc. 85051 (A) 0+/5 0+/5 ND ND Inoc. 86004 (B) 0+/5 0+/5 ND ND Inoc. 85035 (D) 0+/5 0+/5 ND ND Inoc. 99178 (Ca) 5+/5 0+/5 ND ND Inoc. 99214 (Ca) 1+/5 0+/5 0+/5 0+/5

Inoc. 193ADV8602 (Co) 4+/5 2+/5 0+/5 0+/5 ND : non disponible à ce jour

TABLEAU 4 : Résultats exprimés en moyenne des 11 sérums prélevés 28 jours après inoculation des différents lots de canetons de Barbarie EOPS testés en ELISA avec les différents antigènes

Ag 85051 (A) Ag 86004 (B) Ag 85035 (D) Ag 99178 (Ca) Ag 193ADV (Co) Avant inoc. 0.012 0.010 0.011 0.002 0.014

Témoin Véro 0.033 (0.021) 0.019(0.011) 0.026 (0.016) 0.004 (0.016) 0.000 (0.010) Lot 85051 0.077 (0.098) 0.025 (0.018) 0.025 (0.018) -0.002 (0.007) -0.008 (0.011) Lot 86004 0.046 (0.047) 0.063 (0.116) 0.032 (0.034) 0.002 (0.010) 0.006 (0.011) Lot 85035 0.028 (0.008) 0.022 (0.006) 0.024 (0.009) 0.000 (0.004) 0.003 (0.006) Lot 99178 0.073 (0.046) 0.051 (0.037) 0.059 (0.037) 0.614 (0.055) 0.544 (0.104) Lot 99214 0.058 (0.043) 0.048 (0.032) 0.046 (0.032) 0.396 (0.143) 0.311 (0.134)

Lot 193ADV 0.041 (0.018) 0.032 (0.028) 0.035 (0.017) 0.362 (0.178) 0.418 (0.215) • Les valeurs homologues sont notées en gras. • Les écart-types sont notés entre parenthèses. Les valeurs grisées sont très significativement différentes des valeurs obtenues avec le lot témoin Véro sur l’antigène homologue

ETUDE DES SENSIBILITES DE SOUCHES DE PASTEURELLA MULTOCIDA, ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE ET RIEMERELLA ANATIPESTIFER D’ORIGINE

AVIAIRE VIS A VIS DE LA TIAMULINE

Gavaret Thierry1, Jacquinet Claire2,, Balloy Dominique3

1 SCP de vétérinaires, 53 route de Nantes, 85300 Challans 2 Ceva Santé Animale, ZI la Ballastière, 33501 Libourne

3 LABOVET, ZAC la Buzenière, 85500 Les Herbiers Résumé Les sensibilités des souches de Pasteurella multocida, Ornithobacterium rhinotracheale et Riemerella anatipestifer d’origine aviaire sont étudiées vis à vis de la tiamuline sur une période de trois ans. La constance des valeurs très basses de CMI, ainsi qu’une répartition des souches, homogène et de type unimodale, sont en faveur d’une excellente activité de la tiamuline, et de l’absence d’apparition de résistance. La distribution intra-tissulaire de la tiamuline et les très fortes concentrations intracellulaires déterminent son efficacité dans le contrôle des pathologies respiratoires chroniques des volailles. Enfin, le statut particulier de cette molécule, réservée à la médecine vétérinaire, est un atout précieux dans le choix d’une antibiothérapie raisonnée. Introduction La tiamuline est un anti-infectieux original appartenant à la famille des pleuromutilines. Historiquement, la tiamuline est indiquée pour lutter contre les maladies respiratoires chroniques (mycoplasmes) des volailles et des porcs, ainsi que l’entérite hémorragique du porc. (Drews et al., Stipkovits et al.). Elle possède également, depuis peu, une AMM chez le lapin pour le contrôle de l’entérocolite. Le but de cette étude est de valider l’intérêt de la tiamuline comme nouvelle alternative pour lutter contre les principaux germes impliqués dans les pathologies respiratoires des volailles, et plus précisément du canard et de la dinde. En effet, un spectre large adapté, une diffusion tissulaire et intracellulaire très importantes, semblent décisifs pour une meilleure maîtrise de ces germes compte-tenu des formes chroniques de la pathologie respiratoire en élevage et des récidives obtenues avec les thérapeutiques habituelles de première intention comme par exemple les tétracyclines, ou l’amoxicilline. 1.1. Matériels et méthodes Les observations faites sont basées sur les résultats des analyses réalisées par le laboratoire de biologie vétérinaire LABOVET, situé en Vendée. Les techniques d’ensemencement, d’isolement, d’identification et de réalisation des antibiogrammes sont les techniques habituelles de la bactériologie. Ornithobacterium rhinotracheale et Riemerella anatipestifer sont isolés sur gélose au sang additionnée de gentamycine sous CO2 . La mesure des CMI pour la tiamuline est réalisée sur gélose par transcription informatique (Toucan *) des diamètres d’inhibition mesurés au pied à coulisse électronique lors de la lecture des antibiogrammes.

Cette mesure de CMI n’est donc qu’une indication. Cependant les valeurs de CMI, beaucoup plus parlantes pour le vétérinaire praticien qu’un diamètre d’inhibition, permettent de faire appel aux notions de pharmacocinétique pour le choix thérapeutique. De plus, et à condition d’être établie sur plusieurs dizaines de souches et périodiquement répétée, l’analyse de la distribution des CMI d’une espèce bactérienne vis à vis d’un antibiotique donne une bonne représentation de l’épidémiologie des résistances. Pour chaque germe étudié, on obtient une distribution, au sens statistique, des valeurs des CMI. La CMI 50 est estimée par la médiane de cette distribution, la CMI 90 par le centile 0,9. Une mise en forme graphique qui lisse les valeurs des CMI, en relativisant par rapport aux valeurs critiques de sensibilité et de résistance est proposée. Pour ce faire les CMI sont réparties par classes en fonction des critères suivants : CMI≤ 4c : souches très sensibles 4c<CMI≤2c : souches sensibles 2c<CMI≤c : souches moyennement sensibles c<CMI≤C : souches intermédiaires C<CMI≤2C : souches faiblement résistantes 2C<CMI≤4C : souches résistantes CMI>4C : souches très résistantes c = CMI critique inférieure : CMI<c la souche est considérée sensible à l’antibiotique testé C = CMI critique supérieure : CMI>C la souche est considérées résistante à l’antibiotique testé Pour la tiamuline, les concentrations critiques inférieures et supérieures sont respectivement 8 et 16 µg/ml (Jones R. et al., 2002) Un histogramme représente le pourcentage de chacune des catégories. Cette répartition par classe qui ne tient

Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003

compte que des valeurs relatives des CMI par rapport aux limites de sensibilité et de résistance permet de suivre l’évolution dans le temps des CMI et de comparer les sensibilités des souches à des antibiotiques différents en élargissant un peu la notion simple de sensibilité et de résistance. 2. Résultats 38 souches de Pasteurelles, 87 souches d’Ornithobacterium et 125 souches de Riemerella isolées sur les pays de Loire pendant le premier semestre de l’année 2002 ont été incluses dans cette étude. La répartition des isolements par espèce aviaire est présentée dans le Tableau 1, et montre que ces germes sont principalement isolés de canards et de dindes. Les Tableaux 2,3, et 4 présentent les pourcentages de sensibilité à la tiamuline pour chacun des germes et comparés sur 3 années. Une estimation des CMI 50 et 90 est donnée dans le Tableau 5 pour l’année 2002. Les graphes 1, 2 et 3 représentent la répartition des CMI en fonction des classes de sensibilités à la tiamuline pour ces trois germes, sur 2000 et 2002. 3. Discussion

Les résultats des sensibilités à la tiamuline pour Pasteurella multocida, Ornithobacterium rhinotracheale et Riemerella anatipestifer montrent une activité très intéressante de cette molécule. Les CMI sont très basses vis à vis d’Ornithobacterium rhinotracheale et Riemerella anatipestifer, plus élevées mais néanmoins sensibles pour Pasteurella multocida. De même, les valeurs des CMI 90 en-dessous de la concentration critique inférieure pour Ornithobacterium rhinotracheale et Riemerella anatipestifer, et en dessous de la concentration critique supérieure pour Pasteurella multocida, sont en faveur d’une très bonne sensibilité des populations bactériennes présentes sur le terrain. Dans tous les cas, et sur trois ans, la répartition des souches reste de type unimodale, ce qui est en faveur de l’absence d’apparition de résistance. Ces résultats sont compatibles avec les précédentes observations de Valks et al. dans une étude comparative de l’activité et du développement des résistances, sur 25 ans, des mycoplasmes aviaires vis à vis de la tiamuline et d’autres anti-infectieux. Cette étude confirme qu’aucune souche de mycoplasme n’est devenue résistante au cours des 25 dernières années, alors que ces mycoplasmes ont acquis des résistances vis à vis d’autres molécules : enrofloxacine, lincomycine, tylosine, oxytétracycline. Les auteurs concluent que la tiamuline induit des résistances de façon très lente, et plus lentement que les autres antibiotiques testés. A titre d’exemple, les CMI les plus hautes de la tiamuline vis à vis de Mycoplasma

gallisepticum sont encore 16 fois plus basses que celles de la lincomycine. (Valks et al., 2001). Une autre étude récente de sensibilité aux antibiotiques des souches d’Ornithobacterium rhinotracheale révèle une acquisition de résistances pour toutes les familles d’antibiotiques, à l’exception de la tiamuline (Devriese et al., 2001). Dans une étude de sensibilités de souches de Riemerella anatipestifer , menée avec les mêmes méthodes que dans ce travail, seuls le ceftiofur , les cyclines et l’amoxicilline présentent un niveau de sensibilité comparable à la tiamuline, supérieur à 95% (Gavaret et al., 2000). La pathogénie des troubles respiratoires chroniques reste encore mal connue, notamment chez le canard, et dans une moindre mesure chez la dinde. Il reste encore beaucoup d’inconnues quant aux implications respectives des mycoplasmes, pasteurelles, et riemerelles chez le canard (Kempf, 1990). Chez la dinde, les infections à Ornithobacterium, reconnues comme majeures dans cette espèce, sont sans doute sous-diagnostiquées en raison du portage chronique possible (respiratoire et articulaire) et des récidives fréquentes observées en élevage (Chin et al., 1997). La très forte concentration tissulaire et intracellulaire de la tiamuline, ainsi que son large spectre adapté aux germes respiratoires, laissent présager d’une efficacité in vivo sur ces pathologies respiratoires que des essais terrain pourront confirmer. Enfin, cette molécule présente des atouts d’avenir dans le choix raisonné et sécurisé des thérapeutiques en médecine vétérinaire. En effet, la tiamuline est un cas à part dans les différentes familles des anti-infectieux : elle est réservée à la médecine vétérinaire, n’engendre pas de résistance croisée avec d’autres familles d’antibiotiques utilisés en médecine humaine ou vétérinaire, et les acquisitions de résistance sont lentes, voire très lentes (EMEA report, 1999). Conclusion

Les niveaux de sensibilité obtenus par les méthodes de laboratoire confirment que la tiamuline est une alternative très intéressante aux thérapeutiques actuelles utilisées dans le contrôle des pathologies respiratoires chroniques des dindes et des palmipèdes. Une prochaine étape consistera à évaluer les modalités pratiques d’administration en élevage. Références bibliographiques

Chin R. P., et al., Diseases of poultry, Xème edition, 1012-1015 Devriese L.A., et al., Avin Pathology (2001) 30, 197-200 Drews, J. et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy., 2, 5, pp507-516

EMEA report by the Committee for Veterinary Medicinal Products, 14 july 1999

Stipkovits, L ; et al., (1993) Proceedings Xth WVPA Congress, Sydney, p179, Abs 121

Gavaret T., et al., Proceedings 4èmes Journées de la recherche sur les palmipèdes à foie gras, Arcachon, p84

Stipkovits, L., et al., (1993) Proceedings Xth WVPA Congress, Sydney, p155, Abs 40 Valks M., et al., Proceedings Xth WVPA Congress, Cairo, p200, Abs 38 Jones R., et al., Journal of cClinical Microbiology, feb.

2002, p.461-465 * logiciel TOUCAN version 6.0 BIORAD ND Kempf I., Rec. Med. Vet., 1990, 166 (12), 1111-1115

TABLEAU 1 : Répartition des isolements sur l’année 2002, de Pasteurella multocida, Ornithobacterium rhinotracheale et de Riemerella anatipestifer par espèce aviaire

Nombres d’isolements barbarie mulard Mulard

gavage pékin dinde poulet poule gibier

Pasteurella multocida 1 20 9 2 6 2 Ornithobacterium

rhinotracheale 78 4 5

Riemerella anatipestifer 74 19 1 9 22

TABLEAU 2 : Pourcentage de sensibilité sur 3 années des souches de Pasteurella multocida vis à vis de la tiamuline (16-8)

Pasteurella multocida 2000 2001 2002

Nombre de souches testées 21 49 38 % de souches sensibles 57% 86% 87%

% de souches intermédiaires 24% 12% 8% % de souches résistantes 19% 2% 5%

TABLEAU 3 : Pourcentage de sensibilité sur 3 années des souches de Ornithobacterium rhinotracheale vis à vis de la tiamuline (16-8)

Ornithobacterium

rhinotracheale 2000 2001 2002

Nombre de souches testées 196 185 87 % de souches sensibles 99% 100% 99%

% de souches intermédiaires 0% 0% 0% % de souches résistantes 1% 0% 1%

TABLEAU 4 : Pourcentage de sensibilité sur 3 années des pour souches de Riemerella anatipestifer vis à vis de la tiamuline (16-8)

Riemerella anatipestifer 2000 2001 2002

Nombre de souches testées 184 193 125 % de souches sensibles 99% 98% 98%

% de souches intermédiaires 1% 1% 1% % de souches résistantes 0% 2% 2%

TABLEAU 5 : Estimation des CMI 50 et 90 pour Pasteurella multocida, Ornithobacterium rhinotracheale et

Riemerella anatipestifer sur l’année 2002

CMI 50 (2002) CMI 90 (2002) Pasteurella multocida 5,5 10,9

Ornithobacterium rhinotracheale 0,06 0,4 Riemerella anatipestifer 0,08 0,48

.

FIGURE 1 : Représentation graphique de la répartition des CMI en classe de sensibilité à la tiamuline sur 2000 et

2002 pour Riemerella anatipestifer

0%

20%

40%

60%

80%

100%

< c/4 [c/4 à c/2] ]c/2 à c] ]c à C] ]C à 2C] ]2C à 4C] >4 x C

Riemerella anatipestifer 2002

0%

20%

40%

60%

80%

100%

< c/4 [c/4 à c/2] ]c/2 à c] ]c à C] ]C à 2C] ]2C à 4C] >4 x C

Riemerella anatipestifer 2000

FIGURE 2 : Représentation graphique de la répartition des CMI en classe de sensibilité à la tiamuline sur 2000 et

2002 pour Pasteurella multocida

0%

20%

40%

60%

80%

100%

< c/4 [c/4 à c/2] ]c/2 à c] ]c à C] ]C à 2C] ]2C à 4C] > 4x C

Pasteurella multocida 2002

0%

20%

40%

60%

80%

100%

< c/4 [c/4 à c/2] ]c/2 à c] ]c à C] ]C à 2C] ]2C à 4C] >4 x C

Pasteurella multocida 2000

FIGURE 3 : Représentation graphique de la répartition des CMI en classe de sensibilité à la tiamuline sur 2000 et

2002 pour Ornithobacterium rhinotracheale

0%

20%

40%

60%

80%

100%

< c/4 [c/4 à c/2] ]c/2 à c] ]c à C] ]C à 2C] ]2C à 4C] >4 x C

Ornithobacterium rhinotracheale 2002

0%

20%

40%

60%

80%

100%

< c/4 [c/4 à c/2] ]c/2 à c] ]c à C] ]C à 2C] ]2C à 4C] >4 x C

Ornithobacterium rhinotracheale 2000