Pátráme po mikrobechDíl V.

Testování citlivosti mikrobů a jejich faktorů

rezistenceOndřej Zahradníček

K praktickému cvičení pro VLLM0421cKontakt na mne:

zahradnicek@fnusa.cz

Obsah této presentace

Přehled antimikrobiálních látek

MIC, MBC, baktericidní a bakteriostatická antibiotika

Mechanismy účinku atb a mechanismy rezistence

Epidemiologicky významné typy rezistence

Metody testování I: Difusní diskový test

Metody testování II: E-test

Metody testování III: Mikrodiluční test

Metody detekce faktorů resistence + fágová terapie

Bonus: Přehled antimikrobiálních látek

Úvod & pohádka

Pohádka• Bylo jednou jedno antibiotikum,

říkejme mu třeba ampicilin. A to se rozhodlo vyrazit do světa a pomáhat lidem bojovat s mikroby.

• Bylo to statečné antibiotikum, odhodlané vyzrát na každého mikroba, který by se naskytl v dohledu. Ale ouha…

Ampicilin potkává mikroby…

• První mikrob se jmenoval Proteus mirabilis a opravdu se nechal ampicilinem zničit. Ampicilin to povzbudilo, a tak šel dál

• Jenže potkal mikroba jménem Klebsiella pneumoniae, a to ho vyděsilo. Ampicilin otráveně řekl: Ach jo, na tebe nemám, klebsielo, ty jsi na mě primárně rezistentní, s ním nic nenadělám… no nic, půjdu radši zase dál, a na tebe pošlu nějakého účinnějšího brášku…

Do třetice• Ampicilin potkal mikroba Escherichia

coli. To je dobré, řekl si, tu by se mi mohlo podařit zničit. Ale ouha… jak se do ní pustil, vysmekla se mu, utekla a chechtala se: Chi chi, ty si myslíš, že na mě vyzraješ, já jsem sice kdysi byla na tebe citlivá, ale mezitím jsem na tebe získala sekundární rezistenci, a tak teď se mnou nic nepořídíš!

Pláč ampicilinův

• se rozléhal tkání. Ale přišel k němu mikrobiolog a řekl: neboj, ampiciline, příště to uděláme lépe. Každého mikroba, který by na tebe mohl být citlivý, ale mohl by být i rezistentní, otestujeme, abychom se přesvědčili, jak na tom jsme. A když nebudeš co platný ty, budeme podle testu vědět, kdo z tvých brášků bude účinný.

• I zaradoval se ampicilin, a rozběhl se pomáhat lidem dál.

Poučení z naší pohádky• Některé mikroby jsou na některá

antibiotika primárně rezistentní. Nemá ani cenu jejich citlivost na ně testovat, je vždycky nulová.

• Jiné mikroby mohou (ale nemusí) získat sekundární rezistenci. Potom– se buď otestuje citlivost mikroba in vitro

na danou antimikrobiální látku– nebo se zjistí, zda příslušný mikrob

produkuje určitý faktor, zodpovědný za rezistenci

Přehled antimikro-biálních látek

Možnosti „boje“ s mikroby• Imunizace – využívá přirozených

mechanismů makroorganismu• Dekontaminační metody – hrubé

fyzikální a chemické vlivy, působení vně organismu (viz minulé praktikum)

• Antimikrobiální látky – jemné, cílené působení uvnitř organismu s cílem maximálního zásahu mikroba a minimálního vlivu na makroorganismus

• A také některé další metody, například použití bakteriofágů (= „biologický boj“)

Druhy antimikrobiálních látek

• Látky působící celkově:– Antiparazitární látky proti parazitům– Antimykotika proti kvasinkám a vláknitým houbám– Antivirotika proti virům– Antituberkulotika proti mykobakteriím– Antibiotika proti bakteriím (přírodního původu)– Antibakteriální chemoterapeutika také proti

bakteriím, ale syntetickáV poslední době se často používá pojem

„antibiotika“ i pro antibakteriální chemoterapeutika

• Látky působící lokálně: antiseptika

První antibiotikum objevil sir Alexander Fleming

Ještě dekontaminace, nebo už antimikrobiální látka?• Hranice mezi dekontaminačními metodami

a antimikrobiálními látkami je neostrá.• Zpravidla se za dekontaminaci ještě považuje

působení na neporušenou kůži.• Aplikace do rány už znamená užití

antimikrobiální látky (antiseptika)• Důsledky i legislativní: dekontaminační

prostředky se na rozdíl od antibiotik nepovažují za léčiva

MIC, MBC, baktericidní a bakteriostatická antibiotika

Působení určitých vlivů na mikroby I

• Při působení vlivu jako je pH má osa působení horní i dolní extrém

• Při působení antimikrobiálních látek (ale také například desinfekčních prostředků) má logický smysl pouze pravá polovina osy

Působení vlivů na mikroby II

• Při dekontaminaci trváme na usmrcení mikrobů (mikrobicidní efekt)

• Při užití antimikrobiálních látek můžeme počítat se spoluprací pacientovy imunity, proto obvykle stačí i mikrobistatický (inhibiční) účinek

• Toto však neplatí u akutních stavů či imunokompromitovaných pacientů, kde se snažíme o mikrobicidní působení vždy

MIC a MBCMIC – minimální inhibiční koncentrace je

pojem, který se u antibiotik používá pro označení meze růstu (množení) mikroba

MBC – minimální baktericidní koncentrace se používá pro mez přežití bakterie. (Mluvíme pro jednoduchost jen o bakteriích. U virů by se použil pojem „minimální virucidní“ apod.)

Později se ještě setkáte s pojmy MBIC a MBEC, které se týkají působení na antibiotika v.biofilmu

Primárně baktericidní a primárně bakteriostatická atb

Primárně baktericidní jsou atb, kde MIC a MBC jsou si téměř rovny

Primárně bakteriostatická jsou atb, u kterých se využívá hodnoty nad MIC, ale nikoli nad MBC (svou podstatou bakterie jen inhibují)

V praxi se snažíme vyvarovat použití bakteriostatických antibiotik u závažných akutních stavů, imunosuprimovaných pacientů apod. Neplatí ovšem striktně – antibiotika s dobrým průnikem do kostí použijeme u akutní osteomyelitidy navzdory tomu, že jsou bakteriostatická.

Primárně baktericidní a primárně bakteriostatická atb

Mechanismy účinku a mechanismy resistence

Mechanismy působení antibiotik• Na buněčnou stěnu (baktericidní)

– Betalaktamová antibiotika– Glykopeptidová antibiotika (působí i na proteosyntézu)

• Na cytoplasmatickou membránu – polypeptidy (baktericidní)

• Na nukleovou kyselinu – chinolony (baktericidní)

• Na proteosyntézu: aminoglykosidy (baktericidní); makrolidy, tetracykliny, linkosamidy, amfenikoly (bakteriostatické)

• Na metabolismus – sulfonamidy, bakteriostatické

Primárně bakteriostatická antibiotika nejsou vhodná k léčbě akutních stavů, pacientů s poruchou imunity a podobně!

BA

KT

ER

ICID

NÍ

BA

KT

ER

ICID

NÍ

BA

KT

ER

IO-

BA

KT

ER

IO-

ST

AT

ICK

ÁS

TA

TIC

KÁ

Proč je neprobíráme podrobněji• Podrobnosti o jednotlivých skupinách a

jejich použití se dozvíte na přednášce nebo se je dočtete v učebnici

• Přehled antibiotik také naleznete v bonusovém materiálu.

• Dále si antibiotika proberete v rámci výuky farmakologie

• Můžete si také zapsat předmět „Základy antimikrobiální terapie“ VSAT081 – předmět je jednosemestrální a je povinně volitelný ve 4. nebo 5. ročníku studia

Rezistence mikrobů na antimikrobiální látky• Primární rezistence: všechny kmeny

daného druhu jsou rezistentní. Příklad: betalaktamová atb nepůsobí na mykoplasmata, která vůbec nemají stěnu.

• Sekundární rezistence: vznikají necitlivé mutanty, a ty při selekčním tlaku antibiotika začnou převažovat. (Escherichie mohou být citlivé na ampicilin, ale v poslední době výrazně přibývá rezistentních kmenů)

Mechanismy rezistence

• Mikrob zabrání vniknutí antibiotika do buňky• Mikrob aktivně vypuzuje atb z buňky• Mikrob nabídne antibiotiku falešný receptor• Mikrob enzymaticky štěpí antibiotikum

(například betalaktamázy štěpí betalaktamová antibiotika)

Znalost příslušného mechanismu nám umožňuje pokusit se na mikroba vyzrát

Inhibitory betalaktamáz – 1

• Působíme-li samotným antibiotikem, je inaktivováno bakteriální betalaktamázou.

Inhibitory betalaktamáz – 2

• Má-li však laktamáza na výběr atraktivnější substrát, zvolí si ho, a antibiotikum pak může nerušeně působit.

Příklady antibiotik potencovaných inhibitory betalaktamáz

Z intranetu FN USA

Inhibitory betalaktamáz vždycky nestačí

• Bohužel, inhibitory betalaktamáz zabírají jen u méně účinných typů betalaktamáz

• Existují velmi silné, širokospektré betalaktamázy (viz také dále), u kterých inhibitory nestačí (ani při jejich použití není léčba spolehlivě účinná)

• Určitý efekt ale lze pozorovat i u těchto betalaktamáz. To se využívá v diagnostice, kdy se pozoruje rozdíl v účinku určitého antibiotika s inhibitorem a bez něj

Epidemio-logicky významné typy rezistence

Epidemiologicky významné rezistence – 1 • MRSA – methicilin rezistentní

stafylokoky. Nevpouštějí do svých buněk oxacilin ani jiné betalaktamy. Mnohé MRSA jsou rezistentní také na další atb (makrolidy, linkosamidy). Citlivé zůstávají glykopeptidy (vankomycin, teikoplanin).

• VISA, VRSA – stafylokoky částečně nebo úplně rezistentní i na glykopeptidy

• VRE – vankomycin rezistentní enterokoky. Snadno se šíří – enterokoky má spousta lidí ve střevě

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/de/e/ed/EARSS_MRSA_2008.gif

MRSA v Evropě 2008

Epidemiologicky významné rezistence – 2

• Producenti ESBL (Extended Spectrum Beta Lactamase). G- bakterie (klebsiely, ale i E. coli aj.) mohou tvořit širokospektré betalaktamázy, kde ani účinek inhibitorů není dostatečný. Účinné bývají jen karbapenemy a někdy některá ne-betalaktamová atb.

• Podobné jsou také ampC betalaktamázy. Kromě karbapenemů zde zůstávají citlivé i cefalosporiny 4. generace.

• MLS rezistence je sdružená rezistence na makrolidy a linkosamidy (a steptograminy), u streptokoků a stafylokoků. U S. aureus zatím naštěstí vzácné.

„Antibiotická politika“, atb střediska

• Používání širokospektrých antibiotik představuje selekční tlak – přežívají rezistentní kmeny bakterií

• V zemích, kde se antibiotika používají volně, bývají vysoké počty rezistencí na antibiotika

• U nás existují „volná antibiotika“, která mohou lékaři předepisovat volně, a „vázaná atb“, jež musí schvalovat antibiotické středisko

• Atb střediska bývají zřizována při mikrobiologických laboratořích velkých nemocnic. Dělají i poradenskou činnost.

Metody testování I: difusní diskový test

Metody zjišťování citlivosti in vitro• Zjišťování citlivosti in vitro = v

laboratoři• Nezaručí stoprocentní účinnost léčby• Přesto vhodné u většiny nálezů

kultivovatelných patogenních bakteriíV běžných případech kvalitativní

testy (citlivý – rezistentní)V indikovaných případech

kvantitativní (zjišťujeme MIC). Jde zpravidla o rizikové kmeny u rizikových pacientů.

Když „in vitro“ neodpovídá „in vivo“

• U močových infekcí by nás měl zajímat breakpoint odvozený od koncentrací dosažitelných v moči, nikoli v séru. (U většiny močových infekcí se ovšem MIC nezjišťuje)

• U abscesů, procesů v kostech a zejména u meningitid: breakpointy jsou vyjádřením koncentrace atb především v séru; musíme vzít v úvahu, že koncentrace v různých místech těla mohou být mnohem nižší

• Je také nutno počítat s tím, že mikroby mohou existovat ve formě biofilmu – nutno určovat hodnoty např. minimální biofilm eradikující koncentrace

Difúzní diskový test – 1 • Na MH (nebo jiný) agar se štětičkou

plošně naočkuje suspenze baktérie• Pak se nanášejí tzv. antibiotické disky

– papírky napuštěné antibiotikem• Atb difunduje z disku agarem dál• U standardní Petriho misky se používá

zpravidla šest disků, někdy se dává ještě sedmý doprostřed

Jak naočkovat difusní diskový test

• Připravte suspenzi bakterie ve fyziologickém roztoku s glukózou

• Suspenzi rovnoměrně naneste na misku s MH agarem

• Po zaschnutí suspenze rozmístěte opatrně a rovnoměrně po povrchu agaru antibiotické disky

Difúzní diskový test – 2 • Koncentrace atb klesá se

vzdáleností od disku (a tedy i jeho schopnost inhibovat)

• Pokud mikrob roste až k disku, nebo má jen malou zónu, je rezistentní (necitlivý)

• Je-li kolem disku dost velká zóna citlivosti (větší než stanovená hranice), je citlivý.

Difúzní diskový test učeně – 1

Antibiotikum difunduje z disku, který je jím napuštěn, agarem. Čím dále od disku, tím je menší koncentrace antibiotika. V určitém bodě je koncentrace přibližně rovna MIC – to znamená, že antibiotikum přestává být schopno inhibovat růst dané bakterie.

Difúzní diskový test učeně – 2

Možnost A: Léčebná koncentrace neinhibuje růst mikrobů. Růst mikrobů by inhibovala až vyšší koncentrace. Léčebná koncentrace < MIC. Mikrob je rezistentní, ledaže zvýšíme koncentraci (to ale může poškodit pacienta)

Difúzní diskový test učeně – 3

Možnost B: Léčebná koncentrace spolehlivě inhibuje růst mikrobů. Léčebná koncentrace > MIC. Mikrob je citlivý na dané antibiotikum.

Pamatujte si:•V praxi reálně porovnáváme zóny (měříme zónu v milimetrech a porovnáváme s hodnotou referenční zóny•Nepřímo ale vlastně porovnáváme koncentrace: MIC versus léčebná koncentrace (zvaná též breakpoint).To ale neznamená, že bychom mohli reálně určovat MIC difusním diskovým testem – na to je ten test příliš nepřesný.

Poznámka pro zvídavé: •Ve skutečnosti se zpravidla nepoužívá tzv. přirozený breakpoint (odvozený z.léčebné koncentrace), nýbrž jsou zohledněny různé další faktory tak, aby in vivo bylo antibiotikum skutečně účinné a aby byl včas odhalen vznik rezistentní subpopulace kmenů (mikrobiologický breakpoint, klinický breakpoint). Více viz například stránky evropské organizace EUCAST:

http://www.eucast.org

Difusní diskový test po lopatě

1 Bakterie se bojí antibiotika. Velká zóna – někdy dokonce tak velká, že se ani nedá změřit.

2 Bakterie se nebojí antibiotika, jsou na ně rezistentní. Malá, anebo vůbec žádná zóna kolem atb disku.

REZISTENTNÍ

CITLIVÝ

Sestavy antibiotik• Disky se zpravidla používají v určitých daných

sestavách. Existují sestavy vhodné spíše pro G+ či spíše při G– mikroby. Lze ovšem vytvořit i sestavy relativně „univerzálních“ antibiotik. Multirezistentní kmeny ovšem jsou často rezistentní i na takováto antibiotika.

G+ mikrob G- mikrob

Sestava pro G+

většinou citlivé

větš. rezistentní

Sestava pro G- větš. rezistentní

většinou citlivé

Širokospektrá sestava většinou citlivé většinou citlivé

Difúzní diskový test v praxi: zóny se změří a porovnají s referenčními

www.medmicro.infoŽádná zóna: Mikrob je rezistentní

Zóna je větší než hraniční: Mikrob je citlivý

Zóna existuje, ale je menší než hraniční: Mikrob je rezistentní

Difúzní diskový test u pigmentovaného mikroba (Pseudomonas aeruginosa)

www.medmicro.info

Někdy jsou příliš velké zóny

Jsou-li zóny tak velké, že se nedají změřit, tak je neměřte a prostě rovnou napište, že kmen je na dané antibiotikum citlivý.

Zeleně jsou vyznačeny teoretické okraje zón – všimněte si, že z.naprosté většiny buď splývají, nebo jsou mimo misku

Foto O. Z.

Metody testování II: E-test

E-testy• Podobné v principu difúznímu diskovému

testu• Místo disku se však použije proužek• V proužku stoupající koncentrace atb

od jednoho konce ke druhému (získáno díky speciální technologii – proto jsou tak drahé)

• Zóna není kruhová, ale vejčitá.• Test je kvantitativní• Na papírku je stupnice – jednoduché

odečítání (viz obrázek na další obrazovce)

E-testy – vyhodnoceníHodnota MIC se odečítá přímo na proužku – v.místě, kde okraj zóny protíná daný proužek

www.uniklinik-ulm.de

Někde používají speciální velké misky

www.unifesp.b

Metody testování III: mikrodiluční test

Mikrodiluční test• Atb je v řadě důlků v plastové destičce,

koncentrace postupně klesá• Nejnižší koncentrace, která inhibuje

růst, představuje hodnotu MIC• V přiložené šabloně je zpravidla označen

breakpoint. Je-li MIC nižší než breakpoint, je kmen citlivý. Je-li MIC vyšší, je rezistentní

• Jedna destička se zpravidla použije pro jeden kmen, např. 12 antibiotik, každé v 8 různých koncentracích (přesněji: dvanácté jen v.sedmi, rohový důlek vpravo nahoře je kontrola růstu)

Jak odečíst mikrodiluční test• Zjistěte a zapište hodnoty MIC pro

dvanáct testovaných antibiotik• Zakalený důlek = roste to tam• Nezakalený důlek = neroste to tam• Neroste to tam = je to inhibováno• Nejmenší koncentrace, která inhibuje je

minimální inhibiční koncentrace

• MIC breakpoint kmen citlivý• MIC > breakpoint kmen rezistentní

Mikrodiluční test – ukázka

Foto O. Z.

Mikrodiluční test – odečítání

• Ve sloupcích 1, 3, 4 a 5 je hodnota MIC příliš vysoká než aby mohla být změřena. Můžeme ale zapsat „MIC > x“, kde „x“ je koncentrace v horním důlku.

Někdy se v důlcích mohou objevit bublinky – při odečítání si jich nevšímejte

Příklad odečítání

• E: MIC >32, breakpoint =16, závěr: rezistentní

• F: MIC = 32, breakpoint = 16, závěr: rezistentní

• G: MIC = 8, breakpoint = 32 závěr: citlivý

• H: MIC 0,1, breakpoint = 8, závěr: citlivý

E F G H

E F G H

32 64 128 64

16 32 64 32

8 16 32 16

4 8 16 8

2 4 8 4

1 2 4 2

0,5 1 2 1

0,25

0,5 1 0,5

Metody detekce faktorů rezistence

Zjišťování faktorů rezistence

• Někdy je lépe speciálními metodami zjišťovat přítomnost konkrétních faktorů rezistence, např. betalaktamáz.

• Důvody mohou být následující:– testování citlivosti nedává dostatečně

spolehlivé výsledky (špatná difuse v difusním testu, antibiotikum nepracuje přímo, ale přes metabolit…)

– chceme vědět, zda jde o resistenci určitého konkrétního typu (ESBL, ampC)

Nitrocefinový test pro detekci běžné betalaktamázy

• Používá se v situacích, kdy výsledek difusního, ale i mikrodilučního testu, je nejasný

• Týká se to zejména• neisserií (nahrazujeme test citlivosti na penicilin)• Moraxella catarrhalis (nahrazujeme ampicilin)• Haemophilus influenzae (nahrazujeme ampicilin)

• V praxi jde o proužkový test podobný biochemickým identifikačním testům typu oxidázového testu

• Dává dobré výsledky jen u čerstvých kmenů, z toho důvodu jej prakticky provádět nebudeme (výsledky nebyly vždy dobré)

Dvě možnosti postupuObrázky z letáku výrobce testu

Vyhodnocení

Obrázky z letáku výrobce testu

Testování produkce širokospektrých betalaktamáz typu ESBL• Širokospektré betalaktamázy jsou horší než

„běžné“ betalaktamázy (testované nitrocefinovým testem). Důležitým typem širokospekteré betalaktamázy je „ESBL“ beta-laktamáza. Testujeme ji dvěma způsoby. Principem obou je posílení účinku antibiotika klavulanovou kyselinou. (Efekt tohoto posílení by tu nebyl dostatečný pro léčebné použití, ale pro diagnostiku stačí.)

• U „testu dvojité synergie“ (nedělá se v aktuální verzi praktika) si všímáme deformace zóny betalaktamového antibiotika na straně přivrácené k disku s ko-amoxicilinem

• V „CLSI testu“ porovnáváme účinek stejného antibiotika s / bez klavulanové kyseliny

Metoda CLSI Činí-li rozdíl mezi zónami kolem disků cefotaximu bez inhibitoru: cefotaximu s klavulanátem s ním více než pět milimetrů, je kmen považován za producenta (širokospektré) beta-laktamázy. Totéž platí pro ceftazidim.

Foto O. Z.

Testy produkce dalších typů betalaktamáz

• U testování konstitutivní ampC porovnáváme zóny citlivosti čtyř betalaktamů na MH půdě bez oxacilinu a s oxacilinem

• Vedle konstitutivní ampC betalaktamázy existuje také indukovaný typ ampC betalaktamázy. Projeví se pouze v případě, že bakterie je provokována klavulanovou kyselinou či jiným aktivátorem

• V poslední době se objevují nové typy betalaktamáz: metalobetalaktamázy (hlavně u G– nefermentujících) a karbapenemázy (u různých G– bakterií)

„ABCD“ testU tohoto testu ověřujeme přítomnost dvou typů betalaktamáz najednou. Rozdíly mezi jednotlivými antibiotiky jsou typické buď pro betalaktamázu typu ESBL, nebo pro ampC betalaktamázu konstitutivního typu (jak vidíme na obrázku)

httpjmm.sgmjournals.orgcontent606715F1.expansion.gif

Screening kmenů MRSA a VRE

• Při screeningu kmenů MRSA a VRE (ale i producentů ESBL) se používají speciální screeningové půdy.

• Jsou zpravidla chromogenní, specifické pro určitý rod a druh bakterie, a obsahují „inkriminované“ antibiotikum (např. vankomycin u VRE), takže citlivé kmeny tam nerostou.

MRSA (vlevo) a VRE (vpravo) na svých specifických chromogenních půdách

Fágová terapie• Jak antibiotika ztrácejí účinnost (bakterie

jsou rezistentní), dostávají se do zorného pole opět alernativní způsoby léčby.

• Je také možné vyzkoušet účinek fágů či fágového lyzátu (směs bílkovin produkovaných fágem) na kulturu mikrobů (v místě, kde byl aplikován fágový lyzát, bakterie buď rostou, nebo nerostou)

• Později (v J14 va P04) vyzkoušíme také účinnost bakteriofágů na biofilm a jejich využití při takzvané fagotypizaci (zvláštní metoda identifikace bakterií)

Bakteriofágová terapie v praxi

Na tomto obrázku vidíte kmen stafylokoka, naočkovaného tak, že pokrývá celý povrch média. Avšak fágový lyzát přítomnost inhibičních zón – což znamená, že kmen je citlivý k danému fágovému lyzátu. Nepřítomnost zón by znamenala, že kmen je vůči danému fágu rezistentní.

Konec

Foto O. Z.

Sir Alexander Fleming

• Sir Alexander Fleming (6. srpna 1881 farma Lochfield u Darvelu v hrabství Ayrshire ve Skotsku – 11. března 1955 Londýn) byl skotský lékař známý objevem baktericidních účinků lysozymu, ale hlavně získáním penicilinu z plísně Penicillium notatum.

• V roce 1922 učinil Fleming objev s lysozymem, který ve své době neměl příliš velký význam, ale o třicet let později se k němu věda vrátila.V roce 1928 Fleming objevil penicilin, k tomto objevu došlo z části náhodou, Fleming totiž náhodou našel na staré Petriho misce plíseň usazenou na agaru. Izolovat čistý penicilin se nepodařilo a když Fleming přednesl tento objev svým mimo laboratorním kolegům nikdo se o něj nezajímal. Izolovat penicilin se podařilo teprve v květnu 1940 oxfordskému chemikovi jménem Ernst Chain s jeho přítelem biochemikem jménemHoward Flory.

http://cs.wikipedia.org/wiki/Alexander_Fleming

http://cs.wikipedia.org/wiki/Alexander_Fleming

http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1945/fleming-bio.html

Test synergismuNa obrázku je pozitivní výsledek – zóna je širší na levé straně (tedy straně přivrácené ke ko-amoxicilinu)

Příklad pozitivního výsledkuDůležitá je modře ohraničená oblast

Foto O. Z.

Bonusový materiál:Přehled antimikrobiálních látek• Toto je pouze stručný přehled

nejdůležitějších antibiotik, nikoli záruka, že to bude stačit ke zkoušce

Fotografie, u kterých není uveden zdroj, pocházejí z AISLP na intranetu FN USA v Brně

Betalaktamová antibiotika

• Mají ve struktuře tzv. betalaktamový kruh• Působení na buněčnou stěnu• Jsou baktericidní, působí však jen na rostoucí

bakterie, které si budují stěnu• Jsou téměř netoxické (lidské buňky stěnu

nemají), ale mohou alergizovat• Patří sem:

– Peniciliny (deriváty kyseliny penicilanové)– Cefalosporiny (deriváty kys. cefalosporanové)– Monobaktamy– Karbapenemy

Různé formy „klasického“ (Flemingova) penicilinu

• Parenterální (injekční) formy– Benzylpenicilin (G-penicilin), nitrožilní. Lékem

volby u řady infekcí (viz dále).– Prokain-benzylpenicilin, nitrosvalový. Hůře se

drží plasmatická dávka – nepomůže ani zvýšení dávky

– Benzatin-benzylpenicilin, nitrosvalový. Měl by se používat pouze na streptokoky a treponemata

• Perorální (ústy podávané) formy– Fenoxymetylpenicilin (V-penicilin). Lékem volby

u angíny, v sekvenční léčbě* po G-penicilinu aj.– Penamecilin

*Sekvenční léčba je postup, kde se začne injekčním antibiotikem a pokračuje se perorálním.

Perorální peniciliny – V penicilin…

… a penamecilin

Kde je G-penicilin lékem volby(jen pro ilustraci!)• Meningitida a sepse způsobená meningokoky,

pneumokoky a streptokoky.• Pneumokoková pneumonie.• Endokarditida způsobená viridujícími streptokoky.• Těžké streptokokové a klostridiové infekce měkkých

tkání.• Anaerobní infekce vyvolané nesporulujícími anaeroby

(s výjimkou Bacteroides fragilis), např. aspirační pneumonie a plicní absces.

• Aktinomykóza. • Neuroborrelióza.• Anthrax, diphtherie, červenka.• Neurosyfilis, kongenitální syfilis.

Podle Konsensu používání antibiotik subkomise pro antibiotickou politiku ČLS JEP

Depotní formy penicilinu

(po podání se dlouho udržuje v organismu určitá hladina)

Depotní formy penicilinu pro dlouho-dobou léčbu

Protistafylokokové peniciliny Spektrum rozšířené o stafylokoky, ale ne o jiné bakterie

• Methicilin – užívá se v některých jiných zemích. Pro nás je významný tím, že figuruje ve zkratce MRSA (u nás by byla příhodnější zkratka ORSA – oxacilin rezistentní S. aureus)

• Oxacilin – indikován pouze u stafylokokových infekcí a u smíšených infekcí stafylokokovo-streptokokových a stafylokokovo-pneumokokových. Zato v případě stafylokoků by se měl používat u nealergických pacientů striktně, nenahrazovat makrolidy, na které velice vzrůstá počet rezistencí

Ampicilin a amoxicilin• Rozšíření účinku na některé

gramnegativní bakterie, enterokoky a další bakterie

• Ampicilin je užitečný hlavně v injekční formě, perorální se příliš nedoporučuje (místo něj raději amoxicilin)

• Amoxicilin je doporučován k léčbě zánětů středního ucha a přínosních dutin. (Zde nemá smysl vyšetřovat např. výtěr z nosu či ucha a je lépe rovnou zahájit léčbu.)

Problém: betalaktamázy• Řada bakterií produkuje různé typy

betalaktamáz, ať už primárně (tj. vždycky) nebo sekundárně (tj. jen některé kmeny). V takovém případě např. amoxicilin nemusí být účinný.

• Možným řešením je spolu s antibiotikem podat tzv. inhibitor betalaktamázy, který zajistí účinnost amoxicilinu (či jiného antibiotika) i za těchto okolností (vizte též pojednání v hlavní části prezentace)

pojednání v hlavní části prezentace

Ko-ampicilin a ko-amoxicilin

• Ko-ampicilin je označení ampicilinu se sulbaktamem, známé např. pod firemním názvem Unasyn

• Ko-amoxicilin je označení amoxicilinu s kyselinou klavulanovou, známé např. jako Augmentin, Amoksiklav apod.

• Neměly by se používat tam, kde stačí např. samotný amoxicilin, povzbuzují bakterie k tvorbě betalaktamáz. U rezistentních bakterií jsou ale užitečné.

Piperacilin a tikarcilin• Oproti předcházejícím mají širší spektrum

zejména na gramnegativní nefermentující tyčinky (například pseudomonády).

• Nejsou však účinné proti enterobakteriím, které produkují betalaktamázy

• Lékem volby jsou právě u pseudomonádových infekcí a infekcí dalšími gramnegativními nefermentujícími tyčinkami

• Používají se také kombinace s inhibitory betalaktamázy, podobně jako u ampicilinu či amoxicilinu.

• (Piperacilin je v současnosti dostupný jen v kombinaci s inhibitorem betalaktamázy, ačkoli k léčbě by byl užitečný i samotný)

Cefalosporiny 1• Jsou částečně příbuzné penicilinům• Zkřížené alergie peniciliny ×

cefalosporiny méně časté než např. mezi peniciliny navzájem. V případě nutnosti lze při alergii na peniciliny za kontroly stavu použít cefalosporiny a naopak

• Některé rezistence jsou společné, jiné se týkají pouze penicilinů, pouze cefalosporinů, nebo pouze některých preparátů

• Většinou se oproti penicilinům více vylučují močí, hodí se proto lépe u cystitid (včetně stafylokokových, místo oxacilinu)

Cefalosporiny 2• Všechny enterokoky a listerie jsou

rezistentní na všechny cefalosporiny – přitom peniciliny jsou na tyto bakterie účinné (klasický penicilin jen částečně)

• Někdy se zvlášť vyčleňují tzv. cefamyciny – sem patří cefoxitin, popř. cefotetan. Vyznačují se lepším působením na anaerobní bakterie.

• Cefamyciny se používají i v diagnostice, např. při ověření kmene MRSA, jde-li o skutečný kmen MRSA, nebo jen kmen s hyperprodukcí stafylokokové betalaktamázy

Cefalosporiny 3

• I. generace: účinné zejména na G+ bakterie, ale i na některé enterobakterie.

• II. generace: lepší účinnost na G- bakterie, ale některé (enterobaktery, serratie, Proteus vulgaris aj.) jsou na I. i II. generaci primárně rezistentní

• III. generace: mnohem lepší účinnost na enterobakterie a u některých (opravdu jen u některých, např. u ceftazidimu) i na G- nefermentující tyčinky včetně pseudomonád. Bohužel jsou výraznými selektory betalaktamáz!

• IV. generace: účinnost i na producenty některých betalaktamáz (tzv. ampC), obecně ještě lepší na G- bakterie

Cefalosporiny – ukázky1. a 2. generace

3. generace

„Nové betalaktamy“• Monobaktamy – nejvýznamnějším zástupcem

je aztreonam (AZACTAM). Neúčinkují na G+.• Karbapenemy – imipenem (TIENAM) a

meropenem (MERONEM) – na pseudomonády a producenty širokospektrých betalaktamáz (na ty se používá také ertapenem – INVANZ)

Glykopeptidová antibiotika

• Působí také především na syntézu buněčné stěny (ale nejen); nejsou příbuzná s betalaktamy. Jsou vhodná pouze k léčbě infekcí vyvolaných G+ bakteriemi.

• Používají se jako rezervní, např. u methicilin rezistentních stafylokoků (MRSA), některých enterokoků a podobně

• Patří sem vankomycin (EDICIN) a méně toxický, ale dražší teikoplanin (TARGOCID)

Polypeptidová antibiotika

• Působí na cytoplasmatickou membránu• Jsou vysoce toxická: ototoxická, nefrotoxická• Polymyxin B se používá jen lokálně (např.

součást ušních kapek Otosporin)• Polymyxin E – kolistin se ve výjimečných

případech užívá celkově• Působí i na nerostoucí bakterie• Rezistentní jsou všechny grampozitivní bakterie

a všechny protey, providencie, morganelly a serratie

Chinolonová chemoterapeutika I

• Působí na nukleové kyseliny (inhibice gyrázy)

• Od 2. generace jsou baktericidní• Nepodávat do 15 let (růstové chrupavky)• I. generace (kyselina oxolinová) a II.

generace (norfloxacin – NOLICIN) jen pro močové infekce

• Hodně používaná III. generace – ofloxacin (TARIVID), ciprofloxacin (CIPLOX), pefloxacin (ABAKTAL) – i pro systémové infekce

„

Aminoglykosidy• Působí baktericidně v úvodu

proteosyntézy• Jsou ototoxické a nefrotoxické• Synergie s betalaktamy – snížení toxicity• Streptomycin už jen antituberkulotikum.

Užívá se gentamicin, netilmicin, amikacin• Neomycin s bacitracinem = framykoin

(neomycin je příliš toxický, proto jen lokálně)Už ve starých dílech „Nemocnice na kraji města“ se

léčí „gentlemanovýma kouličkama“… vlastně gentamicinovými kuličkami

Ukázky aminoglykosidů

Makrolidy, linkosamidy, tetracykliny, amfenikoly

• Působí na proteosynézu, avšak nikoli na její počáteční fázi. Všechny jsou bakteriostatické

• Makrolidy a linkosamidy jsou vhodné jen pro grampozitivní bakterie (až na výjimky, jako jsou hemofily a některé G- anaeroby)

• Tetracykliny a amfenikoly mají široké spektrum

• Tetracykliny a amfenikoly patří k starším antibiotikům, dnes se pro toxicitu užívají spíše méně. Naopak makrolidy se dnes až nadužívají.

Makrolidy (a azalidy)• I. generace: erythromycin, v praxi se

užívá dnes už poměrně málo.• II. generace: roxithromycin (RULID);

josamycin (WILPRAFEN) a spiramycin se příliš nepoužívají

• III. generace: klarithromycin (KLACID), azithromycin (SUMAMED, AZITROX). Azithromycin se někdy vyčleňuje do zvláštní skupiny tzv. azalidů. Od ostatních se liší lepším intracelulárním průnikem a dlouhodobým účinkem

Tetracyklinová antibiotika• Poměrně široké spektrum, ale mohou být

sekundární rezistence• Nesmějí se podávat do deseti let (vývoj zubů)• Používají se dnes méně než dříve, ale občas jsou

stále nenahraditelné (u některých atypických pneumonií, některých gynekologických infekcí apod.)

• Spíše než klasický tetracyklin se dnes používá doxycyklin (Deoxymykoin). In vitro se ale testuje citlivost na tetracyklin a vztahuje se na doxycyklin.

• Vzdáleně příbuzná jsou nová glycylcyklinová antibiotika. Preparát tigecyklin (TYGACIL) je širokospektrý a představuje šanci u rezistentních kmenů.

Linkosamidy

• Používá se linkomycin (LINCOCIN) a klindamycin (DALACIN C)

• Rezervní antibiotika určená zejména pro použití v ortopedii a chirurgii

• Velmi dobrý účinek na většinu anaerobů

• Výjimkou je Clostridium difficile – riziko pseudomembranosní enterokolitidy

Chloramfenikol (amfenikoly)• Široké spektrum a nepříbuznost s

jinými antibiotiky je jeho výhodou• Má vynikající průnik do likvoru• Avšak: je výrazně hematotoxický

(ovlivnění krvetvorby)• V humánní klinické praxi se používá pouze

chloramfenikol, ostatní amfenikoly se používaly ve veterinární medicíně

• Zůstává jako rezerva, kdyby jiné možnosti selhávaly

Makrolidy a tetracykliny: kdy ano, kdy ne

• U onemocnění způsobených mykoplasmaty, chlamydiemi, helikobakterem, brucellou apod. jsou lékem volby. (Mykoplasmata nemají buněčnou stěnu betalaktamová antibiotika na ně neplatí

• U angíny či zánětu středního ucha pouze tam, kde je pacient alergický na lék volby (penicilin, amoxicilin)

Ukázky makrolidů a linkosamidů

Tetracykliny a amfenikoly – ukázky

Analoga kyseliny listové• Nejběžnější je sulfametoxazol

v kombinaci s pyrimidinovým chemoterapeutikem trimetoprimem – ko-trimoxazol – BISEPTOL…

• Bakteriostatický, horší průnik do některých tkání, ale poměrně dobrý průnik do mozkomíšního moku

• Běžně se používá k léčbě močových infekcí, ale lze jej použít i k léčbě některých respiračních infekcí

Nitrofurantoin (a nifurantel)• Působí na metabolismus cukrů. Je

bakteriostatický. Mají poměrně široké spektrum

• Nitrofurantoin se užívá na močové infekce. Podezíral se ze závažných nežádoucích účinků na gastrointestinální trakt, ty se však již v současnosti nepovažují za tak závažné.

• Nifuratel se používá lokálně, hlavně v gynekologii, buď samotný (MACMIROR) nebo v kombinaci s antimykotikem (MACMIROR KOMPLEX, kombinace s nystatinem)

Nitroimidazoly

• Působí na syntézu nukleových kyselin u anaerobních bakterií. Kromě nich ale působí také na prvoky (T. vaginalis, E. histolytica)

• Používá se metronidazol (ENTIZOL, EFLORAN a ornidazol (AVRAZOR, TIBERAL). Nejčastěji se využívají v léčbě gynekologických nebo střevních infekcí

• Některá se kombinují s antimykotiky, např. KLION je směs metronidazolu s antimykotikem – Mikonazolem. Používá se v gynekologii.

Ukázky ko-trimoxazolu a nitroimidazolů

Nová antibiotika• Linezolid (ZYVOXID) je antibiotikum z nové

skupiny oxazolidinových antibiotik. Inhibuje proteosyntézu. Používá se proti G+ mikrobům tam, kde nechceme použít glykopeptidy, případně u rezistence na ně (vankomycin rezistentní enterokoky – viz dále)

• Quinupristin+dalfopristin (SYNERCID) je kombinovaný přípravek streptograminových antibiotik se širokým spektrem účinku

• Tigecyklin (TYGACIL) je glycylcyklinové antibiotikum, o kterém již byla řeč

• Fidaxomicin (DIFICLIR) je nové nadějné makrocyklické antibiotikum vhodné zejména pro léčbu infekcí Clostridium difficile

Antivirotika (virostatika)

• Používají se jen u závažných virových infekcí, běžné se léčí symptomaticky

• U velkého množství virů ani neexistuje adekvátní antivirotická léčba

• V praxi se zatím nepoužívá in vitro testování citlivosti virů na antivirotika

• Léčba se proto opírá spíše o zkušenosti ze změn účinnosti jednotlivých preparátů

• Zpravidla mají smysl jen je-li infekce zachycena v inkubační době nebo ve fázi prodromů, ne již u rozvinuté infekce (např. herpesvirové)

Přehled antivirotik (kromě antiretrovirotik)HSV (1 a 2), VZV aciklovir p. o., i. v., lokálně

HSV, VZV, EBV valaciklovir p. o.

CMV valaganciklovir p. o.

HSV1, HSV2 trifuridin p. o.

CMV, HBV, HSV ganciklovir i. v.

RSV, chřipka a jiné foskarnet i. v.

chřipka A ribavirin i. v., p. o., aerosol

hepatitida B adefovir dipivoxil p. o.

HPV podofylotoxin lokálně

HPV, VZV, HBV interferony i. v.

chřipka amantadin, zanamivir, oseltamivir p. o.

Léky účinné proti herpesvirům

• Používají se lokálně i celkově• Působí proti replikaci virů• Dávkují se po osmi až dvanácti hodinách• Pro léčbu pásového oparu je u acikloviru

doporučeno použít parenterální formu• Pro léčbu infekcí CMV se užívá ganciklovir,

valaganciklovir, cidofovir a foskarnet. Jsou účinnější, ale bohužel i toxičtější.

Při oparu lokalizovaném na rtu lze údajně též použít extrakt z.meduňky (Mellisa officinalis), který obsahuje např. kyselinu rozmarýnovou. Extrakt má být účinný především v počátečních stádiích onemocnění. (Nalezeno na internetu, bez záruky)

Herpes simplex: léčbaShora: famciklovir, valaciklovir, acyklovir

opt.pacificu.edu/ce/catalog/14382-AS/Herpes.html

Léky účinné proti chřipce• Používají se u oslabených osob• Na rozdíl od očkování je nelze použít

k primární prevenci, některé však lze použít k profylaxi

• Starší: amantadin a rimantadin, ztrácejí účinnost (proti klasické chřipce). Brání průniku a začlenění viru do buňky

• Oseltamivir a zanamivir jsou modernější a účinnější preparáty, k použití i proti některým ze současných pandemických kmenů. Jsou to inhibitory neuraminidázy

• Dávkují se po 12–24 hodinách. Léčbu je třeba zahájit co nejdříve

Přehled antiretrovirotik

Inhibitory proteáz sakinavir, indinavir, ritonavir, nelfinavir

Nukleosidové a nukleotidové inhibitory RT

zidovudin, didanosin, stavudin, zalcitabin, lamivudin, abakavir, tenofovir, emtricitabin

Kombinace předchozích tamivudin + zidovudintenofovir + emtricitabin

Nenukleosidové inhibitory RT

nevirapin, efavirenz

Další antivirotika

• Interferony se používají v léčbě papilomavirových infekcí, hepatitid, VZV aj. Účinek je komplexní.ů

• Podofylotoxin se používá lokálně proti papilomavirovým condylomata accuminata

• Z dalších se používá vidarabin, iododeoxyuridin a mnoho dalších

• Rozvoj antivirotikje očekáván

ttp://depts.washington.edu/nnptc/online_training/std_handbook/gallery/pages/rectalcondyloma.html

Antimykotika

• Antimykotika jsou léky na houby. • Lokální antimykotika se používají u

nekomplikovaných kožních a slizničních mykotických infekcí

• Celková léčba je nutná u systémových mykóz, ale i u opakujících se nebo komplikovaných mykóz kožních a slizničních (například vaginálních)

Polyenová antimykotika: amfotericin B

• Amfotericin B je účinné, ale velmi toxické (nefrotoxické) antimykotikum.

• Nepůsobí příliš na dermatofyty, ale na kvasinky má dobrou účinnost i při rezistenci na azolová antimykotika. Působí i na aspergily (= kropidláky) a mucory (= plíseň hlavičková). Navzdory toxicitě zůstává lékem volby u závažných infekcí

Polyenová antimykotika: ambisom

• Ambisom je liposomální derivát amfotericinu B

• Spektrum účinnosti je zachováno, přičemž výskyt nežádoucích projevů je nižší (asi pětinásobně nižší toxicita)

• Z klinického pohledu: aplikace nevyžaduje několikahodinové infúze, ale jen asi 40 min

• Jde ovšem bohužel o velmi nákladný preparát

Polyenová antimykotika: ostatní

• Nystatin účinkuje zejména na kandidy a používá se s výhodou k eliminaci střevního rezervoáru kandidové infekce

• Natamycin má podobné zaměření. Při použití vaginálních globulí se projevuje jeho současný antitrichomonádový efekt

• Ani tyto preparáty neúčinkují na dermatofyty

Imidazolová antimykotika

• Lokálně i celkově podávané preparáty, na rozdíl od většiny jiných se používají i perorálně

• Inhibice syntézy ergosterolu v membráně

• Minimální nežádoucí účinky• Hodí se k léčbě kožních a slizničních,

nikoli však systémových mykóz• Patří sem mikonazol a ketokonazol, a

dále pouze lokální klotrimazol, ekonazol, bifonazol, oxikonazol a fentikonazol

Triazolová antimykotika

• Jsou účinnější než imidazoly, ani ne tak spektrem účinku, ale spíše biologickým poločasem, dávkováním apod.

• Lze je použít i k léčbě systémových mykóz• Patří sem itrakonazol, flukonazol a nový

vorikonazol• Flukonazol je dobře snášen a je účinný,

avšak Candida crusei je primárně rezistentní• Itrakonazol je lékem volby u

bronchopulmonární aspergilózy. Používá se perorálně.

Analoga nukleotidů• Flucytosin (5-fluorocytozin) se v

buňce houby mění na cytostatikum, kdežto člověk ho příliš nemetabolisuje

• Nedoporučuje se podávat ho samotný, spíše v kombinaci s amfotericinem B.

• U dětí lze monoterapii použít u kandidózy močových cest.

Caspofungin a anidulafungin

• Caspofungin (CANCIDAS) a nový anidulafungin (ECALTA) jsou echinokandidová antimykotikum k.léčbě invazivní kandidózy a aspergilózy

• Jsou to rezervní antimykotika• Nebývají na ně rezistence

Jodid draselný• Opomíjená lokální terapie některých

kandidóz

Terbinafin a naftifin• Jsou to novější látky k léčbě

dermatomykóz

Antiparazitární látky

• Antiparazitární látky je souhrnný název pro látky působící proti parazitům

• Ve skutečnosti je tato skupina různorodá tak, jako jsou různorodí paraziti sami

• In vitro citlivost se u parazitů netestuje• Chemoprofylaxe malárie – snad jediný

případ, kdy se antimikrobiální látka používá dlouhodobě k profylaxi

• Dělí se na antiprotozoika, anthelmintika a látky proti vnějším parazitům

Kontrolní otázky1. Jaký je hlavní rozdíl mezi působením desinfekce a působením

antibiotik?2. Jaký typ léků se používá k léčbě mykóz?3. Jaký typ léků se používá k léčbě (těžkých) viróz?4. Jaký typ léků se používá k léčbě tuberkulózy?5. Jak se nazývají lokální antiinfektiva?6. Co znamená pojem "breakpoint"?7. Které skupiny antibiotik patřící mezi betalaktamová antibiotika?8. U které skupiny antibiotik jsou hodnoty MIC a MBC téměř totožné?9. Co znamenají zkratky ESBL, MRSA, VRE a MLS(B)?10. Které typy testů citlivosti na antibiotika jsou kvantitativní?11. Co je to, když se řekne „ampC“?12. Která je nadějná alternativa antibiotické terapie?