PAULO ROBERTO ADONA - uenf.bruenf.br/Uenf/Downloads/PGANIMAL_3898_1164626852.pdf · FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 028/2006 Adona, Paulo Roberto Bloqueio

BLOQUEIO DA MEIOSE COM BUTIROLACTONA I EM OVÓCITOS BOVINOS: EFEITOS SOBRE A MATURAÇÃO NUCLEAR E CITOPLASMÁTICA

PAULO ROBERTO ADONA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ MARÇO – 2006


PAULO ROBERTO ADONA

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal.

Orientadora: Profª. Drª. Cláudia Lima Verde Leal CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

MARÇO – 2006

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 028/2006

Adona, Paulo Roberto

Bloqueio da meiose com butirolactona I em ovócitos bovinos : efeitos sobre a maturação nuclear e citoplasmática / Paulo Roberto Adona. – 2006. 78 f. il.

Orientador: Cláudia Lima Verde Leal Tese (Doutorado em Produção Animal) – Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. Campos dos Goytacazes, RJ, 2006. Bibliografia: f. 55-67.

1. Butirolactona I 2. Embrião 3. Maturação 4. Meiose 5. Ovócito bovino I. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. II. Título.

CDD 636.2082


PAULO ROBERTO ADONA

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal.

Aprovado em 10 de março de 2006. Comissão Examinadora: ___________________________________________________________________

Profª. Drª. Gisele Zoccal Mingoti (Doutorado em Fisiologia) UNESP ___________________________________________________________________

Profª. Drª. Maria Clara Caldas Bussiere (Doutorado em Fisiologia) UENF ___________________________________________________________________

Profº Dr. Reginaldo da Silva Fontes (Doutorado em Fisiologia) UENF ___________________________________________________________________ Profª. Drª. Cláudia Lima Verde Leal (Doutorado Reprodução Animal) USP/FZEA

(Orientador)

ii

AGRADECIMENTOS

Em especial à minha mãe, meu irmão e às minhas irmãs.

Gostaria de expressar minha profunda gratidão e carinho, em especial:

À Rosângela A. Queiroz;

À Cláudia L. V. Leal;

À Margot A. N. Dode;

À Maineide Z. Velasques.

À todos meus amigos pelo carinho e companheirismo. Sem cada um de vocês

nada disso seria possível e a vida não teria sentido.

Alexandre Barreto; Aline S. M. César; Amanda de A. Rocha; Aparecida Mandella; Bethania Lopes; Bruno Fagundes; Camila Cortez; Fabiana Bressan; Felipe C. Braga; Fernando Biaze; Flávio P. Júnior; Giovana K. F. Merighe; Gustavo (Sancho); Hebinho (Baby Sauro) Isabele P. Emanuelli; Kátia L. Schwartz; Kelen S. Viana; Lígia Garcia Mesquita; Marcos R. Chiaratti; Mariene (Bitoca); Moysés S. Miranda; Nilton P. dos Santos; Norma Clea Rodovalho; Patrícia M. Porciúncula; Paula Ripamonte; Pedro Ratto; Roberto Carneiro; Rosemary Bastos; Sílvia G. Matta; Sylvia S. Cortezzi; Tiago H. C. De Bem; Vanessa G. Ueno;

iii

Aos Professores: Maria Clara C. Bussiere, Flávio Vieira Meirelles, Reginaldo

Fontes, Gisele Zoccal Mingoti.

Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse

trabalho.

À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy R. (UENF/CCTA/LMGA);

À Universidade de São Paulo (USP/FZEA/ZAB);

À FAPESP, pelo financiamento do projeto de pesquisa;

À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo.

iv

BIOGRAFIA

PAULO ROBERTO ADONA, filho de Ivo Adona e Maria Boniatti Adona,

nasceu em 26 de agosto de 1966, na cidade de Campinas do Sul – RS.

Em março de 1995, ingressou no curso de Biologia da Universidade Católica

Dom Bosco (UCDB), em Campo Grande – MS. Submeteu-se à apresentação de

monografia para conclusão do curso em dezembro de 1998.

Foi selecionado em março de 1997 como estagiário do setor de Reprodução

Animal da Embrapa – CNPGC, sob orientação da Pesquisadora Drª. Margot A. N.

Dode.

Foi aprovado em agosto de 2000 no curso de Pós-graduação em Produção

Animal, a nível de mestrado, da Universidade Estadual do Norte Fluminense

(UENF), Campos dos Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa de tese para a

conclusão do curso em abril de 2002.

Foi aprovado em março de 2002 no curso de Pós-graduação em Produção

Animal, a nível de doutorado, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro (UENF), Campos dos Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa de tese

para a conclusão do curso em março de 2006.

v

CONTEÚDO LISTA DE ABREVIATURAS------------------------------------------------------------------- viii

RESUMO ------------------------------------------------------------------------------------------- x

ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------- xii

1. INTRODUÇÃO ----------------------------------------------------------------------------- 01

2. REVISÃO DE LITERATURA ----------------------------------------------------------- 03

2.1. Ovogênese e foliculogênese ----------------------------------------------------- 03

2.2. Maturação ovocitária --------------------------------------------------------------- 04

2.2.1. Maturação nuclear ----------------------------------------------------------- 05

2.2.2. Maturação citoplasmática ------------------------------------------------- 06

2.2.3. Organização estrutural na maturação ---------------------------------- 07

2.2.3.1. Citoesqueleto --------------------------------------------------------- 07

2.2.3.2. Organelas -------------------------------------------------------------- 08

2.2.3.2.1. Mitocôndrias ----------------------------------------------------- 08

2.2.3.2.2. Grânulos corticais --------------------------------------------- 09

2.2.4. Mudanças moleculares e bioquímicas --------------------------------- 10

2.2.4.1. Cinases dependentes de ciclinas (CDKs) --------------------- 11

2.2.4.2. Fator promotor da maturação (MPF) --------------------------- 12

2.2.4.3. Proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK) ------------- 13

2.3. Competência ovocitária ------------------------------------------------------------ 15

2.4. Bloqueio meiótico-------------------------------------------------------------------- 17

3. OBJETIVOS -------------------------------------------------------------------------------- 20

vi

4. MATERIAL E MÉTODOS --------------------------------------------------------------- 21

4.1. Coleta de ovários e ovócitos ----------------------------------------------------- 21

4.2. Solução estoque do inibidor ------------------------------------------------------ 22

4.3. Bloqueio da meiose com butirolactona I --------------------------------------- 22

4.4. Determinação do estádio da meiose ------------------------------------------- 22

4.5. Maturação in vitro ------------------------------------------------------------------- 23

4.6. Microtúbulos -------------------------------------------------------------------------- 24

4.7. Microfilamentos ---------------------------------------------------------------------- 24

4.8. Grânulos corticais ------------------------------------------------------------------- 25

4.9. Mitocôndrias -------------------------------------------------------------------------- 25

4.10. Fecundação e cultivo in vitro --------------------------------------------------- 25

4.11. Delineamento experimental ----------------------------------------------------- 27

4.11.1. Experimento 1. Avaliação de concentrações decrescentes de

BL I em meio suplementado com BSA -----------------------------------------------------

27

4.11.2. Experimento 2. Avaliação de concentrações crescentes de BL

I em meio sem suplementação de BSA ----------------------------------------------------

27

4.11.3. Experimento 3. Efeito do bloqueio da meiose na maturação

nuclear ----------------------------------------------------------------------------------------------

28

4.11.4. Experimento 4. Cinética da maturação nuclear pós-bloqueio

da meiose ------------------------------------------------------------------------------------------

29

4.11.5. Experimento 5. Efeito do bloqueio da meiose na organização

dos microtúbulos e dos microfilamentos ---------------------------------------------------

29

4.11.6. Experimento 6. Efeito do bloqueio da meiose na distribuição

dos grânulos corticais e das mitocôndrias -------------------------------------------------

30

4.11.7. Experimento 7. Efeito da BL I no desenvolvimento

embrionário in vitro -------------------------------------------------------------------------------

31

4.12. Análise estatística ----------------------------------------------------------------- 32

5. RESULTADOS ----------------------------------------------------------------------------- 33

5.1. Experimento 1. ----------------------------------------------------------------------- 33

5.2. Experimento 2. ----------------------------------------------------------------------- 34

5.3. Experimento 3. ----------------------------------------------------------------------- 35

5.4. Experimento 4. ----------------------------------------------------------------------- 36

5.5. Experimento 5. ----------------------------------------------------------------------- 38

vii

5.7. Experimento 6. ----------------------------------------------------------------------- 40

5.9. Experimento 7. ----------------------------------------------------------------------- 43

6. DISCUSSÃO ------------------------------------------------------------------------------- 45

7. CONCLUSÕES ---------------------------------------------------------------------------- 54

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------------------------------- 55

APÊNDICE ----------------------------------------------------------------------------------------- 68

viii

LISTA DE ABREVIATURAS μg – micrograma;

μL – microlitro;

μM – micromolar;

AI – anáfase I;

AMPc – monofosfato de adenosina cíclica;

ATP – trifosfato de adenosina;

B199 – TCM-199, sais de Earle e 20 mM de bicarbonato de sódio;

BL I – butirolactona I;

BSA – albumina sérica bovina;

CDK – cinase dependente de ciclina;

CIV – cultivo in vitro;

CO2 – dióxido de carbono;

CSF – fator citostático;

DMSO – dimetilsulfóxido;

DNA – ácido desoxirribonucléico;

ERK – cinase regulada por sinal extracelular (MAPK);

FITC – isotiocianato de fluoresceína;

FIV – fecundação in vitro;

FSH – hormônio folículo estimulante;

ix

GDP – guanosina difosfato;

GTP – guanosina trifosfato;

H199 – TCM -199, sais de Earle, 20 mM de bicarbonato de sódio e 25 mM de Hepes;

LH – hormônio luteinizante;

MAPK – proteína cinase ativada por mitógenos;

MAP2K, MAP3K, MAP4K – cinases ativadoras de cinases ativadas por mitógenos

MAT – metáfase I, anáfase I e telófase I;

MBP – proteína básica de mielina;

MEK – cinase regulada por sinal extracelular (MAP2K);

MI – metáfase I;

MII – metáfase II;

Miss – MAPK de interação e estabilização do fuso meiótico;

MIV – maturação in vitro;

mL – mililitro;

mos – oncogene c-mos;

MPF – fator promotor da maturação;

Myt1, Wee1 e CDC25 – proteínas cinases envolvidas na atividade do MPF;

P90RSK – proteína cinase ribossomo S6;

PBS – tampão fosfato salina;

PIV – produção in vitro;

PKA – proteína cinase A;

PKC – proteína cinase C;

PVA – álcool polivinílico;

Raf-1 – MAP3K;

Ras – MAP4K;

RNAm – ácido ribonucléico mensageiro;

SFB – soro fetal bovino;

SOF – fluido de oviduto sintético;

TALP – meio tyrode’s com albumina, lactato e piruvato;

TCM-199 – meio de cultura de tecidos 199;

TI – telófase I;

VG – vesícula germinativa.

x

RESUMO

ADONA, Paulo Roberto, Dr. S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro: março de 2006; Bloqueio da meiose com butirolactona I em ovócitos

bovinos: efeitos sobre a maturação nuclear e citoplasmática; Orientador: Profª. Drª.

Cláudia Lima Verde Leal. Conselheiro: Profª. Drª. Maria Clara Caldas Bussiere.

O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito do uso da butirolactona I

(BL I) na pré-maturação sobre a progressão da meiose, estruturas celulares e

desenvolvimento de ovócitos bovinos cultivados in vitro. Ovários bovinos foram

coletados em frigoríficos e os folículos de 2-6 mm de diâmetro foram aspirados para

a obtenção dos ovócitos. Inicialmente, foram avaliadas diferentes concentrações de

BL I em meio suplementado ou não com BSA. Houve diferença (P < 0,05) nas taxas

de vesícula germinativa (VG) entre os grupos C/24 (0,0%), 25 (65,1%), 50 (84,4%) e

100 μM (97,4%) de BL I suplementados com BSA, mas não houve diferença (P >

0,05) entre os tratados com 10 (94,7%), 15 (97,2%), 20 (98,7%) e 25 μM (98,7%) de

BL I em meio sem BSA. As taxas de maturação (MII) não diferiram (P > 0,05) entre o

controle (91,1%) e os tratados com 10 (B10 = 91,5%) e 100 μM (B100 = 92,4%) de

BL I. Em relação à cinética de MIV pós-bloqueio, observou-se que às 6h de MIV os

grupos B10 (71,4%) e B100 (74,3%) apresentaram taxas de VG inferiores (P < 0,05)

ao controle (97,3%). Com 12h de MIV a maior parte dos ovócitos estava em estádios

intermediários da meiose (MAT) (77,9; 83,1 e 86,4% para controle, B10 e B100,

respectivamente, P > 0,05). Com 18h de MIV as taxas de MII não diferiram (P >

xi

0,05) entre controle (72,0%), B10 (73,7%) e B100 (78,9%). Com relação aos

microtúbulos não foram observadas alterações no fuso meiótico quanto à

organização e formação da placa metafásica nos diferentes grupos de ovócitos

(controle, B10 e B100) e horários (0, 6, 12, 18 e 24h) avaliados. Também não foi

observada nenhuma alteração no arranjo dos microfilamentos no citoplasma dos

ovócitos avaliados nas mesmas condições. Em 100% dos ovócitos não maturados

independente do grupo (C/0h, B10 e B100), os grânulos corticais apresentavam-se

dispersos pelo citoplasma (P > 0,05) dos ovócitos. Após 24h de MIV, 98% dos

ovócitos apresentavam migração dos grânulos corticais para a região periférica do

citoplasma em todos os grupos (P > 0,05). As mitocôndrias nos ovócitos não

maturados dos grupos tratados encontravam-se em sua maioria na periferia dos

ovócitos (81,5 e 86,9%, P > 0,05), mas foi inferior (P < 0,05) ao controle (100%).

Após 24h de MIV, as mitocôndrias migraram por todo o ovócito, sendo o grupo C/24

(81,5%) inferior (P < 0,05) aos grupos B10M (95,2) e B100M (98,2%) que não

diferiram entre si (P > 0,05). As taxas de clivagem (81-87%) não diferiram (P > 0,05)

para os ovócitos submetidos à FIV nos grupos controle, B10 e B100. Com relação à

percentagem de blastocisto no D7, os grupos controle (38,3%) e B10 (41,6%) não

diferiram entre si (P > 0,05), mas ambos foram superiores (P < 0,05) ao grupo B100

(33,0%). A taxa de blastocisto eclodido foi similar (P > 0,05) entre os grupos controle

(19,2%), B10 (17,7%) e B100 (11,0%) no D8. Também não foi observada variação

(P > 0,05) no número médio de células dos blastocistos no D8, entre o controle

(138), B10 (136) e B100 (150). A pré-maturação com BL I não aumentou os índices

de desenvolvimento, porém também não induziu alterações estruturais e não

comprometeu (B10) o desenvolvimento embrionário, sugerindo a possibilidade de

sua aplicação em biotécnicas de PIV de embriões e de clonagem.

Palavras-chave: butirolactona I, embrião, maturação, meiose e ovócito bovino.

xii

ABSTRACT

ADONA, Paulo Roberto, Dr. S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy

Ribeiro: março de 2006; Meiosis block using butyrolactone I in bovine oocytes:

Effects on nuclear and cytoplasmic maturation; Supervisor: Prof. Dr. Cláudia Lima

Verde Leal. Counselor: Prof. Dr. Maria Clara Caldas Bussiere.

The present study aimed to assess the effects of butyrolactone I (BL I) in pre-

maturation on meiosis progression, cellular structures and development of bovine

oocytes cultured in vitro. Bovine ovaries were collected in abattoirs and 2-6mm

follicles were aspirated to obtain oocytes. Initially, different BL I concentrations were

evaluated in B199 medium supplemented or not with BSA. Germinal vesicle (GV)

rates were different (P < 0.05) among the groups C/24 (0.0%) 25 (65.1%), 50

(84.4%) and 100 μM (97.4%) BL I in medium supplemented with BSA. However, no

difference (P>0.05) was observed when oocytes were cultured with 10, 15, 20 and 25

μM BL I (94.7, 97.2, 98.7 and 98.7%, respectively) in medium without BSA.

Maturation rates (MII) were similar (P > 0.05) between controls (91.1%) and treated

oocytes (91.5 and 92.4% for B10 and B100, respectively). Regarding maturation

kinetics, VG rates at 6h IVM in controls (97.3%) were superior (P < 0.05) to treated

oocytes (71.4 and 74.3% for B10 and B100, respectively). At 12h most of the oocytes

were at intermediate stages of meiosis (77.9, 83.1 and 86.4%, for control, B10 and

B100, respectively, P>0.05). After 18 h IVM, MII rates were similar (P > 0.05) among

groups (72.0, 73.7 and 78,9% for control, B10 and B100, respectively). Regarding

xiii

microtubules no alterations in meiotic spindle were observed for organization and

formation of metaphase plate in different groups (control, B10 and B100) and IVM

periods (0, 6, 12, 18 and 24h). No alterations in microfilament arrangement were

observed either under the same conditions. All immature oocytes (100%) presented

cortical granules (CG) dispersed throughout the cytoplasm, irrespective of oocyte

group (C/0h, B10 and B100, P > 0.05). After 24 h IVM, also irrespective of oocyte

group, 98% of the oocytes had the CG migrated to the periphery of the cytoplasm (P

> 0.05). Immature oocytes in treated groups presented mitochondria mostly in the

periphery of the oocytes (81.5 and 86.9%, P > 0,05), although at a lower rate than in

control oocytes (100%, P < 0.05). After 24 h IVM, mitochondria migrated throughout

the cytoplasm, but in both treated groups the migration rates were superior (95.2 and

98.2% for B10 and B100, P > 0.05) to controls (81.5%, P < 0.05). Cleavage rates

were not affected (81-87%, P > 0.05) in oocytes fertilized in vitro. However,

blastocyst rates in day 7 were reduced in the B100 group (33.0%, P < 0.05). Controls

and B10 had similar rates (38.3 and 41.6%, respectively, P >0.05). Day 8 hatching

rates (19.2, 17.7 and 11.0% for control, B10 and B100, P > 0.05) and blastocyst cell

numbers (138, 136 and 150 B100 for control, B10 and B100, P > 0.05) were

unaffected. Pre-maturation using BL I did not increase blastocyst rates, but also did

not affect cell structures and development (B10), suggesting the possibility of its use

for in vitro embryo production and cloning.

Palavras-chave: butyrolactone I, embryo, maturation, meiosis and oocyte bovine.

1. INTRODUÇÃO

Os mecanismos pelos quais os ovócitos adquirem a competência para

desenvolverem-se até o estádio de blastocisto ainda não estão totalmente

compreendidos. Há evidências de que a aquisição da competência está

correlacionada com moléculas de RNAs e de proteínas estocadas e processadas

durante as fases de crescimento, “capacitação” (pré-maturação) e maturação do

ovócito. Essas moléculas são usadas para sustentar as fases iniciais da

embriogênese até que a transcrição do DNA do embrião se torne ativa (DE LA

FUENTE e EPPIG, 2001).

Apesar dos muitos esforços para melhorar a produção in vitro (PIV) de

embriões para fins científicos e/ou comerciais, a sua eficiência ainda é relativamente

baixa. Apenas 35-40% dos ovócitos bovinos maturados in vitro (MIV) desenvolvem-

se até o estádio de blastocisto (MAYES e SIRARD, 2001; SIRARD et al., 2006), e

ainda desses, somente 30% chegam a termo após a transferência (WARD et al.,

2002; PARK et al., 2005). Essas baixas taxas são determinadas por vários fatores

decorrentes das etapas que constituem o sistema de PIV de embriões. As condições

de cultura para maturação nuclear e citoplasmática do ovócito certamente têm um

papel fundamental, e uma maturação completa é essencial para o desenvolvimento

embrionário. Portanto, para a obtenção de um sistema que possibilite a produção de

um maior número de embriões é necessária a compreensão dos mecanismos

envolvidos na maturação.

Observou-se que in vivo, os ovócitos, ao final de seu período de crescimento,

2

mas antes do período de maturação propriamente dito, passam por um período

chamado de “capacitação”, o qual parece ser importante para o desenvolvimento

pleno de sua competência. Nesse período ocorrem modificações estruturais e

moleculares que são importantes para o desenvolvimento embrionário (HYTTEL et

al., 1997, DIELEMAN et al., 2002).

Os ovócitos utilizados no sistema de PIV de embriões normalmente já

concluíram sua fase de crescimento e entraram no período de “capacitação”

ovocitária (HYTTEL et al., 1997). Porém, ao serem removidos do ambiente folicular

reiniciam a meiose (KUBELKA et al., 2000) e uma parte dessa população ainda não

concluiu a “capacitação” ovocitária.

Uma das alternativas que vários pesquisadores vêm analisando para estudar

a competência de desenvolvimento dos ovócitos in vitro é o bloqueio da retomada da

meiose antes da maturação. No entanto, pouco se sabe do que ocorre nesse

período. De toda forma, o bloqueio da meiose serviria como ferramenta para estudar

os possíveis fatores envolvidos na indução da “capacitação” após a remoção dos

ovócitos do ambiente folicular, e que poderiam ter efeitos positivos sobre o

desenvolvimento embrionário subseqüente. A obtenção de conhecimento nesse

sentido, por sua vez, poderá contribuir para um melhor embasamento no

desenvolvimento de procedimentos mais eficientes para a PIV de embriões bovinos.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Ovogênese e foliculogênese

A ovogênese refere-se à seqüência de eventos em que as células

germinativas primordiais diferenciam-se em ovogônias, ovócitos primários e

secundários, findando com a fecundação do ovócito maturo (GONSALVES et al.,

2002; VAN DEN HURK e ZHAO, 2005). Já a foliculogênese inicia-se com a

formação dos folículos

primordiais,

progredindo para

folículos primários,

secundários e

terciários, finalizando

com a ovulação de um

ovócito maturo

(GONSALVES et al.,

2002; VAN DEN

HURK e ZHAO, 2005)

(Figura 1). A

diferenciação das

células da linhagem

germinativa feminina ocorre totalmente ou quase totalmente na fase

embrionária/fetal dependendo da espécie (MOORE e PERSAUD, 2000;

GONSALVES et al., 2002) (Tabela 1). Estudos recentes, porém, sugerem que possa

Figura 1. Diagrama simplificado da ovogênese e foliculogênese. Fonte: adaptado de Gonsalves et al., (2002) e Van den Hurk e Zhao (2005).

C. germinativas primordiais

Endoderma

Ovogônia

Ovócito 1°

Folículo primordial Folículo 1º

Folículo 2º

Folículo ovulatório

Meiose IIOvulação

Fecundação

Zigoto

Mitose

FO L I C U L O G Ê N E S E

Blastocisto

O V O G Ê N E S

Dictióteno

Início da meiose I

Prófase I

Prófase I

Folículo 3º Folículos pré-antrais

Folículos antrais

E

Ovócito 2°

Término da meiose I

Término da meiose II

4

haver diferenciação dessas células também em adultos, embora a maior parte das

evidências ainda indique que folículos primários sejam formados apenas na vida

fetal (BUKOVSKY et al., 2005).

Ao nascer, os bovinos dispõem de um número determinado de ovócitos

primários, cada um dos quais com o material genético duplicado (GONSALVES et

al., 2002). O processo de

diferenciação dos ovócitos

primários (imaturo) para

secundários (maturo) é iniciado

na maturidade sexual quando, a

intervalos médios de 21 dias

(bovinos), um ovócito (2n)

conclui a primeira meiose

iniciada na fase fetal. Agora, o ovócito secundário ou maturado (n) encontra-se apto

para a fecundação. Com a fusão do espermatozóide, o ovócito finaliza sua segunda

divisão meiótica (extrusão do segundo corpúsculo polar). Desse modo o material

genético do ovócito é reduzido à metade por meio de duas divisões meióticas

sucessivas. A ploidia retorna à sua conformação original (2n) com a interação

(singamia) do material genético do espermatozóide com o do ovócito, formando

assim o zigoto, que originará o embrião (MOORE e PERSAUD, 2000; GONSALVES

et al., 2002; HAFEZ, 2002).

Tabela 1. Cronologia da ovogênese e foliculogênese em bovinos e ovinos.

Eventos Dias de gestação Bovinos Ovinos

Células germinativas primordiais 35 23 Ovogônias 60 48 Ovócitos primários 75-80 55 Folículo primordial 90-130 90 Folículos primários 140 95 Folículos secundários 210 103 Folículos terciários 230-250 150 Nascimento 280 150

Fonte: McNatty et al., 2000; Gonsalves et al., 2002; Fair, 2003

2.2 . Maturação ovocitária

Durante todo o período do desenvolvimento, desde a formação e crescimento

dos ovócitos e dos folículos, até após o período da dominância folicular, os ovócitos

bovinos permanecem em estádio de prófase da primeira meiose. In vivo, o reinício

da meiose ocorre com o surgimento do pico pré-ovulatório de LH (hormônio

luteinizante) e se dá somente nos ovócitos inteiramente crescidos e meioticamente

competentes dos folículos pré-ovulatórios (FAIR, 2003; RODRIGUEZ e FARIN,

2004). A competência dos ovócitos tem uma estreita relação com as multicamadas

de células do cumulus que os cercam, mantendo uma importante via de

5

comunicação através das junções comunicantes (gap), antes e durante o pico pré-

ovulatório de LH (RODRIGUEZ e FARIN, 2004; GILCHRIST et al., 2004). Logo após

o pico de LH, começa a ocorrer o desaparecimento dessas vias de comunicação

entre o ovócito e as células do cumulus (HYTTEL et al., 1997).

A progressão do ciclo celular do ovócito até o estádio de metáfase da

segunda meiose (metáfase II), tanto in vivo quanto in vitro, é marcada por uma série

de transformações bioquímicas e estruturais no núcleo e no citoplasma do ovócito,

eventos esses que caracterizam a maturação ovocitária (MACHATKOVA et al.,

2004; DE SOUSA et al., 2004). Na transição da prófase I à metáfase II, estabelece-

se uma complexa cascata de fosforilações e desfosforilações de uma série de

proteínas envolvidas no reinício e na regulação da meiose (DEKEL, 2005; DUMONT

et al., 2005). Entre as proteínas que mais se destacam no período da maturação

estão as proteínas do complexo MPF (fator promotor da maturação) e da família

MAPK (proteína cinase ativada por mitógenos). Para efeito de estudo, a maturação

será dividida em maturação nuclear e citoplasmática, apesar desses eventos

ocorrerem concomitantemente.

2.2.1. Maturação nuclear

A diferenciação do ovócito imaturo em maturo envolve uma série de

alterações que são estimuladas principalmente por hormônios gonadotróficos

(MERTON et al., 2003). Sob a influência dos hormônios, o ovócito recomeça seu

ciclo celular progredindo da fase de diplóteno da prófase da primeira meiose

(prófase I), passando pelos estádios de metáfase I, anáfase I, telófase I (término da

primeira divisão meiótica) e progredindo até o estádio de metáfase da segunda

divisão meiótica (MEINECKE et al., 2001). No intervalo que compreende os estádios

de prófase I a metáfase II, os cromossomos condensam e o envelope nuclear é

desfeito marcando o início da maturação nuclear (MEINECKE et al., 2001; JONES,

2004). Dando seqüência, os cromossomos homólogos são divididos em dois grupos,

com a metade do número original de cromossomos. Ao término da primeira divisão

meiótica o citoplasma é dividido assimetricamente (CAN et al., 2003), gerando duas

células de tamanhos diferentes: uma pequena chamada de corpúsculo polar e outra

6

grande, o ovócito secundário. Ao término da maturação nuclear o ovócito permanece

nesse estádio do ciclo celular (metáfase II) até a fecundação (MAYES e SIRARD,

2001) ou ativação partenogenética (YI e PARK, 2005).

Os fatores da ativação (natural ou artificial) dos ovócitos maturos vão

promover o término da segunda divisão meiótica, que se caracteriza pela progressão

da metáfase II até a telófase II com a liberação do segundo corpúsculo polar. Após a

ativação, o futuro embrião prossegue seu ciclo celular por divisão mitótica. In vitro, a

maturação nuclear de ovócitos bovinos de folículos > 2 mm de diâmetro em

condições apropriadas requer de 18 a 24 horas de cultivo (KHATIR et al., 1998;

DODE e ADONA, 2001; ADONA e LEAL, 2004).

2.2.2. Maturação citoplasmática

A competência de desenvolvimento do ovócito em embrião em estádio

adiantado de desenvolvimento é basicamente dependente das modificações

bioquímicas, moleculares e estruturais do citoplasma. Essas alterações na

maturação do ovócito são processos altamente complexos que envolvem vários

eventos simultâneos como síntese de proteínas (KHATIR et al., 1997; SIRARD et al.,

1998), modificações moleculares (KUBELKA et al., 2000) e migração e

reorganização de organelas no citoplasma (STOJKOVIC et al., 2001). Se

compararmos as taxas de

maturação (Tabela 2),

observaremos que a maturação

citoplasmática (taxa de

blastocistos) in vitro está aquém

da maturação nuclear (taxa de

metáfase II) (HASHIMOTO et al., 2002; OYAMADA et al., 2004; ADONA e LEAL

2004). Por outro lado, in vivo, as taxas de blastocistos são de aproximadamente 80%

(RIZOS et al., 2002).

Tabela 2. Comparação entre maturação nuclear e citoplasmática.

Nuclear1 Citoplasmática2

81,0% 33,5% 81,4% 22,2% 90,9% 34,8%

1 Taxa de ovócitos em estádio de metáfase II; 2 Taxa de embriões em estádio de blastocisto, após sete dias de cultivo in vitro. Fonte: Hashimoto et al., 2002; Oyamada et al., 2004; Adona e Leal, 2004

7

2.2.3. Organização estrutural na maturação

2.2.3.1. Citoesqueleto

Microtúbulos, um dos componentes do citoesqueleto, são filamentos

altamente dinâmicos e sua dinâmica se dá pela adição (polimerização) ou remoção

(despolimerização) constante de novas unidades de tubulina α e β. Na transição do

ciclo celular durante a maturação de ovócitos de mamíferos ocorre uma intensa

reorganização dos microtúbulos (KIM et al., 2000).

Durante a maturação meiótica, duas populações de centrossomos regulam

coordenadamente o conjunto de microtúbulos nos eventos nucleares e

citoplasmáticos, tais como formação do eixo meiótico orientado assimetricamente,

segregação dos cromossomos durante a meiose, a extrusão do primeiro corpúsculo

polar e a formação da segunda placa metafásica (ALBERTS et al., 1997; KIM et al.,

2000; CAN et al., 2003; SUN et al., 2004).

Os erros de segregação dos cromossomos durante uma ou outra divisão

meiótica podem resultar em embrião aneuplóide após a fecundação, o que por sua

vez pode ter grave conseqüência para o desenvolvimento (BRUNET et al., 2003;

SUN et al., 2004). Especificamente nos mamíferos, a perda ou ganho de um

cromossomo autossômico resulta em distúrbios fisiológicos e de desenvolvimento

(ABRUZZO e HASSOLD, 1995).

Para o sucesso da fecundação, o fuso meiótico no ovócito deve permanecer

estável e corretamente organizado durante o

bloqueio do ovócito em metáfase II (TERRET et

al., 2003). Há evidências de que as proteínas da

família MAPK (proteína cinase ativada por

mitógenos) e a PKC (proteína cinase C) são

responsáveis pela estabilidade dos microtúbulos

mantendo o fuso meiótico estável em ovócitos de

ratos (HORNE et al., 2003; TONG et al., 2003).

Os substratos da MAPK (Figura 2), tais como a

p90rsk (proteína cinase ribossomo S6) e a MISS

(MAPK de interação e estabilização do fuso)

Figura 2. Proteínas envolvidas na estabilidade do fuso meiótico e na atividade do CSF em camundongos. Fonte: Lefebvre et al., (2002).

mos

MAPKK

MAPK

Miss P90RSK

Estabilidade do fuso MII CSF bloqueio ?

8

parecem participar dessa estabilidade via proteínas mos/.../MAPK (LEFEBVRE et al.,

2002; TERRET et al., 2003).

A rede de microtúbulos é usada por proteínas motoras (famílias das cinesinas

e dineínas) para gerar movimentos periódicos das organelas no interior da célula. As

proteínas motoras dependentes de microtúbulos desempenham uma função

importante no posicionamento das organelas (ALBERTS et al., 1997).

Os microfilamentos são os maiores componentes do citoesqueleto em

ovócitos de mamíferos e fornecem a estrutura para divisão celular (KIM et al., 2000).

Ficam situados principalmente no córtex celular (camada situada logo abaixo da

membrana plasmática rica em actina e uma variedade de proteínas) de ovócitos em

estádio VG (vesícula germinativa) e no eixo meiótico da célula depois do rompimento

da VG (desestruturação da membrana nuclear) (ALBERTS et al., 1997; KIM et al.,

2000). Estão envolvidos na incorporação do espermatozóide, na extrusão do

corpúsculo polar e na migração dos grânulos corticais para o córtex celular durante a

maturação ovocitária em diferentes espécies de mamíferos (CONNORS et al., 1998;

KIM et al., 2000; SUN et al., 2001a).

2.2.3.2. Organelas

2.2.3.2.1. Mitocôndrias

As mitocôndrias são a central bioenergética da célula com função claramente

essencial que define a competência funcional dos ovócitos. São organelas

especializadas que ocupam uma porção substancial do volume citoplasmático das

células de origem materna. São responsáveis pela produção da maior parte da

energia celular em forma de ATP (trifosfato de adenosina), por fosforilação oxidativa

através do metabolismo dos carboidratos e dos ácidos graxos contidos no

citoplasma provenientes do meio interno e externo (WILDING et al., 2001;

CUMMINS, 2004). Nos ovócitos em geral, há uma grande concentração de

mitocôndrias para suportar uma taxa mais elevada de síntese de moléculas dos

processos fisiológicos envolvidos no desenvolvimento. A eficiência da matriz

mitocondrial na conversão do piruvato em ATP é requerida para o processo de

maturação e divisão celular (WILDING et al., 2001). A inabilidade das mitocôndrias

9

de aumentarem e/ou acumularem ATP tem sido ligada ao desenvolvimento anormal

ou ao bloqueio do desenvolvimento embrionário (STEUERWALD et al., 2000).

Durante a mitose, as mitocôndrias são distribuídas aleatoriamente entre as

células filhas e no decorrer da ovogênese há um aumento substancial no número de

mitocôndrias (6000 para 193.000 mitocôndrias no ovócito em humanos) com uma

variação expressiva entre ovócitos do mesmo estádio de desenvolvimento

(REYNIER et al., 2001; CUMMINS, 2004). Porém, se os blastômeros embrionários

não receberem uma população suficiente de mitocôndrias para produção de ATP

podem tornare-se disfuncionais e fragmentados (CUMMINS, 2004). Há uma

correlação similar entre o potencial para o desenvolvimento, índice de ATP e função

mitocondrial tanto nos ovócitos quanto nos embriões bovinos (STOJKOVIC et al.,

2001).

Durante a maturação ovocitária as mitocôndrias modificam sua disposição

dentro do citoplasma celular. Elas são localizadas próximas às gotas de lipídios que

por sua vez aumentam de tamanho com a progressão da maturação (HYTTEL et al.,

1997). Em ovócitos de mamíferos em estádio de VG, as mitocôndrias são

encontradas em maior quantidade na periferia do citoplasma, e com pequenos

grupos dispersos mais ao centro do ovócito (HYTTEL et al., 1997; SUN et al.,

2001b). Já nos ovócitos em estádio metáfase II, as mitocôndrias estão mais

centralizadas no citoplasma (HYTTEL et al., 1997; SUN et al., 2001b).

2.2.3.2.2. Grânulos Corticais

Os grânulos corticais (GC) são organelas produzidas a partir do complexo de

Golgi e estão presentes apenas nos gametas femininos de todos os mamíferos, na

maioria dos vertebrados e em muitos invertebrados (WESSEL et al., 2001; MAYES,

2002). São possuidores de uma população de moléculas que incluem proteases,

glicosidases, enzimas e proteínas estruturais que contribuem para a barreira física e

bioquímica que bloqueia a polispermia (WESSEL et al., 2001).

Os GC são vesículas secretoras não renováveis e com advento da

fecundação o seu conteúdo não é mais sintetizado. Os RNAs que codificam as

diversas moléculas do conteúdo dos GC são degradados seletivamente no período

10

da maturação do ovócito e só voltam a ser transcritos e codificados nos novos

ovócitos do ciclo reprodutivo (WESSEL et al., 2001).

A principal função do conteúdo presente nos GC é de construir

(equinodermos – Ex.: ouriço-do-mar) ou de modificar (mamíferos – Ex.: bovinos) a

matriz extracelular (zona pelúcida) existente nos ovócitos para oferecer uma barreira

bioquímica e mecânica que impede a entrada de mais de um espermatozóide no

ovócito (WESSEL et al., 2001). Os GC são formados nos ovócitos em crescimento,

mas sua redistribuição ocorre no período da maturação (DUCIBELLA et al., 1994; HYTTEL et al., 1997). Primeiramente, os GC podem ser identificados em pequenos

grupos pelo citoplasma dos ovócitos em estádio de VG. Sua migração para a

periferia do ovócito vai ocorrendo com o avanço da maturação. Em estádio de

metáfase II, os GC estão distribuídos no córtex próximo à membrana plasmática

(CONNORS et al., 1998; WESSEL et al., 2001; VELILLA et al., 2004).

2.2.4. Mudanças moleculares e bioquímicas

Durante o crescimento, a “capacitação” e a maturação do ovócito, diversas

moléculas são sintetizadas e armazenadas. Essas moléculas vão dar suporte à

maturação e ao desenvolvimento após a fecundação, até que o genoma do embrião

se torne transcricionalmente ativo e as mensagens derivadas do embrião comecem

a regular a embriogênese (CHA e CHIAN, 1998; MERMILLOD et al., 2000;

MEIRELLES et al., 2004). A maioria dos RNAm (ácido ribonucléico mensageiro) no

ovócito é sintetizada e acumulada durante o período de crescimento do ovócito (DE

SOUSA et al., 1998). Esse metabolismo no ovócito é caracterizado pela transcrição

e pela tradução ativa durante o período pré-ovulatório. Entretanto, a transcrição

gênica bovina cessa antes da ovulação, assim, o ovócito, o zigoto e o embrião com

menos de 16 blastômeros são dependentes do “pool” dos RNAs e das proteínas

acumuladas durante o período de crescimento e de maturação do ovócito

(GANDOLFI e GANDOLFI, 2001; MEMILI e FIRST 2000; LONERGAN et al., 2003).

Ovócitos de muitas espécies dependem da síntese e da ativação de uma

variedade de proteínas para que possam ingressar e prosseguir no processo de

maturação ovocitária. Entre as proteínas mais importantes que regulam o

11

mecanismo da maturação ovocitária estão as proteínas do complexo MPF e as

proteínas da família MAPK (SHENG et al., 2002; TIAN et al., 2002; JONES, 2004).

2.2.4.1. Cinases dependentes de ciclinas (CDKs)

As CDKs são uma família de serina/treonina cinases envolvidas na regulação

do ciclo celular (CDK1, 2, 3, 4, 6 e 7), na transcrição (CDK7, 8 e 9) ou na função

neuronal (CDK5) (SCHANG, 2004; MAPELLI et al., 2005). A atividade da CDK é

dependente da interação com uma ciclina, cujos níveis são regulados

seqüencialmente para assegurar que as fases do ciclo celular prossigam na ordem

correta (ARRIS et al., 2000). Por exemplo, as ciclinas D interagem com as CDKs 4 e

6 durante a fase G1, a ciclina E com a CDK2 no final da fase G1, a ciclina A com a

CDK2 na fase S/G2 e a ciclina B com a CDK1 na fase G2/M (Figuras 3 e 4)

(KNOCKAERT et al., 2002; ARRIS et al., 2000). A falha no controle das CDKs e a

conseqüente perda da função do ponto de verificação do ciclo celular têm sido

relacionadas diretamente à patologia

molecular do câncer (ARRIS et

al.,2000).

Figura 3. Diagrama simplificado da atividade das CDKs/ciclinas na regulação do ciclo celular. Fonte: Knockaert et al., (2002) e Arris et al., (2000)

CDK 2 Ciclina E

CDK 1 Ciclina B

CDK 4/6 Ciclina D

CDK 2 Ciclina A

Mitose

Meiose

ovócito

Figura 4. CDKs envolvidas na regulação do ciclo celular, na transcrição e na função neuronal. Fonte: Knockaert et al., (2002)

CDK1 Ciclina B

Ringo Transição de prófase I para metáfase II Regulação da topoisomerase II

Transição das fases G1/S e S/G2 Duplicação do centrossomo.

Transição das fases G1/S

Fase G1

Apoptose Migração dos neurônios Envolvida em outros eventos celular

Sinal de tradução e transcrição

Fase G1, morte de células neurais.

Ativação da CDK1 e CDK2

Regulação da DK7/ciclina H

Processamento de RNA ou transcrição Apoptose

CDK2

CDK3 Ciclina E?

Ciclina E

Ciclina A

Ciclina D

P35, P25

P39, P29

Ciclina D

Ciclina H

Ciclina C

Ciclina K

Ciclina T

Ciclina L

CDK4

CDK5

CDK6

CDK7

CDK8

CDK9

CDK11

Fase G1

F a s e S

Fase G2

F a s e M

12

2.2.4.2. Fator promotor da maturação (MPF)

O MPF é um heterodímero composto por uma cinase catalítica (p34cdc2 ou

CDK1) e uma subunidade de ciclina B regulatória (ABRIEU et al., 2001; JONES,

2004). Há ao menos três tipos de ciclinas B (B1, B2 e B3), e nos mamíferos parece

que a ciclina B1 é a principal responsável pela atividade do complexo MPF. Embora

a ligação da CDK1 com a ciclina B1 seja necessária, não é o suficiente para

desencadear a atividade do complexo MPF (CASTRO et al., 2001; JONES, 2004),

que é dependente dos mecanismos subseqüentes: fosforilação da CDK1 nos

resíduos de tirosina 15 (Y15),

treonina 14 (T14), treonina 161

(T161) e a posterior

desfosforilação dos resíduos

Y15 e T14 (KIKUCHI et al.,

2000; VAILLANT et al., 2001;

JOSEFSBERG e DEKEL,

2002). Em termos gerais a

CDK1 é fosforilada em Y15 e

T14 pelas proteínas cinases

Myt1 e Wee1, que causam uma

fosforilação inibitória da CDK1.

Nesse estádio o complexo MPF

está formado (pré-MPF), mas

ainda está inativo (Figura 5). A

ativação do MPF depende da

desfosforilação em Y15 e T14

pela proteína fosfatase CDC25

(MPF – ativo) (KIKUCHI et al., 2000; JONES, 2004). O aumento da atividade da

proteína CDC25 e a baixa atividade das proteínas cinases Myt1 e Wee1 são

necessários para a ativação completa do complexo MPF (JONES, 2004).

Figura 5. Diagrama simplificado do mecanismo de ativação do MPF. Fonte: Dekel (2005).

Wee1

Myt1

AMPc

PKC

Síntese

Ovócito em VG

Condensação dos cromossomos Rompimento da VG

Mos -RMAm poliadenilação

Mos síntese, MEK MAPK ativação.

Formação do fuso

Extrusão do 1ª corpúsculo polar

CSF estável Metáfase II bloqueada

Fecundação ou ativação artif. CSF instável

M E I O S E

A T I V A D A

n

Ciclina B

A variação da atividade do MPF pode ser detectada nos ovócitos bovinos

durante a maturação. Sua atividade é baixa em VG passando a ser observada no

início do rompimento da VG. Alcança um pico no estádio de metáfase I e declina sua

MPF

MPF Ativo

MPF Ativo

MPF Ativo

CDK1

M CDK1 E I O S E

B L O Q U E A D A

Ativação

CDC25

13

atividade durante a transição entre os estádios de metáfase I e metáfase II

(KUBELKA et al., 2000), reativando para entrada do ovócito em metáfase II. Sua

inativação nos ovócitos em estádio de metáfase II é induzida pela fecundação ou

pela ativação paternogenética (NEBREDA e FERBY, 2000; KUBELKA et al., 2000;

KIKUCHI et al., 2000; ABRIEU et al., 2001; LEDAN et al., 2001). A inativação

abrupta do MPF é considerada como um disparador necessário para o escape da

meiose bloqueada em metáfase II (TAIEB et al., 1997).

O processo de desorganização do heterodimero do complexo MPF independe

da sua ativação catalítica, que é causada geralmente pela proteólise da ciclina B.

Em ovócitos fecundados de camundongos e de suínos, a degradação da ciclina B foi

claramente relacionada com a inativação do complexo MPF (WINSTON, 1997;

KIKUCHI et al., 1999).

O MPF é um dos principais reguladores das alterações morfológicas durante

a maturação ovocitária, regulando a condensação dos cromossomos, o rompimento

do envelope nuclear, a reorganização dos microtúbulos e outras organelas

citoplasmáticas com a participação de outras proteínas (KIM et al., 2000; KANO et

al., 2000; KRISCHEK e MEINECKE, 2002; KUBELKA et al., 2002; LEFEBVRE et al.,

2002).

2.2.4.3. Proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK)

Um segundo grupo importante de proteínas que estão envolvidas na

progressão da meiose pertencem à família das serina/treonina cinases, as proteínas

cinases ativadas por mitógenos (MAPK) (KUBELKA et al., 2000). Essas proteínas

são ativadas dentro de vias específicas de transdução de sinais (Figura 6), por sinais

extracelulares (NEBREDA e FERBY, 2000). Por esta razão, a MAPK também é

chamada de ERK (cinase regulada por sinal extracelular – suas variantes, ERK1/2 –

p44/p42 kDa) (KRISCHEK e MEINECKE, 2002). A via intracelular de transdução de

sinal consiste na proteína mos (do oncogene c-mos) que ativa a MEK (MAPKK) que

fosforila a ERK (MAPK) (CHA e CHIAN, 1998; KRISCHEK e MEINECKE, 2002; SUN

et al., 2002).

14

A ampla faixa de atuação das MAPKs é mediada pela fosforilação de diversos

substratos, incluindo fosfolipases, fatores de transcrição e proteínas do

citoesqueleto. As MAPKs também catalisam fosforilação e a ativação de diversas

proteínas cinases, denominadas de proteínas cinases ativadas pelas MAPKs, que

representam um adicional enzimático de vários espectros em diferentes células

(ROUX e BLENIS, 2004).

As MAPKs são amplamente ativadas por fatores de crescimento e por soro,

com uma ativação menor pelo

estresse, efeito osmótico e pela

desorganização dos microtúbulos.

Uma variedade de estímulos

diferentes pode ativá-las, mas no

geral a ERK1 e ERK2 são ativadas

preferencialmente em resposta aos

fatores de crescimento, enquanto

as cinases JNK (c-jun amino

terminal cinase) e p38 cinase são

mais responsivas aos estímulos de estresse e efeitos osmóticos (CHEN et al., 2001;

ROUX e BLENIS, 2004).

MAP4K GDP GTP

A via MAPK é ativada universalmente durante a maturação meiótica em

ovócitos de vertebrados. Entretanto, o tempo requerido para sua ativação é díspar

nas diferentes espécies (NEBREDA e FERBY, 2000). A ativação da MAPK em

ovócitos bovinos ocorre após 8 horas de cultivo in vitro e apresenta um aumento

gradual até 12–14 horas e se mantém estável até o final da maturação (KUBELKA et

al., 2000).

As duas principais isoformas (ERK1/2) da MAPK são ativadas com a

proximidade do rompimento da VG em ovócito bovinos (KUBELKA et al., 2000). Isso

sugere que a MAPK não é requerida para o reinício da meiose, mas é essencial em

eventos pós-rompimento da VG (KANO et al., 2000; LEFEBVRE et al., 2002).

Porém, a injeção de MAPK ativa em ovócitos de suíno ou de bovino induz o

rompimento da VG, indicando que essa proteína promove o reinício da meiose em

condições especiais (FISSORE et al., 1996; INOUE et al., 1998).

MAP3K MAPKK MAPK Figura 6. Diagrama simplificado das vias de ativação das MAPKs. Fonte: Cha e Chian 1998; Nebreda e Ferby, 2000; Kubelka et al., 2000; Krischek e Meinecke, 2002; Sun et al., 2002.

GTP

Raf-1

MEK

ERK

CSF

GDP

mos

AMPc ⇓

PKA ⇓

Ras

15

2.3. Competência ovocitária

A competência para a progressão da maturação meiótica em ovócitos de

mamíferos é adquirida durante o crescimento folicular (PAVLOK et al., 2000;

MIYANO, 2003). Nesse contexto, para que o ovócito tenha competência para a

maturação tanto nuclear como citoplasmática esse deve completar sua fase de

crescimento. Em bovinos foi demonstrado que folículos de diâmetro acima de 3 mm

de diâmetro contêm ovócitos (110-120 μm de diâmetro) com potencial de

desenvolvimento mais elevado que os de folículos menores (GANDOLFI e

GANDOLFI, 2001). Ovócitos obtidos de folículos maiores de 3 mm de diâmetro

resultam em blastocistos com maior número de células nucleadas, comparados com

os ovócitos obtidos de folículos menores que 3 mm (AVELINO et al., 1998).

Ainda não está totalmente compreendido como os ovócitos adquirem a

competência meiótica durante sua fase de crescimento e se tornam competentes

para reiniciar e terminar a meiose. Há evidências de que a aquisição da competência

meiótica nos ovócitos está correlacionada com as moléculas de RNAs e de proteínas

estocadas durante a fase de crescimento e maturação do ovócito e com o aumento

da funcionalidade das mitocôndrias (DE LA FUENTE e EPPIG, 2001; STOJKOVIC et

al., 2001; TOMEK et al., 2002; CHIAN et al., 2003).

Essas moléculas são usadas para sustentar as fases iniciais do

desenvolvimento embrionário antes que a transcrição do DNA do embrião se torne

ativa (DE LA FUENTE e EPPIG, 2001). Os padrões de síntese protéica aumentam

antes do rompimento da vesícula germinativa em ovócitos durante o cultivo de

maturação, sugerindo que essa síntese de proteínas possa ser importante para o

subseqüente desenvolvimento embrionário (TOMEK et al., 2002; CHIAN et al.,

2003). Isso faz do ovócito uma célula muito especial, completamente diferente das

células somáticas, onde os RNAs e as proteínas se submetem geralmente a uma

rápida rotação de estoque. Para permitir o estoque e o uso oportuno de tais

moléculas armazenadas, vários mecanismos necessitam ser eficaz nesse controle

no ovócito (GANDOLFI e GANDOLFI, 2001; TOMEK et al., 2002).

Em bovinos, os RNAs e as proteínas do ovócito conduzem o desenvolvimento

embrionário inicial após a fecundação até o 4º ciclo celular quando o controle

genômico (estádio de 8 a 16 células) do embrião torna-se evidente. Muitos dos

16

produtos derivados dos transcritos maternos são necessários para preparar o

maquinário biológico do embrião (SIRARD, 2001; DIELEMAN et al., 2002; KAÑKA,

2003).

A competência meiótica em ovócitos de Xenopus sp está correlacionada com

as mudanças no acúmulo e na ativação de moléculas do ciclo celular (JESSUS e

OZON, 2004). Esses mesmos

mecanismos foram observados em

ovócitos em crescimento de suínos

que começam a acumular

moléculas CDK1. Já a ciclina B foi

observada em ovócitos de folículos

antrais pequenos quando cultivados

em meio de maturação (Figura 8),

mas a CDK1 foi negativamente

fosforilada e assim inativada, talvez

pela proteína Myt1 (KANAYAMA et al., 2002; MIYANO, 2003). Nos folículos de 1,0-

1,5 mm de diâmetro, os ovócitos iniciam a meiose, mas param em metáfase I. Eles

são capazes de ativar o MPF, mas não estabelecem a cascata de proteínas da via

MAPK (KANAYAMA et al., 2002; MIYANO, 2003). Os ovócitos em crescimento

desenvolvem primeiramente a habilidade de ativar CDK1 e posteriormente de ativar

a via MAPK. Somente os ovócitos com o crescimento completo possuem

competência para ativar efetivamente as duas vias do ciclo celular.

Folículos 0,5-0,7mm 1,0-1,5 mm 4,0-6,0 mm Ovócitos 104 μm 109 μm 122μm

0 27 42 0 27 42 0 27 42h

histona H1 MBP Cultivo (h)

Figura 8. Mudanças nas atividades da CDK1 e da MAPK durante a maturação de ovócitos de suínos em vários estádios do crescimento folicular. As atividades da CDK1 e da MAPK foram detectadas pela fosforilação de histona H1 e da proteína básica de mielina (MBP), respectivamente. Adaptado a partir de Miyano, 2003.

Na produção de embriões in vitro, a maioria dos ovócitos bovinos são

provenientes de folículos de 2 a 6 mm de diâmetro (ADONA e LEAL, 2004; DALVIT

et al., 2005). A remoção dos ovócitos dos folículos antes de eles finalizarem a

foliculogênese é, provavelmente, um dos fatores envolvidos na baixa produção de

embriões in vitro. Assim sendo, a interrupção da foliculogênese seria um fator

responsável pela redução da competência ovocitária. Para contornar a

foliculogênese interrompida a que os ovócitos são submetidos, uma alternativa seria

mantê-los por um determinado período com a mesma configuração nuclear daquela

encontrada nos folículos. Para tal, os ovócitos seriam submetidos ao bloqueio

meiótico, evitando a retomada da meiose logo após a sua remoção dos folículos,

para que tenham o tempo necessário para sofrerem as mudanças necessárias antes

de serem submetidos à maturação in vitro.

17

2.4. Bloqueio meiótico

A maturação espontânea em ovócitos de bovinos ocorre in vitro após sua

retirada do ambiente folicular, o que se deve, provavelmente, à remoção do sinal

inibidor proveniente do folículo. Estudos sugerem que o fator inibidor que controla a

retomada da meiose seja produzido pelas células da teca e/ou granulosa (células

foliculares) (FOOTE e THIBAULT, 1969; SIRARD et al., 1998). KOTSUJI et al.

(1994) demonstraram que o fator inibidor da meiose em ovócitos bovinos seria

sintetizado pelas células da granulosa, mas que as células da teca contribuiriam na

amplificação desse sinal. O mecanismo que envolve o reinício da meiose também

está associado a redução nas concentrações de AMPc (monofosfato de adenosina

cíclica) (CONTI et al., 1998).

O AMPc é uma molécula sinalizadora intracelular que exerce um importante

controle na meiose em mamíferos, anfíbios e em alguns invertebrados (BILODEAU-

GOESEELS, 2003). A redução do AMPc no interior do ovócito parece estar

envolvida com a ruptura da vesícula germinativa, ao menos in vitro. Assim, os níveis

elevados da AMPc dentro do ovócito mantêm o bloqueio meiótico, visto que a

redução do AMPc é um sinal necessário para a maturação ovocitária (CONTI et al.,

1998; EYERS et al., 2005).

A regulação nas atividades enzimáticas de uma série de proteínas cinases e

fosfatases controla a meiose em ovócitos de mamíferos. Dessa forma, a meiose

pode ser bloqueada por inibidores que mantenham altas concentrações de AMPc no

interior do ovócito (BILODEAU-GOESEELS, 2003), por inibidores não específicos da

síntese protéica (MEINECKE et al., 2001), de proteínas cinases (ANDERIESZ et al.,

2000; DODE e ADONA, 2001) e por inibidores específicos da fosforilação de

proteínas CDKs (ADONA e LEAL, 2004).

In vitro, o reinício da meiose ocorre porque o ovócito é liberado da influência

dos inibidores provenientes do folículo (KOTSUJI et al., 1994). No entanto, a

maturação in vitro resulta em uma redução na produção de embriões, sugerindo que

nem todos os ovócitos conseguem maturar adequadamente (maturação

citoplasmática). Portanto, diferentes protocolos estão sendo usados in vitro para

permitir que todos (ou a maioria) os ovócitos coletados terminem a maturação

nuclear sem afetar a qualidade dos mesmos, a fim de maximizar a produção de

18

embriões (ADONA e LEAL, 2004; SCHOEVERS et al., 2005). O uso de inibidores

fisiológicos ou farmacológicos pode ser uma alternativa in vitro para um cultivo de

pré-maturação antes de submeter os ovócitos à maturação, fecundação e ao

desenvolvimento embrionário.

A ativação das cinases dependentes de ciclinas (CDKs - MPF) é um ponto

chave no reinício da meiose em ovócitos. Na tentativa de sincronizar o

desenvolvimento nuclear nos ovócitos in vitro, alguns estudos demonstraram a

inibição da ativação do MPF pelo aumento de níveis intracelulares de AMPc com

dbcAMP ou hipoxantina (SUN et al., 1999; MA et al., 2003), pela inibição não

específica da síntese protéica com cicloheximida (MEINECKE et al., 2001) ou pela

inibição não específica de proteínas cinases com 6-dimetilaminopurina

(ANDERIESZ et al., 2000; DODE e ADONA, 2001). Embora a inibição da ativação

do MPF seja bem sucedida com o uso dessas drogas, os efeitos não específicos

desses inibidores são prejudiciais para o desenvolvimento subseqüente do ovócito.

As CDKs desempenham um papel central na regulação do ciclo da divisão

celular, o que lhes faz um alvo promissor para o desenvolvimento de agentes

terapêuticos do câncer. Um grande esforço foi feito nos últimos anos na busca de

inibidores específicos de CDKs de baixo peso molecular (BRAÑA et al., 2004). A

butirolactona I é um inibidor natural isolado do fungo Aspergillus terreus, que exibe

atividade antiproliferativa, inibindo seletivamente em mamíferos as cinases CDK2 e

CDK1, que executam um importante papel na progressão do ciclo celular nas fases

G1/S e G2/M, respectivamente (SCHIMMEL et al., 1998; SCHANG, 2004).

Entretanto, tem pouco efeito nas proteínas cinases ativadas por mitógenos, proteína

cinase C, cinases dependentes de AMPc, caseína cinase I e II e no receptor tirosina

cinase do fator de crescimento epidermal (SCHIMMEL et al., 1998; SAX et al., 2002;

BRAÑA et al., 2004). A butirolactona I comporta-se como um inibidor competitivo

pelo local de ligação do ATP na CDK1 (SAX et al., 2002; BRAÑA et al., 2004).

É possível manter os ovócitos bovinos em estádio de vesícula germinativa in

vitro por um determinado período de tempo com o uso de inibidores específicos ou

não de CDKs (butirolactona I, roscovitina, cicloheximida e 6-dimetilaminopurina).

Essas informações são importantes, pois tornam possível fazer um cultivo de pré-

maturação para, posteriormente, induzir a maturação final. Assim, permite ao ovócito

um tempo maior para sofrer as mudanças necessárias à aquisição da competência

meiótica, visto que estes são submetidos a uma foliculogênese interrompida, sendo

19

removidos precocemente dos folículos e ocorrendo a retomada espontânea da

meiose. Entretanto, convém ressaltar que nesse tipo de estudo é importante verificar

não só a efetividade das substâncias em inibir o reinício da meiose, mas também

sua eficiência na reversibilidade e ausência de efeitos negativos sobre o

desenvolvimento embrionário.

20

3. OBJETIVOS

O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito da butirolactona I no

cultivo de pré-maturação sobre a meiose, estruturas celulares e desenvolvimento

dos ovócitos bovinos cultivados in vitro.

Mais especificamente foram avaliados:

1) as condições de redução da concentração de BL I para indução de bloqueio

meiótico e sua reversão (maturação in vitro);

2) a cinética de maturação pós-bloqueio;

3) a organização do citoesqueleto (microtúbulos e microfilamentos) após o

bloqueio meiótico e sua reversão;

4) a distribuição de organelas (grânulos corticais e mitocôndrias) após o bloqueio

meiótico e sua reversão;

5) o efeito do bloqueio meiótico sobre o desenvolvimento embrionário.

21

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Coleta de ovários e ovócitos

Ovários de fêmeas bovinas foram coletados em frigoríficos logo após o abate

e transportados em solução fisiológica estéril (NaCl 0,9% – Sigma, S9625) acrescida

de antibióticos (100 UI/mL de penicilina – Sigma, P7794 e 100 ug/mL de

estreptomicina – Sigma, S9137) a uma temperatura de 30º C. No laboratório, os

ovários foram lavados em NaCl 0,9% e os folículos com diâmetro de 2 – 6 mm

foram aspirados com auxílio de uma agulha de 18 “G” (1,20 X 40 mm) conectada a

uma seringa descartável de 10 mL. O líquido folicular contendo os ovócitos foi

depositado em tubos cônicos de 50 mL (Cellstar, 227261) e mantido em repouso

para decantação por 5 minutos. A porção superior do líquido foi retirada e na porção

restante foram adicionados 3-5 mL de meio H199 (TCM199 com 25 mM de Hepes –

Gibco, 12340030) acrescido de 100 UI/mL de penicilina e 100 ug/mL de

estreptomicina; suplementado com 1% de soro fetal bovino – Gibco, 26140-079).

Posteriormente, o material do tubo foi transferido para uma placa de Petri (60 x 15

mm – Falcon, 353002), onde foi feita a busca dos ovócitos sob estereomicroscópio

para avaliação e classificação dos mesmos. Somente ovócitos classificados como

graus I e II (DE LOOS et al., 1991), contendo três ou mais camadas de células do

cumulus oophorus e citoplasma uniforme, foram utilizados para os experimentos.

22

4.2. Solução estoque do inibidor

O inibidor de cinases dependentes de ciclinas (CDKs) butirolactona I (Biomol,

87414-49-1) foi preparado em solução estoque de 50 mM em dimetilsulfóxido

(DMSO – Sigma, D5879) e rediluído para 5 mM com B199 [TCM199 com sais de

Earle e com 20 mM de bicarbonato de sódio (Gibco-11150-067) suplementado com

10 μg/mL de gentamicina (Sigma, G1272)], aliquotado em tubos para

microcentrífuga e conservado no freezer a -20º C.

4.3. Bloqueio da meiose com butirolactona I

Para o bloqueio da meiose os ovócitos bovinos foram cultivados in vitro com

butirolactona I (BL I) diluída em meio B199 (suplementado com 0,2 mM de piruvato –

Sigma, P5280) na concentração apropriada do experimento (descrita

posteriormente). O cultivo foi feito em gotas de 100 µl de meio de bloqueio (±20

ovócitos por gota), sob óleo mineral (Sigma, M8410) a 38,5º C em atmosfera de 5%

de CO2 em ar.

4.4. Determinação do estádio da meiose

Para determinação do estádio da meiose, os ovócitos foram desnudados

(remoção das células do cumulus oophorus) em tubo de 5 mL com 0,3 mL de PBS

acrescida de 1% de SFB (soro fetal bovino) e agitados no “vortex” por 4 minutos

(Figura 9). Os ovócitos desnudos foram fixados entre lâmina e lamínula por 24 horas

em etanol (Synth, A1084.01.BJ) e ácido acético (Synth, A1019.01.BJ) 3:1. Após a

fixação, foram corados com lacmóide 0,004% (Aldrich, 274720) e observados em

microscópio de contraste de fase para determinação dos estádios da meiose. Os

ovócitos foram classificados de acordo com a configuração nuclear em vesícula

germinativa (VG), metáfase I (M I), anáfase I (A I), telófase I (T I) e metáfase II (M II)

23

(Figura 10). A taxa de bloqueio foi avaliada como a percentagem de ovócitos em VG

e a de reversão como a percentagem de ovócitos em M II.

Figura 9. Procedimentos para fixação e coloração de ovócitos.

3) Pressionar a lamínula sobre a lâmina suavemente até fazer uma pressão nos ovócitos – pouca pressão os ovócitos ficam soltos entre a lâmina/lamínula; o inverso os ovócitos rompem. 4) Colocar a lâmina no fixador 3:1 (álcool etílico e ácido acético). 5) Deixar fixando por no mínimo 24 h.

6) coloração com lacmóide ou orceina acética

a) Colocar a lâmina em um ângulo de 45°, adicionar o corante na parte superior da lâmina; b) Corar por ±5 minutos; c) se for necessário remover o excesso de corante com o próprio fixador; d) Não deixar secar a lâmina – vedar com esmalte. (corante: 40 mL ácido acético, 60 mL água + 0,004% do corante – aquecer para dissolver melhor e filtrar)

2) Preparação das lâminas para fixação dos ovócitos

Lâmina: Fazer uma gota de ±4μL

com ± 25 ovócitos.

Lamínula: Colocar pequenas gotas

de cola (silicone) nas bordas.

1) Procedimento para desnudar os ovócitos

Em um tubo de 5 mL adicionar 0,3 mL de PBS e os ovócitos. Agitar no vortex (velocidade 6-7) por 4 minutos; lavar a parede do tubo com 2 mL de meio; transferir o conteúdo para uma placa de Petri para seleção dos ovócitos.

P B S

A B C D

400X 400X 200X 200X

Figura 10. Classificação da meiose de ovócitos bovinos. A) vesícula germinativa; B) metáfase I; C) anáfase I/telófase I; D) metáfase II. Seta vermelha: placa metafásica e seta azul: 1° corpúsculo polar.

4.5. Maturação in vitro

Após o período de bloqueio, os ovócitos foram lavados três vezes em meio

livre de inibidor e transferidos para o meio de maturação [B199 suplementado com

10% de SFB (soro fetal bovino), 5,0 µg/mL de LH (hormônio luteinizante, Bioniche –

Lutropin-v), 0,5 µg/mL de FSH (hormônio folículo estimulante, Bioniche – Folltropin-

v), 0,2 mM de piruvato e 10 μg/mL de gentamicina]. Como controle, um grupo de

ovócitos foi submetido à maturação sem sofrer cultivo prévio de bloqueio. O cultivo

24

de maturação in vitro (MIV) foi feito em gotas de 100 µl de meio de maturação (±20

ovócitos por gota), sob óleo mineral a 38,5 º C e atmosfera de 5% de CO2 em ar.

4.6. Microtúbulos

Para avaliação dos microtúbulos os ovócitos foram desnudados e fixados em

3,7% de paraformaldeído (Sigma, P6148) acrescido de 0,6% Triton X-100 (USB,

9002-93-1) em PBS (livre de cálcio e magnésio) com 0,1% de PVA (álcool polivinílico

- Sigma, P8136) por 30 minutos; lavados três vezes em PBS com 0,1% de PVA

(PP); bloqueados com 3% de soro de cabra (Invitrogen, 16210-064) em PP por 45

minutos; corados com anticorpo anti-alfa tubulina conjugada com FITC (Sigma,

F23168) (1:100) em PP por uma hora; lavados por três vezes em PP; corados com

10 μg/mL de iodeto de propídio (Sigma, P4170) em PP por 15 minutos; lavados três

vezes em PP e montados entre lâmina e lamínula com glicerol (USB, 56-81-5) para a

avaliação sob microscópio de epifluorescência.

4.7. Microfilamentos Para avaliação dos microfilamentos os ovócitos foram desnudados e fixados

em 3,7% de paraformaldeído mais 0,6% Triton X-100 em PP por 30 minutos; lavados

três vezes em PP; colorados com 1 μg/mL de faloidina conjugada com FITC (P5282)

mais 10 μg/mL de iodeto de propídio em PP por 30 minutos; lavados três vezes em

PP e montados entre lâmina e lamínula com glicerol para a avaliação sob

microscópio de epifluorescência.

25

4.8. Grânulos corticais

Para avaliação dos grânulos corticais os ovócitos foram desnudados e a zona

pelúcida foi removida com 0,5% protease (Sigma, P8811) em PBS (livre de cálcio e

magnésio) por ±6 minutos a 38,5 °C; fixados em 3,7% de paraformaldeído em PP

por 30 minutos; incubados em solução de bloqueio [SB: PBS suplementado com

0,1% de BSA, 0,751% de glicina (Sigma, G8790) e 0,2% de azida sódica (Research

Organics, 0939S)] por duas horas; permeabilizados com 0,1% Triton X-100 em SB

por 5 minutos; lavados três vezes em SB; corados com 1 μg/mL de lectina – Lens

culinaris (Sigma, L9262) e 10 μg/mL de iodeto de propídio em SB por 15 minutos;

lavados três vezes em SB e montados entre lâmina e lamínula com glicerol para a

avaliação sob microscópio de epifluorescência.

4.9. Mitocôndrias

Para avaliação das mitocôndrias os ovócitos foram desnudados; corados com

0,5 µM de Mitotracker red (Molecular probes) e 10 µg/mL Hoechst 33342 (Sigma,

B2261) em PP por 20 minutos; lavados três vezes em PP e montados entre lâmina e

lamínula para a avaliação sob microscópio de epifluorescência.

4.10. Fecundação e cultivo in vitro

Para a fecundação in vitro (FIV) foi utilizado sêmen congelado de um mesmo

touro e da mesma partida, o qual foi preparado segundo a técnica de gradiente

Percoll (Amersham Biosciences, 17-0891-01). Em um tubo cônico de 15 mL (Tedia

Brazil, 1475-1611.50), foi adicionado 1 mL de Percoll 90% e, em seguida, 1 mL de

Percoll 45% (Apêndice). O gradiente foi mantido na estufa de CO2 por uma hora

antes de sua utilização. O sêmen foi descongelado a uma temperatura de 37° C por

30 segundos e, em seguida, adicionado na porção superior do gradiente de Percoll e

26

centrifugado por 10-12 minutos a 650 “g”. Após a retirada do sobrenadante foram

adicionados 4 mL de meio TALP-sp (Apêndice), e uma nova centrifugação de 2

minutos a 200 “g” foi realizada para remover o excedente do Percoll.

Os espermatozóides foram adicionados na gota de fecundação a uma

concentração final de 2 x 106 espermatozóides/mL. A fecundação foi feita em TALP–

FIV (Apêndice) suplementado com 2 µM penicilamina (Sigma, P4875), 1 µM

hipotaurina (Sigma, H1384), 250 µM epinefrina (Sigma, E1635) e 20 µg/mL heparina

(181 UI/mg, USB, 9041-08-1). Os espermatozóides e os ovócitos foram co-

incubados em gotas de 100 µL de meio sob óleo mineral em placa de Petri (35 x 10

mm. Corning, 430165) por um período de 18 horas.

Após as 18 horas de FIV, os ovócitos foram parcialmente desnudados com

auxílio de um micro-pipetador de 50 µL. Após o desnudamento parcial, os ovócitos

foram transferidos para o meio de cultivo in vitro SOF (fluido de oviduto sintético -

Apêndice) em gotas de 100 µL e com 48 horas de cultivo in vitro (D2), foi avaliada a

taxa de clivagem. Os ovócitos clivados permaneceram no meio de cultivo in vitro e

os demais foram removidos e descartados. No quinto dia (D5) de cultivo in vitro foi

feita a troca (feeding) parcial (40%) do meio de cultivo e a partir do sétimo (D7) e do

oitavo dia (D8) foi feita a avaliação das taxas de formação de blastocisto (D7), de

eclosão (D8) e a contagem do número de células dos embriões eclodidos (D8). O

cultivo in vitro dos embriões foi feito em estufa de CO2 a 38,5ºC em atmosfera de 5%

de CO2 em ar.

Para a contagem do número de células dos embriões em estádio de

blastocisto eclodido, eles foram corados com 10 µg/mL de Hoechst 33342 em PP

por 15 minutos; lavados três vezes em PP e montados entre lâmina e lamínula para

a avaliação sob microscópio de epifluorescência.

27

4.11. Delineamento experimental

4.11.1. Experimento 1: Avaliação de concentrações decrescentes de BL I em meio suplementado com BSA.

Nesse experimento foram avaliadas concentrações decrescentes de BL I

(100, 50 e 25 μM) em meio de cultivo (B-199) suplementado com albumina sérica

bovina (BSA, Sigma, A9647) (Figura 11), para avaliar a capacidade da BL I em

promover o bloqueio meiótico em diferentes concentrações. Os ovócitos foram

cultivados na presença ou ausência (controle) de BL I por um período de 24 h. Após

o período de cultivo in vitro, os ovócitos foram desnudados, fixados, corados e

avaliados sob microscópio de contraste de fase para determinação das taxas de

bloqueio da meiose (VG). Um grupo de ovócitos foi fixado logo após a aspiração

(controle zero hora).

Figura 11. Esquema representativo do delineamento do experimento 1.

25 μM de BL I

50 μM de BL I

100 μM de BL I

fixados

Controle C/0

24 h de cultivo com BSA

desnudados

corados

avaliados

Controle C/24

Avaliado logo após a aspiração

4.11.2. Experimento 2: Avaliação de concentrações crescentes de BL I em meio sem suplementação de BSA

Nessa avaliação, não foi usada suplementação protéica (BSA) no meio de

bloqueio (Figura 12). O bloqueio da meiose foi feito em meio B199 com diferentes

concentrações de BL I (10, 15, 20 e 25 μM) com o intuito de investigar a capacidade

do inibidor em bloquear a meiose em concentrações ainda mais baixas, porque

segundo KUBELKA et al., (2000) o inibidor (BL I) poderia interagir com o BSA,

reduzindo sua disponibilidade no meio. Com base nesse estudo os ovócitos bovinos

28

foram cultivados na presença ou ausência (controle) do inibidor sem suplementação

de BSA por um período de 24 horas. Após o cultivo, os ovócitos foram desnudados,

fixados, corados e avaliados sob microscópio de contraste de fase para

determinação das taxas de bloqueio da meiose (percentagem de VG).


10 μM de BL I

15 μM de BL I

20 μM de BL I

25 μM de BL I

Avaliados

Controle C/24

24 h de cultivo sem adição de BSA

4.11.3. Experimento 3: Efeito do bloqueio da meiose na maturação nuclear

Para a avaliação da maturação pós-bloqueio da meiose, ovócitos bovinos

foram cultivados na presença (10 μM em meio sem BSA e 100μM em meio com

BSA) de BL I por 24 h, conforme definido nos experimentos 1 e 2. Como controle,

um grupo submetido apenas à maturação in vitro. Após o período de bloqueio,

ambos os grupos foram maturados in vitro por mais 24 h (Figura 13). A seguir, foram

desnudados, fixados, corados e avaliados sob microscópio de contraste de fase para

determinação das taxas de maturação (percentagem de metáfase II).


10 μM de BL I

100 μM de BL I

Avaliados

24 h de bloqueio

24 h de MIV

24 h de MIV

24 h de MIV

Controle

29

4.11.4. Experimento 4: Cinética da maturação nuclear pós-bloqueio da meiose

Nesse experimento, os ovócitos foram bloqueados por um período de 12

horas na presença (100 μM de BL I) ou na ausência (10 μM de BL I) de BSA e

avaliados ao longo da MIV, nos horários de 6, 12 e 18 horas de maturação (Figura

14). Os períodos de bloqueio da meiose e da maturação (reversão) foram baseados

no estudo feito por ADONA e LEAL (2006). Após cada período de maturação (6, 12

e 18 horas), os ovócitos foram desnudados, fixados, corados e avaliados sob

microscópio de contraste de fase para determinação do estádio de maturação

nuclear. Um grupo de ovócitos submetido somente à MIV também foi avaliado nos

mesmos períodos dos tratados com BL I.

Horários das avaliações Figura 14. Esquema representativo do delineamento do experimento 4.

12 horas de bloqueio

10 μM de BL I

100 μM de BL I

12 h de MIV

18 h de MIV

MIV

Controle

Avaliações

CCiinnééttiiccaa ddaa mmaattuurraaççããoo ppóóss--bbllooqquueeiioo ddaa mmeeiioossee

6 h de MIV

4.11.5. Experimento 5: Efeito do bloqueio da meiose na organização dos microtúbulos e dos microfilamentos

Nesse experimento foram avaliados os efeitos do bloqueio meiótico em

condições de baixa e alta concentração de BL I (definidos nos experimentos 1 e 2)

na organização dos microtúbulos e dos microfilamentos. Os ovócitos foram

bloqueados por 24 horas e posteriormente cultivados em meio de maturação.

Ovócitos foram coletados às 0, 6, 12, 18 e 24 horas de pós-bloqueio para a

avaliação da organização dos microtúbulos, microfilamentos. A progressão meiótica

foi avaliada concomitantemente (Figura 15). O controle foi avaliado nos mesmos

30

horários ao longo da MIV sem ter sofrido inibição prévia. Um grupo de ovócitos foi

avaliado logo após a aspiração (controle 0h) e um outro no final das 24 horas de

bloqueio (antes do início da MIV – controle 24h).



10 μM de BL I

100 μM de BL I

6 h de MIV

12 h de MIV

18 h de MIV

MIV

Controle

Avaliações

Horários das avaliações

0 h de MIV

24 h de MIV

Avaliação dos microtúbulos e dos microfilamentos

4.11.6. Experimentos 6: Efeito do bloqueio da meiose na distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias.

Nesse experimento foi avaliado o efeito da BL I na distribuição dos grânulos

corticais e das mitocôndrias nos ovócitos tratados com duas concentrações de BL I,

uma na ausência (10 μM) e outra na presença (100 μM) de BSA. Os ovócitos foram

bloqueados por 24 horas e após esse período de bloqueio foram divididos em dois

grupos, uns para avaliação imediata (24 horas de bloqueio) e os demais cultivados

em meio de maturação e coletados somente depois de 24 horas de MIV (Figura 16),

para a avaliação do efeito na distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias

nos ovócitos tratados com o inibidor do ciclo celular. No grupo controle, a avaliação

foi feita em dois momentos, um logo após a aspiração (zero hora) e uma outra no

final da maturação (24 horas de MIV).

31



Controle

10 μM de BL I

100 μM de BL I

Avaliados

Bloqueados

Imaturos

Maturados

Avaliados

Maturados

Avaliação dos grânulos corticais e das mitocôndrias

4.11.7. Experimento 7: Efeito da BL I no desenvolvimento embrionário in vitro

Nesse experimento foi avaliado o efeito de BL I sobre os ovócitos que foram

expostos (tratados) ou não (controle) a duas concentrações do inibidor, uma na

ausência (10 μM de BL I) e outra na presença de BSA (100 μM de BL I). Após o

período de bloqueio (24 horas) e de maturação in vitro (MIV, 21 horas), os ovócitos

foram submetidos à fecundação in vitro (FIV, 18 horas) seguida pelo cultivo in vitro

(CIV, 8 dia) (Figura 17). Com 48 horas de CIV (D2), foram avaliados quanto às taxas

de clivagem. As taxas de desenvolvimento dos embriões em estádio de blastocistos

foram determinadas no dia 7 (D7) da CIV. No dia 8 (D8) da CIV foram determinadas

as taxas de eclosão e o número total de células dos blastocistos eclodidos.


Eclosão

Nº de células

Clivagem Blastocistos

Controle/MIV FIV CIV

24 horas 21 horas 18 horas D2 D7 D8

MIV CIVFIV10 μM de BLI

MIV FIV CIV100 μM de BLI

32

4.12. Análise estatística

Os dados foram avaliados utilizando metodologia de quadrados mínimos, por

meio do procedimento PROC GLM do programa Statistical Analysis System, versão

9.1.3 (SAS, 1995). As variáveis foram transformadas, de acordo a função arco seno

(raiz - percentagens), de acordo com as recomendações de Banzatto e Kronca

(1989). Os dados dos números de células dos blastocistos não foram transformados,

sendo analisados em escala original. Para os resultados significativos nas análises

de variância foi utilizado o teste t de Student como procedimento de comparações

múltiplas entre os grupos. O nível de significância foi de 5% para evidenciar

diferenças entre os tratamentos.

33

5. RESULTADOS

5.1. Experimento 1

Nesse experimento foram avaliadas diferentes concentrações de butirolactona

I (BL I) em meio de cultivo B199 suplementado com albumina sérica bovina (BSA),

visando determinar a concentração mais adequada em estudos de bloqueio meiótico

em ovócitos bovinos.

A maioria dos ovócitos tratados nas concentrações de 100 (B100), 50 (B50) e

25 µM (B25) de BL I permaneceram bloqueados na meiose em estádio de vesícula

germinativa (VG), nas proporções de 97,4; 84,4 e 65,1%; respectivamente. No grupo

controle após 24 h de cultivo (C/24) não foram observados ovócitos em estádio de

VG (0%). Dos ovócitos avaliados logo após a aspiração folicular (controle zero hora

– C/0), 100% dos mesmos encontravam-se em estádio VG (Tabela 3). Os grupos

C/24 (0%), B100 (97,4%), B50 (84,4%) e B25 (65,1%) diferiram entre si (P < 0,05)

para o percentual de ovócitos em VG, com as taxas de bloqueio meiótico diminuindo

com a redução da concentração do inibidor. O grupo B100 (97,4%) e o C/0 (100%)

por outro lado, foram similares entre si (P > 0,05).

Foram observados ovócitos nas fases intermediárias da meiose (MAT,

metáfase I, anáfase I e telófase I), somente no grupo C/24, no demais tratamentos

os ovócitos estavam em VG ou MII (metáfase II). A taxa de ovócitos em MAT do

grupo C/24 (10,4%) diferiu (P < 0,05) dos demais tratamentos (0%).

Com relação aos percentuais de ovócitos que atingiram o estádio de MII, ou

seja, que concluíram a maturação in vitro (MIV), houve diferença (P < 0,05) nas

taxas de MII entre os ovócitos dos grupos C/24 (89,6%), B100 (2,6%), B50 (15,6%) e

34

B25 (34,9%) após 24 horas de cultivo, com a redução da taxa de MII com o aumento

da concentração de BL I. Não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos C/0 (0%) e

B100 (2,6%) para o percentual de ovócitos em estádio de MII.

Tabela 3. Estádios da meiose de ovócitos bovinos submetidos ao bloqueio meiótico com concentrações decrescentes de BL I (100, 50 e 25 µM) em meio de cultivo B199 suplementado com BSA.

Estádios da meiose

Tratamentos* Ovócitos VG1

Nº (%) MAT2

Nº (%) MII3

Nº (%) C/0 75 75 (100)a 0 (0,0)b 0 (0,0)d

C/24 77 0 (0,0)d 8 (10,4 ± 1,4)a 69 (89,6 ± 1,4)a

B100 78 76 (97,4 ± 3,9)a 0 (0,0)b 2 (2,6 ± 3,9)d

B50 77 65 (84,4 ± 1,8)b 0 (0,0)b 12 (15,6 ± 1,8)c

B25 83 54 (65,1 ± 4,0)c 0 (0,0)b 29 (34,9 ± 4,0)b

1Vesícula germinativa (VG); 2metáfase I, anáfase I e telófase I (MAT); 3metáfase II (MII); *controle 0 hora (C/0), ovócitos avaliados logo após a aspiração folicular; controle 24 horas (C/24), ovócitos cultivados por 24 horas em meio B199 suplementado com BSA; tratados (B25, B50 e B100), ovócitos cultivados por 24 horas com 25, 50 e 100 μM de BL I em meio B199 suplementado com BSA. Resultado de três réplicas. a-d Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média.

5.2. Experimento 2

No experimento anterior não foi possível reduzir a concentração de BL I sem

perder a eficiência do bloqueio. Então, procurou-se reduzir a concentração de BL I

em meio de cultivo sem suplementação de BSA, verificando se o bloqueio nessa

condição de cultivo seria eficiente na manutenção da meiose bloqueada. Após 24

horas de bloqueio (sem adição de BSA) a maioria dos ovócitos tratados nas

concentrações de 10 (B10), 15 (B15), 20 (B20) e 25 µM (B25) de BL I

permaneceram em estádio de VG. Houve diferença (P < 0,05) do grupo C/24

(13,7%) em relação aos tratados com B10 (94,9%), B15 (97,2%), B20 (98,7%) e B25

(98,7%) para o percentual de ovócitos em estádio de VG (Tabela 4), os quais não

diferiram entre si (P > 0,05). Após 24 horas de cultivo foram observados ovócitos nos

estádios de MAT, somente no grupo C/24 (11,0%, P 0 < 0,05).

35

Os percentuais de ovócitos que atingiram o estádio de MII após 24 horas de

cultivo diferiram (P < 0,05) entre o grupo C/24 (75,3%) e os grupos B10 (5,1%), B15

(2,8%), B20 (1,3%) e B25 (1,3%), que não diferiram entre si (P > 0,05).

Pode-se observar que na ausência de BSA, concentrações mais baixas de BL

I (entre 10 e 25 µM) são igualmente eficientes no bloqueio da meiose de ovócitos

bovinos cultivados in vitro.

Tabela 4. Estádios da meiose de ovócitos bovinos submetidos ao bloqueio meiótico com diferentes concentrações de BL I (10, 15, 20 e 25 µM) em meio de cultivo B199 sem suplementação de BSA.

Estádios da meiose


Nº (%) MAT2

Nº (%) MII3

Nº (%) C/24 73 10 (13,7 ± 2,4)b 8 (11,0 ± 3,5)a 55 (75,3 ± 1,1)a

B10 78 74 (94,9 ± 2,6)a 0 (0,0)b 4 (5,1 ± 2,6)b

B15 72 70 (97,2 ± 2,3)a 0 (0,0)b 2 (2,8 ± 2,3)b

B20 76 75 (98,7 ± 2,2)a 0 (0,0)b 1 (1,3 ± 2,2)b

B25 76 75 (98,7 ± 2,4)a 0 (0,0)b 1 (1,3 ± 2,4)b

1Vesícula germinativa (VG); 2metáfase I, anáfase I e telófase I (MAT); 3metáfase II (MII); *controle 24 h (C/24), ovócitos cultivados por 24 h em meio B199 sem suplementação de BSA; tratados (B10, B15, B20 e B25), ovócitos cultivados por 24 h com 10, 15, 20 e 25 μM de BL I em meio B199 sem suplementação de BSA. Resultado de três réplicas. a-b Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média.

5.3. Experimento 3

Como foi possível bloquear a meiose dos ovócitos bovinos com eficiência, em

meio de bloqueio na presença e na ausência de BSA, fez-se necessário averiguar se

a reversibilidade da meiose nos ovócitos (maturação) seria afetada pelo bloqueio

meiótico nas duas condições de cultivo.

Os ovócitos foram bloqueados por 24 h nas concentrações de 10 µM (B10) e

100 µM BL I (B100) em meio de cultivo suplementado (B100) ou não (B10) com BSA

e maturados em meio de MIV por igual período. Um pequeno percentual dos

ovócitos permaneceu nos estádios de VG (3,3; 0,0 e 1,1%) e de MAT (5,6; 8,5 e

6,5%) após 24 h de MIV (P > 0,05) nos grupos C/24, B10 e B100, respectivamente.

O percentual de maturação nuclear (taxa de metáfase II) foi de 91,0; 91,4 e 92,3%

36

para os grupos C/24, B10 e B100, respectivamente. As taxas de VG, MAT e MII não

diferiram (P > 0,05) entre os tratamentos após 24 h de MIV (Tabela 5).

O uso de BL I em baixa concentração (10 µM) na ausência de BSA não reduz

a taxa de MIV (MII) pós-bloqueio da meiose, indicando ser tão eficaz quanto a

concentração usual de 100 µM em meio suplementado com BSA, ao menos no que

se refere a esse parâmetro.

Tabela 5. Estádios da meiose de ovócitos bovinos submetidos ao bloqueio meiótico nas concentrações de 10 e 100 µM de BL I em meio de cultivo B199 suplementado ou não com BSA.

Estádios da meiose


Nº (%) MAT2

Nº (%) MII3

Nº (%) C/24 90 3 (3,3 ± 0,4) 5 (5,6 ± 2,3) 82 (91,1 ± 2,6)

B10 94 0 (0,0) 8 (8,5 ± 2,1) 86 (91,5 ± 2,1)

B100 92 1 (1,1 ± 1,9) 6 (6,5 ± 3,1) 85 (92,4 ± 1,8)

1Vesícula germinativa (VG); 2metáfase I, anáfase I e telófase I (MAT); 3metáfase II (MII); *controle 24 horas (C/24), ovócitos cultivados por 24 horas em meio de maturação in vitro; tratados (B10 e B100), ovócitos cultivados por 24 h com 10 e 100 μM de BL I em meio B199 suplementado (B100) ou não (B10) com BSA seguidos de MIV por 24 h. Resultado de três réplicas. Não houve diferença entre tratamentos (P > 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média.

5.4. Experimento 4

Uma vez determinados nos experimentos anteriores que o bloqueio meiótico

com BL I na presença e na ausência de BSA e a reversibilidade dos mesmos foi

eficiente, fez-se necessário fazer um acompanhamento mais detalhado da

maturação nuclear para averiguar um possível efeito do bloqueio sobre a progressão

meiótica (cinética) durante a maturação in vitro.

Os ovócitos foram bloqueados por 12 h com B10 e B100 e transferidos para o

meio de MIV e avaliados em diferentes horários (6, 12 e 18 h) de MIV. O grupo

controle foi avaliado nos mesmos horários sem ser submetido ao bloqueio com BL I.

As taxas de VG observadas com 6 h de MIV pós-bloqueio (Tabela 6) nos

grupos controle (97,3%) e tratados com B10 (71,4%) e B100 (74,3%) apresentaram

diferença (P < 0,05) entre o controle e os tratados. O percentual de MAT às 6 h de

MIV também apresentou diferença (P < 0,05) somente entre o controle (2,7%) e os

37

tratados com B10 (28,6%) e B100 (25,7%). Essa observação sugere uma aceleração

nas primeiras 6 h de maturação, independente da concentração de BL I.

Com 12 h de MIV as taxas de VG do grupo controle (11,7%) e do B10 (7,0%)

não diferiram (P > 0,05), mas ambos diferiram (P < 0,05) do grupo B100 (3,7%).

Nesse mesmo horário (12 h), a maioria dos ovócitos encontravam-se em estádios de

MAT. Não houve diferença (P > 0,05) quanto às taxas de MAT entre o grupo controle

(77,9%) e o grupo B10 (83,1%), mas houve diferença (P < 0,05) com o B100

(86,4%). Já os grupos B10 (83,1%) e B100 (86,4%) não diferiram (P > 0,05) entre si.

Nesse horário uma pequena parcela dos ovócitos (±10%) já estava em MII em todos

os grupos (P > 0,05).

Com 18 h de maturação, os percentuais de ovócitos em estádios de VG (2,7;

2,6 e 1,1%) e MAT (25,3; 23,7 e 20,0%) não apresentaram diferença (P > 0,05) entre

os grupos controle, B10 e B100, respectivamente. As taxas de ovócitos em estádio

de MII também não diferiram (P > 0,05) entre os grupos controle (72,0%), B10

(73,7%) e B100 (78,9%). Após 18 h de maturação, o efeito da aceleração da meiose

induzida pela BL I não foi mais observado, sugerindo que tal aceleração em ovócitos

bovinos tratados com BL I só ocorre aparentemente no início da meiose (retomada).

Tabela 6. Estádios da meiose após 6, 12 e 18 horas de maturação em ovócitos

submetidos a 12 horas de bloqueio da meiose com 10 e 100 µM de BL.

Estádios da meiose

Tratamentos* MIV4 Ovócitos VG1

Nº (%) MAT2

Nº (%) MII3

Nº (%) Controle 73 71 (97,3 ± 3,3)a 2 (2,7 ± 3,3)b 0 (0,0)

B10 70 50 (71,4 ± 3,7)b 20 (28,6 ± 3,7)a 0 (0,0)

B100

6 h

74 55 (74,3 ± 7,6)b 19 (25,7 ± 7,6)a 0 (0,0)

Controle 77 9 (11,7 ± 1,5)a 60 (77,9 ± 5,1)b 8 (10,4 ± 3,7)

B10 71 5 (7,0 ± 3,1)a 59 (83,1 ± 8,4)ab 7 (9,9 ± 5,5)

B100

12 h

81 3 (3,7 ± 4,4)b 70 (86,4 ± 3,9)a 8 (9,9 ± 3,8)

Controle 75 2 (2,7 ± 2,8) 19 (25,3 ± 5,0) 54 (72,0 ± 5,5)

B10 76 2 (2,6 ± 2,8) 18 (23,7 ± 4,4) 56 (73,7 ± 4,8)

B100

18 h

95 1 (1,1 ± 2,1) 19 (20,0 ± 1,9) 75 (78,9 ± 1,1)

1Vesícula germinativa (VG); 2metáfase I, anáfase I e telófase I (MAT); 3metáfase II (MII); 4tempo (h) em que os ovócitos foram maturados (MIV); *controle, ovócitos maturados; tratados, ovócitos bloqueados com 10 e 100 μM de BL I em meio suplementado (B100) ou não (B10) com BSA e maturados. Resultado de 4 réplicas. a-b Letras diferentes na mesma coluna e no mesmo horário de MIV indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média.

38

5.5. Experimento 5

Nesse experimento foram avaliadas a configuração da maturação nuclear,

organização dos microtúbulos e a disposição dos microfilamentos nos ovócitos

submetidos ao bloqueio meiótico com B10 e B100. Os ovócitos foram bloqueados

por 24 horas, transferidos para o meio de maturação (MIV) e avaliados em diferentes

horários de MIV (0, 6, 12, 18 e 24 horas). O grupo controle foi avaliado nos mesmos

horários sem ser submetido a uma pré-maturação com BL I.

Os resultados da configuração da maturação nuclear não serão descritos aqui

por que seguiram o mesmo padrão observado na cinética da maturação nuclear pós-

bloqueio. As observações feitas sugerem uma aceleração no início da retomada da

meiose nos ovócitos tratados com BL I, mas no decorrer da MIV essa aceleração

não foi mais evidenciada, confirmando os resultados do experimento 4.

A marcação positiva dos microtúbulos foi observada por todo o citoplasma

dos ovócitos em todos os grupos e horários. Uma marcação mais intensa dos

microtúbulos foi observada em MAT e MII junto aos cromossomos (fuso meiótico)

nos ovócitos que haviam iniciado o rompimento da VG (Figura 18). Esse mesmo

padrão foi observado em todos os tratamentos (controle, B10 e B100) e horários (6,

12, 18 e 24 h). Não foram observadas alterações no fuso meiótico quanto à

organização e formação da placa metafásica nos diferentes grupos de ovócitos e

horários dos tratamentos. Dos 653 ovócitos avaliados nesse experimento apenas um

ovócito tratado com B100 após 24 horas de maturação pós-bloqueio apresentou

alteração na placa metafásica, o que é importante para demonstrar a segurança e a

efetividade da droga.

Com relação aos microfilamentos, observou-se uma marcação por todo o

citoplasma dos ovócitos em todos os grupos e horários (Figura 19). Uma marcação

mais intensa dos microfilamentos foi observada na região onde o corpúsculo polar foi

liberado e no córtex celular, nos horários de 18 e 24 horas maturação, para todos os

grupos (controle, B10 e B100). Não foi observada nenhuma diferença ou alteração

no arranjo dos microfilamentos no citoplasma dos ovócitos avaliados nos diferentes

grupos e horários de maturação, indicando a segurança na utilização dessa droga.

39

A B

400X

400X 400X

200X

400X

400X

200X

C

D F

G

400X

E

H

Figura 18. Dinâmica dos microtúbulos em ovócitos bovinos: Corado em vermelho a cromatina e em verde os microtúbulos. Ovócitos em estádio de VG (A), MI (B), AI (C e D), TI (E), MII (F), fuso meiótico alterado (G) e imagem mostrando somente a marcação dos microtúbulos (H).

A

100X

400X

C

B D

100X

400X

Figura 19. Disposição dos microfilamentos em ovócitos bovinos: Corado em vermelho a cromatina e em verde os microfilamentos. Imagem geral do ovócito com marcação dos microfilamentos (A), ovócitos em estádio de VG (B), TI (C) e MII (D).

40

5.6. Experimento 6

A configuração da maturação nuclear, migração dos grânulos corticais e

mitocôndrias foram avaliadas nos ovócitos submetidos ao bloqueio da meiose com

BL I e nos ovócitos maturados pós-bloqueio da meiose. Os ovócitos do grupo

controle (não bloqueados) foram avaliados logo após a aspiração folicular e após a

MIV.

As taxas de ovócitos em estádio de VG para os grupos C/0, B10 e B100

foram de ~98,4%. Os percentuais de ovócitos em estádio de VG não diferiram (P >

0,05) entre os grupos de ovócitos avaliados. Após 24 h de MIV ~96,6% (P > 0,05)

ovócitos encontravam-se no estádio de MII para os grupos C/24, B10 e B100.

Em 100% dos ovócitos imaturos (não maturados) independente dos grupos

(C/0, B10 e B100, P > 0,05), os clusters de grânulos corticais apresentavam-se

dispersos pelo citoplasma dos ovócitos (distribuição geral). Mas, após 24 horas de

maturação, também independente dos grupos, 98% (P > 0,05) dos ovócitos

apresentavam migração dos grânulos corticais para a região periférica do citoplasma

(distribuição periférica) (Tabela 7, Figura 20).

As mitocôndrias encontravam-se em sua maioria na região periférica do

citoplasma nos ovócitos imaturos. No entanto, nos grupos tratados a proporção (81,5

e 86,9%, P > 0,05) de ovócitos com mitocôndrias localizadas na região mais

periférica do citoplasma foi inferior (P < 0,05) ao controle (100%). Após 24 horas de

maturação, as mitocôndrias migraram por todo o citoplasma do ovócito. No grupo

C/24 (81,5%) a migração das mitocôndrias foi inferior (P < 0,05) aos grupos B10M

(95,2) e B100M (98,2%) que não diferiram (P > 0,05) entre si (Tabela 8, Figura 21).

De acordo com os resultados, sugere-se que embora o ciclo celular meiótico

estivesse bloqueado com BL I, o que também bloqueou a migração dos grânulos

corticais, a migração das mitocôndrias não foi totalmente bloqueada. No entanto, o

bloqueio não interfere na migração posterior dos grânulos corticais e das

mitocôndrias quando os ovócitos são submetidos à maturação in vitro.

41

Tabela 7. Distribuição dos grânulos corticais dos ovócitos imaturos e maturados in vitro tratados ou não com 10 e 100 µM de BL I.

Distribuição dos grânulos corticais

Tratamentos* MIV** Ovócitos Geral1

Nº (%) Periférica2

Nº (%) Ovócitos imaturos

C/0 56 56 (100) 0 (0,0)

B10 59 59 (100) 0 (0,0)

B100

0 h

59 59 (100) 0 (0,0)

Ovócitos maturados

C/24 59 1 (1,7 ± 4,5) 58 (98,3 ± 4,5)

B10M 57 1 (1,8 ± 3,8) 56 (98,2 ± 3,8)

B100M

24 h

57 1 (1,8 ± 3,5) 56 (98,2 ± 3,5)

1Geral, distribuição dos clusters de grânulos corticais por todo o citoplasma do ovócito; 2periférica, distribuição dos grânulos corticais mais na região do córtex citoplasmático do ovócito; *controle (C/0), ovócitos avaliados logo após aspiração folicular; tratados (B10 e B100), ovócitos submetidos ao bloqueio da meiose por 24 h com 10 e 100 μM de BL I em meio suplementado (B100) ou não (B10) com BSA; controle (C/24), ovócitos submetidos à maturação in vitro; tratados (B10M e B100M), ovócitos bloqueados por 24 h com 10 e 100 μM de BL I e em seguida submetidos a maturação in vitro; **maturação in vitro (MIV). Resultados de quatro réplicas. Letras diferentes na mesma coluna dos ovócitos imaturos ou dos maturados indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média.

200X400X

A B Figura 20. Distribuição dos grânulos corticais em ovócitos bovinos imaturos e maturados in

vitro. Distribuição geral dos clusters de grânulos corticais em ovócito em estádio VG (A) e distribuição periférica dos grânulos corticais em ovócito em estádio MII (B).

42

Tabela 8. Distribuição das mitocôndrias dos ovócitos imaturos e maturados in vitro tratados ou não com 10 e 100 µM de BL I.

Distribuição das mitocôndrias

Tratamentos* MIV** Ovócitos Periférica1

Nº (%) Geral2

Nº (%) Ovócitos imaturos

C/0 63 63 (100)b 0 (0,0)b

B10 65 53 (81,5 ± 11,1)a 12 (18,5 ± 11,1)a

B100

0 h

61 53 (86,9 ± 12,7)a 8 (13,1 ± 12,7)a

Ovócitos maturados

C/24 59 10 (16,9 ± 5,7)a 49 (83,1 ± 5,7)b

B10M 62 3 (4,8 ± 5,3)b 59 (95,2 ± 5,3)a

B100M

24 h

57 1 (1,8 ± 3,3)b 56 (98,2 ± 3,3)a

1Periférica, distribuição das mitocôndrias na região mais periférica do citoplasma do ovócito; 1Geral, distribuição das mitocôndrias por todo o citoplasma do ovócito; *controle (C/0), ovócitos avaliados logo após aspiração folicular; tratados (B10 e B100), ovócitos submetido ao bloqueio da meiose por 24 h com 10 e 100 μM de BL I em meio suplementado (B100) ou não (B10) com BSA; controle (C/24), ovócitos submetidos à maturação in vitro; tratados (B10M e B100M), ovócitos bloqueados por 24 h com 10 e 100 μM de BL I e em seguida submetidos à maturação in vitro; **maturação in vitro (MIV). Resultados de quatro réplicas. Letras diferentes na mesma coluna dos ovócitos imaturos ou dos maturados indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da média.

200X

C

100X

A

200X

B

Figura 21. Distribuição das mitocôndrias em ovócitos bovinos imaturos e maturados in vitro (MIV). Corados em azul a cromatina (setas) e em vermelho as mitocôndrias. Distribuição periférica das mitocôndrias nos ovócitos em estádio VG (A e B) e distribuição geral das mitocôndrias no ovócito em estádio MII (C).

43

5.7. Experimento 7

Para a avaliação do desenvolvimento embrionário, os ovócitos foram

submetidos à inibição com BL I, maturados, fecundados e cultivados in vitro. Os

resultados estão apresentados na Tabela 9.

As taxas de clivagem observadas foram de 85,8; 86,7 e 80,7% para os ovócitos

submetidos à fecundação in vitro nos grupos controle, B10 e B100, respectivamente,

não havendo diferença (P > 0,05) entre os tratamentos. Entretanto, o

desenvolvimento embrionário variou entre os grupos. Com relação à percentagem

de ovócitos que atingiram o estádio de blastocisto aos sete dias (D7) de cultivo, os

grupos controle (38,3%) e B10 (41,6%) não diferiram entre si (P > 0,05), mas ambos

diferiram (P < 0,05) do grupo B100 (33,0%). A percentagem de ovócitos que

chegaram até o estádio de blastocisto eclodido (Figura 22) foi similar (P > 0,05) entre

os grupos controle (19,2%), B10 (17,7%) e B100 (11,0%) aos oito dias (D8) de

cultivo. Também não foi observada variação significativa (P > 0,05) no número

médio de células dos blastocistos eclodidos aos oito dias (D8) de cultivo, entre os

grupos controle (138), B10 (136) e B100 (150).

A concentração de BL I mais elevada reduziu a produção de blastocistos aos 7

dias de CIV, embora a proporção de blastocistos eclodidos e o número de células

totais não tenham sido afetada pelos tratamentos ou pela concentração de BL I.

Tabela 11. Desenvolvimento embrionário de ovócitos bovinos fecundados in vitro após o bloqueio meiótico com 10 e 100 µM de BL I.

Desenvolvimento embrionário

Tratamet* Ovócitos Nº Clivados

Nº (%) Blastocistos D71

Nº (%) Eclodido D82

Nº (%) Nº de células (média ± dp)3

Controle 120 103 (85,8±6,1) 46 (38,3±3,2)a 23 (19,2±3,7) 138 ± 30

B10 113 98 (86,7±4,7) 47 (41,6±2,2)a 20 (17,7±1,9) 136 ± 21

B100 109 88 (80,7±2,0) 36 (33,0±3,5)b 12 (11,0±1,4) 150 ± 22

1Percentual de blastocistos em relação ao número de ovócitos aos 7 dias (D7) de cultivo in vitro; 2percentual embriões eclodidos em relação ao número de ovócitos aos 8 dias (D8) de cultivo; 3média do número de células dos blastocistos e seu respetivo desvio padrão aos 8 dias (D8) de cultivo; *Controle, ovócitos maturados in vitro sem serem submetidos ao bloqueio da meiose; tratados (B10 e B100), ovócitos bloqueados por 24 horas com 10 e 100 μM de BL I em meio suplementado (B100) ou não (B10) com BSA e em seguida submetidos a maturação in vitro. Resultados de quatro réplicas. a-b Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença entre tratamentos (P < 0,05) e o símbolo ± refere-se ao desvio padrão da médias.

44

Figura 22. Blastocisto eclodido em D8 corado com Hoechst para visualização dos núcleos para contagem de células.

100X

45

6. DISCUSSÃO

O bloqueio meiótico visa manter os ovócitos em estádio de vesícula

germinativa (VG) para que os mesmos tenham um tempo adicional para sofrerem

as modificações que ocorrem antes da maturação propriamente dita (HYTTEL et al.,

1997) e adquirir competência para o desenvolvimento (KUBELKA et al., 2000;

MERMILLOD et al., 2000).

Um dos tratamentos usualmente utilizados é o cultivo pré-maturação na

presença de inibidores de cinases dependentes de ciclinas (MERMILLOD et al.,

2000; PONDERATO et al., 2001; KUBELKA et al., 2002), o que, no entanto pode

causar danos ultra-estruturais (FAERGE et al., 2001; FAIR et al., 2002; LONERGAN

et al., 2003). Tal tratamento, embora não reduza (IMAI et al., 2002; BEKER-VAN

WOUDENBERG et al., 2005) e possa até aumentar o desenvolvimento a blastocisto

(HASHIMOTO et al., 2002; COY et al., 2005a), pode ter efeitos posteriores

desconhecidos.

O presente trabalho propôs reduzir a concentração de BL I usualmente

utilizada para indução de bloqueio meiótico (100 μM), no intuito de reduzir riscos de

alterações nos ovócitos e possivelmente aumentar o desenvolvimento embrionário.

No primeiro experimento foram avaliadas concentrações decrescentes de BL

I (100, 50 e 25 μM) e seu efeito na indução de bloqueio meiótico. Observou-se que

à medida que se reduzia a concentração do inibidor, reduzia-se também a eficiência

do bloqueio meiótico. KUBELKA et al. (2000) também observaram que a indução de

bloqueio meiótico com BL I é dependente de concentração do inibidor e que a

46

presença de BSA no meio faz com que a concentração necessária para induzir o

bloqueio seja maior do que aquela necessária com PVA. Os autores sugerem que a

BL I poderia se ligar ao BSA, reduzindo sua disponibilidade no meio.

Para poder reduzir a concentração de BL I, testou-se a utilização de meio

sem adição de BSA e concentrações ainda mais baixas de inibidor. Nesse

experimento, todas as concentrações foram igualmente eficientes em manter os

ovócitos em VG, demonstrando que de fato o BSA interfere na ação da droga. Na

sua ausência, uma concentração 10 vezes mais baixa (10 μM) pode ser usada para

manter um bloqueio meiótico eficaz, visto que 95% dos ovócitos permaneceram em

VG após 24h de cultivo. Esse valor é bastante próximo ao obtido com alta

concentração de BL I (100 μM) na presença de BSA (97%). WU et al. (2002)

utilizando ovócitos de suínos e uma concentração de 12,5 μM BL I, próxima da que

utilizamos, também obtiveram sucesso no bloqueio meiótico. PONDERATO et al.,

(2001) também conseguiram taxas similares de bloqueio usando uma mistura de BL

I e roscovitina (ROS) (12,5 e 6,25 μM, respectivamente) numa concentração total de

18,75 μM de inibidores no meio. Essa concentração, porém, é quase o dobro da

menor concentração utilizada no presente estudo.

Visto que as taxas de bloqueio de 100 μM BL em meio com BSA e 10 μM BL

I em meio sem BSA foram bastante próximas, fez-se necessário verificar se a MIV

subseqüente ao bloqueio também seria similar, uma vez que utilizando baixa

concentração de BL I, o cultivo era feito por 24 h sem adição de macromoléculas, o

que poderia prejudicar a maturação dos ovócitos. Nesse experimento, porém,

observou-se que as taxas de maturação nuclear (progressão à MII) foram similares

para os dois sistemas de bloqueio e também para os controles não bloqueados

antes da MIV (~90%). O uso da mistura de inibidores (BL I + ROS) em baixas

concentrações também não prejudicou a progressão meiótica (>90%) de ovócitos

bovinos (PONDERATO et al., 2001). Esses autores também excluíram o BSA do

meio de bloqueio. Em ovócitos de suínos, o uso de concentração similar (12,5 μM

em meio contendo PVA e EGF) também não afetou a taxa de MII (83,4%) (WU et

al., 2002). Embora não haja descrição do uso de concentração tão baixa de BL I em

ovócitos bovinos, os resultados mostram que esse tratamento pode ser utilizado

para bloquear eficientemente a meiose de forma totalmente reversível.

Alguns pesquisadores relatam que o uso de inibidores como a BL I e ROS

causam uma aceleração da progressão meiótica durante a MIV (LAGUTINA et al.,

47

2002; HASHIMOTO et al., 2002; ADONA e LEAL, 2004). No experimento seguinte

foi avaliada a cinética da maturação pós-bloqueio de ambos os sistemas de cultivo,

para averiguar se uma concentração mais baixa de BL I reduziria esse efeito.

Observou-se uma aceleração na retomada da meiose em ambos os tratamentos em

comparação com os controles não bloqueados, uma vez que às 6 h de MIV, a

proporção de ovócitos em VG (~70%) foi inferior ao controle (97%). Essa diferença,

dos ovócitos tratados estarem em estádios mais avançados da meiose, se manteve

às 12h, porém às 18h de MIV todos os ovócitos apresentaram taxas similares de

MII. Isso indica que a aceleração que ocorreu no reinício da meiose, já não foi mais

observada na segunda metade do período de maturação. PONDERATO et al.

(2001) observaram um padrão similar ao usar a mistura de inibidores em baixas

concentrações, onde houve uma aceleração inicial de ~ 4 h na quebra da VG, mas

às 18h, os ovócitos estavam em estádios similares da meiose. Em suínos, tal

fenômeno também foi observado (MARCHAL et al., 2001; WU et al., 2002).

Essa aceleração pode ser um padrão do tipo de droga e não um efeito da

concentração, pois é observado em diferentes espécies, diferentes inibidores de

CDK (BLI, ROS e a mistura de ambos) e concentrações diferentes como 10 e 100

μM.

Alguns estudos mostram que o bloqueio da meiose de ovócitos não inibe

completamente a síntese (MARCHAL et al., 2001) e fosforilação protéicas

(VIGNERON et al., 2004a) ou a transcrição (LEQUARRE et al., 2004). WU et al.

(2002) ainda observaram que a MAPK, embora inibida durante o bloqueio, é

rapidamente ativada após a remoção do inibidor. Isso indica que durante o bloqueio

pode haver acúmulo de fatores necessários à progressão meiótica.

O efeito dessa aceleração, porém, não parece ser deletério, pois as taxas de

desenvolvimento à blastocisto usando tais tratamentos não foram prejudicadas

(BEKER-VAN WOUDENBERG et al., 2005) e podem até melhorar o

desenvolvimento à blastocisto (COY et al., 2005a). Além disso, recentemente foi

relatado o nascimento de leitões produzidos in vitro a partir de ovócitos bloqueados

antes da MIV (COY et al., 2005b). O significado da aceleração da meiose ainda não

está bem esclarecido.

Nos experimentos seguintes buscou-se averiguar o efeito de tais tratamentos

sobre estruturas celulares que sofrem modificações durante o processo normal de

maturação e que são alguns dos indicativos de maturação citoplasmática. Sabe-se

48

que o citoesqueleto (microtúbulos e microfilamentos) (CONNORS et al., 1998; KIM

et al., 2000; SUN et al., 2001ac) e a disposição de organelas como grânulos

corticais (CONNORS et al., 1998; WESSEL et al., 2001; VELLILA et al., 2004) e

mitocôndrias estão relacionados à competência dos ovócitos (HYTTEL et al., 1997;

SUN et al., 2001b; WILDING et al., 2001).

Nesse estudo foi observada uma marcação positiva dos microtúbulos por

todo o citoplasma dos ovócitos controles e inibidos (10 ou 100 μM) ao longo de toda

a maturação in vitro pós-bloqueio. Uma marcação mais intensa dos microtúbulos foi

observada no período em que normalmente se inicia o rompimento do envelope

nuclear, permanecendo junto aos cromossomos no estádio de MII, organizando o

eixo meiótico independente dos tratamentos. Não foram observadas alterações no

fuso meiótico quanto à organização e formação da placa metafásica nos diferentes

grupos de ovócitos e horários dos tratamentos. Esses resultados são similares aos

observados por KIM et al. (2000) na avaliação dos microtúbulos em ovócitos

bovinos maturados in vitro, sugerindo que o inibidor não parece afetar a

organização dos microtúbulos.

WU et al. (2002), também não observaram alterações em ovócitos de suínos

expostos à baixa concentação de BL I. Por outro lado, JU et al. (2003), usando ROS

também em ovócitos suínos, observaram alterações no citoesqueleto, mas só em

concentrações mais altas, assim como ALBARRACÍN et al. (2005) em ovócitos de

bezerras. JU et al. (2003), porém, observaram alterações mais intensas na

cromatina. Nesse estudo houve apenas um ovócito com uma alteração do fuso,

envolvendo os microtúbulos e a cromatina no grupo tratado com 100 μM BL I, não

sendo, porém, significativo.

Essa diferença entre relatos pode se dever a diferentes condições de cultivo,

inibidores, animais, espécies ou ainda à forma de avaliação. Esses estudos foram

feitos por microscopia confocal, enquanto que o nosso foi feito por microscopia de

epifluorescência, que gera imagens menos nítidas que o confocal.

A marcação dos microfilamentos também foi observada por todo o citoplasma

dos ovócitos em todos os tratamentos e horários. Uma marcação mais intensa dos

microfilamentos foi observada no córtex e na região onde o corpúsculo polar foi

liberado, nos horários de 18 e 24 horas de maturação. Esses resultados são

similares aos encontrados por KIM et al. (2000) e WU et al. (2002) que observaram

os microfilamentos no córtex celular, em torno da VG e por todo o citoplasma do

49

ovócito. Não foi observada nenhuma diferença ou alteração no arranjo dos

microfilamentos no citoplasma dos ovócitos avaliados nos diferentes grupos e

horários de maturação, sendo esses resultados similares aos encontrados em

ovócitos de suínos tratados com BL I (WU et al., 2002).

Os dados dos microtúbulos e microfilamentos sugerem que o bloqueio

meiótico nas condições usadas nesse estudo não afetaram sua organização nos

ovócitos maturados in vitro pós-bloqueio da meiose, sendo um fato importante para

sua utilização, pois o arranjo dos microtúbulos e microfilamentos estão associados e

interagem com as mudanças cromossômicas durante a maturação do ovócito (KIM

et al., 2000; BRUNET e MARO, 2005). Com o ovócito bloqueado em estádio de VG

os cromossomos estão descondensados e o MPF está inativo (KUBELKA et al.,

2000). Nesse estádio celular, a dinâmica do citoesqueleto também permanece

inativa no que se refere aos eventos da divisão celular. Com a supressão do

bloqueio meiótico, porém, há o rompimento da VG, a condensação dos

cromossomos e a ativação do MPF (KUBELKA et al., 2000), eventos que promovem

a ativação do citoesqueleto (BRUNET e MARO, 2005). Os microtúbulos e os

microfilamentos não são requeridos para o rompimento da VG, mas, são importantes

na formação da placa metafásica e para a extrusão do corpúsculo polar (KIM et al.,

2000).

Os grânulos corticais nos ovócitos imaturos estão distribuídos por todo o

citoplasma celular e sua migração para a região periférica do ovócito (córtex) vai

ocorrendo com o avanço da maturação (CONNORS et al., 1998; WESSEL et al.,

2001; VELILLA et al., 2004). Nos ovócitos bloqueados com BL I por 24 horas,

independente dos tratamentos, não foi constatada migração dos grânulos corticais

para o córtex celular, mantendo a mesma distribuição de ovócitos imaturos. Esse

bloqueio da migração sugere que o MPF estaria envolvido, uma vez que, estando

inibida pela BL I, a migração dos grânulos corticais não ocorreu. WESSEL et al.

(2002) sugerem essa relação, uma vez, que utilizando ovócitos de ouriço-do-mar

bloqueados com ROS, também não houve migração de grânulos corticais.

A ausência de migração também pode estar relacionada a “inatividade” dos

microfilamentos que são responsáveis pela migração dos mesmos para região do

córtex celular (CONNORS et al., 1998; SUN et al., 2001a). Essa “inatividade” pode

estar associada ao bloqueio meiótico causada pelo MPF inativo, o qual não induz a

dinâmica do citoesqueleto (BRUNET e MARO, 2005), responsável pelo movimento

50

de organelas no interior do citoplasma celular (CONNORS et al., 1998; SUN et al.,

2001a; WESSEL et al., 2002).

Um estudo, porém, observou que a utilização de um enantiômero da ROS

bloqueia a meiose, mas não totalmente a migração de grânulos corticais, pois uma

parcela dos ovócitos tratados apresentou migração (COY et al., 2005a). Essa

contradição pode ser resultado de diferenças nas condições de cultivo, tipo de droga

ou de avaliação ou bloqueio menos eficiente.

Em ovócitos maturados in vivo ou in vitro os grânulos corticais são

encontrados em sua maioria na região do córtex celular (CONNORS et al., 1998;

WESSEL et al., 2001; VELILLA et al., 2004), sendo um dos indicativos de maturação

citoplasmática. A migração dos grânulos corticais para a região do córtex celular,

nos ovócitos maturados in vitro após o bloqueio da meiose com BL I foi similar aos

ovócitos submetidos somente à maturação in vitro. Esses resultados condizem com

os descritos para ovócitos maturados in vitro (VELILLA et al., 2004), sugerindo que o

bloqueio do ciclo meiótico pela BL I nos ovócitos bovinos, nas concentrações

apresentadas nesse estudo, não afeta a migração dos grânulos corticais no pós-

bloqueio meiótico. COY et al. (2005a) também observaram migração normal após a

MIV de ovócitos bloqueados com ROS. Essa migração dos grânulos corticais para o

córtex celular também é um indicativo de que os microfilamentos não foram afetados

pelo bloqueio meiótico, uma vez que são eles os responsáveis pela migração dos

mesmos (CONNORS et al., 1998; SUN et al., 2001a).

A distribuição das mitocôndrias para as células-filhas durante a divisão celular

é uma característica essencial para a proliferação das células. Elas têm um papel

central no fornecimento de ATP para a maturação, fecundação e para o

desenvolvimento embrionário (SUN et al., 2001b; WILDING et al., 2001). Durante a

maturação ovocitária as mitocôndrias alteram sua disposição no citoplasma celular.

Em ovócitos bovinos (HYTTEL et al., 1997) e suínos (SUN et al., 2001b) em estádio

de VG as mitocôndrias estão distribuídas em sua maioria na periferia do citoplasma

com grupos dispersos também mais ao centro do ovócito. Já nos ovócitos maturados

em estádio metáfase II as mitocôndrias estão mais centralizadas no citoplasma

(HYTTEL et al., 1997; SUN et al., 2001b). Esse mesmo padrão de distribuição das

mitocôndrias nos ovócitos imaturos e maturados foi observado nesse estudo, com

uma possível diferença na distribuição das mitocôndrias nos ovócitos maturados,

que segundo HYTTEL et al. (1997) estão mais centralizadas no citoplasma do

51

ovócito, mas nesse estudo estavam distribuídas por todo citoplasma. Essa variação

pode ser devido à diferença técnica de avaliação aplicada nos dois estudos

(epifluorescência nesse e microscopia eletrônica de transmissão no outro).

Houve diferença na distribuição das mitocôndrias entre os ovócitos imaturos

do grupo controle C/0 h (100% dos ovócitos recém-aspirados com mitocôndrias

distribuídas em sua maioria na região periférica do citoplasma) em relação aos

tratamentos com B10 e B100 (81,5% e 86,9%, respectivamente, com esse tipo de

distribuição). Ou seja, em 13-19% dos ovócitos mantidos em VG com BL I houve

migração das mitocôndrias para um padrão similar ao de ovócitos maturados. Isso

sugere que essa migração poderia não ser completamente controlada pelo MPF (ou

MAPK que é indiretamente inibido pela BL I – KUBELKA et al., 2000), isto é, outra(s)

via(s) poderia(m) participar desse controle. WU et al. (2002), também observaram

migração de mitocôndrias em ovócitos de suínos bloqueados. VIGNERON et al.

(2004b) observaram que ovócitos bovinos bloqueados com ROS acumulam algumas

moléculas relacionadas com o ciclo celular como a Aurora A cinase, JNK e PI3K. Se

essas moléculas têm de fato relação com a migração das mitocôndrias deve ser

testado.

A distribuição das mitocôndrias no interior do ovócito é mediada pelos

microtúbulos (SUN et al., 2001b) que são usados por proteínas motoras que geram

movimento das organelas no interior da célula (ALBERTS et al., 1997). Embora, o

ciclo celular meiótico estivesse bloqueado foi observada migração das mitocôndrias,

indicando que mesmo com ciclo celular bloqueado o mecanismo que gera o

movimento das mitocôndrias estava ativo em parte dos ovócitos submetidos ao

bloqueio meiótico. Em ovócitos de suínos tratados com BL I também foi observada a

translocação das mitocôndrias no interior do citoplasma celular (WU et al., 2002).

Esses resultados indicam que a translocação das mitocôndrias pode ser, ao menos

em parte, independente da maturação nuclear e da ativação do MPF (WU et al.,

2002).

Nos ovócitos maturados também foi observada diferença no padrão da

distribuição das mitocôndrias no citoplasma entre o controle C/24 (81,5% dos

ovócitos com mitocôndrias distribuídas por todo citoplasma) e os tratamentos com

B10M e B100M (95,2% e 98,2, respectivamente). Isso indica que houve uma maior

migração das mitocôndrias após a remoção do inibidor, provavelmente ocasionada

pela parcela de ovócitos que já havia iniciado a migração mesmo durante o bloqueio.

52

No que se refere ao desenvolvimento embrionário, no presente estudo as

diferenças se revelaram somente mais tardiamente na formação de blastocistos,

visto que as taxas de clivagem foram elevadas (80-86%) e semelhantes em todos os

tratamentos. Pela observação dos resultados do percentual de ovócitos que

alcançaram o estádio de blastocisto, verificou-se um número maior de embriões nos

grupos controle (38,3%) e B10 (41,6%) comparado ao B100 (33,0%). No entanto, os

percentuais de embriões eclodidos e o número médio de células dos blastocistos

não diferiram entre os tratamentos. A maturação citoplasmática avaliada pela

formação de blastocistos aos 7 dias de cultivo, porém, foi afetada pelo inibidor BL I

na concentração de 100 μM de BL I (B100), o que foi demonstrado pelo

comprometimento no desenvolvimento embrionário. As prováveis causas da baixa

eficiência na produção de embriões podem estar correlacionadas com as

concentrações do inibidor. LONERGAN et al. (2000) demonstraram que o bloqueio

meiótico com concentração elevada de BL I (150 μM) tem efeitos adversos no

desenvolvimento embrionário de ovócitos bovinos. Entre as alterações observadas

por microscopia eletrônica no estudo feito por LONERGAN et al. (2003) em ovócitos

bovinos tratados com BL I (100 μM) ou com roscovitina (25 μM), as células do

cumulus apresentavam-se mais alongadas, o núcleo do ovócito ondulado e

invaginado, as mitocôndrias com o formato bastante modificado (pleomorficas), o

reticulo endoplasmático aumentado e alguns dos grânulos corticais com aparência

de degenerados. Essas alterações foram bem mais acentuadas nos ovócitos

tratados com roscovitina (ROS). Em concordância com essa observação, pode-se

presumir que estaria ocorrendo uma correlação entre a maior dose do inibidor e uma

maior toxicidade, visto que a menor concentração de BL I (B10) não prejudicou a

produção de embriões (41,6%) quando comparado ao controle (38,3%).

Por outro lado, a maior parte dos estudos usando 100 μM de BL I ou não

reduz (PONDERATO et al., 2001; IMAI et al., 2002, LONERGAN et al., 2000;

BEKER-VAN WOUNDERBERG et al., 2005) ou até pode aumentar o

desenvolvimento até o estádio de blastocisto (HASHIMOTO et al., 2002; COY et al.,

2005b). Além disso, há relato de desenvolvimento fetal (PONDERATO et al., 2002) e

nascimento (COY et al., 2005b) com tratamentos similares. Apenas um estudo de

MARCHAL et al. (2001) com ovócitos suínos com ROS também obteve redução da

produção de blastocistos. Mesmo resultados anteriores de nosso laboratório não

mostraram essa redução (ADONA e LEAL, 2004). As razões para essa discrepância

53

não são claras, mas poderia ser causada por variação sazonal na qualidade dos

ovócitos que poderiam estar mais sensíveis ao uso da concentração mais alta do

inibidor.

Embora tenha havido redução da formação de blastocistos apenas no grupo

bloqueado com 100 μM BL I, a taxa de eclosão e o número de células não foi

afetado negativamente por nenhum tratamento, indicando que apesar de poder

afetar a proporção de blastocistos formados, a qualidade dos mesmos não foi. Isso

pode indicar um efeito do tratamento sobre a qualidade dos ovócitos, mas não dos

embriões gerados. RIZOS et al. (2002) observaram que a proporção de embriões

produzidos por FIV é afetada pela qualidade intrínseca do ovócito, mas que a

qualidade dos embriões é afetada pelo cultivo in vitro. A falta de efeito negativo

sobre o número de células de embriões obtidos de ovócitos bloqueados também foi

observada por MERMILLOD et al. (2000). HASHIMOTO et al. (2002), porém,

obtiveram aumento do número de células. PONDERATO et al. (2001), avaliando a

qualidade de embriões por taxa de eclosão após vitrificação de blastocistos também

não observaram diferenças entre embriões de ovócitos bloqueados ou não.

Os resultados do desenvolvimento embrionário aqui apresentados estão de

acordo com a literatura (MERMILLOD et al., 2000; PONDERATO et al., 2001;

PONDERATO et al., 2002; ADONA e LEAL, 2004) apesar de não ter sido

encontrado nenhum estudo em ovócitos de bovinos com a concentração próxima de

10 μM BL I (B10). PONDERATO et al. (2001) em seu estudo misturou os inibidores

ROS (12,5 μM) e BL I (6,25 μM), reduzindo a concentração dos mesmos, tendo bons

resultados de desenvolvimento embrionário, mas similar ao de ovócitos não trados.

De toda forma, o uso de inibidor em baixa concentração na ausência de

macromoléculas não afetou negativamente o desenvolvimento embrionário.

O cultivo de pré-maturação (B10) não melhorou e nem piorou os percentuais

de embriões que chegaram ao estádio de blastocistos em relação aos ovócitos não

tratados com BL I. Mais estudos são necessários para a melhor utilização do inibidor

(BL I), buscando melhorar a eficiência da maturação dos ovócitos bovinos in vitro,

adicionando aditivos durante o período de bloqueio (antioxidantes, hormônios,

fatores de crescimento ou fatores que estão envolvidos com a competência do

ovócito) para estudar os mecanismos envolvidos na maturação citoplasmática.

54

7. CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos nesse estudo, pode-se concluir que:

1) ovócitos bovinos podem ter a meiose bloqueada de forma eficaz e

reversível com baixa concentração de BL I, desde que na ausência de BSA;

2) a cinética da maturação in vitro pós-bloqueio da meiose é acelerada

mesmo com baixa concentração de BL I;

3) a organização dos microtúbulos e microfilamentos não foi afetada pelo

bloqueio meiótico com BL I sendo, sob esse aspecto, segura para ser utilizada na

pré-maturação;

4) a migração dos grânulos corticais foi inibida durante o bloqueio, mas não

foi alterada no pós-bloqueio; enquanto a translocação das mitocôndrias não foi

completamente inibida pelo bloqueio da meiose;

5) a BL I pode prejudicar ou não o desenvolvimento embrionário, dependendo

da concentração empregada;

6) a BL I pode ser utilizada em baixa concentração para bloquear de forma

segura e eficaz a meiose em ovócitos bovinos, prestando-se como ferramenta para

estudar as condições de cultivo para a produção de embriões in vitro.

55

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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68

APÊNDICE

69

I) ESTOQUES

Meios para MIV, FIV e CIV

1) Penicilina/estreptomicina Volume

H2O 100 mL 20,0 mL

Penicilina (100 UI/mL) Sigma/P-7794 6,1 g 1,22 g

Estreptomicina (100 μg/mL) Sigma/S-9137 5,0 g 1,0 gFiltrar/estocar no freezer (validade seis messes)

2) Gentamicina sulfato Volume

NaCl 0,9 % 10,0 mL

Gentamicina (10 mg/mL) Sigma/G-1272 0,1 gFiltrar/estocar no freezer (validade seis messes)

3) LH 5.0 μg/mL

Diluição em TCM-199 ou NaCl 0,9% lutropin-v BIONICHE Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

4) FSH 0,5 μg/mL

Diluição em TCM-199 ou NaCl 0,9% Folltropin-v BIONICHE Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

5) Estradiol-17β 1,0 μg/mL

(freezer) Estocar no freezer

6) Ácido piruvico

H2O 5 mLPiruvato (2mM) Sigma/P-5280 Filtrar/estocar no freezer (validade seis messes)

7) Solução Salina Volume

H2O 50,0 mL

NaCl (0,9%) 0,45 gFiltrar e estocar na geladeira por duas semanas.

8) Hipotaurina Volume

NaCl 0,9% 10,0 mL

Hipotaurina (1 mM) Sigma/H-1384 0,0011 gFiltrar e fazer alíquotas

70

9) Epinefrina (Proteger da luz) Volume

H2O 40,0 mL

Acido lático (60%) 104 μL

Metabissulfito (Na2S2O5) Sigma/S-9000 0,04 g

Corrigir o pH para 4,0 com HCl (1M) Acrescentar a Epinefrina (250 mM) Sigma/E-1635 0,00183 gFiltrar e fazer alíquotas

10) Penicilamina

VolumeNaCl 0,9 % 10,0 mL

Penicilamina (2 mM) Sigma/P-4875 0,003 gFiltrar e fazer alíquotas

11) PHE (Proteger da luz) Volume

NaCl (0,9%) 8,0 mL

Penicilamina 5,0 mL

Hipotaurina 5,0 mL

Epinefrina 2,0 mLEstocar em alíquotas de 250 μL no freezer por seis meses (proteger da luz).

12) Heparina Volume

NaCl 0,9 % 10,0 mL

Heparina (3 mg/mL) USB/CAS:9041-08-1 0,03 gFiltrar/estocar no freezer alíquotas de ± 30 μL (validade seis messes)

13) CaCl2.2H2O

VolumeH2O 5,0 mL

CaCl2.2H2O 0,155 gFiltrar/estocar na geladeira (validade seis messes)

14) Sodium tri citrate

VolumeH2O 5,0 mL

Sodium tri citrate (1000X) Merck/1.06448.1000 0,5 gFiltrar/estocar no freezer (validade seis messes)

15) Hemi cálcio–lactato

VolumeH2O 3,0 mL

Hemi cálcio–lactato (100X) 0,164 gFiltrar/estocar no freezer (validade seis messes)

71

16) Aminoácidos (AA) VolumeH2O 6,0 mL

Glicina (50X) Sigma/G-8790 0,225 g

Alanina (50X) Sigma/A-7627 0,045 g

Glutamina (50X) Sigma/G-8540 0,027 gFiltrar/estocar no freezer (validade seis messes)

17) TALP – Fec

(TALP - Tyrode’s Albumin lactate Pyruvate) mM Volume H20 50,0 mL

NaCl Sigma/S-9625 0,333 g

NaH2P04 Sigma/S-5515 0,002 g

NaHCO3 Sigma/S-5461 0,105 g

KCl Sigma/P-5405 0,012 g

MgCl2.6H20 Sigma/M-2393 0,005 g

CaCl2.2H2O Sigma/C-7902 0,015 g

Acido lático (60%) Sigma/L-7900 72 μL

Phenol red Sigma/P-3552 0,001 g

Piruvato Sigma/P-5280 0,0011 g

Antibióticos estoque 50 μLpH: ± 7,8. Filtrar e estocar na geladeira por duas semanas. mOsm. ± 285

18) TALP – SP (10X)

VolumeH20 10,0 mL

NaCl 0,584 g

NaH2P04 0,0035 g

KCl 0,0232 g

Acido lático (60%) 310 μL

Hepes Sigma/H-4034 0,238 g

NaHCO3 0,21 g

Phenol red 0,0001 g

CaCl2.2H2O --

MgCl2.6H20 0,008 g

Piruvato 0,011 g

Antibióticos estoque 100 μL pH: ± 7,3. Filtrar e estocar na geladeira por duas semanas. mOsm. ± 285

72

19) Solução SOF (10X) VolumeH2O 10,0 mL

NaCl 0,628 g

KCl 0,0532 g

NaHCO3 0,22 g

KH2PO4 Sigma/P-5655 0,0162 g

MgSO4 Sigma/M-2643 0,009 g

CaCl2.2H2O ---

Acido láctico (60%) 62 μL

Fenol 0,001 g

Antibióticos 100 μLFiltrar/estocar na geladeira (validade duas semanas)

20) Solução CR2 (10X)

VolumeH2O 25,0 mL

NaCl 1,58 g

KCl 0,056 g

NaHCO3 0,55 g

Antibióticos 250 μLFiltrar/estocar na geladeira (validade duas semanas)

21) Solução final CR2

VolumeH2O 4,0 mL

CR2 10X 500 μL

Hemi cálcio–lactato 50 μL

AA 100 μL

Piruvato 5 μL

MEM (100X) 50 μL

BEM (50X) 100 μL

SFB (5%) 250 μL

BSA 0,005 gValidade uma semana

73

II) MEIOS DE ROTINA (MIV, FIV e CIV)

22) Meio de manipulação de ovócitos (H) Volume

TCM-199/Hepes Sigma/12350-039 49,0 mL

Piruvato 50 μL

Antibióticos 50 μL

Soro (2% SFB) 1,0 mLPara uso diário

23) MIV final (B) Volume

TCM-199 Gibco/11150-067 2,7 mL 4,5 mL

FSH (0,5 µg/mL) 30 μL 50 μL

LH (5,0 µg/mL) 30 μL 50 μL

Piruvato 3 μL 5 μL

Antibióticos 3 μL 5 μL

Soro (10% SFB) 300 μL 500 μL

Estradiol-17β Opcional 3 μL 5 μLEstabilizar na estufa por ± 3 h antes de adicionar os ovócitos na gota (Gotas de 100μL ± 25 ovócitos).

24) FIV final Volume

TALP-Fec 4,5 mL

Heparina 15 μL

PHE 200 μL

BSA (Sigma/A-6003) 0,03 g Estabilizar na estufa por ± 3 h antes de adicionar os ovócitos na gota (Gotas de 100μL ± 25 ovócitos).

25) CIV Final (SOF) Volume

H20 7,3 mL

SOF estoque (10X) 1 mL

Myo-inositol 100 μL

MEM (100X) Gibco/11140-050 100 μL

BME (50X) Gibco/11130-051 200 μL

AA (opcional) 200 μL

Sodium tri citrate 10 μL

Piruvato 10 μL

CaCl2.2H2O 82 μL

SFB (10%) 1 mL

BSA (opcional) Sigma/A-6003 --Corrigir o pH: 7,2. (Validade uma semana)

74

III) Preparação do Gradiente de percoll

26) TALP-sp VolumeH2O 4,5 mL

TALP – sp (10X) 500 μL

CaCl2.2H2O 50 μL

BSA Sigma/A9647 0,03 g

27) Preparação do percoll 90%

VolumePercoll comercial Amersham B./17-0891-01 1,5 mL

TALP – sp (10X) 167 μL

28) Preparação do percoll 45%

VolumePercoll 90% (nº 27) 500 μL

TALP – sp (nº 26) 500 μL

29) Preparação do gradiente de percoll

VolumePercoll 45% (nº 28) 1,0 mL

Percoll 90% (nº 27) 1,0 mLColocar o percoll 45% em um tubo e, em seguida adicionar no fundo tubo o percoll 90% - Estabilizar por uma hora.

30) Preparação do sêmen pela técnica do percoll

- Descongelar o sêmen 37ºC por 30 segundos;

- Adicionar lentamente o sêmen na parte superior do gradiente;

- Centrifugar a 650 G por 10-12 minutos;

- Retirar o sobrenadante com cuidado e adicionar 4 mL de TALP-sp (nº 26)

sobre o pellet;

- Centrifugar novamente a 150 G por 1-2 minutos;

- Retirar o sobrenadante, fazer a concentração e a fecundação.

75

31) Cálculo para concentração de espermatozóides (spz) - Prepara um micro tubo com 190 μL de água;

- Retira-se uma amostra de 10 μL Spz para concentração;

- Homogeneizar bem;

- Fazer a contagem de Spz na câmara de Neubauer;

- Contar 5 quadrante de cada lado da câmara;

- Somar o nº de Spz contados nos dois lados da câmara e fazer a média;

- Fazer os cálculos - CI . VI = CF . VF;

- CI = concentração inicial – nº de Spz contado na câmara (média ex. ~46);

- VI = volume inicial –?;

- CF = concentração/final Spz/mL utilizado na fecundação (2,0 .106 Spz/mL);

- VF = volume final – volume da gota de FIV (Ex. Gota de 100 μL);

- Fazer os cálculos para saber o volume há ser utilizado na FIV;

- Exemplo. VI = CF . VF ⇒ VI = 2,0 .106 . 100

CI ~46.106

- VI = ~4,3μL → Volume de Spz utilizado para inseminação dos ovócitos.

Preparação do sêmen pela técnica Swim – up

32) TALP-sp volumeH2O 9,0 mL

TALP – sp (10X) 1,0 mL

CaCl2.2H2O 50 μL

BSA 0,06 gDeixar na estufa até dissolver totalmente o BSA

33) Procedimentos de preparação do sêmen pelo Swim – up

- Descongelar o sêmen 37ºC por 30 segundos;

- Colocar 1mL de TALP-sp (nº 32) em um tubo e, em seguida adicionar o

sêmen no fundo do tubo;

- Deixar o tubo na estufa inclinado a 45º por uma hora;

- Transferir 850 μL da fração superior para outro tubo com 4mL de TALP-sp;

- Centrifugar a 120 G por 5 minutos;

- Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet com 4 mL de TALP-sp;

- Centrifugar novamente a 120 G por 5 minutos;

- Retirar o sobrenadante, fazer a concentração e a fecundação.

76

IV) Meios para coloração

34) Solução de PBS pH - 7.4 – filtrar/estocar na geladeira (validade dois messes) volumeH2O (q.s.p.) 500 mL

NaCl 4.0 g

Na2HPO4 7H2O Nuclear/3168 (Obs: Na2HPO4 = 0,575g) 1,08 g

D-glicose Sigma/G-7021 0.5 g

KCl 0.1 g

KH2PO4 0.1 g

MgCl2 6H2O 0.05 g

Piruvato de sódio 0.018 g

Estreptomicina 0.025 g

Penicilina 0.029 g

Vermelho fenol 0.002 g

CaCl2.2H2O 0.066 g

35) Solução Bloqueio (SB)

VolumePBS 100 mL

BSA 0,1 g

Glicina 0,751 g

Azida sódica Sigma/S-8032 0,2 g

36) Coloração dos Grânulos corticais

1- Desnudar os ovócitos em PBS + 1% de SFB (vortex 4 min);

2- Remoção da zona pelúcida: PBS + 0,5% de protease (±8 min);

3- Fixação: PBS + 3% de paraformaldeído (PFD) (30 min)(Sigma/P6148);

4- Incubação: SB (2h);

5- Permeabilização: SB + 0,1% de Triton X-100 (5 min)(USB/9002-93-1);

6- Coloração: SB com 1 μg/mL de lens culinaris (Sigma/L9262) + 10 μg/mL de Iodeto

de propídio (15 min) (Sigma/P4170);

7- Lavar os ovócitos 3 vezes em SB;

8- Montagem das lâminas com glicerol (USB/CAS.56-81-5);

9- Visualização em microscópio de epifluorescência.

“lens culinaris” aglutinina conjugada a FITC (esta lecitina se liga especificamente à α-D-manose presente nos grânulos

corticais).

77

37) Coloração do Citoesqueleto (microtúbulos)

1- Solução PP: PBS + 0,1% de PVA;


3- Fixação: PBS com 3% de PFD + 0.6% de Triton X-100 (30 min);

4- Bloqueio: PP com 3% de Soro de Cabra (45 min);

5- Coloração: PP com α-Tubulina conjugada com FITC (1:100)(1h);

6- Coloração: PP com 10 μg/mL de Iodeto de propídio (15min);

7- Lavar os ovócitos 3 vezes em PP;

8- Montagem das lâminas em glicerol;


38) Coloração do Citoesqueleto (microfilamentos)

1- Solução PP: PBS + 0,1% de PVA;


3- Fixação: PBS com 3% de PFD + 0.6% de Triton X-100 (30 min);

4- Coloração: PP + 1 μg/mL de Faloidina conjugada com FITC + 10 μg/mL de Iodeto de

propídio (30 min);

5- Lavar os ovócitos 3 vezes em PP;

6- Montagem das lâminas em glicerol;


39) Coloração das Mitocôndrias


2- Coloração: TCM-199/hepes + 10% de SFB com 0,5 μM de Mitotracker red + 10 μg/mL

de hoechst (20 min);

3- Lavar os ovócitos 3 vezes em TCM-199/hepes + 2% de SFB;

4- Montagem das lâminas;


40) Recomendações gerais

- Usar produtos de marcas de confiança (Sigma e Gibco etc.);

- Usar Substâncias “embryo tested” preferencialmente;

- Usar água testada para PIV de embriões;

- Filtrar sempre;

- Deixar os meios de MIV, FIV e CIV estabilizando em overnight;

- Reduzir um pouco incidência de luz na sala de trabalho;

78

- As manipulações devem ser as mais rápidas possíveis;

- Se possível não usar material de vidro ou plástico reciclado;

- Cuidado com oscilações de temperatura durante os procedimentos, se necessário

usar placa aquecedora;

- Atenção com o pH dos meios – pH entre 7,2 e 7,4;

- Ajustar a osmolaridade – mOsm entre 280 – 290.

Para corrigir o pH usar 1M HCl ou 1M NaOH

Para corrigir a osmolaridade usar NaCl (↑ mOsm) ou H2O (↓ mOsm)

Documents

PAULO ROBERTO ADONA - uenf.bruenf.br/Uenf/Downloads/PGANIMAL_3898_1164626852.pdf · FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 028/2006 Adona, Paulo Roberto Bloqueio