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Mi21 Martina Jahn 08.02.2016 2
PCR basierte-Detektionstechniken
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Anwendung
Anwendung
• 1. Forensische Analysen DNA- Abstammungsanalysen (Vaterschaftstests, Kriminalistik)
• 2. Mikrobielle Gemeinschaften: Biofilme, medizinische Mikrobiologie
• 3. Gentechnisch hergestellte Lebensmittel
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Anwendung
• minimale Mengen an DNA ausreichend
• zeitsparend
• schneller Überblick
• kulturunabhängig
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• Strangtrennung durch kurzzeitiges Erhitzen der DNA auf 95°C
• Hybridisierung der Primer bei spezifischer Annealingtemperatur
• DNA-Synthese bei 72°C durch eine hitzeresistente DNA-Polymerase
Kary B. MullisNobelpreis 1993
PCR- Methode (http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html)
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Sequenzierung von PCR-Fragmenten nach Sanger
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Frederic SangerNobelpreis für Chemie1980
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1. Humane Anwendungen
• DNA-Abstammungsanalysen
• Forensische Analysen
• Ahnenforschung
• (Analyse fossiler DNA)
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„Fingerprinting“ bei Menschen
WS 10/11
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• Tandem-Repeat-Polymorphismen durch repetitive Cluster charakterisiert
• in nicht-kodierenden Bereichen der DNA (Introns, Pseudogene).
• co-dominante Vererbung
• Short Tandem Repeats (STR) • Variable Number of Tandem Repeats (VNTR)• Fragmentlängen-Analyse
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Forensic
46 Chromosomen (Mensch)
Genorte (Stand 2011): D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, Amelogenin, vWA, D8S1179, TPOX und FGA
DNA-Abschnitte: Mikrosatelliten
1985-1989: meist VNTRsseit 1998: STRs
Wahrscheinlichkeit.2 Individuen = gleiche Anzahl von wiederholten Repeats: 1 zu mehreren Milliarden!!!
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DNA Abstammungsanalysen
Mikrosatelliten sind kurze Abschnitte der DNA, die in verschieden häufigen Wiederholungen vorliegen (Fragmentlängen-Analyse). Die Anzahl der Wiederholungen unterscheiden sich von Mensch zu Mensch, die Kombination des Musters dieser Wiederholungen sind einzigartig. Sie werden aber - zusammen mit dem gesamten Erbgut - von den Eltern an Ihre Kinder vererbt. Die Vererbung und die Vielfältigkeit (Polymorphie) der Mikrosatelliten machen Sie zu idealen Markern für eine genetische Abstammungsanalyse.
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Vaterschaftstest M Kindsmutter
K Kind
PV Putativvater
A B
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Eineiigige Zwillinge
??????????????• Fingerabdruck• Anatomisch• Genetisch• Krankheiten
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Eineiige Zwillinge
WS 14/15
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Unterscheiden sich eineiige Zwillinge?
• Anatomisch? Leberflecke (u.a.), Muttermale
• genetisch? Nein; epigenetisch verändertes Methylierungsmuster an DNA &Histon-AcetylierungenV(D)J-Regionen der T- & B-Lymphozytendes Immunsystems (adaptiveImmunsystem)
• Krankheiten/Allergien? Nicht zwingend
Nussallergie 65% (7% bei 2-eiigen)Asthma 20%
• Fingerabdruck: Papillarleisten ? Nein; (umweltfaktorische Ausnahmen)
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2. Mikrobiologische Anwendungen
• Identifizierung von Mikroorganismen in unterschiedlichen Habitaten
• Erregernachweis bei Infektionskrankheiten
• Phylogenetische Analysen
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Phylogentische Marker
• Ribosomale RNA (5S, 16S, 23S)
• Spezifische Gene (z.B. rpoN)
• Phospholipide, Fettsäuren
• Internal Transcribed Spacer Regions (ITS)
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16S rRNA
DNA Protein
• Strukturelle und katalytische Komponente der Ribosomen
• Hohe Kopienzahl
• Ca. 1.500 Basenpaare
Ribosom
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16S rRNA
23S und 5S rRNA
16S rRNA
Bakterielles 70S Ribosom
E. Coli 15.000
Thomas SteitzNobelpreis 2009X-stal structure ribosom
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16S rRNA
• Mutationen oft letal
• Konstanter Selektionsdruck
• Sekundärstruktur an vielen Stellen hochkonserviert
• Vergleich analoger variabler Bereiche
• Datenbanken
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Fingerprinting „Bakteriengemeinschaften“
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Analytik• Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP)*
• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)*
• Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)*
• Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)*
• Terminal Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (tRFLP)
* = gelbasierende Auftrennung der PCR-Amplifikate
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z. Bsp.: SSCP
• Unterscheidung von DNA-Molekülen derselben Länge aber unterschiedlicher Sequenz
• Auftrennung nach Sekundärstruktur der einzelsträngigen PCR Produkte
• DNA - Konformation ändert Laufverhalten
• Trennung in nicht-denaturierendem Polyacrylamidgel
• 5`- Primer trägt Phosphatrest
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Prinzip SCCP-Gel
G
C
G
G
+
-
A
T
T
T
+
-
Bakterium A Bakterium B
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Analytik SSCP Gel
Densiometrische Ableitung
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Datenanalyse - Profilvergleich
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3. Gentechnisch hergestellte Lebensmittel
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Vorraussetzungen zur Generierung einer gentechnisch veränderten
Pflanze
1. Kultivierung einer individuellen Pflanzenzelle (Protoplast oder Zellkultur)
2. Regenerierung zur vollständigen Pflanzenzelle aus Protoplasten oder Zellkultur
3. Änderung des Nucleus der Pflanzenzelle durch Insertion neuen genetischen Materials (DNAs)
- Plasmid mit Fremdgen über/in Agrobacterium- mechanisch, durch „gene gun“ Methode
Infizierte Maispflanze
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Insertion neuenGenetischen MaterialsÜberAgrobacterium
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Gene Gun
Alternative Methode der Gen Insertion – “Gene Gun”
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4.Screen nach transformierten Pflanzen– Antibiotika Resistenz:
Problem: Wie kann man von 1 bis 1000 Pflanzen die gentechnisch
veränderte erkennen?
Lösung: man koppelt die Antibiotika –Resistenz mit dem Gen, welches
genetisch entfernt wird
1. Kultivierung einer individuellen Pflanzenzelle (Protoplast oder Zellkultur)
2. Regenerierung zur vollständigen Pflanzenzelle aus Protoplasten oder Zellkultur
3. Änderung des Nucleus der Pflanzenzelle durch Insertion neuen genetischen Materials (DNAs)
- Plasmid mit Fremdgen über/in Agrobacterium- mechanisch, durch „gene gun“ Methode
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Gentechnisch veränderter Mais
Bt – Bacillus thuringiensis – ubiquitär vorkommendes Bakterium
Produziert Proteine (“crystal proteins”, Cry [>60]) welche selektiv bestimmte Gruppen von Insekten tötet- Magen toxins, müssen von Insekten gefressen werden um tödlich zu wirken- Proteine binden an Darmrezeptoren Insekt stoppt Nahrungsaufnahme/verhungert- seit 30 Jahren werden Bt Toxine als Pestizide in Mio to/Jahr auf Feldern versprüht
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„Corn Borer Impact“U.S. + Canada: > $1 Mrd per annum, Schaden und Kontrollkosten
D > 250.000 Euro
Maiszünsler (Ostrinia nubilalis), westliche Maiswurzelbohrer (Diabrotica virgifera)
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Gefahren durch Genmais?1. Potentielles Risiko für Menschen auf allergische Reaktionen?
- Toxizität der Cry Proteine für Menschen ≤ Null
- Cry1 – wird über Magensäure unschädlich für Menschen
degradiert
- Cry9 – moment. im Tier (Maus) Modell untersucht (bisher keine Tox.)
2. Tötlich für andere Insektenarten? (select. für Lepidopterane):
- Monarch Schmetterlinslarve
ja: Bt Toxin, aber Schmetterling
geht nicht auf Maispflanze
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Transgener Reis
Anbau + H2O Ist – H2O
Gewünscht – H2ORaipur Indien 2005
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Transgener Golden Reis
Gentechnisch verändert:Enthält ß Carotin, welches sich in Vitamin A umwandelt
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Gentomate
„ Anti-Matschtomate“1994 Flavr Savr Tomate: entwickelt in USA; von Monsanto auf dem Markt1997 mangels Nachfrage eingestellt
2010: indische Forscher: Tomaten haltbarer durch α-Mannosidase und ß-D-N-Acethylhexosaminidase die das WeichwerdenDer Tomaten inhibieren (für zusätzliche 30 Tage)
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Transgene Baumwolle
Ein oder mehrere Gene des Bodenbakteriums B. thuringiensis werden in die chromosomale DNA der Baumwollpflanze integriert → produzieren Toxine gegen Schädlinge (Käfer, Schmetterlinge, Zweiflügler, Baumwolleule
Transgene Baumwolle wurde 2009 in 12 Ländern angebaut: Argentinien (95%), Australien (95%), Brasilien (18%), Burkina Faso (29%), China (60%), Indien (89%), Kolumbien (31%, 2007), Mexiko (56,5%), Südafrika
(98%), USA (88%), Indonesien, und Costa Rica.
Baumwollkapselbohrer
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Warum die öffentliche Angst über Biotech Lebensmittel?
• Unwissenheit über die Technologie
• Fehlen verlässlicher Informationen
• Unwissenheit über genetisch eingebaute „Safeguards“
• Negative Medienpräsens und –meinung
• Opposition durch Aktivistengruppen
• Misstrauen der Industrie
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