REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite a los investigadores para producir millones de copias de una secuencia específica de ADN en aproximadamente dos horas. Este proceso automático evita la necesidad de utilizar bacterias para amplificar el ADN.

En un tubo de ensayo el ADN de la especie objeto de estudio. Se añade en dicho tubo un par de oligonucleótidos que actúen como cebadores para la ADN polimerasa. Los cebadores o primers son los delimitan la región a amplificar y deben ser complementarios a cada uno de los extremos 3´ de la región a amplificar.Añadir al tubo de reacción los 4 tipos de desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs) que componen el ADN (dATP, dGTP, dTTP y dCTP,) por último también la ADN polimerasa.Taq-polimerasa, aislada de la bacteria Thermus aquaticus polimerasa especial capaz de resistir las elevadas temperaturas a la que vamos a someter a nuestro tubo de reacciónPor último, facilitar que la polimerasa lleve a cabo la síntesis de ADN utilizando como cebadores los extremos 3´ de los primers utilizados. Así, nuestra reacción constaría de 3 pasos:

1. Desnaturalización. Se conseguiría elevando la temperatura del tubo de reacción hasta 94oC, durante, por ejemplo, un minuto (este tiempo puede variar entre ½ minuto y 2 minutos)

 2. Alineamiento. Se

desciende la temperatura hasta una temperatura que puede oscilar entre 40 oC y 60 oC (dependiendo de diversos parámetros como la secuencia de los primers, su especificidad,...). La duración de este paso puede oscilar entre ½ minuto y 2 minutos.

 

3. Extensión. Se vuelve a aumentar la temperatura hasta los 72 oC y se deja actuar a la Taq polimerasa durante 1 ó 2 minutos.

Estos tres pasos constituyen un ciclo. La repetición de este ciclo unas 40 veces, por ejemplo, permite obtener, como resultado de un experimento de amplificación, millones de copias del fragmento de interés.

Todo esto, por supuesto, se realiza de forma automatizada. Para ello, los tubos de reacción se introducen en un termociclador que de forma automática realiza los 40 ciclos de amplificación.

Uno de los aportes fundamentales de la PCR a la investigación básica en biología molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante la cual se realiza una tarea que antes requería largas y tediosas jornadas.

El producto que se obtiene al finalizar la reacción, favorece la tarea de los investigadores empeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre la estructura y función de los genes.

Ha facilitado:

La tarea de identificación de personas Nuevas estrategias de diagnóstico Detectar agentes infecciosos como los virus de

las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)

Diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres seropositivas

Diagnóstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, e hizo posible reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológicas.

La técnica de la PCR permite seleccionar la región del genoma que se desea estudiar y realizar múltiples copias de la misma. Para ello, se prepara una reacción (mezcla de PCR o "mix") que contiene todos los elementos necesarios para producir una síntesis "in vitro" de ADN:

Tampón de PCR (PCR buffer). Contiene sales que estabilizan el pH de la reacción.

- Cloruro de Magnesio (MgCl2).Forma complejos solubles con los dNTPs para producir un substrato reconocible por la polimerasa.

- Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs: dATP, dTTP/dUTP, dCTP,dGTP). Constituyen el sustrato con el que la ADN polimerasa construye la nueva cadena de ADN.

- Una pareja de cebadores ("primers"). Secuencias cortas de ADN complementarias a ambos extremos de la región de ADN que se desea copiar.

- Taq polimerasa. Enzima encargada del copiado de las cadenas a partir de los cebadores. Se trata de una DNA polimerasa purificada de la bacteria termófila "Thermus aquaticus", y que por lo tanto es estable a temperaturas superiores a los 90ºC.

Esta se basa en tres porcedimientos:

• Desnaturalizacion: la desnanturalizacion por calor (usualmente mayor o igual 90ºC) separa la doble hebra de DNA en dos hebras sencillas rompiendo los enlaces de hidrogeno que unen a las bases, mientras que los enlaces entre la desoxirribosa y los grupos fosfato permanecen intactos.

• Hibridacion: el cebador se unira a su secuencia complementaria en el ADN molde3. para esto es necesario que la temperatura descienda (generalmente entre 55ºC, 65ºC). Estos cebadores actuaran como limites de la region de la molecula que va a ser amplificada.

Alargamiento: por ultimo actua la DNA polimerasa, tomando el DNA molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sintesis de nuevo DNA. Se aumenta la temperatura hasta 72ºC (para la taq polimerasa), temperatura a la cual la DNA polimerasa presenta su maximo de actividad, aumentando exponencialmente la cantidad de fragmentos de DNA en la muestra.

Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extension de la cadena a la temperatura optima de la taq polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su conservacion.

Este ciclo (Desnaturalizacion,Hibridacion y Alargamiento) se repetira un numero de veces dependiendo la cantidad de fragmentos amplificados que se desee

Reacción de la Cadena de Polimerasa en Transcripción Reversa.

Las técnicas de RT-PCR permiten la formación de cDNA (DNA complementario) del ARN, que salva la secuencia de ARN (tal como mRNA) en la forma más estable de ácido nucléico, DNA. Esta transcripción reversa del ARN en su DNA reversa del complemento (cDNA) es el primer paso de progresión de un proceso generalmente de dos etapas de RT-PCR. Además, copiando el ARN en la DNA, una puede entonces amplificar la secuencia del cDNA usando las cartillas específicas para la secuencia de la DNA. Esta amplificación es el segundo paso de progresión principal final del proceso de dos etapas de RT-PCR.

LUISA CARBONELL MONTESJEINNY CARBONELL SANJUAN

ALEXANDRA ILLIDGE PACHECOEILLEN GARZON ZABALAMARIA LUISA MANOTAS

LAURA ZAMBRANO POLO