PCR (Polymerase Chain Reaction)

聚合酶链反应

目 的：

熟悉 PCR 技术的基本原理和操作

1983.4 Kary Mullis

在开车前去北加利福尼亚

红 树 县 Redwood

country的一条被月光笼

罩的山路上构思了 PCR

随后卖给了 Roche公司

价格： 10.000$

1993 Nobel prize

历 史

PCR 的基本原理 变性、复性、半保留复制

一生二，二生四，四生万物

PCR 三步曲变性 90 ～ 97℃

退火 45 ～ 55℃延伸 72℃左右

PCR 过程

PCR 引物设计

1. 一对引物，分别与 5 ′ 和 3′ 端互补2. 长度： 15～ 30 个核苷酸3. 引物内、引物间不应有互补序列4. 引物与非特异扩增区无同源性

PCR 反应体系的五要素： 引物、酶、 dNTP 、模板和 Mg2+

Taq DNA 聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+ 依赖性 无校读功能

PCR反应体系的准备

+ primers

+ nucleotides

+Taq polymerase (Thermus aquaticus )

+ salts (ions)

+ DNA fragment

TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA

Step 1 : Denaturation 变性94°C

TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT

ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA

Step 2 : Annealing 退火T° primer-dependent

CGTAGTAGCA

GCTGCTACGTAG

TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT

ACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA

Step3 : Extension 延伸72°C

CGTAGTAGCA

GCTGCTACGTAG

Taq Polymerase

Taq Polymerase

TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC

GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA

TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA

Next step : Cooling

You get two copies of your DNA

TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTA

PCR Process

1 cycle 2 cycle 3 cycle

Process

变性

退火

延伸

加样器的使用

模板的制备DNA

1.从细胞中提取 DNA ：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞

2.固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶 K消化

RNA新鲜组织或细胞

所用器皿和试剂必需经高温灭菌或 DEPC 处理

( 一 ) 组织处理： 取新鲜大鼠肝用预冷的生理盐水洗去表面血液，每克肝脏加 2ml 的裂解液，匀浆器中匀浆

（一） 引物： 5’ –TTTTCGTAGTAACGGAAGCC-3 ’

5’ –TAAGGATTCTCAGATGCAAATG-3 ’

引物的设计可以参照： 两分钟 StepByStep 学会引物设计软件 Primer premier5.0/oligo 软件

www.dxy.cn核酸基因技术讨论版 /生物信息学讨论版/ PCR技术讨论版

PCR 反应

（二） 无菌 eppendorf 管中加 双 /三蒸水 9 l 10×缓冲液 2 l dNTP 混合物 3 L 引物 　　　 2 l 　 模板 DNA 　　　 2 l 25mmol/L Mg2+ 2.5 l

液体石蜡　 10 l

混匀离心 5sec ， 94℃水浴， 2min

+ Taq DNA 聚合酶 　 0.55 l程序设置： 94℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 30s 35 个循环 （一般在 72℃ 时酶催化核苷酸的标准速率可达 35 ～ 100 个核苷酸 / 秒） 反应结束后加中止液10 l

（三）扩增结果： 220-242 bp 对于 100 ～ 300bp 之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。双温 PCR （ two-temperature PCR ）仅仅执行两步温度程序。合并退火与延伸温度。一般常用温度是 94-95℃ 和 46-47℃

PCR 中的注意事项

PCR 反应中可能出现的问题：• 假阴性，不出现扩增条带• 假阳性• 出现非特异扩增带

（一）防止污染试剂小量分装吸头及 EP 管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作

（二）设立对照：阳性对照： 阳性模板阴性对照： 阴性模板试剂对照： 除模板外的所有组分

PCR 的反应特点1. 特异性强2. 灵敏度高： PCR产物的生成量是以指数方式

增加的，能将 pg=10- 12级的起始待测模板扩增到微克 (g= 10 -6) 水平

3. 简便、快速： PCR 反应一般在 2～ 4 小时完成扩增反应

4. 对标本的纯度要求低： DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测

电泳操作步骤

2 、胶床准备 ①取出胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸，形成约 5 ～ 8mm 的挡墙 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有 1mm 的间隙 ③将胶床放在调整好的水平台上

1 、凝胶准备 用 0.5×TBE配制 1％琼脂糖凝胶。① 称 1g琼脂糖置三角瓶中，加 100ml 0.5×TBE ② 微波炉加热大约 1分钟，熔化琼脂糖 ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到 60 ～ 70℃时，加入 EB 0.5μl ，并轻轻混匀

3 、铺胶：将冷却致 60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度 3～ 5mm 4 、室温下静置 1小时左右，凝胶固化。撕去胶床两端的胶带纸，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极

5 、向电泳槽中加入 0.5×TBE 电泳缓冲液，越过凝胶表面即可

6 、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。 原梳齿处 (样品孔 )即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除

7 、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀

8 、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般 10μl

9 、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：电压 50v ；时间 0.5小时左右

10 、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。

11、电泳结果分析：①紫外检测仪直接观察电源条带 ②摄影记录

注意事项：1 、凝胶浓度选择根据样品 DNA分子大小而定， 所以电泳前应对 DNA 片段大小有粗略的估计 2、用胶布封闭胶床两端时，要确保严密，以免灌胶时有胶液漏出 3 、用微波炉熔化琼脂糖时，以免突然产生气泡，使琼脂糖溢出来

4 、凝胶冷却至 60℃左右，立即铺胶，以防凝固 5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除 6、电泳前，确认样品孔位于电场负极 7 、因 EB 存在，全部操作过程要带防护手套

琼脂糖凝胶浓度与 DNA 分子的有效分离范围

胶浓度（％） 线性 DNA 分子大小（ kb）0.3 5 ～ 600.6 1 ～ 200.7 0.8～ 100.9 0.5 ～ 71.2 0.4 ～ 61.5 0.2 ～ 42.0 0.1 ～ 3

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