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PCRPCRPolymerase-KettenreaktionPolymerase-Kettenreaktion
Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction
Die Die PCRPCR ist eine M ist eine Mööglichkeit Abschnitte glichkeit Abschnitte einer DNA keiner DNA küünstlich zu vervielfnstlich zu vervielfäältigen ltigen
PCRPCR
Kary MULLISKary MULLIS(1993 (1993 Nobelpreis Nobelpreis für Chemie)für Chemie)
DNA-PolymeraseDNA-Polymerase In allen In allen
LebewesenLebewesen Verdoppelt Verdoppelt
DNA vor DNA vor ZellteilungenZellteilungen
Erzeugt einen Erzeugt einen Komplementär-Komplementär-strang an strang an geöffneter DNAgeöffneter DNA
DurchführungDurchführung
Vervielfältigung eines Vervielfältigung eines kurzen, genau definierten kurzen, genau definierten Teils eines DNA-Stranges Teils eines DNA-Stranges (Gen, Teile eines Gens, (Gen, Teile eines Gens, nicht codierende nicht codierende Sequenzen)Sequenzen)
Was wird gebraucht:Was wird gebraucht:
Die zu vervielfältigende Original-Die zu vervielfältigende Original-DNADNA
Zwei Primer (Starthilfen) für Zwei Primer (Starthilfen) für Anfang und Ende der SequenzAnfang und Ende der Sequenz
Polymerasen um den Abschnitt zu Polymerasen um den Abschnitt zu kopierenkopieren
Nukleotide zum Bau der Kopie-Nukleotide zum Bau der Kopie-SequenzenSequenzen
Der AblaufDer Ablauf
Jeder PCR-Prozesss Jeder PCR-Prozesss besteht aus einer Serie besteht aus einer Serie von 20 -30 Zyklen.von 20 -30 Zyklen.
Jeder Zyklus besteht aus Jeder Zyklus besteht aus 3 Schritten3 Schritten
1. Schritt: Schmelzen1. Schritt: Schmelzen
Die DNA wird auf 96Die DNA wird auf 96o o C C erhitzt,erhitzt,dabei werden die Basenpaar-dabei werden die Basenpaar-bindungen aufgebrochen. bindungen aufgebrochen.
Die DNA ist nun in 2 Die DNA ist nun in 2 Einzelstränge getrennt Einzelstränge getrennt (Melting)(Melting)
2. Schritt: Anlagern2. Schritt: Anlagern
Nach Trennung der Stränge Nach Trennung der Stränge wird die Temperatur auf 68wird die Temperatur auf 68oo C gesenkt.C gesenkt.
Jetzt lagern sich die Primer Jetzt lagern sich die Primer an die einzelnen Stränge an an die einzelnen Stränge an (Annealing).(Annealing).
3. Schritt: Verlängerung3. Schritt: Verlängerung
Bei 72Bei 72oo C beginnt die C beginnt die DNA-Polymerase an den DNA-Polymerase an den angelagerten Primern mit angelagerten Primern mit dem Anbau neuer dem Anbau neuer komplementärer Stränge komplementärer Stränge (Elongation)(Elongation)
Taq-PolymeraseTaq-Polymerasevon Thermus aquaticusvon Thermus aquaticus
Verwendet wird eine Verwendet wird eine hitzestabile DNA-Polymerase hitzestabile DNA-Polymerase aus dem Bakterium aus dem Bakterium Thermophilus aquaticusThermophilus aquaticus
VervielfVervielfäältigungltigung
Durch häufiges Wiederholen Durch häufiges Wiederholen dieses Vorganges wird eine dieses Vorganges wird eine exponentielle exponentielle Vervielfältigung Vervielfältigung (Amplifizierung) dieses DNA (Amplifizierung) dieses DNA Abschnittes erreicht. Abschnittes erreicht.
ThermocyclerThermocycler
ElektrophoreseElektrophorese
Die Trennung der vermehrten Die Trennung der vermehrten DNA-SequenzenDNA-Sequenzen
Schema zur Gensortierung
Durch PCR vermehrte Gensequenzen
Gensequenzen nach Größe sortiert JG
Elektrophorese mit Agar-Elektrophorese mit Agar-GelGel
Die Länge des PCR-Produkts Die Länge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich kann durch einen Vergleich mit einer DNA-Leiter, die mit einer DNA-Leiter, die DNA-Fragmente bekannter DNA-Fragmente bekannter Größe enthält und parallel Größe enthält und parallel zur Probe im Gel mitläuft, zur Probe im Gel mitläuft, bestimmt werden .bestimmt werden .
Elektrophorese von PCR vervielfältigter DNA-Fragmente.
•(1) Vater, (2) Kind, (3) Mutter. Das Kind hat Teile der Fingerabdrücke der beiden Elternteile geerbt wodurch es über einen eigenen, einzigartigen Fingerabdruck verfügt.
AnwendungAnwendung
Gerichtsmedizin (Forensik)Gerichtsmedizin (Forensik) VaterschaftstestVaterschaftstest KrankheitsnachweisKrankheitsnachweis StammbaumanalyseStammbaumanalyse Nachweis gentechnischer Nachweis gentechnischer
VeränderungenVeränderungen Klonierung von GenenKlonierung von Genen Analyse fossiler DNAAnalyse fossiler DNA
Thank you for your Thank you for your attentionattention