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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Técnica que permite a amplificação
da quantidade de DNA específico
utilizando a enzima Taq DNA
polimerase, sequências iniciadoras
específicas (primers) e variações de
temperatura controladas.
Taq polimerase
Primers
Tampão
Água
MgCl2
ETAPAS DO PCR
1. Adição de reagentes
DNA
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
(nucleotideos)
Taq DNA polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus,
a qual é uma bactéria encontrada
sobrevivendo a altas temperaturas em
geisers no Yellow Stone National Park.
Trata-se de uma enzima cuja atividade é mantida
durante 45 minutos a 95°C.
• Sua quantificação é dada em Unidades (U), sendo que
cada U é definida como a quantidade de enzima capaz de
incorporar 10 nM de dNTP em cerca de 30 min a 72°C.
• Na maioria dos protocolos são utilizadas 2,0 a 2,5 U
(0,5 l) de enzima em volume final de 100 l.
• É importante deixar claro que o excesso de enzima
também pode prejudicar a eficiência da reação, podendo
inclusive inibi-la.
Taq DNA polimerase
• Os primers (forward e reverse) devem ser
construídos de acordo com a conveniência do
investigador, de modo que esses possuam
seqüências complementares a determinadas
regiões do DNA que limitam os segmentos a
serem amplificados.
Seqüências dos primers
• São as bases nitrogenadas que constituirão as
novas cadeias de DNA.
• Sua concentração numa reação pode variar de
20 a 200 uM sendo importante que as quatro
devam variar em concentrações equivalentes.
• Quando estão em excesso (um nucleotídeo ou
todos) podem ocorrer erros de incorporação de
bases, gerando cópias alteradas
Desoxinucleotídios trifosfatados
(dNTP)
• O íon magnésio (Mg++) é um co-fator enzimático que
desempenha um papel de extrema importância na
atividade da enzima Taq DNA polimerase.
• Sua concentração em torno de 1,5 mM é aplicável a
maioria das necessidades.
- Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos
pouco ou nenhum produto
- Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a
PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas
bandas ou “smear”.
Íon magnésio
PCR “Requerimentos”
• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
• Tampão: pH 8.3-8.8
• dNTPs: 20-200µM
• Primers: 0.1-0.5µM
• DNA Polimerase: 1-2.5 units
• DNA Alvo: 1 µg
Taq polimerase
Primers
Tampão
Água
ETAPAS DO PCR
1. Adição de reagentes
DNA
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
(nucleotideos)
Taq polimerase
Primers
Tampão
Água
94ºC
DENATURAÇÃO
ETAPAS DO PCR
1. Adição de reagentes
2. Alternância de temperaturas
(Termociclador)
DNA
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
(nucleotideos)
Taq polimerase
Primers
Tampão
Água
94ºC
DENATURAÇÃO
57ºC
ANELAMENTO
ETAPAS DO PCR
1. Adição de reagentes
2. Alternância de temperaturas
(Termociclador)
DNA
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
(nucleotideos)
Taq polimerase
Primers
Tampão
Água
94ºC
DENATURAÇÃO
72ºC
EXTENSÃO
57ºC
ANELAMENTO
ETAPAS DO PCR 1. Adição de reagentes
2. Alternância de temperaturas
(Termociclador)
25-40 (35) CICLOS
DNA
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
(nucleotideos)
http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/
Essa temperatura está relacionada, por exemplo,
com a quantidade das bases C e G, de modo que
quanto maior for o número dessas bases, a
temperatura de hibridização tende a aumentar.
• Normalmente primers de 18 a 25 nucleotídios
contendo 50 a 60% de G + C são adequados.
• Para se calcular a TM (temperatura média de
hibridização) de primers com até 20 nucleotídios
aplica-se a seguinte formula:
4 x (C + G) +2 x (A + T) = TM
Temperatura média (Tm) de Anelamento
Ponte de Hidrogênio
fosfatopentose
Citosina
Guanina
Timidina
Adenina
Ponte de Hidrogênio
fosfatopentose
Citosina
Guanina
Timidina
Adenina
• Esse fator depende do comprimento do
segmento a ser amplificado e da concentração
do DNA molde utilizado na reação.
• A temperatura ótima de extensão dos primers é
de 72°C (temperatura ótima de atividade da
polimerase) e o tempo de extensão de 1
minuto é considerado suficiente para estender
produtos de aproximadamente 1.250 pb (em
condições ideais).
Tempo de extensão dos primers
• As condições de desnaturação utilizadas
normalmente são de 95°C por 5 minutos
(desnaturação inicial) e por 30 segundos
(desnaturação na ciclagem), sendo que
temperaturas mais altas podem ser utilizadas
quando se trabalha com seqüências moldes
ricas em G+C.
• Temperaturas muito altas e tempos longos de
desnaturação levam a perda de atividade da
enzima
Tempo e temperatura de denaturação
CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA
0 1
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
7 128
8 256
9 512
10 1,024
11 2,048
12 4,096
13 8,192
14 16,384
15 32,768
16 65,536
17 131,072
18 262,144
19 524,288
20 1,048,576
21 2,097,152
22 4,194,304
23 8,388,608
24 16,777,216
25 33,554,432
26 67,108,864
27 134,217,728
28 268,435,456
29 536,870,912
30 1,073,741,824
31 1,400,000,000
32 1,500,000,000
33 1,550,000,000
34 1,580,000,000
Número de cópias de 1 molécula de DNA após 34 ciclos: 1.580.000.000
Análise
dos dados
Termociclador
Reação:
DNA
Enzima Taq
Primer
Nucleotídeos
Tampão
Água
Reação de PCR
+ Tampão Corado
(Loading Buffer)
Análise
dos dados
Eletroforese em gel de agarose
+ Brometo de Etídeo
Termociclador
Reação:
DNA
Enzima Taq
Primer
Nucleotídeos
Tampão
Água
Reação de PCR
+ Tampão Corado
(Loading Buffer)
Análise
dos dados Luz Ultravioleta
Fotodocumentação
Termociclador
Reação:
DNA
Enzima Taq
Primer
Nucleotídeos
Tampão
Água
Eletroforese em gel de agarose
+ Brometo de Etídeo
Reação de PCR
+ Tampão Corado
(Loading Buffer)
Marcador
de pares
de base
(pb)
300
200
100
400
500 600
1400
1300
FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%
UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb
Marcador
de pares
de base
(pb)
300
200
100
400
500 600
1400
1300
400 400 400
600 600
100 100 100 100
FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%
UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb
TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE
DNA AMPLIFICADOS
- Reverse Transcriptase -PCR (RT-PCR): amplifica RNAm,
construindo cópias complementares de DNA (cDNA).
- Real Time-PCR: PCR quantitativo utilizado para determinação
de carga viral.
- Nested-PCR: amplifica seqüências de DNA de baixa
frequência (exemplo: diagnóstico de parasitoses).
Variações da técnica de PCR
• A alta sensibilidade do método de PCR, bem como
a sua especificidade, nos permite amplificar uma
seqüência-alvo mesmo a partir de amostras com
baixo grau de pureza e de quantidades mínimas
de DNA, o que torna o método viável não só para a
pesquisa básica mas também para a pesquisa
aplicada.
Aplicações do PCR
Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes
utilidades/ aplicações:
1. Detecção de deleções / inserções determinadas pela
geração de produtos amplificados que apresentam
alterações em seu tamanho.
2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de
bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos
genéticos podem ser determinadas pela ação das
enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.
Aplicações do PCR
3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional
(particularmente para doenças herdadas).
4. Na tipagem para transplantes de órgãos e
susceptibilidade para doenças auto-imunes
específicas (detecção de polimorfismo para HLA).
5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem
genética, como o câncer, através do estudo dos
genes relacionados a essas doenças.
6. Na medicina forense (DNA fingerprint).
7. No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes
patogênicos diversos
Aplicações do PCR