PCR

•Scelta dello stampo

•Scelta dei primer

PCR da DNA genomico

PCR da mRNA (RT-PCR)

Uso dei “linkers”

Vettori dA:dT

3’3’5’5’

3’5’3’

5’

PCR da DNA genomico

EcoRIBamHI

BamHI EcoRI

prom Tag o rep. cDNA term

trascrizionetraduzione

Proteine di fusione

Elettroforesi di acidi nucleici

•Gel di agarosio

•Gel di acrilammide

Elettroforesi su gel di agarosio

Tamponi di elettroforesi

Soluzioni di caricamento

Soluzioni di caricamento

•Aumentano la densità del campione

•Colorano il campione

•Rendono visibile la corsa elettroforetica

Migrazione del DNA su gel

Fattori che influenzano la migrazione

•Peso molecolare

•Concentrazione di agarosio

•Conformazione DNA

•Voltaggio applicato

•Intercalanti

•Tampone di elettroforesi

Visualizzazione del DNA

Marcatori di peso molecolare

HindIII

Fotodocumentazione

Recupero DNA da gel

•Elettroeluizione

•Agarosio “low melting”

•Solubilizzazione agarosio

Gel di acrilammide

Apparato per gel di acrilammide

Metodi di sequenziamento

•Sanger (enzimatico)

•Maxam e Gilbert

(chimico)

Metodo di Sanger

primer

primernuovo DNA

dideossinucleotideterminatore

quattro dNTP (incluso 32PdNTP)DNA polimerasi

La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP

Denaturare e separare su gel di poliacrilammide

ddTTP ddCTP ddGTP ddATP

Metodo di Maxam e GilbertDNA singolo filamento marcato ad una estremità

4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche

Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina

Es. metilazione delle G con dimetilsolfato

Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

32P

Gel di poliacrilammide di sequenza

Fasi di un progetto di sequenziamento

•clonaggio e preparazione del DNA

•reazioni di sequenza

•elettroforesi su gel di

poliacrilammide

•interpretazione e raccolta dati

Vettori a singolo filamento

Fagemidi

Strategie di sequenziamento

•Primer specifici consecutivi

•Delezioni progressive

•Frammenti casuali (shotgun)

Reazioni base-specifiche

Confronto metodi di sequenziamento

Sanger

rapida e semplice attuazione

disponibilità di kit

necessità di primer

sensibile a strutture secondarie

Maxam e Gilbert

lunga preparazione del DNA

reazioni da mettere a punto

relativamente economico

strutture non influenti

utilizzabile per oligonucleotidi

Sequenziamento automatico

Sequenziamento con Taq polimerasi