Herausgegeben von Dr. Stefanie Heiden und Dr. Rainer Erb, Deutsche Bundesstiftung Umwelt – www.dbu.de

9. Jahrgang | ISSN 1435-5272 | A 49017

2003BioTechnologie Nachrichten-Magazin

Sonderheft Nachhaltige Biokatalyse

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Förderleitlinien/Informationen zur Antragstellung

aktueller Jahresbericht Jahresbericht (regelmäßiger Bezug)

Kurzinfo zur Deutschen Bundesstiftung Umwelt

aktuelle CD-ROM der DBU

Broschüre „Landwirtschaft und Umwelt“

Broschüre „Naturschutz“

Broschüre „Innovationen“

Info-Mappe „Produktionsintegrierter Umweltschutz“

„Integrierte Biotechnologie - Sensorik“

„Integrierte Biotechnologie - Biokatalyse

„Nachhaltige Chemie“

„Regenerative Energien“

Publikationsliste der Deutschen Bundesstiftung Umwelt

Zu welcher Zielgruppe würden Sie sich zählen? (bitte ankreuzen)

Wirtschaft/Unternehmen Forschung/Hochschule

− Mitarbeiterzahl Bildungseinrichtung

− Branche Umweltverband

privat sonstige

Politik/Verwaltung

Entwicklung eines biotechnologischen ..................... 28Verfahrens zur stofflichen Wiederverwertungkautschukhaltiger Rest- und Abfallstoffe

Dipl.-Biol. Matthias Arenskötter, Dipl.-Biol. DirkBaumeister, Dipl.-Biol. Daniel Bröker, Dr. Udo Hölker,M.Sc. Ebaid M. A. Ibrahim, Dr. Jürgen Lenz, Dipl.-Biol.Karsten Rose, und Prof. Dr. Alexander Steinbüchel

Industrielle Biokatalyse – nachhaltig gestaltet ............ 4

Dr. Stefanie Heiden und Dr. Rainer Erb

Verbund Biokatalyse und InnovationsCentrum ............ 6Biokatalyse - Biokatalysatoren im Dienste einesintegrierten Umweltschutzes

Dr. Ralf Grote und Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian

Biotechnologische Innovationen in der ...................... 12Aminosäure-Darstellung

Dr. Petra Peters-Wendisch, Carsten Protsch, HenningSerger, Prof. Dr. Hermann Sahm, Dr. Robert Faurie, Priv.-Doz. Dr. Roland Ulber

Neue Wege zur Bioproduktion pharmazeutischer ...... 16Wirkstoffe mit Corynebacterium glutamicum

Dr. Petra Peters-Wendisch, Dr. Lothar Eggeling, Dr. BirgitKlaßen, Dr. Robert Faurie und Prof. Dr. Hermann Sahm

Umweltfreundliche Aufbereitung von ........................ 17Hühnerfedern mittels extremthermophiler Bakterienund thermostabilen Enzymen

Dipl.-Biotechnol. Julia Brodersen, Dr. Sabine Rießen,Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian, Prof. Dr. HerbertMärkl

Aerobe thermophile Reinigung fetthaltiger ................ 20Abwässer der Lebensmittelindustrie mit Bacillusthermoleovorans

Dipl.-Biol. Matthias Krüger, Dipl.-Ing. Ingo Reimann,Prof. Dr.-Ing. Herbert Märkl, Dr. Jörg Taube, Dipl.-Ing.Wolfgang Eckert

Umweltgerechte biotechnologische Herstellung ........ 33von biokompatiblen Polymerwerkstoffen für dieMedizintechnik

Dr. Frank Thunecke, Dr. Karin-Dagmar Wendlandt, Dr.Roland A. Müller, Dipl.-Chem. Gabriele Mirschel, Dipl.-Ing. Carmen Kunze, Dipl.-Ing. Hans-Frieder Listewnik

Überwachung der Immunsuppressions-Therapie ...... 37nach Organtransplantation mit Hilfe einer wirkungs-bezogenen Analysenmethode

Dr. Bernfried Specht, Dr. Manfred Fobker, Dr. BeateVollenbröker, Dr. Michael Erren, Dr. Ulrich Müller, Dipl.-Ing. Jan Hendrik Koch, PD Dr. Helge Hohage, Prof. Dr.Friedrich Spener und Dr. Norbert Bartetzko

Umweltverträgliche Synthese chiraler ....................... 502-Oxazolidinone

Dr. Martin Bertau, Dr. Thomas Daußmann

Phospholipasen in der Biokatalyse ........................... 51

Prof. Dr. Renate Ulbrich-Hofmann

Extremophile Amidasen für die enantioselektive ....... 54Synthese von Amino- und Carbonsäuren

Dipl.-Biol. Ksenia Egorova, Prof. Dr. Dr. h.c. GarabedAntranikian, Dr. Stefan Buchholz, Dr. Stefan Verseck,Dr. Harald Trauthwein, Dr. Shukrallah Na’amnieh

Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung .................... 55

Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz, Dipl.-Biotech. RobertPuskeiler, Dr.-Ing. Klaus Kaufmann, Dr. Gernot John, Dr.-Ing. Matthias Arnold

4

17

24

43

33

63

Kühlschmierstoffe aus technischen tierischen .......... 24Fetten und Altspeisefetten – Herstellung, Technologieund Ökobilanzierung

Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c. Jürgen Hesselbach, Dr.-Ing.Christoph Herrmann, Dr.-Ing. Ralf Bock, Dipl.-Geoökol.Tina Dettmer, Dr. rer. nat. Gerd Kley, Dr. rer. nat. RudolfBrenneis, Prof. Dr.-Ing. Roland Meyer-Pittroff, Dipl.-Ing.Oliver Falk, Dipl.-Geoökol. Anja Hansen

Chemoenzymatische Synthese ................................. 40von Oligosacchariden und glykosylierten Naturstoffen

Dr. Jürgen Seibel, Prof. Dr. Klaus Buchholz

Hefezellen als Bioindikatoren zur schnellen .............. 42Identifizierung hochselektiver umweltfreundlicherWirkstoffe

Prof. Dr. K.-D. Entian, Dr. Dietmar Eschrich, Dr. JürgenRecktenwald, Dr. Thomas Gassenmeier, Dr. AndreaSättler, Dr. Jörg Hauf, Dr. Joachim Klein, Dr. MartinaRimmele

Wirkstoffe aus extremophilen Mikroorganismen ....... 43

Dr. Guido Meurer, Dr. Stephanie Grond, HD Dr. ArnulfKletzin, Dr. Ralf Grote und Prof. Dr. Garabed Antranikian

Genetische Optimierung der Bäckerhefe ................... 47zur Produktion von L-Glycerol-3-Phosphat

Huyen Thi Thanh Nguyen M.S., Almut Dieterich, Prof. Dr.Ulf Stahl, Dr. Elke Nevoigt

Mikrotiterplatten-Reaktoren mit integrierten ............. 59pH-Sensoren und Autodisplay in E. coli zur evolutivenEnzymentwicklung

Prof. Dr. Elmar Heinzle, staatl. gepr. LMChem. SvenjaWeiß, Prof. Dr. Otto Wolfbeis, Dipl. Chem. Sarina Arain,Prof. Dr. Ingo Klimant, Dr. Gernot John, Dr. ChristianKrause, Dr. Thomas Räbiger, Günther Müller, Dr. HaraldWaltenberger, Dr. Joachim Jose, Dipl.-Biol. EvaSchultheiss

Entwicklung einer innovativen DNA-Chip- ................ 63Technologie zur industriellen Herstellung rekombinanterProteine und zur Identifizierung von Mikroorganismen

Dipl.-Biol. Daniel G. Weber, Dipl.-Phys. T. Injinaash, Dr.Tino Polen, Dipl.-Ing. K. Dembowski, Dipl.-Biol. AndreaVeit, Dipl.-Phys. U.Lehmann, Dr. Kerstin Sahm, Dr.Volker F. Wendisch, Prof. Dr. Dr. h.c. GarabedAntranikian, Prof. Dr.-Ing Jörg Müller, Prof. Dr. HermannSahm

Entwicklung von innovativen Mikrotiterplatten- ........ 66reaktoren zur Bewertung des Abbaus und der Toxizitätneuer Wirkstoffe auf Basis von Mikrosomen undSäugerzellen

Prof. Dr. Elmar Heinzle, M.Technol. Rahul RaviDeshpande, Dr. Udo Bock, Dr. Gernot John, Dr. ChristianKrause, Dr. Günther Müller, Dr. Harald Waltenberger,Dr. Ruth Maas

Sonderband | 2003 | 1INHALTINHALT

Information & Communication for Biotechnology

MAGAZINES | BOOKS | DATABASES | MEDIA SERVICES | CONSULTING

BIOCOM AGwww.biocom.de

S I N C E 1 9 8 6

Foto

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Primärscreening von Mikroorganismen unter ........... 67Fed-Batch Bedingungen

Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs, Priv. Doz. Dr. rer. nat. DorisKlee, Dr.-Ing. Tibor Anderlei

Produktion der Phytase von Escherichia coli ............. 85

Dr. Gerhard Miksch, Dr. Sophia Kleist, Dr. BerndHitzmann, Dr. Michael Arndt, Dr. Karl Friehs, Dr. ArnoCordes, Prof. Dr. Erwin Flaschel

Herstellung bakterieller Oxidasen zur Synthese ........ 88chiraler Feinchemikalien

Dr. Birgit Geueke, Priv.-Doz. Werner Hummel, Dipl.-Ing.Ingo Knabben, Dr. Simon Curvers, Dr. Tibor Anderlei

Das thermoalkaliphile Bakterium Anaerobranca ........ 90gottschalkii als Quelle stabiler Enzyme zur Herstellunghochwertiger Kohlenhydrate

Volker Thiemann, Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian,Dr. Hans-Peter Klenk, Angela Vollstedt, Prof. Dr. RolandFreudl, Catharina Jürgens, Prof. Dr. Reinhard Sterner,Prof. Dr. Wolfgang Liebl

73

81

110

Modulares membranadsorbertechnologisches ........ 109Baukastensystem zum integrierten DownstreamProcessing von Pharmatargets

Dr. Sascha Beutel, Dr. Alexander Loa, Dr. Oskar-WernerReif, Priv.-Doz. Dr. Roland Ulber, Prof. Dr. ThomasScheper

Einsatz effizienter Expressionssysteme und .............. 94Membranverfahren: Produktion von Biokatalysatorenaus extremophilen Mikroorganismen

Dr. Karen Sonnenberger, Prof. Dr. Dr. h.c. GarabedAntranikian, Prof. Dr. Roland Freudl, Prof. Dr. HorstChmiel, Dr. Ralph Nonninger, Dr. Thomas Schäfer

Pyruvat-Produktion aus Glucose mit ......................... 96rekombinanten Escherichia coli-Stämmen

Dr. Ralf Takors, Dipl.-Ing. Bruno Zelié, Dr. Tanja Gerharz,Prof. Dr. Michael Bott

Prozessintegrierte rekombinante Biokatalyse für .... 110hochselektive Oxyfunktionalisierung von Kohlenwasser-stoffen

Dr. Andreas Schmid, Dr. Bruno Bühler, Dr. Bernd Bauer,Prof. Dr. Horst Chmiel, Dr. Bernhard Hauer, Dr. TiloHabicher, Dr. Rudolf Krumbholz

Magnettechnologie in der Bioproduktaufreinigung .... 112

Dr.-Ing. habil. Matthias Franzreb, Dipl.-Ing. Niklas Ebner,Dr. rer. nat. Martin Siemann-Herzberg

Oxidative Enzyme in der Textilindustrie ................... 115

Dr. Eva Schuh, Dr. Elisabeth Heine, Dipl.-Chem. NabilDaâloul, Prof. Dr. Hartwig Höcker, Dipl.-Ing. Rudi Breier,Dr. Anke Mondschein, Dr. Anke Apitz, Prof. Dr. Karl-Heinz van Pée, Dr. Katrin Scheibner

Plant Made Pharmaceuticals (PMP) – Die Pflanze ..... 69als Bioreaktor

PD Dr. rer. nat. Michael Kleine

Innovative Nachweisverfahren .................................. 73für Mykotoxine

Dr. Bernhard Reck, Dr. Richard Dietrich, Dr. ChristineBürk, Björn Lauer, Dr. Thomas ReinardDr. Bernhard Reck, Dr. Richard Dietrich, Dr. ChristineBürk, Björn Lauer, Dr. Thomas Reinard

Biokatalytische Synthese enantiomerenreiner .......... 78Building Blocks

Dr. Markus Kähler, Dr. André Rieks, Dr. Ulrike Kirchner,Kerstin Wiggenhorn, Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer,Marlen Schmidt, Angelika Eisner, Dr. Wolfgang Petersen,Frauke Ellerbrock, Stefan Bollow

Esterasen und Lipasen aus kultivierten und nicht- .... 81kultivierten Mikroorganismen

Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer, Dr. Anna Musidlowska-Persson, Dominique Böttcher, Dr. Klaus Liebeton, Dr.Patrick Lorenz, Dr. Jürgen Eck, Dr. Holger Zinke, Dr.Christa Schleper, Prof. Dr. Peter Langer, Dr. HaraldTrauthwein, Dr. Andreas Karau, Dr. Stefan Buchholz

88

94

Entwicklung biotechnologischer Verfahren zur ........ 100mikrobiellen Reduktion von Ketoverbindungen

Andrea Weckbecker, PD Dr. Werner Hummel, MayaAmidjojo, Prof. Dr. Dirk Weuster-Botz, Michel BrikTernbach, Dr. Ralf Takors, PD Dr. Michael Müller, Prof.Dr. Ch. Wandrey

Enzymatische Gasphasenkatalyse zur Produktion ... 105chiraler Substanzen

Dipl.-Chem. Clara Ferloni, Dipl.-Ing. MatthiasHeinemann, Dr. Thomas Daußmann, Prof. Dr.-Ing.Jochen Büchs

119

Ökoeffizienz-Bewertung in der Prozessentwicklung .. 118

Arno Biwer, Pascal Zuber, Prof. Dr. Klaus Bellmann,Dr. Dieter Sell, Peter Gebhart, Prof. Dr. Elmar Heinzle

Praxisnahe Implementierung biotechnologischer .... 122Verfahren in mittelständischen Textilbetrieben

Peter Gebhart, Dr. Dieter Sell

Umweltorientierte Bewertung von Produktions- ...... 125prozessen am Beispiel der Verbundinitiative BIOL

Dipl.-Ing. René Gildemeister, Dr. Cornelia Haase, Dr.Horst Moormann, Dr. Jens Wohlers, Prof. Dr. NorbertRäbiger

Impressum ............................................................. 111

Sonderband | 2003 | 3INHALTINHALT

122

4 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

EDITORIAL

Industrielle Biokatalyse –nachhaltig gestaltet� Dr. Stefanie Heiden1 und Dr. Rainer Erb2

1 Deutsche Bundesstiftung Umwelt (DBU), Osnabrück, 2 Zentrum für Umweltkommunikation der Deutschen Bundesstiftung Umwelt gGmbH, Osnabrück

Die Deutsche Bundesstiftung UmweltDBU blickt im Jahr 2003 auf eine 12-jährige Fördertätigkeit zurück, in dersie bereits mehr als 5.500 Projekteunterstützte. Die DBU wurde im Jahr1990 auf Initiative des Bundesfinanz-ministers a.D. Dr. Theo Waigel unddes Bundesbankpräsidenten a.D.Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hans Tietmey-er per Gesetz durch den DeutschenBundestag errichtet. Als Organisati-onsform wurde eine private Stiftungbürgerlichen Rechts gewählt, die einhohes Maß an Selbstständigkeit undFlexibilität gewährleistet. Die DBU hatsich dem Leitbild der „NachhaltigenEntwicklung“ (Sustainable develop-ment) verpflichtet, dem auch das Fi-nanzkonzept der Stiftung folgt: Vonden Erträgen leben, ohne das Kapitalzu verzehren. Von dem ursprünglichaus der Privatisierung des Salzgitter-Konzerns zur Verfügung gestelltenStiftungskapital in Höhe von rund1,28 Milliarden Euro hat die DBUimmer einen Teil zur Bildung vonRücklagen verwendet. Heute beläuftsich das Stiftungskapital auf rund 1,6Milliarden Euro, wurde also nominalerhöht; inflationsbereinigt ist das Stif-tungskapital in dieser Zeit in etwakonstant geblieben. Gleichzeitigkonnten mehr als 1 Milliarde Eurofür innovative Umweltschutzprojektebereitgestellt werden.

Innovation mit Anspruch –Die Förderphilosophie derDBU

Die Stiftung fördert Vorhaben der an-gewandten Umweltforschung, derUmwelttechnik, der Umweltbildungsowie Projekte zur Bewahrung undWiederherstellung des nationalen Na-tur- und Kulturerbes. EntscheidendesFörderkriterium ist der konkrete Bei-trag eines Vorhabens zur nachhalti-gen Umweltentlastung und Ressour-censchonung. Die Projekte sollenüber die Erfüllung gesetzlicherPflichtaufgaben hinausgehen und sich

derungen angepasst wird. Umwelt-schutz war und ist niemals eine stati-sche Angelegenheit; die DBU wirddaher auf Flexibilität unter Einbin-dung von Bewährtem setzen.

Integrierte Biotechnologie– Ein Schwerpunkt derDBU

Mit dem Förderschwerpunkt „Inte-grierte Biotechnologie“ wurde einbesonderer Akzent gesetzt. DiesesThema bietet wichtige Möglichkeitenfür ein nachhaltiges Wirtschaften und

mics 2003“, „Biofilms - Preventionof Microbial Adhesion 2004“ oder„Biocat 2004“, sowie einer Vielzahlvon Publikationen und Vorträgen beiFachkongressen begleitet. Hierbeiwird stets auch der Aspekt des Um-weltkostenmanagements betont: DasErreichen ökologischer Ziele ist viel-fach eng an ökonomische Ziele ge-koppelt. Durch Einsatz vorsorgenderund professionell integrativ umgesetz-ter Umweltschutzmaßnahmen wirdanhand zahlreicher Beispiele deut-lich, dass Ökologie und Ökonomiesehr wohl Hand in Hand gehen. Die-ser Ansatz der DBU zieht sich als ro-ter Faden nicht nur durch die Aktivi-täten im Bereich Biotechnologie, son-dern durch die gesamte Fördertätig-keit.

Bei Förderung interdisziplinärerVerbundvorhaben im Rahmen desvornehmlich auf den produkt- undproduktionsintegrierten Einsatz bio-technologischer Verfahren und Pro-dukte ausgerichteten Förderschwer-punkts „Integrierte Biotechnologie“werden vor allem umweltrelevanteProblemlösungen und Entwicklungenim Rahmen von Verbundvorhabenunterstützt. Diese sollen vornehmlichin interdisziplinärer (natur-, inge-nieur- und wirtschaftswissenschaftli-cher) und institutionsübergreifenderKooperation (zwischen mittelständi-schen Unternehmen und Hochschu-len/Forschungseinrichtungen oderzwischen verschiedenen Unterneh-men) verfolgt werden. Durch dieseKompetenzbündelung verspricht sichdie DBU, ihre Zielvorstellungen von„nachhaltig betriebener Biotechnolo-gie“ ein maßgebliches Stück voran-zubringen.

Nachhaltige Biokatalyse

Beispiele für derartige Kompetenz-bündelungen sind der im Jahr 2000etablierte Forschungsverbund „Indu-strielle Nutzung von Biokatalysato-ren“ (www.biokatalyse.de) sowie die

deutlich vom gegenwärtigen Standdes Wissens und der Technik abhe-ben. Ihre praktische Umsetzbarkeitgewährleistet eine möglichst weiteVerbreitung. Dabei steht die beson-dere Förderung kleiner und mittle-rer Unternehmen, die bei der Umset-zung innovativer Ideen unterstütztwerden sollen, im Vordergrund. Mitihrer Fördertätigkeit will die DBUwortwörtlich „anstiften“, neue undteilweise risikoreiche Wege zu gehen.Wenn sich die DBU nach einer maxi-mal förderfähigen Laufzeit von dreiJahren zurückzieht, sollen die unter-

stützten Projekte idealerweise zu ei-nem „Selbstläufer“ geworden sein.

Der Erfolg geförderter Projektide-en muss regelmäßig analysiert undbewertet werden, weshalb eine Eva-luation von Projekten integraler Be-standteil der Stiftungsarbeit ist. DieDBU wird auch weiterhin konsequentauf vorsorgenden produkt- und pro-zessintegrierten Umweltschutz sowiedie Innovationskraft kleiner und mitt-lerer Unternehmen setzen. Durch dieAusschreibung von Förderschwer-punkten werden aktiv aktuelle The-men aufgegriffen und neue Ansatz-punkte im Umweltschutz entwickelt.Hierfür geben die Förderleitlinien denRahmen, der dynamisch den wissen-schaftlichen und technischen Anfor-

wird somit auch in Zukunft einenSchwerpunkt der Fördertätigkeit derDBU darstellen. Bislang geförderteProjekte zeichnen sich dadurch aus,dass es sich um Kooperationsvorha-ben zwischen wissenschaftlichen Ein-richtungen und Industrieunterneh-men der mittelständischen Wirtschafthandelt.

Die Projektförderung im BereichBiotechnologie wird durch eine Rei-he von Informationsmaßnahmen inForm eigener Veranstaltungen, wieden Osnabrücker Umweltgesprächen(z. B.: „Nachhaltige Biokatalyse“ am09.12.2002) oder geförderter inter-nationaler Tagungen, wie beispielhaft„Extremophiles 2000“, „BioTrans2001“, „Biocat 2002“, „Metageno-

Sonderband | 2003 | 5BIOKATALYSEBIOKATALYSE

im Jahr 2002 durch die Stiftung insLeben gerufene Initiative „Innovati-onsCentrum Biokatalyse ICBio –Eine Initiative der DBU zur Förde-rung der Nachhaltigen Biokatalyse“(www.icbio.de). Für den VerbundBiokatalyse (Laufzeit Mai 2000 – De-zember 2003) wurden für 11 Projek-te bei Gesamtkosten von rund 10,1Millionen Euro Fördermittel in Höhevon rund 5,8 Millionen Euro zur Ver-fügung gestellt. Im Rahmen der In-itiative ICBio, die weiterhin offen istfür neue Projektanträge, werden der-zeit 19 Vorhaben mit einer Gesamt-fördersumme von 6,2 Millionen Eurobei Gesamtkosten in Höhe von 14,3Millionen Euro durch die DBU unter-stützt. Die Koordination der im Rah-men beider Initiativen gefördertenVorhaben liegt bei Prof. Garabed An-tranikian, Technische UniversitätHamburg-Harburg.

Biotechnologischen Innovationenkommt, wie auch in der Agenda 21

gie, deren produktionsintegrierterEinsatz vielfach zu einer besseren Aus-nutzung von Rohstoffen, einer Verrin-gerung von Schadstoffimissionen undeiner Herabsetzung des Energiever-brauchs bei gleichzeitig verbesserterProduktqualität und -reinheit führt. Ei-nem verbreiteten Einsatz von Enzymen

Die übergeordneten Ziele der ge-förderten Vorhaben liegen in der– Entwicklung innovativer umwelt-freundlicher Produktionsverfahrenfür die Herstellung neuartiger Wirk-und Wertstoffe auf Basis biotechno-logischer Innovationen;– Entwicklung und Optimierung um-weltfreundlicher biotechnologischerVerfahren zur Substitution konventio-neller industrieller Produktionsver-fahren (z. B. für die Herstellung vonGrund- und Feinchemikalien, vonBiokatalysatoren sowie von Mono-und Polymeren);– Effizienzsteigerung bestehenderProduktionsprozesse durch Neukom-bination mit biotechnologischen Ver-fahren/Produkten.

Berücksichtigung finden hierbeisowohl neue Ansätze aus dem Bereich

Dr. Rainer ErbProjektleiter BiotechnologieZentrum für Umweltkommunikationder Deutschen BundesstiftungUmwelt gGmbHAn der Bornau 2D-49090 OsnabrückTel.: 0541-9633 950Fax: 0541-9633 990eMail: r.erb@dbu.de

Dr. Stefanie HeidenBereichsleiterin BiotechnologieDeutsche Bundesstiftung UmweltAn der Bornau 2D-49090 OsnabrückTel.: 0541-9633 321Fax: 0541-9633 193eMail: s.heiden@dbu.de

der Bio-/Verfahrenstechnik (Model-lierung, Downstream-Processing,Sensorik) als auch innovative Pro-duktionssysteme (Ganzzellsysteme,isolierte Biokatalysatoren) sowie mo-derne molekularbiologische und che-mische Ansätze (Expressionssysteme,evolutives Biokatalysatoren-Design,Stoffwechselflux-Analysen). Für aus-gesuchte Vorhaben ist jeweils eineÖkoeffizienzanalyse vorgesehen, wel-che die Summe aller Stoff- und Ener-gieströme sowie die mit einer Pro-duktionsumstellung/-etablierung ver-bundenen Kosten berücksichtigt.

In der vorliegenden Publikationsind die verschiedenen Forschungs-und Entwicklungsvorhaben der Part-ner der o. g. Initiativen dargestellt.Die in diesem Band zusammengefas-sten Beiträge renommierter Wissen-schaftler aus dem Bereich Biokataly-se/Biotechnologie sollen nicht nur alsBestandsaufnahme der gefördertenProjekte, sondern vielmehr als Aus-blick in die Zukunft verstanden wer-den: Erfolgreiche Konzepte werdenweiterentwickelt, weniger Erfolgrei-ches angepasst, neue Ansatzpunkeaufgenommen und konsequent wei-terverfolgt. Die hier zusammengefas-sten Beiträge, bei deren Lektüre wirIhnen viel Freude wünschen, bietenhierfür eine viel versprechendeGrundlage.

Osnabrück, im August 2003

detailliert ausgeführt, eine besondereBedeutung bei der Realisierung öko-nomisch rentabler und ökologischvorteilhafter Produktionsverfahren zu:Ressourcen werden geschont, Um-weltbelastungen a priori vermiedenoder verringert und unternehmeri-sche Risiken minimiert. Dies gilt ins-besondere für zahlreiche Beispiele desEinsatzes von Biokatalysatoren, diemaßgeblich dazu beitragen können,eine Umweltentlastung im Sinn einesprodukt- bzw. produktionsintegriertenUmweltschutzes zu erreichen. Für na-hezu jede chemische Stoffumwand-lung lässt sich ein geeignetes Enzymfinden, das potenziell in der Lage ist,einen klassischen chemisch-physika-lischen Prozess durch ein biochemi-sches bzw. biotechnologisches Verfah-ren zu ersetzen bzw. zu optimieren.Enzyme gehören somit zu den wich-tigsten Werkzeugen der Biotechnolo-

in chemischen Synthesen stehen je-doch häufig inhärente Nachteile vonBiokatalysatoren entgegen: So ist einehohe katalytische Aktivität konventio-neller Enzyme häufig nur innerhalbenger Temperatur- und pH-Wert-Gren-zen gegeben; Enzyme sind in der Re-gel nur in wässrigen Medien aktiv undbesitzen ein begrenztes Substratspek-trum, wobei die Enantioselektivität fürunnatürliche synthetische Substrategering ist. Darüber hinaus ist auch dieStabilität und Aktivität konventionel-ler Enzyme für eine wirtschaftlicheNutzung häufig nicht ausreichend.Daher ist das Auffinden außergewöhn-licher Enzymaktivitäten, die Optimie-rung industriell relevanter Eigenschaf-ten sowie die Entwicklung effizienterProduktionsverfahren für Enzyme imSinn einer nachhaltigen EntwicklungForschungsgegenstand der o. g. Initia-tiven.

6 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

BIOKATALYSE

Verbund Biokatalyse undInnovationsCentrum Biokatalyse -Biokatalysatoren im Dienste einesintegrierten Umweltschutzes� Dr. Ralf Grote und Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian, Technische Mikrobiologie, Technische Universität Hamburg-Harburg, Hamburg

Keywords: Verbund Biokatalyse, InnovationsCentrum Biokatalyse, ICBio, DBU.

im Juli 2002 darin bestärkt, die In-itiative „InnovationsCentrum Biokata-lyse – Eine Initiative der DBU zur För-derung der Nachhaltigen Biokatalyse“- kurz: ICBio - ins Leben zu rufen.ICBio ist im Gegensatz zum VerbundBiokatalyse ein offenes Forschungs-konsortium unter dessen Dach DBU-geförderte Projekte mit biokatalyti-scher Ausrichtung gebündelt werden.Zurzeit gehören ICBio 19 Projektemit einer Gesamtfördersumme vonrund 6,2 Mio. Euro an (bei Gesamt-kosten von bisher rund 14,3 Mio.

Euro ). Schwerpunkte von ICBio, dasebenfalls von Professor Antranikiankoordiniert wird, bilden die strate-gisch wichtigen ForschungsfelderScreeningsysteme, Expression undDownstream-Processing/Produktauf-bereitung mit dem Ziel der Gewin-nung von Wirk- und Wertstoffen.Langfristig soll ICBio zu einer festenInstitution werden und als zentraleEinrichtung den horizontalen undvertikalen Wissenstransfer sowie dieVernetzung zwischen Industrie undHochschule fördern.

Biotechnologie - EinemoderneQuerschnittstechnologie

Die Biotechnologie gilt neben derInformations- und der Siliziumtechno-logietechnologie als die dritte Mega-technologie des 21. Jahrhunderts. Dashohe Problemlösungspotenzial dieserZukunftstechnologie liegt darin be-gründet, dass es sich um eine wirk-lich integrative Technologie handelt,die das Know-how von Biologen, Che-mikern, Medizinern, Ingenieuren undInformatikern synergistisch bündeltund zusätzlich Erkenntnisse aus denBereichen Ökonomie und Soziologieintegriert. Es ist unstrittig, dass dieBiotechnologie als interdisziplinäreund innovationsträchtige Querschnitts-wissenschaft alle Voraussetzungen er-füllt, um neue umweltschonende Pro-zesse und Produkte im Bereich LifeSciences zu erschließen [1]. Mit Hil-fe der modernen Biotechnologie kön-nen nicht nur Optimierungen an be-stehenden Verfahren vorgenommenwerden, sondern auch völlig neuarti-ge Prozesse und Produkte entwickeltwerden. Einen zunehmend wichtigenBeitrag leisten hierbei Verfahren un-ter Einsatz von Biokatalysatoren.

Biokatalysatoren - Enzymeund Ganzzellsysteme

Der Biokatalyse kommt eine bedeu-tende Rolle zu, wenn es darum geht,nachhaltige Prozesse unter Verwen-dung erneuerbarer Ressourcen zuverwirklichen. Oft werden Biokataly-satoren dabei mit Enzymen gleichge-setzt. Diese Definition ist aber häufig

Mit den Netzwerkprojekten „VerbundBiokatalyse“ und „InnovationsCen-trum Biokatalyse“ hat die DeutscheBundesstiftung Umwelt (DBU) zweiwegweisende Förderprogramme initi-iert, die deutschlandweit eine Vorrei-terrolle bei der Erforschung und beimEinsatz biokatalytischer Verfahren imSinne eines produkt- bzw. produkti-onsintegrierten Umweltschutzes ein-genommen haben. Der Verbund Bio-katalyse (Laufzeit: Mai 2000 bis De-zember 2003) hat mit insgesamt elfProjekten das Potenzial enzymati-scher Verfahren zur umweltverträgli-chen Produktion von Feinchemikali-en, Wirkstoffen und Textilien ein-drucksvoll unter Beweis gestellt.Rund 4,8 Mio. Euro (bei Gesamtko-sten von rund 10,1 Mio. Euro) inve-stierte die DBU in diesen Verbund, dervon Professor Garabed Antranikian(Technische Universität Hamburg-Harburg) federführend koordiniertwird. Kernpunkt dieses Bündnissesfür Biokatalyse ist die enge Zusam-menarbeit von Partnern aus Hoch-schulen sowie kleinen und mittelstän-dischen Unternehmen. Integraler Be-standteil des zukunftweisenden Ver-bundes ist die ökologische und öko-nomische Evaluation biokatalytischerProzesse. Denn nur wo umwelt-freundliche Verfahren auch wirt-schaftlich sinnvoll sind, kann einenachhaltige Entwicklung voranschrei-ten.

Die positiven Erfahrungen aus demVerbund Biokatalyse und die Erkennt-nis, dass Synergien und Kommunika-tion eine herausragende Rolle bei derWeiterentwicklung der Biokatalyse inDeutschland spielen, haben die DBU

Tab. 1: Überblick über wichtige industrielle Biokatalyseverfahren nachSyldatk et al. [4].

Maßstab und Enzym Produkt Firma>1.000.000 t/a:Glucoseisomerase Isosirup (Gluc/Fruct) Verschiedene>10.000 t/a:Nitrilhydratase Lipase Acrylamid Nitto, DSM(Mucor mihei) Kakaobutter Fuji Oil Co., Unilever>1.000 t/a:Penicillinamidase 6-APA VerschiedeneAspartase L-Asp TanabeThermolysin Aspartam Tosoh, DSMHydantoinase/Carbamoylase D-Phg VerschiedeneHydantoinase D-Phg VerschiedeneAldonolactonase D-Pantothensäure Fuji Chem. Ind.Lipase (S)-Methoxyisopropylamin BASF>100 t/a:Fumarase L-Malat TanabeAminoacylase L-Met, L-Val, L-Phe Degussa, Tanabeβ-Tyrosinase L-DOPA AjinomotoLipase (Pseudomonas sp.) (S)-Acylthioisobutyrat DSM, TanabeNitrilase (R)-Mandelsäure BASFLipase Optisch aktive Amine BASFLipase Optisch aktive Alkohole BASF>10 t/a:Lipase (R)-Glycidylbutyrat DSMDehydratase L-Carnitin Lonza

Sonderband | 2003 | 7BIOKATALYSEBIOKATALYSE

zu kurz gefasst, denn auch Ganzzell-systeme können mit ihrer Vielzahl anzelleigenen Enzymen für biokatalyti-sche Prozesse, wie beispielsweise Co-Faktor abhängige Reaktionen oder diefermentative Herstellung von Feinche-mikalien, die ökonomisch sinnvollsteAlternative darstellen (Stichwort Zell-fabrik). Die natürliche Funktion vonEnzymen ist es, Stoffwechselreaktio-nen zu ermöglichen, die unter physio-logischen Bedingungen ohne Hilfe vonBiokatalysatoren nicht oder nur sehrlangsam ablaufen würden. Enzymesind entsprechend ihrer physiologi-schen Funktion den klassischen Kata-lysatoren oft überlegen, da ihre hoheSpezifität beispielsweise dafür sorgt,dass katalysierte Reaktionen enantio-selektiv ablaufen und zu hochreinenProdukten führen [2, 3].

Aufgrund ihrer Summe an positi-ven Eigenschaften wie Spezifität, Se-lektivität und Effektivität nehmen Bio-katalysatoren in der modernen Bio-technologie eine herausragende Stel-lung ein. Für fast jede chemischeStoffumwandlung lässt sich ein geeig-netes Enzym finden, welches poten-ziell in der Lage ist, einen klassischenchemisch-physikalischen Prozessdurch den Einsatz eines biochemi-schen bzw. biotechnologischen Ver-fahrens zu optimieren oder in eini-gen Fällen sogar zu ersetzen. Enzymegehören somit zu den wichtigstenWerkzeugen der Biotechnologie.Auch unter dem Aspekt der Arbeits-sicherheit spielen Biokatalysatoreneine wichtige Rolle, da sie Prozessebei atmosphärischem Druck und inunkritischen Lösungsmitteln (z.B.Wasser) katalysieren.

Biokatalyse - Ein Markt mitZukunft

Die Anwendung von Biokatalysatorenin biotechnologischen Produktions-verfahren führt vielfach zu einer bes-seren Ausnutzung von Rohstoffen, ei-ner Minimierung von Schadstoffemis-sionen und einer Herabsetzung desEnergieverbrauchs bei gleichzeitigverbesserter Produktqualität und -reinheit. Aufgrund dieser Vorteilewird der Einsatz von Enzymen in in-dustriellen Prozessen, in denen zur-zeit noch chemische oder physikali-sche Verfahren dominieren, weiterzunehmen.

Obwohl die Natur über eine Viel-zahl von Biokatalysatoren verfügt(Schätzungen gehen von 7000 unter-schiedlichen Enzymen aus von denenheute etwa 3000 bekannt sind), wer-den bislang nur wenige Enzyme in der

Synthese hochwertschöpfender Sub-stanzen eingesetzt. So werden insge-samt erst 19 Enzyme in einem Maß-stab von 10 bis 1.000.000 Tonnen proJahr in industriellen Biokatalysever-fahren genutzt (Tab. 1). Die jährlichdurch Biokatalysatoren erzeugtenProdukte haben einen Marktwert vonrund 100 Mrd. US-$, wovon etwa 6Mrd. US-$ auf die Sparte Feinchemi-kalien (chirale und nicht-chirale Che-mikalien) entfallen. Unser Wissenüber die Enzymausstattung von Mi-kroorganismen nimmt durch die über51 abgeschlossenen und 208 zurzeitlaufenden Genomprojekte rapide zu[5]. Die Menge an so gewonnenen ge-netischen Informationen ist immens:Auf hochgerechnet über 380.000 po-tenzielle Biokatalysatoren (259durchsequenzierte Mikroorganismen

mit je 1.500 Proteinen) kann in na-her Zukunft zurückgegriffen werden.Im Vergleich zu den bisher ca. 200industriell genutzten Enzymen erge-ben sich hierdurch ungeahnte Chan-cen.

Tab. 2: Projektpartner im Verbund Biokatalyse.

Projekt PartnerVerbundkoordination Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg

Dr. Dieter Sell DECHEMA, Frankfurt/M.Ökologische und Prof. Dr. Elmar Heinzle Technische Biochemie, Universität des Saarlandesökonomische Evaluation Dr. Dieter Sell DECHEMA, Frankfurt/M.

Prof. Dr. Klaus Bellmann Lehrstuhl für Allgemeine BWL und Produktionswirtschaft,Universität Mainz

Mikrobielle Reduktion von Prof. Dr. Christian Wandrey Institut für Biotechnologie 2, Forschungszentrum JülichKetoverbindungen Prof. Dr. Dirk Weuster-Botz Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, TU München

Dr. Thomas Daußmann Jülich Fine Chemicals GmbH, JülichProf. Dr. Werner Hummel Institut für Enzymtechnologie, Universität Düsseldorf

Biodehydrierung Pyruvat Prof. Dr. Hermann Sahm Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum JülichDr. Robert Faurie Amino GmbH, Frellstedt

Kohlenhydratpharmaka Prof. Dr. Ulf Stahl FG Mikrobiologie und Genetik, TU Berlin Versuchs- undDipl.-Kfm. E. Weinmann Lehranstalt für Spiritusfabrikation und

Fermentationstechnologie, BerlinAminosäuren und Peptide Prof. Dr. Herbert Märkl Bioprozess- und Bioverfahrenstechnik, TU Hamburg-

HarburgProf. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-HarburgDr. Hans Friedmann Friedmann & Scholz GbR, Hamburg

Rekombinante Phospholipase Prof. Dr. Renate Ulbrich-Hofmann Institut für Biotechnologie, Universität Halle/SaaleBirgit Rebmann Lipoid GmbH, Ludwigshafen

Hochwertige Kohlenhydrate Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-HarburgDr. Hans-Peter Klenk e-gene Biotechnologie GmbH, BernriedProf. Dr. Roland Freudl Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum JülichProf. Dr. Reinhard Sterner Institut für Biochemie, Universität KölnProf. Dr. Wolfgang Liebl Institut für Mikrobiologie und Genetik, Universität Göttingen

Oxidative Enzyme Dr. Elisabeth Heine Deutsches Wollforschungsinstitut a. d. RWTH Aachen e.V.Rudi Breier Textilchemie Dr. Petry GmbH, ReutlingenProf. Dr. Karl-Heinz van Pée Institut für Biochemie, TU DresdenDr. Katrin Scheibner JenaBios GmbH, Jena

Enzymscreening Prof. Dr. Elmar Heinzle Technische Biochemie, Universität des SaarlandesProf. Dr. Otto Wolfbeis Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik,

Universität RegensburgDr. T. Räbinger BMG GmbH, OffenburgJ. Maier Microcoat, BernriedDr. Joachim José Medizinische und Pharmazeutische Chemie, Universität

des SaarlandesDNA-Chips Prof. Dr. Jörg Müller Arbeitsbereich Halbleitertechnologie, TU Hamburg-

HarburgDr. Volker Wendisch Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum JülichProf. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-HarburgRalf Siebert/Uwe Lehmann SLS µ-Technology GbR, Hamburg

Abb. 1: Logo des VerbundprojektsBiokatalyse.

Biokatalysatoren imDienste des integriertenUmweltschutzes

Der Einsatz von Biokatalysatoren inden Vorhaben des Verbundes Bioka-talyse und von ICBio verfolgt ein ge-meinsames Ziel: Umweltentlastungdurch die Etablierung von innovati-ven biotechnologischen Verfahrenund Produkten. Hierbei macht mansich zu Nutze, dass durch die intrin-sischen Eigenschaften von Enzymeneine höhere Produktreinheit und -ausbeute erzielt werden kann unddies bei gleichzeitiger Reduzierungunerwünschter oder umweltrelevan-ter Neben- und Abfallprodukte. ImSinne der Nachhaltigkeit ist die Ab-kehr von End-of-pipe Maßnahmenzur Beseitigung von Umweltschäden

8 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

dringend geboten. Nur vorbeugende,produkt- bzw. produktionsintegrier-te Maßnahmen unter Ausnutzung bio-technologischer Verfahren haben dasPotenzial, ökologische und ökonomi-sche Vorteile miteinander zu verbin-den, und so dem WirtschaftsstandortDeutschland entscheidende Impulsezu verleihen. Während große Che-mie- und Pharmaunternehmen die-se Chancen bereits erkannt und zunutzen begonnen haben, bleiben klei-ne und mittelständische Unterneh-men dagegen häufig aufgrund fehlen-der F&E-Aktivitäten von den Chancender Biotechnologie ausgeschlossen.Hier sollen der Verbund Biokatalyseund das InnovationsCentrum Bioka-talyse mit ihrem ausgeprägten Netz-werkgedanken entscheidend dazubeitragen, den Wissenstransfer zwi-schen Hochschule und Industrie zufördern sowie innovative Verfahrenund Produkte in eine industrielle Nut-zung zu übertragen. Vergleichbar miteinem „Bündnis für die Biokatalyse“soll die Leistungsfähigkeit der inte-grativen Querschnittsdisziplin Bio-technologie unter Beweis gestelltwerden.

Impulse für dieBiokatalyse

Die Deutsche Bundesstiftung Umwelthat das Problemlösungspotential desEinsatzes von Enzymen in biotechno-logischen Prozessen und Produktenfrühzeitig erkannt und fördert seit1997 eine Vielzahl von Forschungs-vorhaben im Rahmen des Pro-gramms „Integrierte Biotechnolo-gie“. Das im Mai 2000 gestartete Ver-bundprojekt Biokatalyse bündeltKompetenzen, um das Potenzial derBiokatalyse in den Bereichen Fein-chemikalien, Wirkstoffe, Textilienund Methoden unter Beweis zu stel-len.

Verbund Biokatalyse -Wegbereiter für innovativeBiotechnologie

Der Verbund Biokatalyse umfasstbundesweit 11 Projekte an denenüber 50 Wissenschaftler und 9 Firmenaus dem Bereich kleiner und mittel-ständischer Unternehmen (KMU) be-teiligt sind (Tab. 2). Als Schwerpunk-te des Verbundvorhabens wurden dieThemenbereiche Feinchemikalien,Wirkstoffe, Textilien und Methodendefiniert, da hier ein großes Potenzi-al zur Demonstration der Leistungs-fähigkeit biokatalytischer Verfahrengesehen wurde.

Tab. 3: Derzeitige Projektpartner im InnovationsCentrum Biokatalyse ICBio (Stand: Mai 2003).

Projekt PartnerDachprojekt Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg

Dr. Ralf Grote

Wirkstoffe aus extremophilen Dr. Guido Meurer BRAIN AG, ZwingenbergMikroorganismen Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg

Dr. Arnulf Kletzin Institut für Mikrobiologie und Genetik, TU DarmstadtDr. Stephanie Grond Institut für Organische Chemie, Universität Göttingen

Identifizierung Prof. Dr. Karl-Dieter Entian Institut für Mikrobiologie, Universität Frankfurt/M.hochselektiver Wirkstoffe Dr. Helmut Blum Phenion GmbH & Co. KG, Frankfurt/M.

Dr. Jörg Hauf SRD GmbH, OberurselDr. M. Rimmele RiNA GmbH, Berlin

Entwicklung von innovativen Prof. Dr. Elmar Heinzle Technische Biochemie, Universität des SaarlandesMikrotiterplattenreaktoren Dr. Udo Bock Across Barriers GmbH, Saarbrücken

Dr. Günter Müller Mikrocoat GmbH, BernriedDr. Ruth Maas Pharmacelsus GmbH, SaarbrückenDr. Gernot John PreSens GmbH, Regensburg

Entwicklung von Dr. Tibor Anderlei PD AC Biotech GmbH, JülichExpressionssystemen und Dr. Werner Hummel Lehrstuhl für Enzymtechnologie, Universität DüsseldorfAnalysetechnologien

Effiziente Expressionssysteme für Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburgdie Produktion von Biokatalysatoren Prof. Dr. Roland Freudl Institut für Biotechnologie I, FZ Jülich

Prof. Dr. Horst Chmiel upt GmbH, SaarbrückenDr. Ralph Nonninger ItN GmbH, SaarbrückenDr. Thomas Schäfer Novozymes A/S, Dänemark

Aktivitätscharakterisierte Prof. Dr. Uwe Bornscheuer Institut für Technische Chemie und Biochemie,Enzymbank für die Feinchemie Universität Greifswald

Dr. Patrick Lorenz BRAIN AG, ZwingenbergProf. Dr. Peter Langer Institut für Chemie und Biochemie, Universität

GreifswaldDr. Christa Schleper Institut für Mikrobiologie und Genetik, TU Darmstadt

Innovatives Downstream-processing Prof. Dr. Thomas Scheper Institut für Technische Chemie und Biochemie,von Pharmatargets Universität Hannover

Dr. Oskar Reif Sartorius AG, GöttingenDr. Alexander Tappe Cell Culture Service GmbH, Hamburg

Einsatz von Magnettechnologie zur Dr. Matthias Franzreb Institut für Technische Chemie, FZ KarlsruheBioproduktaufarbeitung Prof. Dr. Christoph Syldatk Institut für Bioverfahrenstechnik, Universität Stuttgart

Dr. Lothar á Brassard chemagen AG, BaesweilerDr. Uwe Habich Steinert Elektromagnetbau GmbH, Köln

Stammentwicklung und Dr. Petra Peters-Wendisch Institut für Biotechnologie I, FZ JülichDownstream-processing bei der Dr. Albert deGraaf Metex GmbH, JülichProduktion von L-Serin Dr. Robert Faurie Amino GmbH, Frellstedt

Entwicklung von Parallelverfahren Prof. Dr. Dirk Weuster-Botz Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, TU Münchenzur Etablierung biokatalytischer Dr. Klaus Kaufmann H+P Labortechnik AG, OberschleißheimProzesse Dr. Gernot John PreSens GmbH, Regensburg

Dr. Matthias Arnold DASGIP AG, Jülich

Primärscreening von Prof. Dr. Jochen Büchs Institut für Bioverfahrenstechnik, RWTH AachenMikroorganismen unter Dr. Doris Klee Lehrstuhl für Textilchemie und MakromolekulareFed-Batch-Bedingungen Chemie, RWTH Aachen

Dr. Tibor Anderlei AC Biotech GmbH, Jülich

Entwicklung eines Verfahrens zur Prof. Dr. Horst Chmiel upt GmbH, Saarbrückenprozessintegrierten Biokatalyse Dr. Andreas Schmid ETH Zürichfür Epoxidierungen Dr. Bernhard Hauer BASF AG, Ludwigshafen

Dr. Rudolf Krumbholz K.D.-Pharma GmbH

Sonderband | 2003 | 9BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Tab. 3: Fortsetzung.

Projekt Partner

erfolgen. Daher ist es bei der Entwick-lung neuer Verfahren von großer Be-deutung, dass die Realisierungschan-cen schon frühzeitig beurteilt werden.Die Umsetzung biokatalytischer Ver-fahren scheitert oft trotz zu erwarten-der ökonomischer und ökologischerVorteile, da die Entwicklungschancenals zu ungewiss eingestuft werden. Umdiesem Dilemma zu begegnen, wur-den im Rahmen des Themenschwer-punktes „Evaluation“ Methoden zurBeurteilung der Nachhaltigkeit aufBasis ökonomischer und ökologi-scher Parameter unter Einbeziehungumfassender Stoff- und Energiebilan-zen (Ökobilanzierung) weiterentwik-kelt. Die Software-gestützten Metho-den haben, wie alle Projekte des Ver-bundvorhabens, Beispielcharakterund können auf die Evaluierung neu-er biotechnologischer Verfahren über-tragen werden.

Die Ergebnisse der am VerbundBiokatalyse beteiligten Projekte wer-den in den nachfolgenden Artikelndieser Sonderveröffentlichung detail-liert beschrieben.

Koordination desVerbundprojekts

Die Kooperation innerhalb des Ver-bunds wird durch ein Koordinations-projekt unter der Leitung von Profes-sor Garabed Antranikian (TechnischeMikrobiologie, TU Hamburg-Har-burg) abgestimmt. Zusammen mit

dem stellvertretenden Koordinator Dr.Dieter Sell (DECHEMA e.V.) und demLeiter des Koordinationsbüros Dr. RalfGrote (TU Hamburg-Harburg) sorgtder Koordinator für die Förderung vonSynergieeffekten und eine intensiveKommunikation zwischen den Pro-jektgruppen. Die Verbundkoordinati-on betreut auch die administrative undkaufmännische Abwicklung des Ge-samtverbunds. Ein wichtiges Werk-zeug, verbundübergreifende Aufga-benstellungen effizient bearbeiten zukönnen, sind die sogenannten Task-forcegruppen. Im Verbund Biokataly-se existieren zurzeit vier Taskforce-gruppen zu den Themenbereichen„Methoden“, „Kommunikation“,„Projektmanagement” und „Evaluati-on“. Ziel ist es, den Gesamtverbundflexibel zu gestalten und jederzeit ei-nen Zugriff auf die Resultate der ein-zelnen Partner zu ermöglichen. Hier-bei wird besonderer Wert darauf ge-legt, einzelne Problemstellungennicht unabhängig voneinander zu be-arbeiten, sondern die Arbeiten auf-einander abzustimmen, um Duplika-tionen zu vermeiden. Wichtige Aufga-ben des Koordinators sind außerdemdie Außenpräsentation des Verbund-vorhabens, die Organisation von Sta-tusseminaren und internationalenKongressen sowie die allgemeine Öf-fentlichkeitsarbeit, wie beispielswei-se auf Fachmessen wie der BIOTECH-NICA in Hannover. Unter der Adressehttp://www.biokatalyse.de ist der In-

Einsatz von Amidasen zur Prof. Dr. Garabed Antranikian Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburgenantioselektiven Synthese von Dr. Shukrallah Na’amnieh X-Zyme GmbH, DüsseldorfAmino- und Carbonsäuren

Enzymatische Herstellung von Prof. Dr. Klaus Buchholz Technische Chemie, TU BraunschweigOligosacchariden Dr. Shukrallah Na’amnieh X-Zyme GmbH, Düsseldorf

Enzymatische Altfettalkoholyse Dr. Gerd Kley Bundesanstalt für Materialforschung, BerlinDipl.-Chem. Gerhard Grothe Greibo Chemie GmbH, VeltenDr. Ralf Bock Institut für Werkzeugmaschinen und Fertigungstechnik,

TU BraunschweigFranziska Reh Volkswagen AG, WolfsburgDr. Rüdiger Freitag Castrol Industrie GmbH, Mönchengladbach

Wiederverwertung Prof. Dr. Alexander Steinbüchel Institut für Mikrobiologie, Universität Münsterkautschukhaltiger Reststoffe Dr. Udo Hölker Höfer Bioreakt GmbH, Bonn

Glyoxylat-Produktion Prof. Dr. Michael Bott Institut für Biotechnologie I, FZ JülichDr. Thomas Schwarz bitop GmbH, Witten

Pflanzliche Bioreaktoren zur PD Dr. Michael Kleine Planton GmbH, KielPharmaproduktion Prof. Dr. Jens-Michael Schröder Universitätshautklinik, Kiel

Synthese chiraler 2-Oxazolidinone Dr. Martin Bertau Institut für Biochemie, TU DresdenDr. Thomas Daußmann Jülich Fine Chemicals GmbH, Jülich

Abb. 2: Logo des InnovationsCen-trum Biokatalyse

UmweltgerechteProduktion vonFeinchemikalien,Wirkstoffen und Textilien

Die Themenbereiche „Feinchemika-lien“ und „Wirkstoffe“ nehmen mitsechs Projekten einen großen Rauminnerhalb des Verbunds ein. Feinche-mikalien und pharmakologischeWirkstoffe müssen hinsichtlich ihrerReinheit besonders hohen Qualitäts-ansprüchen genügen. Im Gegensatzzu so genannten Bulk-Chemikalienwerden sie in relativ geringen Men-gen hergestellt und haben eine hoheWertschöpfung. Die industrielle Nut-zung von Biokatalysatoren hat in die-sem Bereich ein großes Potenzial, dabeispielsweise enantiomerenreineProdukte mit weniger Syntheseschrit-ten und einfacherer Aufarbeitung her-gestellt werden können. Die Produk-tion von Feinchemikalien ist außer-dem ein klassisches Betätigungsfeldkleiner und mittelständischer Unter-nehmen, die in der Lage sind, flexi-bel auf kleine Nischenmärkte zu rea-gieren. Hier bietet die Kooperation imVerbundprojekt Biokatalysatoren ge-rade solchen Unternehmen neueChancen, die in Ermangelung eigenerF&E-Aktivitäten bisher keine biotech-nologischen Verfahren entwickelnkonnten.

In der Textilproduktion sind vieleProzesse (Stoffveredelung, Färben)durch einen hohen Energieverbrauchund eine häufig signifikante Gewäs-serbelastung gekennzeichnet, undzwar unabhängig davon, ob es sichum die Herstellung und Verarbeitungvon Kunst- oder Naturfasern (Baum-wolle, Wolle, Seide) handelt. Hierwerden im Verbund Biokatalyse neueVerfahren entwickelt, die diesen öko-logischen Problemen wirkungsvollbegegnen, beispielsweise durch denEinsatz von Oxidasen/Peroxidasen zurenzymatischen Rohstoffbehandlungvon Wolle und Baumwolle.

Methodenentwicklung -DNA-Chips undScreeningstrategien

Der Methodenentwicklung und -pfle-ge widmen sich im Verbund Biokata-lyse zwei Projekte. Zum einen steht dieEtablierung und Optimierung derDNA-Chiptechnologie für den BereichDiagnostik und Analyse im Vorder-grund. Zum anderen werden neuarti-ge Mikroreaktoren mit pH- und Sau-erstoffsensoren entwickelt, die ein ef-fizientes Enzymscreening ermöglichensollen. Beide Methoden werden der

Biotechnologie entscheidende Impul-se verleihen. So können beispielswei-se unterschiedliche Screeningpro-gramme schnell und kostengünstigdurchgeführt werden und biotechno-logische Potenziale früher bewertetwerden. Die Integration dieser metho-dischen Forschungsfelder in den Ver-bund Biokatalyse spielt darüber hin-aus auch für die Vernetzung der Pro-jekte untereinander eine wichtige Rol-le, da beide Methoden für verbund-übergreifende Fragestellungen zurVerfügung gestellt werden können.

Ökologische undökonomische Evaluation

Integraler Bestandteil des Verbundvor-habens ist das Projekt „Ökonomischeund ökologische Evaluation“. Diesesübergreifende Vorhaben hat bei vierausgewählten Projekten des Verbundseine ökonomische und ökologischeEvaluation biokatalytischer Prozessewährend der Entwicklung durchge-führt. Es hat sich herausgestellt, dassin sehr frühen Phasen eines Projektsdie wesentlichen Weichenstellungen

10 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

ternetauftritt des Verbunds Biokataly-se zu erreichen, der eine wichtige in-terne und externe Kommunikations-plattform darstellt.

InnovationsCentrumBiokatalyse

Wie auch am Beispiel des VerbundsBiokatalyse deutlich geworden ist, ha-ben die immensen Forschungsaktivi-täten in den vergangenen Jahren un-ser Wissen über das Vorkommen unddie Funktionsweise von Enzymenrasch anwachsen lassen. Enzymme-chanismen und Struktur-Funktions-Beziehungen wurden an Proteinen ausverschiedensten Quellen (Bakterien,Archaeen, Hefen, höhere Organis-men) vergleichend untersucht. Bioka-talysatoren aus extremophilen Mikro-organismen ermöglichen beispiels-weise den Einsatz von Enzymen in in-dustriellen Prozessen, auch unter har-schen Bedingungen, bei denen kon-ventionelle Proteine vollständig dena-turieren würden [6]. Dennoch habenvergleichsweise wenig enzymatischeProzesse und Verfahren den Weg ineine intensive kommerzielle Nutzunggefunden. Nur rund 2,5% aller be-kannten Enzyme werden zurzeit indu-striell genutzt [7]. Zu einer nachhal-tigen Entwicklung gehört aber geradedie Umsetzung wissenschaftlicher Er-gebnisse zu innovativen Verfahren undProdukten, welche zur Lösung derglobalen Herausforderungen beitra-gen können. Dieses wurde öffentlichim Rahmen des 21. Osnabrücker Um-weltgesprächs „Nachhaltige Biokata-lyse“ am 9. Dezember 2002 diskutiert,wo auch ICBio als Initiative der DBUzur Förderung nachhaltiger Biokata-lyse erstmals vorgestellt wurde.

Ausgehend von den positiven Erfah-rungen im Verbund Biokatalyse, sollversucht werden, durch ICBio dauer-hafte Strukturen zu schaffen, um bio-katalytische Verfahren in Deutschlandnachhaltig zu stärken. Das Innovati-onsCentrum Biokatalyse soll als „Vir-tuelles Haus der Biokatalyse“ einenwichtigen Schritt in diese Richtung ge-hen. In einem flexiblen Zusammen-schluss innovativer Projekte mit einerklaren Koordinationsstruktur werdendie drei strategisch wichtigen Themen-schwerpunkte Screeningsysteme, Ex-pression und Downstream-Proces-sing/Produktaufbereitung mit demZiel der Gewinnung von Wirk- undWertstoffen intensiv bearbeitet. In Ko-operation mit Industrie und Hoch-schule sollen Flaschenhälse eliminiertwerden, die den Einsatz von Biokata-lysatoren blockieren.

Gewinnung von Wirk- undWertstoffen

Ziel jeden biotechnologischen Fort-schritts sind innovative Verfahren undProdukte. Die Gewinnung von ver-marktbaren Wertstoffen aus Abfall-und Reststoffen stellt eine ökologischeund ökonomische Herausforderungdar. Die Kombination von Abfallent-sorgung und gleichzeitiger Wertstoff-gewinnung ist mit biotechnologischenVerfahren und unter Verwendung vonBiokatalysatoren möglich. Den Anfor-derungen von Abfallwirtschafts- undAbfallkreislaufgesetz wird hierbei inbesonderem Maße Rechnung getra-gen. Von besonderem Interesse istaber auch die Umsetzung nachwach-sender Rohstoffe wie Stärke, Cellulo-se und Hemicellulose zu hochwert-schöpfenden Produkten. NeuartigeProduktionsverfahren unter Einsatzlebender Zellen als so genannte „Zell-fabriken“ ermöglichen darüber hin-aus die ressourcenschonende Herstel-lung von Wert- und Wirkstoffen jen-seits von konventionellen Produkti-onsanlagen. Ein Demonstrationspro-jekt mit diesem Schwerpunkt ist bei-spielsweise die Produktion von Bio-pharmazeutika in Pflanzen (Biofar-ming) oder die fermentative Herstel-lung von Aminosäuren.

Ein Centre of Excellenceder Biokatalyse

Das InnovationsCentrum Biokatalyseals ein Centre of Excellence auf demGebiet der Biokatalyse wird durch einin Hamburg ansässiges Koordinations-büro mit ausgeprägtem Dienstlei-stungscharakter unter der Leitung vonProfessor Antranikian koordiniert. Zuden vornehmlichen Aufgaben gehörenhierbei:– Aufbau einer Kommunikations- undKompetenzplattform für den Wissens-transfer zwischen Hochschulen undIndustrie.– Erhöhung der Durchlässigkeit zwi-schen Hochschule und Industrie.– Organisatorische und wissenschaft-liche Abwicklung von Projektvorha-ben zwischen Hochschulen und Indu-striepartnern.– Erarbeiten von Lösungsansätzen fürProbleme der deutschen Biotech-In-dustrie durch Koordination internatio-naler Projektkooperationen.– Sicherstellung eines horizontalenKnow-how Transfers durch Austauschvon Doktoranden, Wissenschaftlernund Managern.– Aus- und Weiterbildung von Fach-kräften.

– Entwicklung eines Konzepts zumAufbau einer Internationalen Samm-lung von Biokatalysatoren.– Organisation und Durchführungvon nationalen und internationalenTagungen und Kongressen.– Organisatorische und logistischeUnterstützung von Antragstellern.

Unter dem Dach der Initiative In-novationsCentrum Biokatalyse werdenzurzeit 19 Projekte durch die DBUgefördert, die in drei Themenschwer-punkten angesiedelt sind (Tab. 3).

IntelligenteScreeningsysteme

Ziele dieses Schwerpunkts sind Ent-wicklung, Optimierung und Einsatz in-novativer Screeningverfahren in derBiotechnologie. Die im Rahmen die-ses Schwerpunkts bearbeiteten Pro-jekte lassen die Identifizierung neuar-tiger und innovativer Zellkomponen-ten für eine breite Anwendung in bio-technologischen und pharmakologi-schen Anwendungsgebieten erwarten.Durch die Einbeziehung neuer Orga-nismenklassen, beispielsweise extre-mophiler Mikroorganismen, sowiedurch den Einsatz modernster Scree-ningtechnologien (Aktivitätsprofilie-rung, PCR-Typisierung, Mikrotiterplat-tenreaktoren, TOP-DS, TOP-HS) ha-ben die Vorhaben einen besondersinnovativen Charakter. Durch die Iden-tifizierung neuartiger Leitstrukturenkönnen die Grundlagen zur Entwick-lung innovativer Wirkstoffgruppen ge-schaffen werden.

Effiziente Expression

Die Anwendung von Biokatalysatorenin biotechnologischen Produktions-verfahren scheitert vielfach noch dar-an, dass die benötigten Enzyme nichtin ausreichender Menge aus den Wild-typstämmen isoliert werden können.Es ist daher von besonderer Relevanz,effiziente Expressionssysteme in me-sophilen Wirtsorganismen zu optimie-ren und einzusetzen, um so die natür-lichen Quellen von Biokatalysatorenfür Umwelt und Gesellschaft zu nut-zen. In den Vorhaben dieses Themen-schwerpunkts werden daher innova-tive Expressionssysteme auch in Gram-positiven Mikroorganismen (Bacillus,Staphylococcus) und in Hefen inten-siv erforscht.

Downstream-Processing

Das Downstream-Processing spielt inbiotechnologischen Produktionsver-fahren eine entscheidende Rolle. Die

katalytische Umsetzung mittels immo-bilisierter Enzyme bzw. die Aufreini-gung von Bioprodukten erfordert ty-pischerweise feststofffreie Lösungen,die sich innerhalb von Festbett- undMembranenreaktoren oder Chroma-tographiesäulen einsetzen lassen. Diezum Erreichen eines feststofffreien Zu-stands eingesetzten Techniken, wieFällung, Zentrifugation oder Mikrofil-tration, machen oft ein kompliziertesvielstufiges Downstream-Processingerforderlich, das oftmals mit einem er-heblichen Chemikalien- und Energie-aufwand sowie einem Produktverlustverbunden ist. Strategien zur Verein-fachung von Downstream-Prozessen,beispielsweise durch Einsatz innova-tiver Trenn- oder Membrantechnolo-gien, werden in diesem Themen-schwerpunkt untersucht, um die Kon-kurrenzfähigkeit biotechnologischerProduktionsverfahren zu erhöhen.

ICBio-Koordination

Da es sich bei ICBio um ein offenesForschungsnetzwerk handelt, könnendie zurzeit bewilligten Projekte durchweitere Vorhaben in den oben genann-ten Themenschwerpunkten ergänztwerden. Übergeordnetes Ziel ist es,das herausragende Potenzial biokata-lytischer Verfahren und Produkte un-ter einem Dach zu bündeln, um hier-durch nachhaltig innovative Struktu-ren und Vernetzungen zu schaffen.

Die durch das ICBio Managementals Serviceleistung generierten Dienst-leistungen finanzieren sich aus DBU-Fördermitteln, die von den beteiligtenPartnern in Form von Unteraufträgenan ICBio weitergeleitet werden.Schwerpunkte der Aktivitäten des IC-Bio Managements sind: Kommunika-tion, Öffentlichkeitsarbeit und Wis-senstransfer.

Um Synergieeffekte zu generierenist eine intensive Kommunikationskul-tur von zentraler Bedeutung. DasICBio Management ist als ständigpräsenter Ansprechpartner sowohl fürdie Sicherstellung der internen Kom-munikation zwischen den Projektpart-nern als auch für die externe Kommu-nikation mit Interessensgruppen undder breiten Öffentlichkeit verant-wortlich. Neben dem Aufbau einesInternetportals unter der Adressewww.icbio.de gehören hierzu Veröf-fentlichung in Form von Broschüren,Beiträgen in Sonderpublikationen so-wie in fach- und populärwissenschaft-lichen Zeitschriften. Um den Wissens-transfer jenseits von Großveranstaltun-gen wie Messen und Kongressen zufördern, fungiert das ICBio Manage-

Sonderband | 2003 | 11BIOKATALYSEBIOKATALYSE

ment als Vermittlungsstelle zwischenKnow-how-Gebern und -Nehmern. ImBereich Weiterbildung bietet ICBio fürseine Projektpartner kostenlose Semi-nare an. So wurde beispielsweise imMai 2003 eine Seminarreihe zum The-ma Projektmanagement gestartet, dieim September 2003 weitergeführtwird.

ICBio Taskforcegruppen

Wie die Erfahrungen im Verbund Bio-katalyse gezeigt haben, sind Taskforce-gruppen ein wichtiges Instrument zurVerzahnung der Projekte. Die Task-forcegruppen bearbeiten definierte,erst während der Projektlaufzeit ent-standene Probleme und bieten über-greifende Lösungen an. So können dieICBio-Projekte flexibel an aktuelleFragestellungen angepasst werden.

Taskforcegruppe „Methoden“:Diese Taskforcegruppe soll die imRahmen von ICBio angewandten Me-thoden evaluieren, katalogisieren undallen interessierten Projektpartnernzugänglich machen. Hierdurch soll ge-währleistet werden, dass die im IC-Bio vorhandene Methodenvielfalt al-len beteiligten Partnern zur Verfügungsteht und gegebenenfalls für eigeneArbeiten genutzt werden kann.

Taskforcegruppe „Projektmana-gement“: Die Aufgabe der Taskforce-gruppe „Projektmanagement“ bestehtdarin, einheitliche Strukturen des Pro-jektmanagements und Projektcon-trolling zu erarbeiten und allen ICBio-Partnern zur Verfügung zu stellen. Zielist die Etablierung eines EDV-gestütz-ten Systems zur Sicherstellung eineseffizienten Projektmanagements beiIndustrie- und Hochschulpartnern.

Taskforcegruppe „Evaluation“:Die Taskforcegruppe „Evaluation“ soll

Kriterien zur Verfügung stellen, wel-che die wesentlichen betriebswirt-schaftlichen (Marktanalyse, Erlös- undKostenanalyse, ökonomische Umfeld-analyse) und ökologischen Parameter(Inputanalyse, Outputanalyse, ökolo-gische Umfeldanalyse) ausgewählterProjekte erfasst. Ziel ist es, schon infrühen Phasen der Entwicklung eineAbschätzung der Konkurrenzfähigkeitder neuentwickelten Verfahren undProdukte zu ermöglichen.

Organisation vonKongressen,Messeauftritten undStatusseminaren

Das ICBio Koordinationsbüro veran-staltet Meetings und Kongresse mitdem Schwerpunkt Biokatalyse. Insbe-sondere soll der International Con-gress on Biocatalysis (biocat), der imJuli 2002 erstmals in Hamburg statt-gefunden hat, als eine feste Plattformder in ICBio vernetzten Projekte aufinternationaler Ebene etabliert werden(weitere Informationen: http://www.biocatalysis.de). Darüber hinauswerden die in ICBio vertretenen Pro-jekte auf wichtigen Messen (z.B. Bio-technica) öffentlichkeitswirksam prä-sentiert. Die Förderung eines intensi-ven Erfahrungsaustausches zwischenden Projekten wird durch regelmäßigstattfindende Statusseminare sicherge-stellt.

Verbund Biokatalyse undICBio - Life Science aufhohem Niveau

Rund 90% aller Chemieproduktedurchlaufen bei ihrer Herstellung einkatalytisches Verfahren, oft unter Ein-satz umweltgefährdender Katalysato-

ren. Es ist unzweifelhaft, dass Bioka-talysatoren aus den verschiedensten(Mikro-)Organismen in Zukunft dieselektivere und spezifischere Alterna-tive darstellen werden. Gerade im Be-reich der pharmazeutischen Industrieund der Sparte Fein- und Spezialche-mikalien mit ihren hohen Anforderun-gen an Produktreinheit und -qualitätwird die Biokatalyse eine herausragen-de Rolle spielen. Einer Studie von Frost& Sullivan (2001) [8] zufolge wird derMarktwert für Chiraltechnologie von6,6 Mrd. US-$ im Jahr 2000 auf 16Mrd. US-$ im Jahr 2007 anwachsen.Die Biokatalyse wird hierbei eine zu-nehmend wichtige Ergänzung zurasymmetrischen Synthese darstellenund dem Bereich Life Sciences ent-scheidende Impulse verleihen. DieProjekte im Verbund Biokatalyse undin ICBio sind durch ihre thematischeAusrichtung optimal in der Zukunfts-technologie Biokatalyse positioniert.Die in beiden Forschungsnetzwerkenbearbeiteten Projekte werden dazubeitragen, die moderne Biotechnolo-gie um wichtige biokatalytische Verfah-ren und Produkte zu bereichern.Gleichzeitig wird dem Gedanken derNachhaltigkeit Rechnung zu tragen,indem sichergestellt wird, dass durchBiokatalyse Umweltschutz und Wettbe-werbsfähigkeit in Einklang gebrachtwerden.

Literatur

[1] OECD – Organisation for EconomicCo-Operation and Development(Hrsg.): Biotechnology for Clean Indu-strial Products and Processes – To-wards Industrial Sustainibility. Paris,1998.

[2] Bornscheuer, U.T., Kazlauskas, R.J.(1999). Hydrolases in Organic Synthe-

sis - Regio- and Stereoselective Bio-transformations, Wiley-VCH, Weinheim.

[3] Schoemaker, H.E., Mink, D., Wub-bolts, M.G., Science 299 (2003),1694-1697.

[4] Syldatk, C., Hauer, B., May, O., BIO-spektrum 2 (2001), 145-147.

[5] Antranikian, G., Klenk, H.-P., Freudl,R., Sterner, R., Liebl, W. (2001). In:BIOspektrum Sonderband Biokatalyse,S. Heiden, R. Erb (Hrsg.), SpektrumAkademischer Verlag, Heidelberg, 44-48.

[6] Grote, R., Bertoldo, C., Antranikian, G.(2001). In: Biotechnologie als interdis-ziplinäre Herausforderung. S. Heiden,C. Buschel, R. Erb (Hrsg.), SpektrumAkademischer Verlag, Heidelberg,294-331.

[7] Sahm, H., Freudl, R., Sprenger, G.(1999). In: Heiden, S., Bock, C., Antra-nikian, G. (Hrsg.). Industrielle Nutzungvon Biokatalysatoren - Ein Beitrag zurNachhaltigkeit. 15. Osnabrücker Um-weltgespräche. Initiativen zum Um-weltschutz, Band 14, Erich SchmidtVerlag, Berlin.

[8] Frost & Sullivan (2001). An As-sessment Of The Global Chiral Tech-nology Market (Report 3835), NewYork.

Korrespondenzadresse

Dr. Ralf GroteKoordinationsbüro VerbundBiokatalyse und ICBioTU Hamburg-HarburgTechnische MikrobiologieKasernenstraße 12D-21073 HamburgTel.: 040-42878 3336Fax: 040-42878 2729eMail: grote@tuhh.deWeb: www.biokatalyse.de,www.icbio.de

Besuchen Sie unsere Homepage

www.dbu.de

Dort finden Sie weitereBiotechnologie-Projekte inunserer Projektdatenbank(www.dbu.de/db/)

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AMINOSÄUREN

Biotechnologische Innovationen inder Aminosäure-Darstellung� Dr. Petra Peters-Wendisch1, Carsten Protsch2, Henning Serger3, Prof. Dr. Hermann Sahm1, Dr. Robert Faurie3, Priv.-Doz. Dr. Roland Ulber2,1Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich GmbH, D-52425 Jülich, 2Institut für Technische Chemie, Callinstr. 3, D-30167 Hannover, 3AMINOGmbH, An der Zuckerraffinerie 10, D-38373 Frellstedt

Möglichkeit, unter schonenden Be-dingungen ein breites Spektrum anAminosäuren zu gewinnen. Allen in-novativen Darstellungsmethoden vonAminosäuren, speziell für den Phar-mabereich, ist bisher die Notwendig-keit einer aufwändigen Aufreinigungund Aufarbeitung gemeinsam. Hier istdie Etablierung neuer Verfahren zurprozessintegrierten selektiven Abtren-

nung von Aminosäuren erforderlich.Die im nachfolgenden vorgestelltenvier Projekte beschäftigen sich mit dermikrobiellen Serinproduktion, derOptimierung der Tryptophanproduk-tion sowie der Hydrolyse von protei-nogenen Rohstoffen mittels Extremo-zymen und der Veredelung regiona-ler Rohstoffe durch neue Aufarbei-tungsverfahren.

MikrobielleSerinproduktion

Die Aminosäure Serin L-Serin wirdderzeit großtechnisch im Wesentli-chen auf zwei Wegen gewonnen:Durch Extraktion von Eiweißhydroly-saten bzw. durch Biotransformationoder fermentativ aus der AminosäureGlycin. Die für die erste Methode ein-gesetzte saure Hydrolyse proteinoge-ner Rohstoffe erfordert einen sehrhohen Energie- und Chemikalienein-satz und ist daher nur unter ökolo-gisch und wirtschaftlich problemati-schen Bedingungen durchführbar,während die Umwandlung von Glycinzu Serin, aufgrund des hohen Glycin-Preises wirtschaftlich eher unrentabelist.

Ziel war daher die Etablierung ei-nes mikrobiellen Verfahrens zur Pro-duktion von Serin ausgehend von demnachwachsenden kostengünstigenRohstoff Glukose und die anschlie-ßende Ökobilanzierung des neuenVerfahrens im Vergleich zum her-kömmlichen Verfahren der saurenHydrolyse.

Zur gezielten Konstruktion einesSerinproduktionsstammes mittelsmolekularer Methoden wurde dasBakterium Corynebacterium glut-amicum verwendet, das bezüglichseiner Fähigkeit andere Aminosäuren,wie Lysin und Glutamat, in großenMengen zu bilden gut untersucht ist[1]. Zunächst wurde die Biosynthesevon Serin analysiert. Die drei relevan-ten Gene serA, serC und serB wurdenaus C. glutamicum kloniert. Die Re-gulation der Synthese erfolgt auf En-zymaktivitätsebene durch Hemmungdes ersten Enzyms des Wegs, der 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase(PGDH, serA) durch Serin. Durch diegezielte Konstruktion von Allelen desserA-Gens von C. glutamicum mittelsPCR wurden PGDH-Muteine erzeugt,die sich nicht mehr durch Serin hem-men lassen [2]. Der Wildtyp von

Einleitung

Aminosäuren sind wirtschaftlich wert-volle Produkte, die in der Pharmain-dustrie, sowie der Nahrungs- und Fut-termittelindustrie Verwendung finden.Sie werden für pharmazeutischeZwecke in höchster Reinheit ohne An-wesenheit von Nebenprodukten benö-tigt. Beispielsweise sind AminosäurenBestandteile von Infusionslösungenfür die prä- und postoperative paren-terale Ernährung, wo vor allem die fürden Menschen essenziellen Aminosäu-ren, wie Lysin, Tryptophan oder Iso-leucin, wichtig sind. Obwohl die Ami-nosäure Serin als nicht-essenziell ein-gestuft ist, weiß man jedoch heute,dass sie im menschlichen Organismusnicht in ausreichender Menge synthe-tisiert werden kann. Damit wird auchsie in Zukunft eine immer bedeuten-dere Rolle als pharmazeutischer Wirk-stoff und als Nahrungsergänzungsmit-tel spielen. Ferner wird Serin als Vor-stufe zur enzymatischen Synthese vonTryptophan, einem ebenfalls wichtigenpharmazeutischen Wirkstoff benötigt.

Die Herstellung vieler Aminosäurenerfolgt großtechnisch durch Prozes-se wie chemische Synthese oder sau-re Hydrolyse proteinogener Rohstof-fe. Diese Methoden zeichnen sich je-doch durch eine hohe Umweltbela-stung aus. So erfordert die saure Hy-drolyse zusammen mit der nachfol-genden chromatografischen Trennungund Aufarbeitung einen sehr hohenEnergie- und Chemikalieneinsatz. Al-ternative Verfahren sind zum Beispieldie Fermentation mit geeigneten Mi-kroorganismen, die direkte enzyma-tische Katalyse oder die chromatogra-phische Aufreinigung von Aminosäu-ren aus nachwachsenden Rohstoffen.Alle alternativen Verfahren haben denVorteil, dass ausschließlich die biolo-gisch aktiven L-Aminosäuren gebildetwerden. Des Weiteren bietet die enzy-matische Hydrolyse proteinhaltiger,industrieller Nebenprodukte die

Abb. 1: Schema des Zentralstoffwechsels und der Serinbiosynthese in C.glutamicum und der darin vorgenommenen gezielten Veränderungen zurKonstruktion eine Serinproduktionsstammes. PGDH, 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase; PSAT, Phosphoserin-Aminotransferase; PSP, Phosphose-rin-Phosphatase; L-SD, L-Serin-Dehydratase.

Sonderband | 2003 | 13BIOKATALYSEBIOKATALYSE

C. glutamicum scheidet kein Serinaus, und erstaunlicherweise führte diealleinige Überexpression deregulier-ter serA-Gene nicht zu einer gesteiger-ten Serinbildung. Die Überexpressionaller drei Biosynthesegene im Wildtypführte jedoch zu einer geringen, abersignifikanten Steigerung der Serinbil-dung. Es wurde daher zusätzlich zurSynthese auch der Abbau von Serinuntersucht. Serin ist neben der Prote-insynthese auch Vorstufe der Synthe-se zahlreicher anderer zellulärer Me-tabolite. Es konnte gezeigt werden,dass die Umsetzung von Serin zu Py-ruvat durch das Enzym L-Serin-Dehy-dratase katalysiert wird und diese Re-aktion wesentlich für die Serinakku-mulation ist. Das Ausschalten dieserReaktion führte bei gleichzeitigerÜberexpression der Biosynthesegenezu einer 80-fachen Steigerung derSerinbildung. Um auch eine möglicheLimitation in der Bereitstellung derVorstufe für die Serinbildung, dem Gly-kolyseintermediat 3-Phosphoglycerat,auszuschalten, wurden Mutanten her-gestellt, die Glykolyseintermediateanstauen. Die Kombination dieserMutationen mit der Überexpressionder Serinbiosynthesegene und einerReduktion des Serinabbaus (Abb. 1)führte letztlich zu einer nochmaligenSteigerung der Serinausbeute bezogenauf das Produkt um das 6-fache, auf2,5 g/l.

Trotz dieser ermutigenden Ergeb-nisse sind weitere Fortschritte erfor-derlich, um auch eine wirtschaftlicheProduktion von Serin im industriellenMaßstab zu ermöglichen. Als Ziel fürdie Produktion wurde in der Modell-bildung für die Ökobilanz und dieWirtschaftlichkeitsanalyse für das fer-mentative Verfahren von 30 g/l Pro-duktausbeute und 47 % Aufarbei-tungsausbeute ausgegangen. Unterdiesen Bedingungen zeigen sich signi-fikante ökologische Vorteile des fer-mentativen Verfahrens gegenüber demReferenzverfahren der sauren Hydro-lyse. Insbesondere in den ökobilanzi-ellen Wirkungskategorien Energiebe-darf, Treibhauseffekt, Wasserver-brauch, Abwasser und mit Einschrän-kungen auch in der Kategorie Ozon-bildung ist das fermentative Verfahrender sauren Hydrolyse überlegen. Ausökonomischer Sicht bietet die Fer-mentation bei diesen Zielparameternrelativ zur sauren Hydrolyse und un-ter den Bedingungen eines deutschenProduktionsstandorts zwar Kostenvor-teile, um im internationalen Wettbe-werb dauerhaft bestehen zu könnenund um angesichts des herrschendenPreisdrucks auf dem Markt für Ami-

nosäuren auch in ungünstigen Markt-phasen mit ausreichenden Deckungs-beiträgen produzieren zu können, istjedoch eine weitere Verbesserung desStamms und des Gesamtprozesses er-forderlich.

Veredelung regionalerRohstoffe durch innovativeAufreinigungsverfahren

Die bei der Zuckerrübenverarbeitunganfallende Zuckerrübenmelasse stellteinen interessanten nachwachsendenRohstoff für verschiedene Einsatzbe-reiche dar. Das von der AMINO

Die Prozessführung des Trennver-fahrens basiert auf online gemesse-nen physikalischen Parametern. Aller-dings können diese Parameter bei derBestimmung der Schnittgrenzen fürdie Serin-Fraktion nur Anhaltspunk-te liefern, sodass das Elutionsverhal-ten aufgrund von Erfahrungswertenabgeschätzt und in regelmäßigen Ab-schnitten durch Probenahme undAnalyse im Labor offline kontrolliertwird. Die Analysenergebnisse stehenerst mit einer zeitlichen Verzögerungvon 12 – 24 h zur Verfügung. Erstdann kann festgestellt werden, ob dieTrennung optimal verlaufen ist.

tion ist proportional zur D-Serin-Kon-zentration. Zwar ergeben sich durchein schwankendes Konzentrationsver-hältnis von D- zu L-Serin in der Me-lasse deutliche Abweichungen bei derAbsolutkonzentration der D,L-Serin-gesamtkonzentration, was aber fürdie Bestimmung der Schnittgrenzenunerheblich ist. Der mit Hilfe des Bio-sensors bestimmte Konzentrationsver-lauf des Serin-Peaks stimmt sehr gutmit der HPLC-Referenzanalytik über-ein. Der Zeitbedarf des Biosensorsy-stems von zwei Minuten pro Analyseerlaubt es zwar nicht, dass die Schnitt-grenzen während der Elution festge-

Abb. 2: Konzept der In-Time-Analytik der D-Serinkonzentration während der chromatographischen Melasseent-zuckerung [5].

GmbH, Frellstedt, im industriellenMaßstab betriebene chromatographi-sche Verfahren zur Melasseentzucke-rung erlaubt neben der Extraktion desZuckers auch die gezielte Anreiche-rung anderer Melasseinhaltsstoffe.Bei diesem Verfahren wird die Melas-se durch Ionenausschluss-Chromato-graphie in einzelne Fraktionen ge-trennt. Bedingt durch die Säulenhö-he ist es möglich, nach zwei Stundeneine neue Melassecharge auf die Säu-le aufzugeben, obwohl ein komplet-ter Chromatographiezyklus etwasechs Stunden benötigt. Durch dieseProzessführung befinden sich insge-samt drei Trennläufe gleichzeitig aufeiner Säule und der Zyklus verkürztsich auf knapp zwei Stunden. Vonbesonderem Interesse für die hierdargestellten Arbeiten ist die Serin-Fraktion [3-5].

Um diese Probleme bei der Schnitt-führung zu umgehen, wurde ein bio-sensorisches Verfahren an dem Pro-zess etabliert, welches die Schnitt-grenzen der Serin-Fraktion in-timeund on-column ermittelt und somitzur Prozesssteuerung eingesetzt wer-den kann. Um Kreuzsensitivitäten mitanderen Aminosäuren im Elutions-profil zu vermeiden, war das EnzymD-Serin-Dehydratase in Kombinationmit Lactat-Dehydrogenase als biolo-gische Komponente für diesen Sen-sor am besten geeignet. Dabei machtman sich zunutze, dass unter den Be-dingungen der Zuckergewinnung dasSerin im geringen Ausmaß racemi-siert. Die Detektion erfolgt photome-trisch über das bei der Umsetzung ver-brauchte Cosubstrat NADH in einemDurchflussphotometer bei 340 nm.Die Abnahme der NADH-Konzentra-

legt werden, dieses ist aber durch diegeringe Änderung des Elutionsver-haltens der Trennkolonnen zwischenzwei Trennzyklen auch nicht zwin-gend notwendig. Für eine Optimie-rung des chromatographischen Pro-zesses ist es ausreichend, wenn dieAnalysenergebnisse in der Zeit zwi-schen zwei Serin-Peaks zur Verfü-gung gestellt werden können. Aufdiese Weise können die Schnittgren-zen der jeweils nachfolgenden Frak-tion optimal gesetzt werden (s. Abb.2). Im Vergleich zum anfänglichenZustand kann bei optimaler Ausle-gung des Prozesses eine bis zu 60 %höhere Produktkonzentration erzieltwerden. Daraus können bei dennachfolgenden Aufreinigungsschrit-ten und der Umsetzung des Serins zuTryptophan weitere Einsparungen er-zielt werden.

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Optimierung derTryptophanproduktion

Bei der AMINO GmbH werden Ami-nosäuren nicht nur über das beschrie-bene chromatographische Verfahrensondern auch über nachgeschalteteBiotransformationen (enzymatischeKatalyse) gewonnen. So wird die Se-rin-Fraktion durch eine biokatalysier-te Reaktion mit Indol zum Tryptophanumgesetzt [6-11]. Die Umsetzung er-folgt mit dem Enzym Tryptophansynt-hase als Biokatalysator und Pyridox-alphosphat als Coenzym. Für den Pro-zess wird eine Wildtypmutante vonEscherichia coli eingesetzt, die dasEnzym konstitutiv überexprimiert. DerBiokatalysator wird in der serinhalti-gen Reaktionslösung suspendiert unddas Indol im Fed-Batch-Verfahren zu-gegeben. Dabei muss eine zu hohe In-dolkonzentration vermieden werden,da sonst eine inhibierende Wirkungdie Prozesseffektivität herabsetzt. DieZellwände werden durch das Indolpermeabilisiert, sodass die Reaktan-den zum Enzym gelangen können. DieKonzentrationen von Tryptophan undIndol im Prozess werden mittels on-line-HPLC-Analyse verfolgt. Ausgehendvon diesen Messwerten wird die not-wendige Indolkonzentration durchentsprechende Dosierung aufrechterhalten. Nach Beendigung des Pro-zesses wird die Biomasse abzentrifu-giert und kann dann erneut eingesetztwerden. Die tryptophanhaltige Lösungwird durch Aktivkohle und mehrma-liges Umkristallisieren gereinigt.

Eine nicht optimale Prozessfüh-rung, und damit verbunden eine zukleine Reaktionsgeschwindigkeit,führt zu signifikanten Serinverlusten,sodass die Indolkonzentration ständigden aktuellen Prozessbedingungen(Enzymaktivität, Serinkonzentration)angepasst werden muss. Dies setzteine Prozessführung voraus, bei dersämtliche Substrat- und Produktkon-zentrationen gemessen werden, um sodie gesamte Reaktionskinetik und dievariierende Biokatalysatoraktivität zuerfassen und die Reaktandenkonzen-tration dementsprechend optimal ein-stellen zu können. Die hierdurch er-reichbare maximale Produktivität beigleichzeitiger optimaler Katalysator-nutzung und -schonung bewirkt direkteine Umweltentlastung und Einspa-rung von Ressourcen (Energie, Sub-strate etc.).

Ziel des Projekts war die Entwick-lung und der Einsatz eines innovati-ven Messsystems. Damit werden ak-tuelle Prozesszustände schneller er-fasst und somit die Prozessführung

dahingehend optimiert, dass einemaximale Raum-Zeit-Ausbeute, eingeringer Indolverbrauch sowie einehohe Produktkonzentration gewähr-leistet sind. Dazu wurde ein 2D-Pro-zessfluorimeter an den Prozess ange-koppelt (Abb. 3), das online alle fluo-reszierenden Komponenten der Reak-tionsmischung, z. B. Tryptophan undIndol, innerhalb kürzester Zeit erfas-sen kann [12]. Mit Hilfe einer Sensi-tivitätsanalyse der Spektren wurdeüberprüft, welche Wellenlängenberei-che Einfluss auf die Bestimmung derKonzentrationsverläufe für Trypto-phan, Serin und Indol nehmen. ZurAuswertung der 2D-Fluoreszenzspek-tren wurden chemometrische Model-le benutzt, um mit Hilfe der Spektrendie Prozessvariablen vorherzusagen.Um die Vorhersagefehler zu minimie-ren, wurden die Onlinevorhersagenmit Hilfe eines Kalman-Filters gefiltert.Durch diese Vorhersagen konnte derProzesszustand online ermittelt wer-den, welches die Grundlage der Füh-rung eines optimierten Prozesses ist.Die optimale Prozessführung zeichnetsich durch eine kontinuierlich abneh-mende Indolkonzentration aus, wo-durch eine Prozessführung im Bereichder höchst möglichen Reaktionsge-

schwindigkeit möglich wird. Aufgrunddieses Optimierungsansatzes wurde inden industriellen Prozess regelnd ein-gegriffen. Durch die Onlinevorhersa-ge der Prozessvariablen wurde derProzesszustand bestimmt und entspre-chend einer optimalen Prozessfüh-rung das Indol zugegeben. Die Tryp-tophanausbeute kann bei optimalerProzessführung um bis zu 30% gestei-gert werden, der Serinverlust um 25%gesenkt werden. Durch eine weitereVerbesserung der Indolzugabe lassensich die erzielbaren Tryptophanaus-beuten weiter erhöhen. Durch die op-timierte Prozessführung wurden eineerhöhte Produktkonzentration undAusbeute erreicht, wodurch die öko-logisch und ökonomisch anspruchs-volle Aufarbeitung vereinfacht werdenkonnte.

Hydrolyse mittelsExtremozymen

Kartoffelfruchtwasser (potatoe prote-in liquor, PPL) ist wie Molke und Me-lasse einer der landwirtschaftlichenReststoffe, die in Deutschland in ge-waltigen Mengen anfallen. Die jährli-che Verarbeitungskapazität von Kartof-feln zu Stärke liegt bei ca. 3,4 Millio-

nen Tonnen. Bei dieser Aufarbeitungfällt das PPL an, aus dem die Kartoffel-proteine isoliert werden können. Beimgegenwärtigen Stand der Technik de-naturieren die Proteine weitestgehendund verlieren nahezu vollständig ihrefunktionellen Eigenschaften, sodassdie Proteinisolate zurzeit nur als Vieh-futter geeignet sind. Der hohe Anteilder essenziellen Aminosäuren Leucin,Lysin, Valin und Phenylalanin machteine Weiterverarbeitung wie die Hydro-lyse zu Aminosäuren oder Peptideninteressant. Um die Aminosäuren ausdem Protein zu gewinnen, muss die-ses hydrolysiert werden. Stand derTechnik bei der Herstellung von Pro-teinhydrolysaten sind saure Hydroly-severfahren, die zwar ausgereift sind,aber neben einer schlechten Energie-bilanz auch hohe Salzfrachten verur-sachen. Die sauren Hydrolyseverfah-ren sind von der Umweltbelastung ausgesehen bedenklich. Nachteilig bei die-sem Hydrolyseprozess ist außerdem,dass die enantiomeren Reinheiten derAminosäuren verloren gehen. Eine al-ternative Methode zur Hydrolyse vonProteinen findet sich in der Anwen-dung von Enzymen (Proteasen) [13].Die enzymatische Hydrolyse läuft un-ter moderaten Temperaturen und

Abb. 3: Schematischer Aufbau des Messsystems zur On-Coulmn-Detektion fluorogener Aminosäuren bei derchromatographischen Melasseentzuckerung [11].

Sonderband | 2003 | 15BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Drücken ab. Der Einsatz von Chemi-kalien und die damit verbundene Salz-fracht im Abwasser ist stark reduziert.Ein weiterer Vorteil von enzymatischenVerfahren liegt darin, dass mit Aspa-ragin und Glutamin Aminosäuren zu-gänglich sind, die bei einer saurenHydrolyse zerstört werden. Ebenfallsdeutlich reduziert ist die Racemisie-rung der gewünschten Produkte. AlsEnzyme werden Proteasen verwendet,die in der Lage sind, die Peptidbin-dungen zwischen den einzelnen Ami-nosäuren zu spalten. Dabei werdensowohl Endo- als auch Exoproteaseneingesetzt.

Da bei der Verwendung von Kartof-felfruchtwasser als Substrat die inhi-

Um die Aminosäuren aus den Hy-drolysaten zu isolieren, mussten die-se noch weiter aufgearbeitet werden.Besonders die Peptide sollten abge-trennt werden, da sie als Nebenpro-dukt noch einen hohen Marktwertbesitzen und damit dazu beitragen,den Prozess wirtschaftlich interessan-ter zu machen. Für den industriellenProzess stehen für die Abtrennung Fil-terpressen zur Verfügung. Im Labor-versuch wurde die Abtrennung überZentrifugation und anschließendeRotationsverdampfung des Überstandsdurchgeführt, um ein aufkonzentrier-tes Filtrat zu erhalten. Die der Filtrati-on folgende Ionenausschluss-Chro-matographie lieferte eine Auftrennung

Zusammenfassung

Bei einer industriellen Umsetzung sol-cher Verfahren müssen natürlich auchunter dem Gesichtpunkt der zuneh-menden Globalisierung der Wirtschaftdie zu leistenden Investitionen zumAufbau der Verfahren stark gewichtetwerden. Was nützt ein ökologisch aus-gewogenes Produktionsverfahren,wenn der hiesige Anbieter durch bil-ligere, eventuell auf Umwelt unverträg-lichem Wege hergestellte Konkurrenz-produkte aus anderen Ländern vomMarkt gedrängt wird? Im Falle der Kar-toffelproteinhydrolyse konnte aberaufgezeigt werden, dass der Prozessin Hinblick auf die Kosten für den Ka-

Abb. 4: Prozessschema zur Gewinnung von Aminosäuren aus Kartoffelprotein [10].

von Peptiden und Aminosäuren (s.Abb. 4).

Da bei diesem Verfahren nur Was-ser als Eluent verwendet wird, zähltes zu den umweltschonenden Metho-den der Aufarbeitung. Die gewonne-nen Peptidfraktionen der Ionenaus-schluss-Chromatographie können alsNahrungsmittelzusätze genutzt wer-den. Die Aminosäurefraktion sollte alsAusgangslösung für die schnelle Iso-lierung von Aminosäuren mit Zeoli-then dienen. Anhand von Untersu-chungen an Modellgemischen, konn-te prinzipiell gezeigt werden, dass einsolches Verfahren für einzelne Amino-säuren möglich ist.

Bei der wirtschaftlichen Bewertungder enzymatischen Hydrolyse zeigtesich, dass vor allem in der höherenQualität der Koppelprodukte der en-zymatischen Hydrolyse Ertragspoten-tiale liegen, die das der sauren Hy-drolyse um ein Vielfaches überstei-gen. Letztlich wird dadurch die Ren-tabilität des enzymatischen Prozessesstark erhöht und die Vorteilhaftigkeitgegenüber der sauren Hydrolysesteigt. Auch für die ökologischen Fak-toren bei der Aminosäuregewinnungergibt sich bei der Einführung derenzymatischen Hydrolyse von Kartof-felfruchtwasser eine deutliche Ver-besserung.

talysator (Enzym statt Säure) zwardeutlich kostenineffizienter erscheint,dieser Malus durch höherwertige Kop-pelprodukte aber ausgeglichen wer-den kann. Durch die Integration neu-er Verfahrenschritte in die bestehen-den Produktionswege werden neueoder verbesserte Produkte zugänglich.Durch eine effiziente Prozesskontrol-le und der damit ermöglichten Pro-zessregelung können komplexe bio-technologische Systeme wie die bio-katalytische oder fermentative Herstel-lung von Aminosäuren optimal geführtwerden. Während in der universitärenForschung hierfür schon seit langembioanalytische Systeme eingesetzt wer-den, ist deren Einsatz in der industri-ellen Praxis eher selten. Solche inno-vativen Verfahren erfüllen aber sehreindrucksvoll die so oft geforderteNachhaltigkeit industrieller Verfah-ren – sowohl ökonomischer als auchökologischer Natur. Ohne eine stetigeWeiterentwicklung biotechnologi-scher Verfahrenstechniken käme die-se Entwicklung zum Erliegen.

Literatur

[1] Eggeling, L., Pfefferle, W., Sahm, H.,In: Basic Biotechnology, CambridgeUniversity Press, 2. Auflage (2001),281-303.

[2] Peters-Wendisch, P., Netzer, R., Egge-ling, L., Sahm, H., Appl MicrobiolBiotechnol. 60 (2002), 437-41.

[3] Sosnitza, P., Irtel, F., Ulber, R., Busse,M., Faurie, R., Fischer, L., Scheper, T.,Biosensors & Bioelectronics 13(1998), 1251-1255.

[4] Irtel, F., Sosnitza, P., Busse, M., Faurie,R., Fischer, L., Ulber, R., Scheper, T.,Chem.-Ing. Tech 72 (2000), 502-505.

[5] Ulber, R., Faurie, R., Sosnitza, P.,Fischer, L., Stärk, E., Harbeck, C.,Scheper, T., J. of. Chromatogr. A, 882(2000), 329-334.

[6] Protsch, C., Hitzmann, B., Faurie, R.,Ulber, R., Scheper, T., In: Biokonversi-on nachwachsener Rohstoffe, Land-wirtschaftverlag GmbH, Münster(2000).

[7] Ulber, R., Protsch, C., Solle, D., Hitz-mann, B., Willke, B., Faurie, R., Sche-per, T., Chem.-Ing. Tech. 73 (2001),524-526.

[8] Ulber, R., Protsch, C., Solle, D., Hitz-mann, B., Willke, B., Faurie, R., Sche-per, T., Engineering in Life Sciences 1(2001), 15-17.

[9] Solle, D., Protsch, C., Ulber, R., Seja,K., Willke, B., Faurie, R., Hitzmann, B.,Scheper, T., In: Erb, R., Heiden, S.(Hrsg.) Sensorik. Sonderausgabe derDBU in Kooperation mit BIOspek-trum, Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg. (2001), 12-15.

[10] Scheper, T., Ulber, R., Koop, T., Kose-mund, D., Müller, U., Huebner, S.,Tostmann, R., Faurie, R., In: Heiden,S., Erb, R. (Hrsg.) Biokatalyse Sonder-ausgabe der DBU in Kooperation mitBIOspektrum, Spektrum Akademi-scher Verlag, Heidelberg (2001), 69-72.

[11] Protsch, C., Solle, D., Hitzmann, B.,Willke, B., Faurie, R., Ulber, R., Sche-per, T., In: Beckmann, D. et al. (Hrsg.);Technische Systeme für Biotechnolo-gie und Umwelt – Biosensorik undZellkulturtechnik; Erich Schmidt Ver-lag, Berlin (2002).

[12] Ulber, R., Beutel, S., Frerichs, J.-G.,Anal Bioanal Chem 376 (2003), 342–348.

[13] Goehring, A., Chaijamaur, S., Koop, T.,Ulber, R., Scheper, T., In: Biokonversi-on nachwachsener Rohstoffe, Land-wirtschaftverlag GmbH, Münster(2000).

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Thomas ScheperUniversität HannoverInstitut für Technische ChemieCollinstr.3, D-30167 HannoverTel.: 0511-762 2509Fax: 0511-762 3004eMail: scheper@iftc.uni-hannover.de

bierende Wirkung der im PPL enthal-tenen Proteinklasse der Proteaseinhi-bitoren auf die eingesetzten Proteasenzu groß war, wurde auf Kartoffelkle-ber zurückgegriffen, der in der Stär-keproduktion bei der Firma Emsland-stärke in großen Mengen anfällt. DemAufbau des enzymatischen Verfahrenslag die Idee zugrunde, dass das Pro-tein über einen zweistufigen Prozesshydrolysiert wird. Im ersten Schrittsollte eine Endoprotease die Proteinein kleinere Bruchstücke zerteilen undsomit die Löslichkeit des Kartoffelpro-teins erhöhen. Über eine anschlie-ßend zugesetzte Exoprotease solltendiese Bruchstücke dann weiter in dieeinzelnen Aminosäuren gespalten wer-den. Um optimale Hydrolyseergebnis-se zu erzielen, musste eine geeigneteKombination von Endo- und Exopro-teasen gefunden werden, die sich auchim industriellen Maßstab einsetzenlässt. Als geeigneteste Kombinationenin Hinblick auf den Hydrolysegradkonnte die Kombination der Endopro-teasen Alcalase oder Savinase mit derExoprotease Flavorzym ermittelt wer-den. Da die enzymatische Hydrolyseselbst bei sehr hohen Hydrolysegra-den unter den gewählten Bedingun-gen nicht vollständig abläuft, erhältman neben den Aminosäuren fastebensoviel Peptide.

16 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

BIOPRODUKTION

Neue Wege zur Bioproduktionpharmazeutischer Wirkstoffe mitCorynebacterium glutamicum� Dr. Petra Peters-Wendisch1, Dr. Lothar Eggeling1, Dr. Birgit Klaßen2, Dr. Robert Faurie2 und Prof. Dr. Hermann Sahm1

1 Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich GmbH, 52425 Jülich, 2 Amino GmbH, An der Zuckerraffinerie 10, 38373 Frellstedt

Viele Primärmetabolite, die als phar-mazeutische Wirkstoffe interessantsind, stellen zentrale Stoffwechselin-termediate dar. Dies stellt besonde-re Anforderungen an die gezielteKonstruktion eines Organismus, mitdem ein solcher Primärmetabolitbiotechnologisch produziert werdenkann. Für die Aminosäure Serin wirddaher modellhaft ein neues resour-censchonendes Verfahren erarbeitet,bei dem zunächst durch klassischeMutation Produktionsstämme vonCorynebacterium glutamicum er-zeugt werden. Deren Mutationen wer-den dann aber anhand hochauflösen-der Techniken wie DNA-Chip-, Meta-bolom- oder Stoffflussanalyse mole-kular aufgeklärt, um so einen syste-mischen Zugang zur Zelle zu erhal-ten. Das gewonnene Wissen wird an-schließend gezielt eingesetzt, ummittels etablierter molekularer Me-thoden den Stoffwechsel zu verän-dern und so einen Hochleistungs-stamm für die Produktion von Serinzu generieren. Im Sinne eines pro-duktionsintegrierten Umweltschutzeserfolgt parallel zur Stammkonstruk-tion eine Optimierung der Aufarbei-tung von Serin durch Einführung ei-ner kontinuierlichen Ionenaus-tauschchromatographie.

Metabolic Engineering

Corynebacterium glutamicum wur-de als Glutamat-produzierendes Bak-terium isoliert und wird heute in gro-ßem Maßstab für die biotechnologi-sche Produktion der AminosäurenGlutamat und Lysin eingesetzt. Im Ge-gensatz zu Glutamat kann Lysin nurdurch geeignete Mutantenstämmevon C. glutamicum hergestellt wer-den. Während diese Bakterienstäm-me bislang weitgehend empirischdurch Mutation und Selektion ge-

wonnen wurden, ermöglichen heut-zutage detaillierte Untersuchungender Stoffwechselwege und deren Re-gulationsmechanismen sowie dieAufklärung der Genomsequenz einegezielte Stammverbesserung mit Hil-fe gentechnischer Methoden (Meta-bolic Engineering) [1].

In vorangegangenen Arbeitenkonnte durch das rationale Metabo-lic Engineering des Serin-Biosynthe-sewegs, des Abbaus von Serin undder Verbesserung der Vorstufenbe-reitstellung bereits ein Produktions-stamm von C. glutamicum erzeugtwerden, der jedoch vergleichsweisegeringe Mengen Serin im Medium ak-kumuliert. Obwohl durch das Meta-

bolic Engineering schon eine Reihevon hervorragenden Aminosäurepro-duzenten von C. glutamicum gewon-nen werden konnten, beinhaltet die-ser Ansatz jedoch keine Möglichkeit,Quervernetzungen zu anderen Stoff-wechselwegen aufzudecken, die dasGesamtsystem betreffen. Darüberhinaus ignoriert dieser Ansatzzwangsläufig ein Drittel der Gene desGenoms, da deren Funktion nicht be-kannt ist und er vernachlässigt auchdie Bedeutung von sogenannten „leaky“ Mutationen. So konnte kürz-lich gezeigt werden, dass die Expres-sion von nur drei Genen, teilweise mit“leaky” Mutationen, im Wildtyp-Hin-tergrund von C. glutamicum zu ei-

nem Stamm führt, der bereits bis zu100 g/l Lysin produziert [2].

Inverses MetabolicEngineering

Das Ziel ist es daher, das bisher ratio-nal nicht erschlossene Potenzial klas-sisch gewonnener Produktionsstäm-me in einem neuen, wiederum ratio-nalen Ansatz (Inverse Metabolic En-gineering) zu nutzen, um einen Hoch-leistungsproduktionsstamm für Serinzu erzeugen. Dazu wird eine dreistu-fige Strategie verfolgt (Abb. 1). DasKonzept sieht im ersten Schritt alswesentliches Element ein Screeningaufgrund einer geeigneten Selektionzur Isolierung eines Stamms vor, derin der Lage ist, Serin auszuscheiden.Hierzu wird zunächst ausgehend vomWildtyp oder einem „Low-level“-Pro-duktionsstamm von C. glutamicumein zunächst widersinnig erscheinen-der Stamm geschaffen, der einen sehrhohen Bedarf an Serin hat. Von die-sem werden aber im zweiten SchrittKlone isoliert, die dann auch ohneexterne Zugabe hoher Serin-Konzen-trationen wachsen können. In diesemSchritt wird also auf Mutationen se-lektioniert, die zu hoher Serin-Bil-dung führen. Auf dieser Stufe erfolgtdie globale Genom-weite Analyse derevolvierten Klone mittels der DNA-Chip Analyse zur Identifizierung ver-änderter Genexpressionsmuster [3].Als weitere globale Analyse werdenMetabolom- sowie Stofffluss-Analysenzur Aufklärung von veränderten in-ternen Metabolitkonzentrationen undStoffflüssen durchgeführt. Dadurchwerden die mutierten Zielgene iden-tifiziert, deren Veränderung als Aus-wirkung zu erhöhter Serin-Bildungführen. Diese Gene werden kloniert,sequenziert und anschließend aufihre Funktion hin untersucht.

Abb. 1: Dreistufiges Konzept zur Gewinnung eines hocheffizienten Serin-Produktionsstamm basierend auf der Strategie des „Inverse MetabolicEngineering“. Stufe I: Mutagenese und Selektion (Screening nach Stäm-men mit verbesserten Eigenschaften), Stufe II: Analyse (Vergleich vonWildtyp und undefiniertem Produzent durch DNA-Microarrays, Fluss-Ana-lyse und Bestimmung von Metabolit Pools), Stufe III: Synthese und Ex-pression (Konstruktion von Stämmen mit verbesserten Eigenschaften).Parallele Optimierung des Downstream-Processings zur Isolierung derreinen Aminosäure Serin.

Sonderband | 2003 | 17BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Die dritte Stufe beinhaltet die ge-zielte Nutzung der erhaltenen Er-kenntnisse, indem die zur Serin-Überproduktion notwendigen Muta-tionen gezielt z.B. in den Wildtyp ein-gebracht werden. Dies geschieht ggf.in Kombination mit den schon ausden Vorarbeiten bekannten notwen-digen Veränderungen, mit dem Ziel,durch die Kombination aller erfor-derlichen Eigenschaften einen hoch-effizienten Serin-Produktionsstammzu gewinnen. Auf jeder Stufe derStammentwicklung stehen Stämmezur Verfügung, die bereits von Beginndes Projekts an zur Optimierung derFermentation und des Downstream-Processings eingesetzt werden kön-nen. Die Optimierung des Downst-ream-Processings beinhaltet vor al-

lem die Etablierung eines einstufigenVerfahrens zur Isolierung von Serinaus dem Fermentationsmedium übereinen kontinuierlichen Ionenaustau-scher [4].

Systembiologie zurBioproduktion

Dieser innovative systembiologischeAnsatz zeichnet sich dadurch aus,dass die zunächst undefinierten Ver-änderungen klassisch erzeugter Se-rin-Produktionsstämme analysiertund auf molekularer Ebene aufge-klärt werden, und dass im Weiterendie Mutationen, die zu diesen not-wendigen Veränderungen führen,gezielt eingesetzt werden um definier-te Serin-Produktionsstämme zu er-

halten. So sind Hochleistungsstämmezu erwarten, bei deren Fermentationkeine Nebenprodukte anfallen, dieeine optimale Substratumsetzung auf-weisen und mit denen erheblich um-weltverträglicher Serin produziertwerden kann als es mit vorhandenenSerin-Produktionsstämmen möglichist. Darüber hinaus trägt dieser An-satz zum besseren Verständnis dergesamten Zelle und zur funktionel-len Charakterisierung bisher unbe-kannter Gene bei.

Literatur

[1] Eggeling, L., Pfefferle, W., Sahm, H.,In: Basic Biotechnology, CambridgeUniversity Press, 2. Auflage (2001),281-303.

[2] Ohnishi, J., Mitsuhashi, S., Hayashi,M., Ando, S., Yokoi, H., Chiai, K.,Ikeda, M., Appl. Microbiol. Biotechnol.58 (2002), 217-223.

[3] Lange, C., Rittmann, D., Wendisch,V.F., Bott, M., Sahm, H., Appl.Environ. Microbiol. 69 (2003),2521-32.

[4] Schick, R., In: Zuckerindustrie 122(2000), 34-38.

Korrespondenzadresse

Dr. Petra Peters-WendischInstitut für Biotechnologie 1Forschungszentrum Jülich GmbHD-52425 JülichTel.: 02461-615430Fax: 02461-612710eMail: p.wendisch@fz-juelich.de

EXTREMOPHILE

Umweltfreundliche Aufbereitungvon Hühnerfedern mittelsextremthermophiler Bakterien undthermostabilen Enzymen� Dipl.-Biotechnol. Julia Brodersen1, Dr. Sabine Rießen2, Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian2, Prof. Dr. Herbert Märkl11 Bioprozess- und Bioverfahrenstechnik, Technische Universität Hamburg-Harburg , 2 Technische Mikrobiologie, Technische Universität Hamburg-Harburg

Bei einer jährlichen Geflügelproduk-tion von etwa 800.000 t in Deutsch-land fallen große Mengen von Abfall-stoffen an. Eine Komponente davonbilden die Federn, welche zum Teil alsBettfedern weiterverwertet werden.Der restliche Anteil der Federn vonmehr als 20.000 t muss als Abfall ent-sorgt werden, was sich für Geflügel-schlachtereien als zunehmend proble-matisch darstellt. Neben der Entsor-gung in Tierkörperbeseitigungsanla-gen und der Kompostierung wird einGroßteil zu Federmehl verarbeitet undfindet nach den EU- „Hygienevor-schriften für nicht zum menschlichenVerzehr bestimmte tierische Neben-produkte“ vorwiegend Einsatz als Zu-schlagstoff für die Herstellung vonKleintierfutter. Die nativen Federn unddas Federmehl stellen allerdings mehr

Ballaststoff als hochwertiges Futter-protein dar, da es kaum verdaulich ist.

Stand der Technik

Keratine, die wesentlichen Bestandtei-le von Federn, sind eine komplexe Mi-schung von unlöslichen Proteinen undin der Natur weit verbreitet. Die struk-turbildenden Aminosäuren sind zu ei-nem β-Faltblatt angeordnet. Nach dem„Twisted-sheet“-Modell bilden jeweilszwei gegenläufige Stränge von β-Falt-blatt-Ketten (Abb. 1) eine linksdre-hende helikale Superstruktur, diedurch die hervorstehenden Seitenket-ten vernetzt wird [1]. Das β-Keratinweist eine hohe mechanische Stabili-tät aber nur eine geringe Elastizität auf.Die Stabilität, die Unlöslichkeit unddas weitgehend inerte Verhalten ge-

genüber Umwelteinflüssen sind ver-mutlich auf den hohen Gehalt an in-tramolekularen Cystinbrücken undPeptidbindungen zwischen den einzel-nen Aminosäureketten zurückzufüh-ren [2,3]. Hierauf beruht auch dieResistenz gegenüber den meisten Pro-teasen, wie z. B. Trypsin [1]. Feder-keratin ist besonders reich an denAminosäuren Serin, Glutamat, Cystein,Prolin, Leucin und Valin.

Als Futtermittelzugabe wird aus denAbfallfedern Federmehl hergestellt.Durch die Dampfhydrolyse oder dieExtrudierung bei hohen Scherkräftenwird die Verfügbarkeit der Proteinedurch das Aufbrechen der Disul-fidbrücken erhöht. Die chemischeHydrolyse wird mit Wasserdampf undbei Drücken von bis zu p = 6,9 bardurchgeführt. Das Mehl kann jedoch

nur in Anteilen von 5% bis 8% demFuttermittel zugemischt werden, danur geringe Mengen an primär limi-tierenden Aminosäuren Cystein undMethionin enthalten sind.

Unter der Vielzahl an Produkten,die aus Abfallfedern hergestellt wer-den können, stellen Aminosäuren undPeptide insgesamt betrachtet die wert-vollsten Erzeugnisse dar.

Zur Herstellung eines hochwertigenFuttermitteladditivs oder hochwertigerAminosäuren aus Federn wird derzeitdie chemische Hydrolyse mit Salzsäu-re oder Natronlauge eingesetzt [4].Diese führt jedoch zu einem breitenProduktspektrum, sodass eine auf-wändige Aufarbeitung erforderlich ist.Die resultierende hohe Salzfracht imProduktstrom ist zudem umweltbela-stend. Chemische Hydrolyseverfahren

18 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Bausteine des Keratins, die Aminosäu-ren und Peptide, gespalten wird. Ent-weder wird der Abbau in vivo von ex-trem thermophilen Bakterien geleistetoder in vitro mit thermostabilen En-zymen. In beiden Fällen wird das Ke-ratin zu löslichen Peptiden und Ami-nosäuren umgesetzt und steht damitals hochwertiges Futtermitteladditivzur Verfügung.

mophilen Organismen führen hinge-gen zu einer deutlichen Absenkung derKeimbelastung und verhindern dasWachstum mesophiler, möglicherwei-se pathogener Keime.

Bei ausreichender Thermostabilitätder Enzyme lassen sich Reaktionen beiTemperaturen von T = 70°C und dar-über durchführen, bei denen die Ge-fahr einer Kontamination durch me-sophile Organismen deutlich verrin-gert wird. Der Abbauprozess unterextrem thermophilen Bedingungenmuss nicht steril geführt werden, wasden apparativen Aufwand deutlich ver-ringert und einen entscheidenden Vor-teil darstellt. Somit ist zu erwarten, dassein thermophiles Verfahren am ehe-sten unter wirtschaftlichen Gesichts-punkten durchgeführt werden kann.

ErgebnisseAuswahl geeigneterBakterien

Im Zuge eines Screeningprogrammesauf den Azoren wurden thermophilekeratinabbauende Mikroorganismenangereichert. Es konnten mehrere Or-ganismen isoliert werden, die in derLage sind, auf nativen Federn als Koh-lenstoffquelle zu wachsen. Zwei der

innerhalb von zwei bis drei Tagen na-hezu vollständig zu Peptiden und Ami-nosäuren abgebaut werden. Die Kera-tinase aus Fervidobacterium pen-nivorans besitzt ein Molekulargewichtvon 130 kDa und einen isoelektrischenPunkt von pH 3,8. Sie wurde als alka-lische Serinprotease klassifiziert, diebei Temperaturen zwischen T = 65°Cund T = 90°C und pH-Werten vonpH 6 bis pH 12 aktiv ist und überwie-gend zellgebunden vorliegt.

Der zweite Stamm, Thermoanaero-bacter keratinophilus, ein neues ther-mophiles anaerobes Bakterium [9], istder erste Vertreter der Gattung Ther-monanaerobacter, für den der Abbaukeratinhaltiger Fasern beschriebenwurde. Der stäbchenförmige Organis-mus wächst optimal bei 70°C und pH7,0. An der Hydrolyse des Federkera-tins durch T. keratinophilus ist vor-wiegend ein extrazelluläres proteoly-tisches Enzym beteiligt (s. Abbildung5).

Die extrazelluläre Protease aus T.keratinophilus ist optimal aktiv bei85°C und pH 8,0 und besitzt eine hoheTemperaturstabilität bei 70°C. DieHalbwertszeit liegt bei über 2 Tagen.Diese Temperaturstabilität bei optima-ler physiologischer Wachstumstempe-ratur ist für den in vivo Abbau vonnativen Federn durch T. keratinophi-lus vorteilhaft. Da die Wachstumsbe-dingungen denen von F. pennivoranssehr ähneln, könnte eine künstlicheMischkultur für einen verbessertenFederabbau sorgen. In diesem Fall ste-hen zwei Proteasen gleichzeitig für dieAbbau zur Verfügung, die voraussicht-lich an verschiedenen Stellen das Ke-ratin spalten und damit den Prozessbeschleunigen könnten.

Charakterisierung desAbbaus mit lebendenBakterienkulturen

Für eine Charakterisierung des Abbau-verhaltens wurden Rein- und Misch-kulturen von F. pennivorans undT. keratinophilus eingesetzt und hin-sichtlich Substratkonzentration, einermöglichen Kostenreduktion bezüglichnotweniger Zuschlagstoffe sowie ver-einfachten Prozessbedingungen zurBegrenzung des apparativen Aufwandsuntersucht.

Im Zuge einer Medienoptimierungausgehend von einem komplexen An-aerobiermedium (Mineralsalze, Hefe-extrakt, Trypton, Reduktionsmittel,Abb. 3) mit 1-2g/l Federn mit über80%-igem Abbau binnen 2-3 Tagenwurde eine für den Abbau zu löslichenProteinen optimale Federkonzentra-

können im Übrigen zur Entstehungunerwünschter Nebenprodukte füh-ren, beispielsweise zu potenziell kan-zerogenen Chlorverbindungen beimEinsatz von Salzsäure. Nachteil deralkalischen Hydrolyse ist der Teilab-bau der freigesetzten Aminosäurenunter anderem durch Desaminierung[5]. Dies führt zu einer Verminderungder Bioverfügbarkeit der Nährstoffeund somit zu einer Verschlechterungder Futterqualität [6,7].

Vorgehen derbiotechnologischenVerfahren

Eine Alternative stellen biotechnolo-gische Verfahren dar, bei der dasschwer zugängliche Keratin durchspezielle Bakterien und deren Enzy-me in leicht verdauliche Peptide undAminosäuren gespalten wird. Die Her-stellung von Futtermittelzusätzendurch den Einsatz von Mikroorganis-men oder ihren Enzymen hat den Vor-teil, dass bei den enzymatischen Ver-fahren im Vergleich zu herkömmli-chen Prozessen weniger unerwünsch-te Nebenprodukte erzeugt werden. DieRückstände der Fermentation sindbiologisch abbaubar; es entstehenkeine neuen Problemstoffe, die ledig-lich eine Verlagerung der Entsor-gungsproblematik darstellen würden.

Im Gegensatz zu den chemischenVerfahren werden bei einem biotech-nologischen Prozess die Federn beimoderaten Drücken und Temperatu-ren im pH-neutralen Bereich mit En-zymen abgebaut. Es gibt mehreredenkbare Verfahrensalternativen (Ab-bildung 2), bei denen der RohstoffFeder ohne weitere chemische Vorbe-handlung oder Zerkleinerung in die

Abb. 1: Sekundärstruktur des Keratins: ß-Faltblattstruktur. 95 % der Fe-dern bestehen aus βββββ-Keratin [10].

Abb. 2: Wege zum Ziel: Die Federn können entweder durch extremophileBakterien oder durch Einsatz von thermostabilen Enzymen (Proteasen) inAminosäuren und Peptide gespalten werden. Letztere verwandeln die Ab-fallfedern in ein hochwertiges Futtermitteladditiv.

Isolate, Fervidobacterium pennivor-ans und Thermoanaerobacter kera-tinophilus, erschienen für den Abbauvon nativem Federkeratin zur Gewin-nung von Peptiden und Aminosäurenbesonders geeignet.

Der erste anaerobe Stamm, Fervi-dobacterium pennivorans, ein zurOrdnung der Thermotogales zählen-des Bakterium, welches optimal bei70°C und pH 7,0 wächst, weist einehohe Protease- bzw. Keratinaseaktivi-tät auf [8]. So konnten native Federn

Warum extrem thermophil?

Bei der Schlachtung werden die Federnunweigerlich mit Wasser und geringenMengen von Schlachtabfällen ver-mischt, die einen idealen Nährbodenfür Keime darstellen. Für einen meso-philen Abbau müssten die Federn vordem Abbau hygienisiert werden. DerAbbauprozess müsste weitgehendaseptisch geführt werden. Höhere Pro-zesstemperaturen von etwa 70°C mitan diese Temperatur angepassten ther-

Sonderband | 2003 | 19BIOKATALYSEBIOKATALYSE

tion von 10g/l (1% Feststoffanteil) er-mittelt. Hierbei konnten bis zu 50%innerhalb von 3 Tagen in Lösung ge-bracht werden. Bei höheren Federkon-zentrationen im Bioreaktor (Abb. 4)wurden geringere Abbaugrade erzielt.Es wurde untersucht, ob für das Ver-fahren alle Anteile des Komplexmedi-ums notwendig sind. Hefeextraktkonnte ohne Umsatzeinbußen um 90%von 5g/l auf 0,5g/l verringert werden.Trypton ist als Medienbestandteil nichtnotwendig. Der Austausch von Hefe-extrakt durch andere Komplexbe-standteile wie Sojamehl gelang nicht.Auf Autoklavieren und steriles Arbei-ten konnte verzichtet werden, da we-der makro- noch mikroskopisch Kon-taminationen beobachtet wurden, wasauf die hoheProzesstemperatur zu-rückzuführen ist.

Die Hauptabfallmengen stellen so-wohl Federn als auch Federmehl dar.Letzteres konnte mit Hilfe einer Misch-kultur von F. pennivorans und T. ke-ratinophilus mit einer Abbaurate von15% nur schlecht abgebaut werden.Die Zellen wuchsen nur bis zu einerZelldichte von 3,5x107 Zellen/ml. DaFedermehl nicht nur aus gemahlenenFedern besteht, sondern alle bei derVerarbeitung der Hühner anfallendenSchlachtabfälle beinhaltet, könntensich auch zahlreiche Stoffe, die dasWachstum oder die Enzymaktivität in-hibieren, darin befinden.

Produktion vonthermostabilen Proteasenfür den in vitro Abbau

Da beide Keratinaseproduzenten ther-mophile anaerobe Mikroorganismensind, ist die Enzymausbeute bedingtdurch den anaeroben Stoffwechselgering. Um die Umsetzung von Kerati-nen zu Aminosäuren und Peptiden ef-fektiv durchführen zu können, ist eserforderlich, die thermostabile Pro-teasen rekombinant in mesophilenWirtsstämmen, wie z.B. E. coli oderBacillus, zu produzieren. Vorteile ei-ner heterologen Genexpression sinddie deutlich höheren Enzymausbeutenin sehr gut untersuchten Systemen. DieKlonierung in Bacillus, einem Gram-positiven Organismus, bietet im Ge-gensatz zu E. coli, einem Gram-nega-tiven Organismus, den möglichen Vor-teil einer Sekretion der rekombinan-ten Enzyme in das Kulturmedium. ImGegensatz zur intrazellulären Produk-tion kann auf diesem Wege die Bildungvon „inclusion bodies“ oder eine to-xische Reaktion des Fremdproteinsauf die Wirtszelle vermieden werden.Zusätzlich wird durch die Sekretion

des Proteins meist eine signifikanteProduktanreicherung erzielt und er-möglicht den Einsatz einer kontinu-ierlichen Fermentation zur Produkt-gewinnung.

Basierend auf diesen Erkenntnissenwäre die Klonierung der keratinase-kodierenden Gene in einem sekreto-rischen System vorteilhaft. Bisherkonnten beide Proteasen aus Fervi-dobacterium pennivorans sowieThermoanaerobacter keratinophi-lus in E. coli kloniert werden. Die

siert. Zusätzlich wird die Klonierung inBacillus megaterium in Kooperationmit Prof. Jahn (Institut für Mikrobio-logie, TU Braunschweig) angestrebt.

Gesteigerte Raum-Zeit-Ausbeuten durch direktenEnzymeinsatz

Vergleichend zu den Verfahren mit En-zymen aus den thermophilen Mikro-organismen wurde der Abbau von Fe-dern und Federmehl auch mit käufli-chen Proteasen untersucht. Es konn-ten zwei käuflich erhältliche Protea-sen (Alkalase und Erha) für den Ab-bau bei 60°C eingesetzt werden. Dieaus dem Handel bezogenen Proteasenbesitzen bei 60°C eine Halbwertszeitvon nur 0,2 und 5 Stunden. Die Pro-tease von T. keratinophilus hingegenweist mit einer Halbwertszeit bei 70°Cvon mehr als 50 h eine 10fach höhe-re Temperaturstabilität auf und istdamit für die Zielsetzung des umwelt-schonenden Federabbaus geeignet.

Von 25g/l Federn wurden mit aus-schließlich Wasser und im Handel er-hältlichem Enzym 16% binnen 24h inLösung gebracht. Die Zugabe von Re-duktionsmitteln erbrachte eine Steige-rung auf 25%. Die Präsenz von 50 mMPhosphatpuffer (pH 8) steigerte denAbbau auf 80% bei 25g/l Einwaage.Wurde die Menge der Federn auf100g/l vervierfacht, ließen sich 20 %lösen.

Zum Vergleich: Mit der thermosta-bilen Protease aus T. keratinophilus

konnte ein Umsatz in Gegenwart vonReduktionsmittel und Puffer von 55%bei 25g/l Federn und sogar von 37 %bei 100g/l nachgewiesen werden.

Fazit

Aufgrund der im Vergleich mit käufli-chen Proteasen 10-fach höheren Tem-peraturstabilität ist die Protease ausT. keratinophilus gut für einen um-weltschonenden Federabbau geeignet.Ziel ist es, in nächster Zeit ausreichen-de Mengen des rekombinanten En-zyms herzustellen und dieses für dieVerfahrensentwicklung zur Verfügungzu stellen. Nach einer erfolgreichenKlonierung in einen Produktions-stamm, der die Protease ins Mediumsekretiert, bedarf es dazu einer wei-teren Produktionsoptimierung im grö-ßeren Maßstab. Weiterhin wird die re-kombinante Protease charakterisiert,und Ihre Eigenschaften werden mitdenen der Protease aus dem Wildtyp-stamm verglichen.

Literatur

[1] Fraser, R.D.B., MacRae, T.P., Rogers,G.E. (1972): Keratins – Their Compo-sition, Structure and Biosynthesis.Charles C. Thomas Publ. Springfield,Ill. U.S.A.

[2] Crewther, W.G., Dowling, L.M., J. Text.Inst. 51 (1960), T775.

[3] Harding, H. W. J.,Rogers, G.E., Bio-chem. 10 (1971), 624.

[4] Hoppe, B., Martens, J., Chemie inunserer Zeit 18 (1984), 73-86.

[5] Voet, D., Voet, J. G., Biochemistry. 2.Aufl. John Wiley & Sons, Inc., NewYork (1995), 58-59.

[6] Papadopoulos, M. C., Agric. Wastes14 (1985), 275-290.

[7] Papadopoulos, M. C., Biol. Wastes 29(1989), 123-138.

[8] Friedrich, A., Antranikian, G., Appl.Environ. Microb. 62 (1996), 2875-2882.

[9] Riessen, S., Antranikian, G., Extremo-philes 5 (2001), 399-408.

[10] Karlson, P. Kurzes Lehrbuch der Bio-chemie. 12. Aufl. Georg Thieme Ver-lag, Stuttgart (1984), 39-40.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr.-Ing. Herbert MärklBioprozess- undBioverfahrenstechnikTU Hamburg-HarburgDenickestr. 15D-21071 HamburgTel.: 040-42878 3017Fax: 040-42878 2909eMail: maerkl@tu-harburg.de

Abb. 3: Kulturgefäßezur Anzucht der an-aeroben extremther-mophilen Bakterienauf Komplexmediummit Federn für denanschließenden Ab-bau von Keratin imBioreaktor.

Abb. 4: Versuchsanlage im 2-l-Maßstab zum Abbau der Federnmit lebenden Bakterien und Pro-duktion von thermostabilen Enzy-men.

rekombinate Keratinase aus F. pen-nivorans liegt jedoch nur in der inak-tiven Form vor (Kooperation: Prof. W.de Vos, Kluskens et al., 2002). Die re-kombinante Protease aus T. keratino-philus wird derzeit weiter charakteri-

Abb. 5: Elektrophoreti-sche Auftrennung derextra- und intrazellulä-ren Proteasefraktionenaus Thermoanaerobac-ter keratinophilus imSDS-Polyacrylamidgel(9%ig). Das im Gel vor-liegende Federmehlkonnte durch keratinoly-tisch aktive Proteine ineinem anschließendenInkubationsschritt bei70°C und pH 7,0 hydroly-siert werden. Nur in der extrazellulären Enzymfraktion wurden keratinoly-tisch aktive Proteine nachgewiesen (siehe Pfeil).

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ABWASSERREINIGUNG

Aerobe thermophile Reinigungfetthaltiger Abwässer derLebensmittelindustrie mitBacillus thermoleovorans� Dipl.-Biol. Matthias Krüger1, Dipl.-Ing. Ingo Reimann1, Prof. Dr.-Ing. Herbert Märkl1, Dr. Jörg Taube2, Dipl.-Ing. Wolfgang Eckert2

1 Bioprozess- und Bioverfahrenstechnik, TU Hamburg-Harburg, 2 Fa. Rauschert Verfahrenstechnik GmbH, Steinwiesen

Im Mittelpunkt eines Forschungsvorhabens an der TU Hamburg-Harburg stand die Entwicklung eines neuen leistungsstarken Verfahrens zur Reinigungfetthaltiger Abwässer aus der Lebensmittelindustrie unter Einsatz des aerob thermophilen Bakteriums Bacillus thermoleovorans IHI-91 sowie einer Zell-rückhaltung durch Membranfiltration. Nach Vorversuchen im Labor konnte durch kontinuierliche Experimente im Pilotanlagenmaßstab die Leistungsfä-higkeit des Verfahrens unter Beweis gestellt werden. Bei einer hydraulischen Verweilzeit von 3 bis maximal 8 Stunden und einer daraus resultierendenmittleren CSB-Raumbelastung von 2,5 g l-1 h-1 und Fett-Raumbelastung von 1,7 g l-1 h-1 konnte eine CSB-Eliminationsrate von mehr als 90 % erreicht wer-den. Die Zelldichte betrug hierbei 8 x 108 Zellen ml-1 entsprechend 0,62 g Trockensubstanz ml-1. Durch die hohe mikrobielle Reinigungsleistung ergibt sichein kompaktes Anlagendesign. Der Betreuungsaufwand ist vergleichsweise gering.

Keywords: Reinigung, Fett, Abwasser, Mikrofiltration, Pilotanlage, Bacillus thermoleovorans.

höheren Temperaturen besondersaktiv sind und gleichzeitig das Substrat- in diesem Fall die Fette des Abwas-sers - dann erst in entscheidendenMengen bioverfügbar wird. Im Mittel-punkt dieses Projekts stand unter Mit-wirkung des Industriepartners, derFirma Rauschert Verfahrenstechnik,die Umsetzung vielversprechenderVorarbeiten im Labor in einen tech-nisch nutzbaren Prozess. Das Konzeptbeinhaltet neben dem mikrobiellenFettabbau die Anwendung von Mem-branen zur Rückhaltung von Biomas-se im Reaktor. Durch den geplantenEinsatz geeigneter Nachbehandlungs-verfahren kann das gereinigte Abwas-ser im Sinne eines produktionsinte-grierten umweltschonenden Verfah-rens wiederverwendet werden.

Material und Methoden

Der Mikroorganismus.Bacillus thermoleovorans IHI-91wurde aus einer Wasserprobe einer

heißen isländischen Quelle isoliert[1] und ist aus humanpathogenerSicht völlig unbedenklich. Es handeltsich um ein katalase-positives, stäb-chenförmiges Bakterium, das in derLage ist, terminale ovale Endosporenzu bilden. Das neuisolierte Bakteri-um ist obligat thermophil, es wächstinnerhalb eines Bereichs von 37°Cbis 75°C mit einem Temperaturopti-mum bei 65°C. Im pH-Bereich 5 bis7,5 ist das Wachstum gut, unterhalbvon pH 4 und oberhalb von pH 8 fin-det kein Wachstum statt. Die Toleranzgegenüber hohen Salzkonzentratio-nen ist begrenzt. Bei 2% (w/v) NaClist kein Wachstum mehr feststellbar.Eine Beschreibung der kinetischenParameter findet sich bei Becker etal. [2].

Abwasserdaten

Im Rahmen des Projekts wurde dieAnwendbarkeit des Verfahrens anhanddiverser Abwässer, z. B. der fischver-

arbeitenden Industrie, der Speiseöl-produktion, einer Großküche, derFleischgewürz- und der Fertigsuppen-herstellung, untersucht (Daten nichtdargestellt). Die Experimente zur Rei-nigung des Abwassers aus der Fleisch-gewürzherstellung sollen hier nähervorgestellt werden. Sie stammten ausder Produktion von Marinaden undWürzölen, wobei ein entsprechendfetthaltiges Abwasser anfällt.

Die Abwasserproben für die Labor-experimente wurden hinter dem vor-handenen Fettabscheider entnommenund bis zur Verwendung bei 4°C gela-gert. Problematisch für eine repräsen-tative Probenahme waren die großenSchwankungen der Abwasservolu-menströme und -zusammensetzun-gen, die durch die chargenweise Pro-duktion und nachfolgende Reini-gungsprozesse (Cleaning-In-Place)zustande kamen. Die mittlere Zusam-mensetzung sowie der Schwankungs-bereich der verwendeten Abwässersind in Tabelle 1 angegeben.

Das verwendete Abwasser für dieExperimente im Pilotmaßstab wurdediskontinuierlich nach einem Fettab-scheider aus einem Beruhigungstankentnommen. Die mittlere CSB-Konzen-tration lag bei 10,4 g l-1 mit einemSchwankungsbereich von 3,6 -21,3 g l-1. Eine eindeutige Ursache,

Problemstellung

Fetthaltige Abläufe aus der Lebensmit-telindustrie stellen für die Abwasser-technik nach wie vor ein ungelöstesProblem dar, weil Fette wegen ihreshydrophoben Charakters und hoherSchmelzpunkte schlecht bioverfügbarsind und durch mesophile biologi-sche Verfahren nur eine unzureichen-de Abbauleistung erreicht werdenkann. Das in Abwässern der Lebens-mittelbranche oftmals emulgierte Fettkann durch die konventionellen phy-sikalisch-chemische Verfahren nichtzufriedenstellend abgetrennt werden.Darüber hinaus fallen nicht verwert-bare Schlämme an, die oft einer Ver-brennung oder Deponierung zuge-führt werden.

Ziel eines durch die DBU finanzier-ten Forschungsprojekts an der TUHamburg-Harburg war die Entwick-lung eines neuen leistungsstarken Ver-fahrens zur thermophilen Reinigungfetthaltiger Abwässer. Zum Einsatzkam das aerob thermophile Bakteri-um Bacillus thermoleovorans IHI-91. Dieser Mikroorganismus wächstbei einer Temperatur von 65°C opti-mal. Dieses bietet die Möglichkeit,biologische Reinigungsverfahren beihöheren Temperaturen durchzufüh-ren, da die Enzyme zum einen bei

Tab.1: Charakteristische Abwasserdaten des untersuchten Abwassers.

Parameter Laborexperiment PilotexperimentMittelwert Bereich Mittelwert Bereich

pH (20°C) [-] 7,3 6,0 – 9,3 - -CSB [mg/l] 4500 2300 - 5800 10400 3600 - 21300Lipophile Stoffe [mg/l] 500 160 - 910 1000 500 - 3000

Sonderband | 2003 | 21BIOKATALYSEBIOKATALYSE

warum diese Werte damit deutlichüber denen aus den Probenahmen fürdie Laborversuche lagen, die von dergleichen Anfallstelle stammten, konntenicht ermittelt werden.

Versuchsaufbau und -durchführung

LaborexperimenteFür Versuche im Labormaßstab wur-de ein 2-Liter-Folienfermenter der Fir-ma Bioengineering eingesetzt. Einegute Durchmischung konnte überScheibenrührer bei einer Drehzahlvon 1000 bis 1200 rpm erreicht wer-den. Das Medium wurde mit Luft be-gast und die Gelöstsauerstoffkonzen-tration gemessen. Die Begasungsrateist dabei so eingestellt worden, dasskeinesfalls 20 % der Luftsättigung imReaktor unterschritten wurden. Dazuwar bei den erreichten Zelldichtenmaximal eine Begasungsrate von 0,3vvm erforderlich. Das den Reaktorverlassende Abgas wurde durch einenRückflusskühler geleitet, um Ver-dampfungsverluste zu minimieren.Neben der Temperatur wurde auchder pH-Wert automatisch geregelt. Anden Rührkesselreaktor war zur Zell-rückhaltung extern ein Modul mit ei-ner keramischen Ultrafiltrations-membran mit 95,2 cm2 Filterflächeund 150 kDa Trenngrenze ange-schlossen (Firma Tami). Dieses wur-de im Kreislauf durchströmt. Übereine Füllstandsregelung wurde diePermeatpumpe angesteuert. Die Zu-

laufpumpe lief kontinuierlich. DasAbwasser wurde in einer Vorratsfla-sche für eine homogene Mischungpermanent gerührt und zur Bilanzie-rung gewogen. Eine schematischeDarstellung des Versuchsaufbaus fin-det sich in Abbildung 1a, ein Foto derVersuchsanlage in Abbildung 1b.

Die kontinuierlichen Experimentewurden begonnen, indem zunächsteine Batch-Fermentation mit einemMineralmedium [3] und Olivenöl alsSubstrat durchgeführt und gegenEnde der exponentiellen Wachstums-phase auf einen kontinuierlichen Be-trieb umgestellt wurde. Während ei-nes kontinuierlichen Experimentswurden neben den online Messwer-ten, wie pH-Wert, Temperatur und Ge-löstsauerstoffkonzentration zusätzlichoffline Zelldichte und Lipaseaktivitätsowie CSB- Werte und Fettgehalte vonSubstrat, Reaktorinhalt und Permeatgemessen. Zunächst wurde ohne Zell-rückhaltung bei hoher hydraulischerVerweilzeit im Reaktor gearbeitet,d. h. das System arbeitete ohne Ein-satz des Ultrafiltrationsmoduls alskontinuierlich durchströmter Rühr-kessel. Hierbei wurde überprüft, obein ausreichender Reinigungserfolg,ggf. auch ohne Modul, zu erreichenwäre. Durch die zu Beginn lange hy-draulische Verweilzeit von 29 h wur-de ein Ausschwemmen der Mikroor-ganismen verhindert. Die Verweilzeitwurde daraufhin stufenweise verrin-gert und jeweils über den Zeitraumvon mindestens drei Verweilzeiten

konstant gehalten. Schließlich wurdeder externe Ultrafiltrationskreislaufzur Zellrückhaltung eingeschaltet.Hierdurch war eine erhebliche Stei-gerung der Reinigungsleistung so-wohl durch die erhöhte Zelldichte alsauch durch den Rückhalt des Fettsdurch die Ultrafiltration möglich.

Aerobe Behandlung imPilotmaßstab

Die Laborvorarbeiten dienten zurÜbertragung des Verfahrens in denPilotmaßstab. Hierzu wurde in Zu-sammenarbeit mit der Firma Rau-schert Verfahrenstechnik GmbH einemobile Pilotanlage konzipiert, vonder Firma Rauschert gebaut und imVor-Ort-Einsatz betrieben. Aufgrund

der Dringlichkeit der Abwasserbe-handlung und dem daraus folgendenInteresse des Anwenders sowie derpositiven Laborresultate wurde als er-ster Anwendungsfall das Abwasserder Fleischgewürzherstellung ausge-wählt.

Die mobile, komplett in einen 20″-Standard-Container eingebaute Pilot-anlage war vom Verfahrensschema (s.Abb. 2a) weitgehend identisch mitder Laboranlage. Aus einem gerühr-ten Vorlagebehälter wurde das zu be-handelnde Abwasser in einen elek-trisch beheizten Rührkessel aus Edel-stahl mit ca. 135 l aktivem Reaktor-volumen gefördert. Im externenKreislauf waren zwei Rohrmodule(Firma Atech Innovations GmbH) mit19-Kanal-Membranen aus Alumini-

Abb. 1a: Schematischer Versuchsaufbau für eine kontinuierliche Abwas-serreinigung im 2-Liter-Folienfermenter mit Zellrückhaltung durch Ultrafil-tration (Trenngrenze: 150 kDa) mit einem externen Modul. Permeat-, Ent-lüftungs- und Kreislaufpumpe, Keramikmembranmodul, Folienfermenter,Substrat-, Säure- und Basepumpe, Substratflasche und Steuereinheit fürden Fermenter.

Abb. 1b: Foto der Versuchsanlage für eine kontinuierliche Abwasserreini-gung im 2-Liter-Folienfermenter mit Zellrückhaltung durch Ultrafiltration(Trenngrenze: 150 kDa) mit einem externen Membranmodul. Nicht abgebil-det sind die Füllstandsregelungstechnik und der Ablauf.

Abb. 2a: Fließschema der mobilen Pilotanlage der Fa. Rauschert Verfah-renstechnik mit 135 l Arbeitsvolumen und Rohrmodulen (Trenngrenze: 0,04µm, Gesamtfläche 0,716 m2) zur Zellrückhaltung.

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umoxid mit 6 mm Kanalquerschnitt,ca. 0,358 m2 Filterfläche je Element,und einer Trenngrenze von 0,04 µmin Reihe geschaltet. Hieraus ergabsich eine relative Filterfläche von5,3 m2 m-3. Die transmembraneDruckdifferenz betrug ca. 4,5 bar. DieFilter wurden in Intervallen mitDruckluft bzw. chemisch mit Natron-lauge zurückgespült (s. Abb. 2b). DieBegasung des Reaktors erfolgte mitDruckluft mit bis zu 1 vvm. Die Ab-luft wurde über einen Biofilter gerei-nigt. Eine pH-Regelung erfolgte mitNatronlauge. Gegebenenfalls wäreauch eine Säuredosierung möglichgewesen, genauso wie Schaumbil-dung über eine Anti-Schaumdosie-rung hätte bekämpft werden können.Ein Prozessleitsystem überwachte diegesamte Anlage, steuerte alle Pumpenan und sorgte für die Datenaufzeich-nung. Die Probenahme von Zu- undAblauf sowie vom Reaktorinhalt er-folgte manuell. Die Zelldichtebestim-mung erfolgte wie im Labormaßstabdurch Auszählen am Mikroskop.

Analytische Methoden

Die Bestimmung der Lipaseaktivitäterfolgte durch einen Test, der auf ei-ner Methode von Sigurgisladottier etal. [4] basiert. Es handelte sich da-bei um einen photometrischen Assaymit dem chromogenen Substrat p-Ni-trophenyllaurat.

Die Messung der CSB-Werte erfolg-te mit Dr. Lange Küvettentests (Dr.Lange, Düsseldorf). Gesamtglührück-stand und -glühverlust wurden in An-lehnung an DIN 38 409 H1 gemes-sen. Die Bestimmung von schwer-flüchtigen lipophilen Stoffen wurdedurch zweifache Extraktion mit Tri-

chlorethylen in Anlehnung an DIN 38409 H17 durchgeführt [3]. Die Zell-dichte wurde durch Auszählen unterdem Mikroskop mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt, da Filtrations-verfahren zur Zelltrockengewichts-messung sowie die Messung opti-scher Dichte aufgrund des Vorhan-denseins vieler Beiprodukte wie Sei-fen und suspendierte Feststoffe aus-schieden.

Ergebnisse

LaborexperimenteBei der Anwendung des thermophi-len Verfahrens mit B. thermoleovor-ans IHI-91 mit den beschriebenenVorteilen war zunächst zu prüfen, obder verwendete Mikroorganismen-stamm überhaupt in der Lage ist, aufdem gebotenen Substrat zu wachsenund gleichzeitig technisch sinnvolleUmsätze zu erreichen.

In Abbildung 3 sind die Versuchs-ergebnisse der Laborexperimentedargestellt. Die kontinuierliche Fer-mentation von Abwasser aus derFleischgewürzproduktion wurdeohne Zellrückhaltung mit einer Ver-weilzeit von 29 Stunden begonnen,welche dann stufenweise auf 6,5 Stun-den gesenkt wurde. Im Betrieb mitZellrückhaltung durch Ultrafiltrationlag die Verweilzeit konstant bei 8,5Stunden, da der transmembrane Flussnicht weiter erhöht werden konnte.Zudem ist die Fett-Raumbelastungaufgetragen. Aufgrund der verwende-ten unterschiedlich belasteten Abwas-serchargen stieg die Fett-Raumbela-stung nicht notwendigerweise mit Ver-ringerung der Verweilzeit an undschwankte auch, wenn die Verweil-zeit konstant blieb.

Im Betrieb ohne Zellrückhaltunglag die Gesamtzelldichte weitgehendkonstant im Bereich von 2 x 108

Zellen ml-1. Die Lipaseaktivität war imMittel mit 0,1 U ml-1 gering; trotzdemlag der Abbau des CSB bei ca. 75 %,fiel jedoch mit Verkürzung der Ver-weilzeit auf 6,5 Stunden auf 50 % ab.Ab dem 16. Versuchstag wurde mitZellrückhaltung durch Ultrafiltrationmit einer Trenngrenze von 150 kDagearbeitet. Es war ein Anstieg der Ge-samtzellzahl auf im Mittel 4 x 109 ml-1

zu beobachten, d. h. eine Steigerungum den Faktor 20. Mit der Zunahmeder Zelldichte stieg auch die Lipase-aktivität auf einen Maximalwert von0,9 U ml-1. Der Abbau des CSB stiegauf durchschnittlich 90 %. Durch denEinsatz des Membranmoduls zur Zell-rückhaltung kam es zunächst zu ei-nem Anstieg des CSB im Reaktor aufeinen Wert oberhalb des Zulauf-CSB.Diese Konzentration blieb aber nach2 Tagen auf einem Niveau von 4500

mg l-1 konstant. Ab dem zweiten Tagdes Betriebs mit Zellrückhaltung istalso ein stationärer Zustand erreichtworden, d. h. die Differenz zwischenCSB im Zulauf und CSB im Permeatwurde vollständig mikrobiell abge-baut; es fand keine weitere Anreiche-rung im Reaktor statt. Die CSB-Raum-belastung schwankte um den Wertvon 300 mg l-1 h-1, die CSB-Abbaulei-stung lag im Mittel bei 200 mg l-1 h-1,sie stieg sogar auf einen Maximalwertvon 540 mg l-1 h-1 (Werte nicht darge-stellt).

Der Fettabbau war bei Betrieb mitZellrückhaltung vollständig, da imRahmen der Messgenauigkeit keinFett im Permeatstrom nachgewiesenwerden konnte. Messungen ergaben,dass es im Reaktor, insbesondereauch bei Einsatz des Membranmo-duls, nicht zu einer Fettanreicherungkam. Ohne Zellrückhaltung lag derFettabbau im Mittel bei 50 % (Wertenicht dargestellt). Der CSB des Per-

Abb. 2b: Fotos der mobilen Pilotanlage der Fa. Rauschert Verfahrenstech-nik. (a) Blick in den geöffneten Container, im Hintergrund der Reaktor-raum, (b) Blick in den Reaktorraum, im Vordergrund der Reaktor, am Bo-den die Kreislaufpumpe und darüber eines von zwei Ultrafiltrationsrohr-modulen.

Abb. 3: Versuchsdaten einer aerob-thermophilen Behandlung von Abwas-ser einer Fleischwürzfabrik im 2 l-Folienfermenter. Ab dem 13. Versuchs-tag (s. gepunktete Linie) wurde eine Ultrafiltrationsmodul (150 kDa; 95,2cm2) zur Zellrückhaltung eingesetzt.

Sonderband | 2003 | 23BIOKATALYSEBIOKATALYSE

meats lag bei Einsatz der Ultrafiltra-tion mit 150 kDa Trenngrenze beidurchschnittlich 350 mg l-1.

Pilotexperimente

Der Verlauf der Messwerte und derdaraus berechneten Größen ist inAbbildung 4 dargestellt. Trotz derCSB-Konzentrationsschwankungendes Abwassers konnten bei hydrau-lischen Verweilzeiten von 3 bis ma-ximal 8 h und einer daraus resultie-renden mittleren CSB-Raumbela-stung von 2,5 g l-1 h-1 und Fett-Raum-belastung von 1,7 g l-1 h-1 eine CSB-Eliminationsrate von größer 90 %erreicht werden. Fett- und CSB-Raumbelastung blieben auch beimleichten Anstieg der Zulaufkonzen-tration konstant, da sich gleichzei-tig die Verweilzeit erhöhte.

Bedingt durch die höheren trans-membranen Flüsse im Pilotmaßstablagen die Raumbelastungswerte si-gnifikant oberhalb denen der Labor-versuche. Eine Fettanreicherung imReaktor konnte auch im Pilotmaß-stab nicht festgestellt werden. Diemittlere CSB-Konzentration im Per-meat der Pilotanlage lag bedingtdurch die Trenngrenze von 0,04 µmder hier verwendeten Mikrofiltrati-on mit 1050 mg l-1 deutlich höher alsim Laborversuch bei der verwende-ten Ultrafiltration (Trenngrenze150 kDa) mit 350 mg l-1. Zum Errei-chen von Brauchwasserqualität sinddaher noch weitere Verfahrens-schritte erforderlich.

Zum Testen der Dauerstabilitätdes Verfahrens wurde im Rahmeneines längeren Feiertagsstillstandsder Fabrikproduktion auch ein Aus-fall der Energieversorgung des Sy-stems simuliert. Wie in Abbildung 4an der Unterbrechung der Zeitach-se ersichtlich, erreichte die Anlagenach acht Tagen Betriebsunterbre-chung (Versuchstage 36 - 44) bin-nen eines Tages wieder ihre volleLeistung. Die Biomassesuspensionwar während dieser Zeit unversorgtim Reaktor belassen worden. Überden gesamten Versuchszeitraumwurde eine Zunahme der Biomasse-konzentration im Reaktor durchkontinuierliche Verfahrensoptimie-rung durch Verbesserung der Rück-spülungsstrategien, Prozessleittech-nik, Begasung usw. festgestellt, ob-gleich mit 8 x 108 Zellen ml-1 bzw.0,62 gTS ml-1 noch längst nicht diegleiche Zelldichte wie im Laborre-aktor mit bis zu 5 x 109 Zellen ml-1

bzw. 3,9 gTS ml-1 erreicht wurde.Dass trotzdem höhere Umsatzraten

als im Labormaßstab erzielt wurden(mittlerer volumenspezifischer CSB-Abbau: Labor = 0,3 g l-1 h-1, Pilot =2,5 g l-1 h-1) ist ein Indiz dafür, dassim Pilotmaßstab der Anteil an akti-ven Zellen an der Gesamtzellzahldeutlich höher lag.

Innerhalb von zwei Monaten Ver-suchsbetrieb musste keinerlei Über-schussschlamm aus dem Pilotreak-tor entfernt werden. Für den Lang-zeitbetrieb ist mindestens zur Entfer-nung von Inertstoffen aus dem Re-aktor hierfür jedoch eine Möglich-keit vorzusehen. Abhängig von derMembranrückhaltung sowie ihrerbiologischen Abbaubarkeit solltengrobe Partikel bereits vor dem Re-aktor abgetrennt werden.

Optimierungspotenzial bestehtnoch bezüglich des Energieaufwandsfür die Zellrückhaltung. Rohrmodulebenötigen aufgrund der erforderli-chen Überströmgeschwindigkeiteneine hohe Pumpleistung. AndereMembranwerksstoffe als Keramik

stoßen bei der Reaktorbetriebstem-peratur von 65°C an ihre Stabilitäts-grenzen.

Schlussfolgerungen

Durch Vorversuche im Labormaß-stab konnte gezeigt werden, dasseine grundsätzliche Abbaubarkeitvon fetthaltigem Abwasser mit einemthermophilen aeroben Verfahren er-zielt werden kann. Darauf aufbauendwurde in Zusammenarbeit mit derFirma Rauschert VerfahrentechnikGmbH eine Pilotanlage konzipiert.Die erzielten Ergebnisse in Vor-Ort-Experimenten zeigten eine enormeBelastbarkeit des Verfahrens im Hin-blick auf die Reinigungsleistung. Beieiner hydraulischen Verweilzeit von3 bis maximal 8 h und einer darausresultierenden mittleren CSB-Raum-belastung von 2,5 g l-1 h-1 und Fett-Raumbelastung von 1,7 g l-1 h-1

konnte eine CSB-Eliminationsratevon größer 90 % erreicht werden.

Abb. 4: Versuchsdaten einer aerob-thermophilen Behandlung von Abwas-ser einer Fleischgewürzfabrik in einer mobilen Pilotanlage mit 135 l Ar-beitsvolumen und Rohrmodulen (Trenngrenze: 0,04 µm, Gesamtfläche0,716 m2) zur Zellrückhaltung. Vollständige Abschaltung der Anlage vonTag 36 bis Tag 44.

Die Zelldichte betrug hierbei 8 x 108

Zellen ml-1 bzw. 0,62 gTS ml-1. Durchdie hohe mikrobielle Reinigungslei-stung ergibt sich ein kompaktes An-lagendesign sowie ein geringer Be-treuungsaufwand.

Die Möglichkeit der Nutzung desgereinigten Abwassers als Brauchwas-ser, eine Optimierung der Zellrückhal-tung und die Übertragung des Verfah-rens auf andere Problemabwässerwird Gegenstand der weiteren For-schung sein. Eine mögliche Nischedieses Verfahrens ist die Reinigungrelativ kleiner Volumenströme undeiner Abwasserkonzentration im Be-reich bis ca. 5.000 mg CSB/l.

Literatur

[1] Markosyan S., Becker P., Märkl H.,Antranikian G., Extremophiles 4(2000) 365-371.

[2] Becker, P., Abu-Reesh, I., Markosyan,S., Antranikian, G., Märkl, H., Appl.Microbiol Biotechnol 48 (1997) 184-190.

[3] Becker, P., Dissertation, TU Hamburg-Harburg (1999).

[4] Becker, P., Köster, D., Popov, N., Mar-kosyan, S., Antranikian, G., Märkl, H.,Wat. Res. 33 (1999) 653-660.

[5] Sigurgisladottir, S., Konradsdottir, M.,Jonsson, A., Kristjansson, J.K., Mat-thiasson, E., Biotechnol. Lett. 15(1993) 361-366.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr.-Ing. Herbert MärklBioprozess- undBioverfahrenstechnikTU Hamburg-HarburgDenickestraße 15D-21073 HamburgTel.: 040-42878 3217Fax: 040-42878 2909eMail: maerkl@tu-harburg.de

24 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

ALTFETTALKOHOLYSE

Kühlschmierstoffe austechnischen tierischen Fetten undAltspeisefetten – Herstellung,Technologie und Ökobilanzierung� Prof. Dr.-Ing. Dr. h.c. Jürgen Hesselbach1, Dr.-Ing. Christoph Herrmann1, Dr.-Ing. Ralf Bock1, Dipl.-Geoökol. Tina Dettmer1, Dr. rer. nat. Gerd Kley2, Dr. rer.nat. Peter Köcher2, Dr. rer. nat. Rudolf Brenneis2, Prof. Dr.-Ing. Roland Meyer-Pittroff3, Dipl.-Ing. Oliver Falk3, Dipl.-Geoökol. Anja Hansen4

1 Institut für Werkzeugmaschinen und Fertigungstechnik, TU Braunschweig, 2 Bundesanstalt für Materialforschung und –prüfung, Berlin, 3 Lehrstuhl fürEnergie- und Umwelttechnik der Lebensmittelindustrie, TU München, 4 LCE Consulting GmbH, Braunschweig.

Bei der zerspanenden Fertigung werden in den meisten Fällen Kühlschmierstoffe eingesetzt. Konventionelle Produkte bestehen in der Regel aus Mine-ralöl. Diese Stoffe sind jedoch bezüglich der Arbeitsphysiologie und dem Verbrauch von endlichen Ressourcen als nicht unproblematisch anzusehen. Ineinem Forschungsverbund soll nun versucht werden, diese Stoffe durch technische tierische Fette und Altspeisefette zu ersetzen. Neben der Überprü-fung der technologischen Tauglichkeit im Labor und in der Industrie werden auch unterschiedliche Herstellungsverfahren, wie die katalytische und dieenzymatische Umesterung, untersucht. Begleitend dazu werden ebenfalls die Auswirkungen des gesamten Produktlebenswegs in Form einer Produkt-ökobilanz ermittelt.

Keywords: Enzymatische Alkoholyse, Tierfett, Altspeisefett, Kühlschmierstoff, Umesterung, Produktökobilanz, LCA.

basierten Kühlschmierstoffe erstnach mehreren Jahren.

Um die Herstellungskosten zu sen-ken, können vermehrt Schlachtne-benprodukte zur Schmierstoffpro-duktion eingesetzt werden. Nach derSterilisierung in einer Tierkörperbe-seitigungsanlage werden die Fette indie gesättigten und ungesättigten Be-standteile getrennt. In einem weite-ren verfahrenstechnischen Schrittkönnen aus diesen Fraktionen durchkatalytische Umesterung sowohl Kühl-schmierstoffe (gesättigter Teil) als

auch z.B. Biokraftstoffe (ungesättig-ter Teil) hergestellt werden. Hierbeikommen unterschiedliche Alkoholezum Einsatz.

Ein weiterer Abfallstoff sind Altspei-sefette, die sich aufgrund des hohenAnteils an gesättigten Fettsäuren eben-falls für die Kühlschmierstoffherstel-lung eignen. Bei diesen Stoffen wirdzur Zeit untersucht, ob neben der ka-talytischen Umesterung der Ausgangs-materialien auch die enzymatischeAlkoholyse zu verwertbaren Schmier-stoffen führt. Erste diesbezügliche

Untersuchungen lassen auf positiveErgebnisse hoffen.

Die Entwicklung nativbasierterKühlschmierstoffe aus Abfällen ist nurdurch eine interdisziplinäre Zusam-menarbeit von Forschern aus ver-schiedenen Fachrichtungen möglich.So arbeiten an diesem Vorhaben dieBundesanstalt für Materialprüfung,Berlin, der Lehrstuhl für Energie- undUmwelttechnik der Lebensmittelindu-strie, TU München, das Institut fürÖkologische Chemie und Abfallana-lytik, TU Braunschweig, sowie das In-stitut für Werkzeugmaschinen undFertigungstechnik, TU Braunschweig,sehr eng zusammen. Eine intensiveKooperation mit der Industrie ge-währleistet die spätere praktischeUmsetzung. Hier sind vor allem dieVolkswagen AG, Wolfsburg, dieCastrol Industrieöl GmbH, Mönchen-gladbach, sowie die LCE ConsultingGmbH, Braunschweig, zu nennen.

Katalytische Umesterung

In Deutschland werden im Jahr ca.1,1 Mio. t mineralölbasierte Schmier-stoffe verbraucht. 50 % davon gelan-gen systembedingt oder durch Unfäl-le und Leckagen in die Umwelt. Ge-rade die Gruppe der Verlust-

Problemstellung

Die bei der Zerspanung verwendetenKühlschmierstoffe bestehen in derRegel aus Mineralöl mit einer Viel-zahl unterschiedlicher Additive. Die-se Kombination führt zu der bekann-ten Problematik bezüglich der Ar-beitsphysiologie sowie der Entsor-gung von endlichen Ressourcen. EineAlternative hierzu bieten Kühl-schmierstoffe auf nativer Basis.

Nativbasierte Esterverbindungenaus gesättigten Fettsäuren zeichnensich durch eine verbesserte Schmier-wirkung im Vergleich zu Mineralölaus. Sie sind daher für einen Einsatzals Kühlschmierstoff besonders ge-eignet. Bei Untersuchungen am In-stitut für Werkzeugmaschinen undFertigungstechnik der TU Braun-schweig hat sich gezeigt, dass nebeneiner Verlängerung der Werkzeug-standzeiten auch Verluste durch Aus-schleppungen (Schleifschlamm,Werkstückanhaftungen) reduziertwerden können. Trotz technologi-scher Vorteile werden sie in der Pra-xis kaum eingesetzt, da ihre Anschaf-fungskosten weit über denen vonkonventionellen Produkten auf Mine-ralölbasis liegen. Durch diese hohenKosten amortisieren sich diese nativ- Abb 1: Verfahrensschema der katalytischen Umesterung.

Sonderband | 2003 | 25BIOKATALYSEBIOKATALYSE

schmierstoffe wie z.B. Kühlschmier-stoffe gehen gebrauchsbedingt fastvollständig verloren. Insbesonderedie in Mineralölprodukten enthalte-ne Kohlenwasserstoffe sind toxischfür Säugetiere, Fische und Bakterien.Biologisch schnell abbaubareSchmierstoffe verursachen dagegenkeine oder nur geringe Umweltbela-stungen, wenn sie in die Umwelt ge-langen.

Als biologische Kühlschmierstoffefinden unter anderen Alkylester na-türlicher Fettsäuren Verwendung. Üb-licherweise werden diese Produktedurch Veresterung von Fettsäuren mitden entsprechenden Alkoholen her-gestellt. Zu diesem Zweck muss erstnatives Fett unter hohem Temperatur-und Druckniveau in Fettsäuren undGlyzerin gespalten werden. Anschlie-ßend werden die Fettsäuren unterhohem Druck und hoher Tempera-tur verestert. Die gewonnenen Pro-dukte sind daher relativ teuer undkaum konkurrenzfähig zu Mineralöl-schmierstoffen.

Andererseits werden in der Biodie-selindustrie große Mengen von Fett-säuremethylestern zu sehr niedrigenKosten hergestellt. Insbesondere beider Verwendung von Altspeisefettenoder technischen Tierfetten als Roh-stoff können die Herstellungskostendieser Methylester noch gesenkt wer-den. In dem von der DBU geförder-ten Projekt „Kühlschmierstoffe ausAltspeisefetten und technischen tieri-schen Fetten“ wurden daher am Lehr-stuhl für Energie- und Umwelttech-nik der Lebensmitteltechnologie aufAltfett basierende Methylester alsRohstoff für die weitere Umesterungmit Alkoholen bis zu acht C-Atomenuntersucht. Im Zuge dieses Projektswurden als erster Schritt Ume-sterungsverfahren für Altspeise- undTierfette zu Methylestern entwickeltbzw. optimiert. In einem zweitenSchritt wurde versucht, die auf dieseWeise hergestellten Methylester mitden Alkoholen Propanol, Butanol und2-Ethylhexanol basisch katalysiertumzuestern. Die besten Ergebnissewurden dabei mit 2-Ethylhexanol er-reicht. Die folgende Abbildung (Abb.1) zeigt ein Verfahrensschema derUmesterung von Fettsäuremethyle-stern mit längerkettigen Alkoholen.

Die Fettsäuremethylester aus derUmesterung der Altspeise- oder Tier-fette werden zur Enfternung von Farb-und Geruchsstoffen über Kopf destil-liert. Das Destillat wird durch frak-tionierte Kristallisation in eine Ole-in- und Stearinfraktion aufgetrennt.Die Oleinfraktion kann nun ohne

weitere Behandlung als kältestabilerBiokraftstoff verwendet werden. Dieverbleibende Stearinfraktion weistdurch ihren hohen Sättigungsgradeine wesentlich bessere Oxidations-stabilität als das Ausgangsproduktauf. Sie muss allerdings, um die fürdie Verwendung als Kühlschmierstoffnötigen Eigenschaften, wie z.B. höhe-re Viskosität und niedriger Pourpoint,zu erlangen, noch einmal mit länger-kettigen Alkoholen umgeestert wer-den. Diese Umesterung findet basischkatalysiert unter Abtrennung des frei-werdenden Methanols statt. Im An-schluss finden noch Waschprozessezur Entfernung von Katalysatorrestenund eine Destillation zur Entfernungvon Restalkohol und -wasser statt.Der auf diese Weise erhaltene Fett-säurealkylester kann nach Additivie-rung als biologisch schnell abbauba-rer Kühlschmierstoff eingesetzt wer-den.

EnzymatischeAltfettalkoholyse

In der Bundesanstalt für Materialfor-schung und –prüfung (BAM) wurdeein innovativer Lösungsansatz gefun-den, der es möglich macht, mit ho-hen Umsatzraten aus (Alt)fetten undhöhermolekularen Alkoholen in ei-nem einstufigen enzymatischen Pro-zess (Alkoholyse) Fettsäureester her-zustellen [1,2,3]. Bei der Alkoholysewird die Glycerol-Komponente (drei-wertiger Alkohol) der Triglyceridedurch einwertige Alkohole substitu-iert:

Fett + Alkohol ➞ Ester(öl)+Glycerol

Auf Grund der in Laboruntersu-chungen (100 ml- und 1,5 l- Reak-tor) gewonnenen Erkenntnisse wur-de eine kleintechnische Anlage mit 15l- und 100 l-Rührreaktoren installiert,in der größere Mengen an Esterölenhergestellt werden können.

Die Umsetzungen erfolgen imbatch- Betrieb bei Temperaturen um60°C unter Einsatz von Novozym 868L (Candida antarctica) der Fa. No-vozymes A/S (Bagsværd, Dänemark).Dieses Enzym hatte sich unter mehre-ren getesteten als das geeignetste er-wiesen.

Als sinnvoll hat sich ein Enzyman-teil von 0,5% bis 1% bezogen auf dieeingesetzte Fettmenge herausgestellt.Entsprechend der Reaktionsgleichungentsteht neben dem „Ester“ (Gemischunterschiedlicher Fettsäureester ent-sprechend dem Fettsäurespektrumdes eingesetzten Fetts) als zweite Kom-

ponente Glycerol. Dieses findet sichals Gemisch mit dem eingesetztenWasser, das sich für eine Aktivierungdes Enzyms und als dessen „Träger-phase“ als notwendig erwiesen hatund dem Enzym nach Reaktionsendeund einer gewissen „Abstehzeit“ in derunteren Phase im Reaktor wieder. Dieobere Phase enthält den Ester undReste des im molaren Überschuss zu-gesetzten Alkohols bzw. bestimmteAnteile an freien Fettsäuren, die durcheine allerdings sehr langsam ablaufen-de Parallelreaktion (Hydrolyse) be-dingt sind. Nach Beendigung der Se-parierung dieser beiden Phasen von-einander wird die „Esterphase“ abge-zogen; die untere wässrige Phase ver-bleibt für den nächsten Ansatz im Re-aktor. Damit aber in dieser Phase derGlycerolgehalt nicht übermäßig an-steigt und somit die Aktivität der En-zyme sinkt, muss nach jedem Ansatzein Teil des Glycerolwassers abgezo-gen werden. Zwangsläufig wird mit

te, Viskosität, Flammpunkt, Pour-point, ....) als auch spezielle anwen-dungsspezifische Eigenschaften derEster beim Einsatz als Kühlschmier-stoff (Schleif- und Zerspanverhalten,...) von den veresterten Fett- und Al-koholkomponenten abhängig sind.Weiterhin ist bekannt, dass Lipasen beider enzymatischen Modifikation vonTriglyceriden bestimmte Selektivitätenaufweisen können [4]. Zur Aufklä-rung möglicher Zusammenhänge wur-den deshalb systematische Untersu-chungen zur enzymatischen Alkoho-lyse unter Kombination unterschied-licher Modellfette mit unterschiedli-chen Alkoholen (linear, verzweigt, zy-klisch) durchgeführt.

Bestimmung vonUmsatzraten

Das Zusammensetzungsspektrum derim Gastronomiebereich eingesammel-ten Altfette ergibt sich naturgemäß aus

Folgende Alkohole wurden getestet:a) linear (lin.A) b) verzweigt c) zyklisch1-Pentanol 2-Methyl-1-Butanol (2Me1Bu) Cyclohexanol (Cy)1-Hexanol 3-Methyl-1-Butanol (3Me1Bu) Methylcyclohexanol1-Heptanol 4-Methyl-2-Pentanol (4Me2Pe) (Me.Cy)1-Octanol 2-Octanol (2Oc)

2-Ethyl-1-Hexanol (2Et1He)

dem Glycerol auch ein bestimmterAnteil des Enzyms und des Wassersentfernt. Diese Verluste müssen demneuen Ansatz ergänzend hinzugefügtwerden.

Bevor jedoch in dieser Anlage diefür die Anwendungstests erforderli-chen Mengen an Esteröl hergestelltwerden, gilt es eine für den speziellenEinsatz als Kühlschmierstoff optimaleEsterzusammensetzung zu ermitteln.Es ist nämlich zu erwarten, dass so-wohl allgemeine physikalische (Dich-

der Bandbreite der ausgeliefertenSpeisefette. Um ein breites Spektrummöglicher Zusammensetzungen ein-zuschließen, wurden als ModellfetteErdnussfett und Olivenöl sowieSchweineschmalz (partiell) ausge-wählt:a) Erdnussfett (= gehärtetes Erdnus-söl; hoher Anteil gesättigter bzw. trans-Fettsäuren und geringer Anteil mehr-fach ungesättigter Fettsäuren im Fett-säurespektrum; wird als Frittier- undBratfett eingesetzt).

Abb. 2: Alkoholyse von Erdnussfett (Umsatzraten mit verzweigten Alkoho-len).

26 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Abb. 6: Alkoholyse von Erdnussfett und Olivenöl (Umsatzraten mit zykli-schen Alkoholen).

optimalen, sondern mit einer gerin-geren Rührerdrehzahl (500 U/min)gearbeitet. Damit sind zwar die Um-satzraten jeweils niedriger, die Ergeb-nisse aber übersichtlicher und unter-einander besser vergleichbar.

Zur Ermittlung der Umsatzratenwurden nach bestimmten Zeiten (0,5h, 1 h, 2 h, 3 h und 4 h) Proben gezo-gen und mittels HPLC analytisch aus-gewertet. Die den speziellen Ansprü-chen angepasste HPLC ist mit einer fürdie Detektion von Tri-, Di- und Mo-noglyceriden sowie Fettsäuren undMonoestern empfindlichen Lichtstreu-detektion ausgerüstet.

Die Retentionszeiten der entstehen-den Ester sind vom Molekulargewichtder eingesetzten Alkohole abhängigund liegen in einigen Fällen teilweiseim Bereich der Retentionszeiten derals Zwischenprodukte auftretendenMonoglyceride, so dass eine genaueZuordnung nicht immer möglich ist.Deshalb wurde als Bezugsgröße derRestgehalt an Triglyceriden gewählt,der sich direkt aus den prozentualenFlächenanteilen bei den entsprechen-den Retentionszeiten ermitteln lässt.

In den Abbildungen 2 bis 6 sind dieResultate der Untersuchungen darge-stellt.

Es zeigt sich, dass offensichtlich so-wohl die Alkohol- als auch die Fett-komponenten Einfluss auf die Ge-schwindigkeit der Fettmodifikation(Alkoholyse) haben.

Die vier getesteten linearen Alko-hole zeigen etwa gleiche Umsatzratenund sind deshalb jeweils in einer Kur-ve zusammengefasst (Abb. 5). Deut-lich höhere Umsatzraten sind mit denverzweigten Alkoholen zu erzielen.Hier ist insbesondere 2-Ethyl-1-Hexa-nol hervorzuheben (Abb. 2 bis 4). Vonden eingesetzten zyklischen Alkoho-len weist Methylcyclohexanol (zusätz-

lich verzweigt) bessere Werte auf(Abb. 6).

Weiterhin kann man aus den Un-tersuchungen eine gewisse Spezifitätdes eingesetzten Enzyms gegenüberden in den Triglyceriden gebundenen„Fettsäuren“ ableiten, denn die Um-setzung von Erdnussfett läuft schnel-ler ab als die von Schweineschmalzund wesentlich schneller als die vonOlivenöl.

Die Kurven der Umsatzraten von Alt-fetten, die teilweise mitbestimmt wur-den, lagen jeweils zwischen denen desErnussfettes und des Olivenöls im Be-reich der Kurven des Schweine-schmalzes.

Genauer lässt sich die Enzymspezi-fität aus den aufgenommenen Spek-tren (HPLC) ermitteln.

In Abbildung 7 sind beispielhaft dieaus den jeweiligen Spektren der Um-setzung von Schweineschmalz mit 2-Ethyl-1-Hexanol nach 0,5 sowie nach1, 2 und 3 h Reaktionszeit ermitteltenFlächenanteile des entstandenen Stea-rinsäureesters, Palmitinsäureesters,Ölsäureesters und Linolsäureesters(Summe auf 100% hochgerechnet)wiedergegeben und dem mittels GCbestimmten Fettsäurespektrum desAusgangsfetts (Schweineschmalz) ge-genübergestellt (Summe von Stearin-,Palmitin-, Öl- und Linolsäure auf100% hochgerechnet). Aus der Abbil-dung wird deutlich, dass die Modifi-zierung der gesättigten Stearin- undPalmitinsäure gegenüber der einfachbzw. zweifach ungesättigten Öl- bzw.Linolsäure bevorzugt abläuft.

BestimmungphysikalischerEigenschaften der Ester

Nach der Entnahme der letzten Pro-be für die Bestimmung der Umsatz-

Abb. 3: Alkoholyse von Schweineschmalz (Umsatzraten mit verzweigtenAlkoholen).

Abb. 4: Alkoholyse von Olivenöl (Umsatzraten mit verzweigten Alkoholen).

Abb. 5: Alkoholyse von Erdnussfett und Olivenöl (Umsatzraten mit linearenAlkoholen).

b)Olivenöl (geringer Anteil gesättig-ter Fettsäuren; Einsatz als Salatöl bzw.Bratfett in mediterraner Küche).c)Schweineschmalz (etwa gleicherAnteil gesättigter und ungesättigterFettsäuren).

Um diese im 1,5 l- Reaktor durch-geführten Untersuchungen vergleich-bar zu machen, wurden sie jeweils

bei gleichen Temperaturen (60°C),gleichen Mengenverhältnissen derEinsatzkomponenten (molares Ver-hältnis Fett : Alkohol = 1 : 3, Fett +Alkohol = 750 g, Wasser = 750 g,Enzym = 1% bezogen auf Fettmen-ge) und damit auch gleicher Reak-torfüllhöhe durchgeführt. Bei denVersuchsreihen wurde nicht mit der

Sonderband | 2003 | 27BIOKATALYSEBIOKATALYSE

raten nach 4 h wurde die Rührwerks-geschwindigkeit erhöht, um schnel-ler einen vollständigen Umsatz zu er-reichen. Wenn in den HPLC-Spektrenkeine Tri-, Di- und Monoglyceridemehr nachweisbar waren, wurde dasRührwerk abgeschaltet. Ist die Sepa-rierung der Esterphase (oben) vonder wässrigen Glycerolphase (unten)erfolgt, kann der Ester abgezogen undgereinigt werden (Abdestillation vongeringen Mengen überschüssigen Al-kohols, Waschen mit Ethanolamin zurSenkung der Säurezahl auf unter 0,3).

Nach der Aufbereitung der Esterwurden an den klaren bis gelblich-hellen öligen Flüssigkeiten (Abb. 8)die Flammpunkte, Dichten, kinema-tischen Viskositäten (20°C und 40°C)und die Pourpoints bestimmt.

Die Flammpunkte der hergestell-ten Esteröle liegen mit jeweils über240°C generell über denen von Mi-neralölen. Deren Dauereinsatz ist auf90 bis 120°C begrenzt, der kurzfri-stige Einsatz auf 130 bis 150°C.

Die Unterschiede in den Dichtenund Viskositäten der Esteröle sindnicht so gravierend, als das sie einenEinfluss auf die Auswahl eines Fettsoder Alkohols zur Herstellungesterölbasierter Kühlschmierstoffehätten. Große Unterschiede gibt esdagegen in den Pourpoints, durch diedas Kälteverhalten der Esteröle cha-rakterisiert wird. Sowohl Art des Al-kohols als auch Zusammensetzungdes Fetts spielen hier eine große Rol-le.

Weiterführung derArbeiten

Auf Grund der höchsten Umsatzratenund des niedrigsten Preises der hiergetesteten Alkohole sowie des gutenKälteverhaltens der resultierendenEster wurde für die weiteren Arbeiten2-Ethyl-1-Hexanol als Alkoholkompo-nente ausgewählt.

Als Fettkomponenten für die weite-ren Untersuchungen wurden Erd-nussfett und Rindertalg mit hohen An-teilen an gesättigten Fettsäuren sowieAltfett festgelegt.

Aus diesen Ausgangsstoffen wurdenin der kleintechnischen Anlage derBAM über den Prozess einer enzyma-tisch katalysierten Alkoholyse größe-re Mengen (jeweils ca. 45 l) der ent-sprechenden Esteröle hergestellt. DieReaktionszeiten bis zu einer vollstän-digen Umsetzung lagen bei 2h.

An den hergestellten Esterölen wer-den momentan im IWF anwendungs-spezifische Parameter bei der span-enden Metallbearbeitung ermittelt. Abb. 9: Stoffstromnetz für Schlachtabfall- und Tierkörperverwertung.

Abb. 7: Auswertung der Untersuchung zur Enzymspezifität.

Abb. 8: Altfett(links), ungereinig-tes Esteröl (Mitte)und gereinigtesEsteröl (rechts).

Umweltwirkungsanalysevon Kühlschmierstoffen

Inwiefern ein Produkt umweltverträg-licher ist als ein anderes, kann mittelsUmweltwirkungsanalysen untersuchtwerden. Für den jeweils vollständigenProduktlebenszyklus werden möglichstumfassend die Umweltwirkungen, z.B.Ressourcenverbrauch (Energieträger,Mineralien) und auch Versauerung,Eutrophierung, Sommersmogbildung

tisch erzeugte Ester auf Pflanzenöl- undTierfettbasis sowie ein enzymatisch her-gestellter Ester aus Altfetten gegenüber-gestellt. Die Basisdaten für die tierfett-basierten Ester liefert das Vorhaben„Kühlschmierstoffe aus Altspeisefettenund technischen tierischen Fetten“ undfür den enzymatisch veresterten KSSaus Altfetten das Projekt „EnzymatischeAltfettalkoholyse zur Herstellung vonWertstoffen“.

Die Ökobilanzierung alsBewertungskonzept

Die Lebenswege der Kühlschmierstof-fe werden beginnend bei der Roh-stoffgewinnung über die Herstellungdes Grundöls, ggf. einer Additivie-rung, dem Einsatz in der Fertigung bishin zur Verwertung bzw. endgültigenEntsorgung untersucht. Neben denzahlreichen Vorketten, d.h. den zurweiteren Herstellung benötigten Vor-produkten und Energieträgern findenauch Praxisdaten aus einem Dauer-versuch bei der Volkswagen AG Be-rücksichtigung in der Lebenswegbi-lanzierung. Der Vergleich der Kühl-schmierstoffe erfolgt anhand der Um-weltwirkungen, die beim Schleifenvon 1000 Werkstücken entstehen.Das Vorhaben soll durch den Ver-gleich der Umweltwirkungen ermit-teln, ob Kühlschmierstoffe auf Tier-fettbasis als umweltverträglicher zubewerten sind als die mineralölbasier-ten Alternativprodukte.

Literatur

[1] Brenneis, R., Köcher, P., Kley, G.,Baeck, B., Schwilling, T., Müll undAbfall 34 (2002), 244-248.

[2] Simon, F.G., Brenneis, R., Köcher, P.,6th World Congress on IntegratedRessources Management R‚02, 12.-15.02.2002, Genf.

[3] Brenneis, R., Baeck, B., Köcher, P.,Kley, G., Reger, C., Enzymes in LipidModification, 26.-28.03.2003, Greifs-wald.

[4] Bornscheuer, U.T. (Hrsg.), Enzymesin Lipid Modification, WILEY-VCH(2000).

Korrespondenzadresse

Dr.-Ing. Ralf BockInstitut für Werkzeugmaschinen undFertigungstechnikTU BraunschweigLanger Kamp 19bD-38106 BraunschweigTel.: 0531-391 7611Fax: 0531-391 5842eMail: r.bock@tu-bs.de

Braunschweig, in dem Vorhaben „Pro-duktökobilanz nichtwassermischbarerKühlschmierstoffe auf Basis von Mine-ralöl, pflanzlichen Ölen sowie Altspei-sefetten und technischen tierischenFetten“ die Lebenswege von vier Kühl-schmierstoffvarianten. Einem konven-tionellen, mineralölbasierten Produktwerden auf klassische Weise kataly-

Erhöhung der Fertigungsgeschwindig-keit eingesetzt werden, gelten ge-braucht als Sonderabfälle und sindunter umwelt- und arbeitsphysiologi-schen Aspekten kritisch zu bewerten.Daher beschäftigen sich aktuell diebeiden zuvor beschriebenen Projektemit der Entwicklung von umwelt- undarbeitsverträglicheren Alternativen aufBasis von Tierfetten und Altfetten.

Für diese Forschungsprojekte ana-lysiert die LCE Consulting GmbH,

oder Treibhauseffekt, ermittelt. Ausdem Vergleich mit den Ergebnissen zuAlternativprodukten lässt sich danneine Bewertung ableiten.

Mineralölbasierte Kühlschmierstof-fe (KSS), die in der Metallverarbeitungzur Herstellung von Werkstücken mithoher Oberflächenqualität bei vermin-derter Werkzeugabnutzung und zur

28 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

KAUTSCHUKVERWERTUNG

Entwicklung einesbiotechnologischen Verfahrenszur stofflichen Wiederverwertungkautschukhaltiger Rest- undAbfallstoffe� Dipl.-Biol. Matthias Arenskötter1, Dipl.-Biol. Dirk Baumeister1, Dipl.-Biol. Daniel Bröker1, Dr. Udo Hölker2, M.Sc. Ebaid M. A. Ibrahim1, Dr. Jürgen Lenz2,Dipl.-Biol. Karsten Rose1, und Prof. Dr. Alexander Steinbüchel1*

1Institut für Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie, Westfälische-Wilhelms-Universität Münster, 2bioreact GmbH, Bonn

Die Jahresproduktion von Kautschuk betrug im Jahr 2000 17,3 Mio. Tonnen. Zur Verwertung der daraus resultierenden Abfälle wird an der Entwicklungeines biotechnologischen Verfahrens gearbeitet, um verschiedene Kautschuk-haltige Abfallstoffe wieder dem Stoffkreislauf zuzuführen. Neben der Akku-mulation technisch nutzbarer Polymere durch Kautschuk-abbauende Bakterien wird die Produktion chemisch interessanter Substanzen angestrebt, wel-che als Rohstoffe für chemische Synthesen oder biotechnologische Produktionsprozesse Verwendung finden können. Da der mikrobiologische Kau-tschukabbau bisher nur wenig verstanden wird, ist eine Analyse der Abbau- und Zwischenprodukte wichtig. Mittels GPC-Analysen konnten Zwischen-produkte unterschiedlicher Molekulargewichte nachgewiesen werden, deren chemische Struktur in Zukunft aufgeklärt werden muss. Zudem bestehtInteresse daran, die bei der Vulkanisation von Kautschukprodukten entstehenden Schwefelbrücken, welche die Materialeigenschaften der Produkte dau-erhaft fixieren, durch den Einsatz von Mikroorganismen zumindest teilweise rückgängig zu machen, um einen größeren Anteil an Altreifengranulat rezy-klisieren zu können. Ziel ist eine effiziente Umsetzung der Substrate in Feststoffbioreaktoren. Außerdem wurden thermophile Mikroorganismen isoliertund charakterisiert, welche in der Lage sind, Kautschuk als alleinige Kohlenstoffquelle zu verwerten, da diese gegenüber mesophilen Bakterien Vorteilebieten können.

Keywords: Kautschukabbau; Feststofffermentation; cis-1,4-Polyisopren; Thermophile, GPC.

Einleitung

Naturkautschuk (natural rubber, NR)ist Bestandteil des Milchsafts vielerDikotyledonen, von denen der Kau-tschukbaum (Hevea brasiliensis) derökonomisch bedeutendste Vertreterist. Aber auch viele einheimischePflanzen wie Löwenzahn oder Feldsa-lat synthetisieren Kautschuk in einemnicht zu vernachlässigenden Umfang.NR ist das cis-Isomer des Polyisoprens(cis-1,4-Polyisopren) und findet Ver-wendung bei der Herstellung von über40.000 Produkten, darunter auchmehr als 400 aus dem medizinischenBereich. Seit Mitte des vorherigenJahrhunderts wird der stetig steigen-de Bedarf an Kautschuk zudem durchdie chemische Synthese von Isopren-kautschuk (IR) gedeckt. Neben die-sen stehen je nach Produktanforde-rung auch andere chemisch syntheti-sierte Kautschuke zur Verfügung, wiez.B. Styren-Butadienkautschuk. Welt-weit betrug die Produktion im Jahr

2000 6,4 Mio. Tonnen Naturkau-tschuk und 10,9 Mio. Tonnen Synthe-sekautschuk [1].

Zwangsläufig fallen große Menge ankautschukhaltigen Abfällen an. Diesewerden bislang großteils der thermi-schen Verwertung zugeführt oder aufDeponien endgelagert. Den Hauptan-teil an diesen Abfällen machen Auto-reifen aus; in den USA werden derzeit2-3 Mrd. Autoreifen deponiert [2], inDeutschland fallen jährlich 600.000Tonnen Altreifen an.

Obwohl der mikrobiologische Ab-bau von Kautschuk bereits lange un-tersucht wird, ist bislang praktischnichts über die biochemischen undmolekularbiologischen Grundlagenbekannt. Bereits zu Beginn des vor-herigen Jahrhunderts gelang die Iso-lierung von Mikroorganismen, welchein der Lage waren, NR als Kohlenstoff-quelle zu verwerten [3]. Heute wer-den Mikroorganismen anhand ihresAbbauverhaltens von Kautschuk inzwei Gruppen eingeteilt [4]: Die er-

ste Gruppe hat die Eigenschaft, auflatexhaltigen Festmedien Kautschukangreifende Enzyme auszuscheidenund Klärhöfe auszubilden. Es handeltsich dabei um Mycel-bildende Actino-myceten der Gattungen Actinoplanes,Micromonospora und Streptomyces[5]. Vertreter der zweiten Gruppe hin-gegen benötigen den direkten Kontaktzum Substrat. Sie bilden keine Klär-höfe, sondern wachsen adhäsiv aufdem kautschukhaltigen Substrat undbilden dort einen Biofilm. Zu dieserGruppe zählen Vertreter der Gattun-gen Gordonia, Mycobacterium undNocardia [6]. Die adhäsiv wachsen-den Bakterien sind in der Regel diepotenteren Kautschukabbauer.

Ergebnisse

Isolierung thermophilerKautschuk-abbauenderBakterienThermophile Bakterien können fürden Einsatz biotechnologischer Ver-

fahren Vorteile gegenüber mesophilenbieten. Diese liegen besonders in ei-ner geringeren Gefahr der Kontami-nation, sodass oft ein geringerer Auf-wand für die Kultivierung betriebenwerden muss. Dieser Umstand wirktsich gerade auf Fermentationen übergrößere Zeiträume aus, wie sie der-zeit für die Umsetzung von Kautschuk-materialien noch benötigt werden.Des Weiteren muss davon ausgegan-gen werden, dass Enzyme aus Ther-mophilen, welche in den Abbau vonKautschuk involviert sind, vergleichs-weise thermostabiler sind und auchfür in vitro Umsetzungen in einembreiteren Temperaturbereich einsetz-bar sind. In der Vergangenheit wur-den nur mesophile Bakterien mit derFähigkeit zum Kautschukabbau be-schrieben, sodass auf keine bereitsuntersuchten thermophilen Vertreterzurückgegriffen werden konnte. Fürdie Anreicherung moderat thermophi-ler Bakterien wurden dementspre-chend Habitate gewählt, in denen die-

Sonderband | 2003 | 29BIOKATALYSEBIOKATALYSE

se zu erwarten waren. Für die Anrei-cherung wurden unterschiedlicheUmweltproben mit Saline (0,9 %NaCl-Lösung) versetzt und damit Er-lenmeyerkolben mit Mineralsalzmedi-um [7] inokuliert. Anschließend wur-den diese Anreicherungskulturen bei55 °C inkubiert. Nachdem durch Trü-bung der Medien makroskopischWachstum erkannt werden konnte,wurden mit den Kulturen sukzessivfrische Medien beimpft und so dieKautschuk-verwertenden Bakterienangereichert. Da viele dieser Bakteri-en nicht auf Festmedien mit Latex zuwachsen vermögen, wurde eine gro-ße Anzahl der Bakterien aus den An-reicherungen auf Komplexmedium(Standard I, Merck, Darmstadt) inReinkultur gebracht. Unter diesenReinkulturen konnten bisher insge-samt fünf unterschiedliche Isolate(E1-E5) als thermophile, Kautschuk-abbauende Bakterien identifiziert wer-den (Tab. 1). Vier der fünf Stämmewurden aus unterschiedlichen Erd-proben bzw. aus viehwirtschaftlichenFutterresten aus Ägypten isoliert; einIsolat entstammt einer Kompostie-rungsanlage in Deutschland. Bei allenhandelt es sich um Gram-positive My-cel-bildende Actinomyceten, welchesich jedoch hinsichtlich ihres Abbau-verhaltens deutlich unterscheiden.Zwei Isolate, E4 und E5, bilden aufLatex-haltigen Festmedium Klärhöfe,was auf eine Sekretion von Enzymen,welche den Kautschuk spalten kön-

dauer bis Klärhöfe gebildet werden.Die Isolate E1, E2 und E3 folgen ei-nem Abbauverhalten von Kautschukwie es bisher von verschiedenenGordonia-Spezies bekannt war. Eswerden keine Klärhöfe auf Latex-hal-tigem Festmedium ausgebildet, undWachstum auf IR als alleiniger Koh-lenstoffquelle lässt sich am besten inFlüssigkultur beobachten; die Zellenbesiedeln die Kautschukoberfläche.Basierend auf der Sequenzanalyse der16S rDNA wurden diese ebenfalls ta-xonomisch Eingeordnet. Höchste Si-milaritäten von bis zu 99,87 % wur-den zu Nocardia farcinica erhalten(E1, E2). Isolat E3 konnte bisher nurbis hin zur Gattung bestimmt werden;es gehört ebenfalls zum Taxon Nocar-dia. Weiterführende Untersuchungen

brauchten Menge HCl gegenüber ei-ner nicht-inokulierten Kontrolle gabAufschluss über die während der Kul-tivierung gebildete CO

2-Menge, welche

durch Mineralisation des Kautschuk-substrats entstand und als BaCO

3 aus-

fiel. Die entstandene Menge an CO2

gibt dann Aufschluss über die von denZellen umgesetzte Menge der Kohlen-stoffquelle, wobei der Anteil, welcherin die Synthese von Biomasse einge-flossen ist, nicht berücksichtigt wer-den kann. Erfahrungsgemäß unter-scheiden sich Klärhof-bildende und

Abb. 1: Zeitlicher Verlauf der Mineralisation. Entstehendes CO2 wurde mit0,25 M Ba(OH)2 als BaCO3 ausgefällt und quantitativ bestimmt.

Abb. 2: Nachweis der Spaltung vonIR durch G. westfalica mittelsGPC-Elutionsprofilen nach (B),24h; (C), 48h; (D), 72h; (E), 120h; (F),144h Inkubationsdauer; (A), Kon-trolle.

Quantitative Bestimmungder Abbauleistungenverschiedener Bakterien

Quantitativ kann die AbbauleistungKautschuk-verwertender Bakterienanhand der Emission von Kohlendi-oxid bestimmt werden. Dazu wird dasdurch Mineralisation von Kautschukfreisetzte CO

2 mit Bariumhydroxid

[Ba(OH)2] in Form von Bariumcar-

bonat (BaCO3) ausgefällt. Zur Bestim-

mung der Mineralisation wurde dierespiratorische CO

2-Produktion wäh-

rend der Kultivierung erfasst. Zu die-sem Zwecke wurden gasdichte Erlen-meyer-Kolben verwendet, die jeweilsmit 50 ml MSM und 0,1 g Kautschuk-substrat (Latex bzw. IR) versetzt wur-den. In den Kolben wurden außerdem

Tab. 1: Neu isolierte, thermophile Mikroorganismen und deren Charakterisierung.

Isolat Isolationsort Wachstumsverhalten optimale 16S rDNA AnalyseWachstumstemperatur

E1 Mutterboden ( E ) adhäsiv 50 °C 99,8% Identität zuNocardia farcinica

E2 Sandboden ( E ) adhäsiv 50 °CE3 Erdprobe Tankstelle ( E ) adhäsiv 50 °CE4 Abfälle aus Tierhaltung ( E ) bildet Klärhöfe 50 °C 99,0% Identität zu

Thermomonospora curvataE5 Kompost ( Münster ) bildet Klärhöfe 50 °C

(E); Ägypten; (-), negativ; (+), positiv

nen, hinweist. Für die taxonomischeKlassifizierung dieser Isolate wurdedie Sequenz der 16S rDNA vollständig(E4) bzw. partiell (E5) ermittelt undmit in Datenbanken hinterlegten 16SrDNA Sequenzen bekannter Speziesverglichen. Basierend auf diesen Er-gebnissen konnten für das Isolat E4höchste Similaritäten zur SpeziesT h e r m o m o n o s p o r a c u r v a t a(99,04 %) erhalten werden. Die par-tielle 16S rDNA Sequenz von Isolat E5deutet ebenfalls auf diese Spezies hin,jedoch unterscheiden sich beideStämme aufgrund der Inkubations-

zur polyphasischen taxonomischenKlassifizierung wie Bestimmung desZellwandtyps, der Zellwandbestandtei-le und Zusammensetzung der zellulä-ren Lipide müssen die Sequenzanaly-sen noch bestätigen. Mit den hier be-schriebenen Bakterienstämmen ste-hen nun erstmals thermophile Spezi-es zur Verfügung, welche in der Lagesind, natürlichen und synthetischenIsoprenkautschuk zu verwerten, undwelche unter Umständen als eineQuelle für thermostabile, Kautschuk-spaltende Enzyme genutzt werdenkönnen.

Glasröhrchen (Reagenzgläser) mit15 ml einer 0,25 M Ba(OH)

2-Lösung

gegeben. Die Gefäße wurden anschlie-ßend entsprechend inokuliert, luft-dicht verschlossen und parallel zu ei-ner nicht-inokulierten Kontrolle un-ter entsprechenden Temperaturbedin-gungen inkubiert. Alle 5-6 Tage wur-den die Kolben belüftet, die Reagenz-gläser durch neue ersetzt und die je-desmal entnommene Ba(OH)

2-Lösung

nach Zugabe von Phenolphtalein(20 µl aus 1 % (w/v) in Isopropanol)mit 0,25 N HCl bis zum Farbumschlagtitriert. Die Differenz der dabei ver-

30 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

adhäsiv wachsende Kautschuk-abbau-ende Bakterien deutlich hinsichtlichihrer Mineralisationsraten. Währendbei Spezies der Gattung GordoniaMineralisationsraten von bis zu 50 %mit Latex und ca. 20 % mit IR als al-leinige Kohlenstoffquelle zu beobach-ten sind, erreichen Klärhof-bildendeVertreter wesentlich geringere Ratenvon ca. 5 % (IR) bzw. 8 % (Latex).Die neu isolierten, thermophilen Bak-terien-Stämme weisen nach einer In-kubation von 50 Tagen bei 55°C Mi-neralisationsraten von ca. 10 % mit IRund ca. 15 % mit Latex auf (Abb. 1).Diese sind höher als sie von mesophi-len Klärhof-bildenden Stämmen wieActinoplanes missouriensis undStreptomyces sp. erhalten werden,erreichen jedoch nur etwa ein Drittelder Mineralisationsraten, welche beigleichen Experimenten mit Gordonia-Spezies erzielt werden können.

GPC-Analysen zumNachweis der Spaltung desKautschuk-Rückgrads

Ein sehr wichtiges Verfahren in derPolymerchemie ist die Analyse poly-merer Verbindungen mittels Gel-Per-meations-Chromatographie (GPC).Dieses Analyseverfahren erlaubt dieErmittlung der Molekularmassen vonPolymeren und fand auch Einsatz zumNachweis der Spaltung von IR. GPC-Analysen basieren auf der Auftrennungpolymerer Stoffe aufgrund ihres Mo-lekulargewichts. Hochmolekulare Ver-bindungen haben bei dieser Methodeeine geringere Retentionszeit als nied-rigmolekulare. Synthetischer Kau-tschuk, wie er für diese Untersuchun-gen eingesetzt wurde, hat ein Mole-kulargewicht von ca. 6 x 106 Dalton.Wird dieses Substrat von Kautschuk-verwertenden Bakterien gespalten, somuss man das Auftreten von Abbau-bzw. Zwischenprodukten geringererMolekulargewichte erwarten. Für Klär-hof-bildende Bakterien wurden solcheAnalysen bereits früher durchgeführt,und es konnten niedermolekulareSubstanzen identifiziert werden [8].Da adhäsiv wachsende Stämme jedochIR erheblich schneller verwerten,kann erwartet werden, dass sich dieAbbaustrategien auch biochemischunterscheiden. Als Modellorganismusfür vergleichende Studien wurdeG. westfalica gewählt [9]. In steriletrockene Erlenmeyer-Kolben wurden2 ml einer 2 % (w/v) IR-Lösung inChloroform gegeben und das Lösungs-mittel abgedampft. Anschließend wur-den auf die am Boden des Gefäßesentstandene und haftende Kautschuk-

schicht 50 ml MSM geben und dieKolben mit 100 µl einer gut gewach-senen Vorkultur inokuliert. Nach un-terschiedlichen Inkubationsperiodenwurde jeweils eine vollständige Kul-tur für die GPC-Messung vorbereitet.Die Kulturbrühe wurde verworfen undder Erlenmeyerkolben mit der amBoden befindlichen Kautschukschichtwurde bei 70°C getrocknet. Anschlie-ßend wurden 50 ml Chloroform hin-zugegeben und so die Kautschuk-schicht darin gelöst. Die erhaltene IR-Lösung wurde in frische Glasgefäßeüberführt und das Chloroform evapo-riert. Dieser Vorgang wurde einmalwiederholt. Der vereinte Rückstand

wurde erneut in einer geeignetenMenge Chloroform aufgenommen undkonnte direkt chromatographischanalysiert werden. Dazu wurden dieProben mit einem Waters-GPC-Systemaufgetrennt und detektiert [Water 515HPLC Pump, 410 Differential Refrac-tometer, 717plus Autosampler, Ver-wendung fanden vier hintereinandergeschaltete Styragel-Säulen (HR3,HR4, HR5, HR6) mit einer Porengrö-ße von 103, 104, 105 bzw. 106 Å]. Ab-bildung 2 zeigt die Elutionsprofilenach einer Inkubation von 1-7 Tagenin Gegenwart von Zellen vonG. westfalica (B-F) und einer nicht-inokulierten Kontrolle nach 7 Tagen

(A). Bereits nach 24 Stunden (B) ließsich eine leichte aber deutliche Ver-änderung des Elutionsprofils erken-nen; der zuvor distinkte Peak lief lang-samer aus, sodass bereits nach die-ser verhältnismäßig kurzen Inkubati-onszeit das Substrat modifiziert wor-den war. Nach 48 Stunden (C) trat einzusätzlicher Peak mit einer geringe-ren Molekularmasse auf, während dervom einsetzten IR resultierende Peakan Fläche abnahm, und nach 72 Stun-den (D) konnte ein weiterer nieder-molekularer Peak identifiziert werden.Im weiteren Verlauf nahmen die Peak-flächen kontinuierlich ab (E, F). An-hand dieser GPC-Analysen konnte dieSpaltung des IRs durch G. westfalicadeutlich demonstriert werden. Auchkönnen die Elutionprofile einen gewis-sen Aufschluss über die Art der Spal-tung des Polymerrückgrads geben. Dazusätzliche Peaks geringerer Moleku-larmasse entstehen, muss es sich beider primären Spaltung von IR um eineEndospaltung handeln. Im Falle einesExoabbaus würde nur die ursprüng-liche Peakfläche kontinuierlich ab-nehmen und sich hin zu längeren Re-tentionszeiten verschieben. Auch kanndie Spaltung des Polymerrückgradsnicht zufällig von statten gehen, dadann nicht mit distinkt auftretendenPeaks gerechnet werden kann. Frag-lich ist, ob die/das Kautschuk-spaltende(n) Enzym(e) eine Präfe-renz für bestimmte Bereiche inner-halb der Polymerkette haben, oder obdie Polymerketten so angeordnet sind,dass an der Oberfläche bestimmteBereiche besonders exponiert sind. InZukunft sollen Analysen der Zwischen-produkte des Kautschukabbaus Auf-schluss geben über die genauen me-chanistischen Vorgänge. Besondersdie Analyse der chemischen Strukturder auftretenden niedermolekularenVerbindungen soll klären, um welcheGruppe von chemischen Substanzenes sich dabei handelt und inwieferndiese für chemische Synthesen inter-essanter Chemikalien einsetzbar sind.Die hier beschriebenen GPC-Analysenunterscheiden sich von solchen, wiesie mit Klärhof-bildenden Organismendurchgeführt wurden. Dort traten kei-ne zusätzlichen Peaks auf, sondern dasdurchschnittliche Molekulargewichtnahm mit zunehmender Inkubations-dauer ab [10]

Feststofffermentation vonKautschukmaterialien

Feststoffbioreaktoren bieten gegen-über standardisierten Submersverfah-ren eine Reihe an Vorteilen. Durch die

Abb. 3: bioreact®-Fungtrix-Festphasenbioreaktor. Dargestellt sind ein Ver-fahrensschema (oben) und der experimentelle Aufbau einer Laboranlage(unten).

Sonderband | 2003 | 31BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Art und Weise der Prozessführung mitgeringen Wasseraktivitäten werden dienatürlichen Lebensbedingungen derMikroorganismen nachempfunden.Darüberhinaus sind wegen der höhe-ren volumetrischen Produktivität inder Regel die Arbeitsvolumina kleinerund die Abwasserbelastung sowie derEnergieverbrauch geringer [11]. Die-sen Vorteilen steht jedoch ein erhöh-ter Regelbedarf gegenüber [12,13].

Als Substrate für die Feststofffer-mentationen fanden Latexhandschu-he (Fa. Kimberly-Clark, Belgien), La-texmatratzen (bestehend aus NR undStyrenbutadienkautschuk 85:15) so-wie Autoreifengranulat (Fa. RTW,Bayreuth) Verwendung. Für die er-sten Test-Fermentationen im Labor-maßstab wurden zwei Bautypen derbioreact GmbH ausgewählt: Der bio-react®-Fungtrix-Festphasenbioreak-tor mit 1,5 Litern Arbeitsvolumen undder bioreact®-Airmix-Festphasenbio-reaktor mit 3 Litern Arbeitsvolumen.Hierbei wurden die hydrophobenund sonstigen physikalischen undstrukturellen Eigenschaften der ver-wendeten Subtrate berücksichtigt.

Der bioreact®-Fungtrix ist als Rie-selfilmreaktor ausgelegt. Der verwen-dete Prototyp besitzt einen konischenReaktorkörper zur Optimierung derFeuchteverteilung, einen kreisförmi-gen Grundriß, eine Siebauflage fürdas Substrat-Festbett sowie eine Ein-richtung zur Belüftung unterhalb desFestbetts. Die Messung und Regula-tion des pH-Werts erfolgt außerhalbdes Reaktors kontinuierlich in einemKonditionierungsgefäß, in dem einResidualvolumen ständig verbleibt.Der bioreact®-Airmix hat einenrechteckigen Grundriß und besitztein im Reaktordeckel montiertes Be-lüftungssystem aus auswechselbarenLanzettdüsen. Diese erlauben einebesonders feinverteilte und gleich-mäßige Belüftung des Festbetts sowie- bei immersen Ansätzen - eine scho-nende, scherkraftarme und dennocheffektive pneumatische Agitation. DerAirmix ist deshalb insbesondere füraerobe Fermentationen und Materia-lien geeignet, die durchmischt wer-den sollen, jedoch in konventionel-len Rührfermentern nicht oder nurschwer behandelt werden können.Der für die Versuche verwendete Pro-totyp ist wie der bioreact®-Fungtrixmit einer Siebauflage für das Festbettausgestattet. Entsprechend wurden inbeiden Reaktortypen zunächst Riesel-filmverfahren durchgeführt, also dasstatische Substrat-Festbett mit demKulturmedium kontinuierlich oderperiodisch berieselt.

Um die Umsetzung der einzelnenSubstrate durch die Mikroorganis-men zu testen, wurden zuerst Ver-suchsreihen in Schüttelkolben mit 50ml Mineralsalzmedium [7] sowie0,5 % Kautschukmaterial als Kohlen-stoffquelle durchgeführt (Kultivierun-gen erfolgten bei 30°C und 140 rpm).Es stellte sich heraus, dass keiner derbekannten Kautschuk-abbauendenOrganismen in der Lage war, Latex-matratzenmaterial sowie Autoreifen-granulat zu verwerten. Wurden dieseKautschukmaterialien einer Chloro-formextraktion unterzogen, ließensich Substanzen extrahieren, die einedeutlich inhibierende Wirkung aufdas Wachstum der Mikroorganismenzeigten. Weitergehende Versuche zie-len in die Richtung, kautschukabbau-ende Mikroorganismen mit höhererToleranz gegenüber diesen extrahier-baren Substanzen zu isolieren.

Um den Schwefelanteil im Altrei-fengranulat zu verringern und somitdurch die teilweise Revidierung derVulkanisation einen höheren Anteilan Altreifengranulat wieder in dieProduktion neuer Reifen einfliessenlassen zu können, wurden Kulturenvon Gordonia desulfuricans in ei-nem Volumen von 50 ml mit schwe-felfreiem Mineralsalzmedium, 0,5 %(v/v) Glycerin als Kohlenstoffquellesowie 0,25 % (w/v) Autoreifengranu-lat als Schwefelquelle kultiviert. Da-bei zeigte sich ein deutliches Wachs-tum, welches aber in Fermentations-versuchen mit dem bioreact®-Fung-trix unter sonst gleichen Bedingun-

gen nicht reproduziert werden konn-te. Im Gegensatz zum Kolben wurdeim bioreact®-Fungtrix aber ein weit-aus höherer Feststoffgehalt eingesetzt(40 % w/v). Der Grund für das feh-

lende Wachstum könnte eine man-gelnde Versorgung des statischenFestbetts mit Nährstoffen, bedingtdurch eine partielle Verblockung in-folge des hohen Substratanteils, sein.Zur Vermeidung dieses Effekts wur-de inzwischen ein fortgeschrittenesReaktormodell entwickelt (sieheAbb. 3), dass als wesentliche Neue-rung die Möglichkeit einer Quasi-Wir-belbettprozessführung vorsieht. Die-se Art der Verfahrensführung kannzum Beispiel während der Anwachs-phase der Kultur zur Gewährleistungeiner gleichmäßigen und homogenenInokulation und später während desProzesses zur Auflockerung und Auf-frischung des Festbetts durchgeführtwerden. Dadurch wird die Gefahr ei-ner dauerhaften Unterversorgung derMikroorganismen mit Nährstoffendurch Verblockung oder auch Kanal-bildung vermieden. Dafür ist der Bio-reaktor mit einer zusätzlichen Sieb-platte oberhalb des Festbetts ausge-stattet, die der Zurückhaltung derFestbettbestandteile für den Falldient, dass die Festbettbestandteileeine höhere Dichte als Wasser besit-zen. Dann wird das Kulturmedium imQuasi-Wirbelschichtmodus antiparal-lel zum Rieselfilmmodus geführt. ImFalle von spezifisch leichteren Sub-straten kann der Medienstrom par-allel zum Rieselfilmmodus orientiertsein. Auch kann die Flußrichtunggeändert werden, falls sich das spe-zifische Gewicht der Substrate infol-ge des Biomassewachstums entspre-chend ändern sollte. Als weitere

Abb. 4: Wachstumsverlauf von Gordonia polyisoprenivorans Y2K auf Latexhandschuhmaterial.

Abb. 5: bioreact®-Airmix -Festpha-senbioreaktor. Gezeigt sind eineGesamtansicht (oben), der Reak-torinnenraum mit dem Misch-/Düsensystem (mitte) und das ein-seitige Lager mit Handantrieb undDruckluftanschluss (unten).

32 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Neuerung wird das Festbett auch beidiesem Reaktortyp künftig durchLanzettdüsen, die im Reaktordeckelmontiert sind, belüftet. Der neue bio-react®-Fungtrix ist damit für Substra-te beliebiger Dichte sowie solcheSubstrate geeignet, die dichte Schüt-tungen mit geringen Porositäten bil-den (wie etwa Reststoffe aus Latex-handschuhen). Entsprechende Ver-suche mit den ausgewählten kau-tschukhaltigen Zielsubstraten sindgeplant.

Erste erfolgreiche Fermentationenwurden mit Latexhandschuhen alsSubstrat im bioreact®-Airmix durch-geführt. Sie demonstrieren die prin-zipielle Möglichkeit der Umsetzungvon Kautschukmaterial in Feststoffer-mentern. Gordonia polyisopre-nivorans Y2K wurde in einem Volu-men von 1,5 l Mineralsalzmediumsowie 10 % (w/v) Handschumateri-al kultiviert (Durchflussrate 30 ml/min, 30°C). In Abbildung 4 ist dieEntwicklung der optischen Dichteüber einen Zeitraum von 65 Tagendargestellt. Nach Kultivierung wurdeeine Abnahme des Substratgewichtsum 3,8 % festgestellt.

Der bioreact®-Airmix wurde imVerlauf des Projekts ebenfalls weiter-entwickelt. Das aktuelle Entwick-lungsmodell zeigt Abbildung 5. Neuim Vergleich zu dem vorhergehendenPrototypen ist ein optionales horizon-tales Misch-/Düsensystem sowie einebenfalls optionaler zylindrischerSiebeinsatz am Reaktorboden, derdie bisherige Siebauflage ersetzt. DasMisch-/Düsensystem erlaubt diegleichzeitige Belüftung und Agitationdes Festbetts. Seine Gestalt und dieGeometrie des Reaktorinnenraumswurden wechselseitig aneinander an-gepasst. Das Misch-/Düsensystem be-steht aus einer Hohlwelle, die ausGründen der Handhabbarkeit einsei-tig gelagert ist, sowie dort einge-schraubten, auswechselbaren, perfo-rierten, seitlichen Düsenfortsätzen.Zur Versorgung des Systems mitDruckluft ist das Lager mit einemensprechenden Anschluss ausgestat-

tet. Der optionale Siebeinsatz am Re-aktorboden ist so konstruiert, dasswährend des Betriebs des Misch-/Dü-sensystems ein Zu- oder Ablauf vonFlüssigkeit möglich ist, d. h. der Re-aktorinnenraum kann sporadischoder rhythmisch geflutet und entleertwerden.

Diese genannten, optionalen undvariablen Elemente, das Lanzettdü-sen-System, das Misch-/Düsensystemund der Siebeinsatz, ermöglicheneine hohe Flexibilität des Airmix-Fest-phasenbioreaktors und damit eineoptimale Anpassung der Prozessbe-dingungen an die variierenden Eigen-schaften der verwendeten Substratesowie verschiedene Verfahrensoptio-nen. Hinsichtlich der konkreten An-wendung der Umwandlung kau-tschukhaltiger Reststoffe sind künf-tig Verfahrensweisen mit und ohneAgitation sowie mit und ohne freiesWasser in jeder zeitlichen Kombina-tion möglich. Dadurch lässt sich dieWasseraktivität, zumindest im Mittel,definiert einstellen und die Eigen-schaften der Grenzschicht zwischenhydrophobem Substrat und bakteri-ellem Biofilm geeignet modulieren.Über eine periodische transiente Im-mersion des Festbetts können Nähr-stoffe zugeführt und/oder produzier-te Metabolite während des Prozessesextrahiert und dennoch überwiegenddie Vorteile hoher Sauerstofftransfer-raten durch die großflächige Grenz-schicht zwischen Gasphase und Ober-fläche des Biofilms genutzt werden.Auch mit dem neuen Prototypen desbioreact®-Airmix sind Testversuchegeplant.

Steriltechnisch wurden beide Re-aktortypen, der bioreact®-Fungtrixund der bioreact®-Airmix durch dieOptimierung der Anschlüsse für dieLanzettdüsen und die Vermeidungvon Toträumen optimiert. Durch diegenerelle Verwendung von Lanzettdü-sen mit einer optimierten Perforie-rung sind die Reaktoren auch in situsterilisierbar.

Versuche zur Temperatur-, Feuch-te- und Sauerstoffregulation im Falle

des Fehlens von freiem Wasser zurspäteren Anwendung in großen Ar-beitsvolumina wurden im Airmix-Bioreaktor im Labormaßstab an ei-nem mikrobiellen Modellsystemdurchgeführt, dass wegen der hohenauftretenden metabolischen Ratenund der Quellfähigkeit des Substratshierfür besonders gut geeignet ist:der Fermentation von Brot mit Asper-gillus niger. Für die kautschukab-bauenden Prozesse sind wesentlichgeringere metabolische Raten undfolglich günstigere Ausgangsbedin-gungen hinsichtlich der Prozess-steuerung zu erwarten. Zudem sindhier die Substrate nicht quellbar, so-dass eine einfachere Wasserbilanzvorliegt. Dadurch wird aber auch dieWasseraktivität des Systems fast aus-schließlich durch die Eigenschaftendes sich entwickelnden Biofilms be-stimmt. Kompensatorische (puffern-de) Vorgänge durch den Transportvon Wasser zwischen Biofilm undSubstrat fehlen.

Bei den durchgeführten Experi-menten ließ sich eine effektive Küh-lung des Fermenterinhalts durchDurchströmen mit trockener Luft er-zielen. Zur Regulation der Wasserak-tivität wurde die relative Feuchte derAbluft gemessen. Die mit der Abluftausgetragene Feuchte wurde nachfol-gend kondensiert und in den Reak-tor zurückgeführt. Eine homogeneVerteilung wurde durch das Misch-/Düsensystem erreicht. Dadurch warnur eine geringe Nachregelung durchZugabe von zusätzlichem destilliertenWasser notwendig.

Als alternative Methode der Regu-lation der Wasseraktivität wurde aufReaktortemperatur erwärmte Luft de-finierter Feuchte (durch Mischentemperierter feuchter und trockenerLuft) in das beschriebene System ein-geblasen. Dem Vorteil einer sehr ge-nauen und gleichmäßigen Regulati-on der Wasseraktivität – insbesonde-re auch in stationären Festbetten –steht hierbei die fehlende Möglich-keit einer gleichzeitigen evaporativenTemperaturregelung nachteilig ge-

genüber. Deshalb wird zurzeit einvöllig neuartiges Verfahren zur simul-tanen Temperatur- und Feuchteregu-lation entwickelt.

Literatur

[1] International Institute of SyntheticRubber Producers (1996), WorldwideRubber Statistics 1996, Huston.

[2] Jang, J.W., Yoo, T.S., Oh, J.H., Iwasa-ki, I., Resour. Conserv. Recycl. 22(1998), 1-14.

[3] Söhngen, N.L., Fol, J.G., Zbl. Bakt. IIAbt. 40 (1914), 87-98.

[4] Linos, A., Berekaa, M.M., Reichelt, R.,Keller, U., Schmitt, J., Flemming, H.C.,Kroppenstedt, R.M., Steinbüchel, A.,Appl. Environ. Microbiol. 66(2000),1639-1645.

[5] Jendrossek, D., Tomasi, G., Kroppen-stedt, R.M., FEMS Microbiol. Lett. 150(1997), 179-188.

[6] Linos, A. and Steinbüchel, A., Kau-tschuk, Gummi, Kunststoffe 51(1998), 496-499.

[7] Schlegel, H. G., H. Kaltwasser, G.Gottschalk., Arch. Mikrobiol. 38(1961), 209-222.

[8] Bode, H.B., Zeeck, A., Pluckhahn, K.,Jendrossek, D., Appl. Environ. Micro-biol. 66 (2000), 3680-3685.

[9] Linos, A., M. M. Berekaa, A. Steinbü-chel, K. K. Kim, C. Spröer, R. M. Krop-penstedt., Int. J. Syst. Evol. Microbiol.52 (2002), 1133-1139.

[10] Bode H.B., Kerkhoff, K., Jendrossek,D., Biomacromolecules 2 (2001), 295-303.

[11] Doelle, H.W., Mitchell, D.A., Rolz, C.E.(Eds), Elsevier Applied Science(1992), London.

[12] Raimbault, M., EJB Electronic Journalof Biotechnology 1 (1998),1-15.

[13] Roussos, S., Lonsane, B.K., Raim-bault, M. (Eds), (1995) Kluwer Acade-mic Publischers, Dordrecht.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Alexander SteinbüchelInstitut für Molekulare Mikrobiologieund Biotechnologie, Westfälische-Wilhelms-Universität MünsterCorrenstrasse 3D-48149 MünsterTel.: 0251-8339 821Fax: 0251-8338 388eMail: steinbu@uni-muenster.de

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Sonderband | 2003 | 33BIOKATALYSEBIOKATALYSE

BIOPOLYMERWERKSTOFFE

Umweltgerechte biotechnologischeHerstellung von biokompatiblenPolymerwerkstoffen für dieMedizintechnik� Dr. Frank Thunecke1, Dr. Karin-Dagmar Wendlandt1, Dr. Roland A. Müller1, Dipl.-Chem. Gabriele Mirschel1, Dipl.-Ing. Carmen Kunze2, Dipl.-Ing. Hans-Frieder Listewnik3

1 Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle GmbH, 2 Universität Rostock, Kompetenzzentrum für Biomaterialien, 3 Bio-Ingenieurtechnik GmbH, Leipzig

Mikrobiell herstellbares PHB (Poly-β-hydroxybuttersäure) ist ein bioabbaubarer und biokompatibler Polyester mit Eigenschaften, die etwa vergleichbarmit denen des auf petrochemischer Basis erzeugten Massenpolymers Polypropylen sind. Im Rahmen des von der DBU geförderten Projekts wird eine amUmweltforschungszentrum Leipzig-Halle GmbH entwickelte und patentierte umweltfreundliche Methode, die einen methanverwertenden Stamm zur Bio-synthese und eine wässrige chemisch-enzymatische Aufarbeitung nutzt, in den kleintechnischen Maßstab überführt. Das Scale-up wird von einem Indu-striepartner begleitet, der daraus Daten für die Überführung in eine Pilotanlage gewinnt. Gleichzeitig werden aus der so produzierten PHB von einemweiteren Projektpartner beispielhaft medizintechnische Produkte hergestellt und getestet. Im Mittelpunkt des Projekts steht damit ein integrierter An-satz, bei dem Biosynthese, Downstream Processing, verfahrenstechnische Überführung und marktfähiges Produkt gleichzeitig und in Wechselwirkungbetrachtet werden.

Keywords: Biopolymer, PHB, PHA, Methylocystis, Medizintechnik, Implantat.

thoden wie Spritzgießen und Extrusi-on verarbeitet werden und hat ähnli-che Polymereigenschaften wie Poly-propylen. Dabei verfügt PHB übereine wesentlich bessere UV-Resistenzsowie eine geringere Wasserdampf-und Sauerstoffdurchlässigkeit undstellt eine gute Aromabarriere dar.

Nachteilig ist die relativ hohe Sprö-digkeit und geringe Reißfestigkeit. Infrüheren Jahren war die Markteinfüh-rung von PHB/PHA auf deren Eigen-schaft der Bioabbaubarkeit ausge-richtet. Die Unternehmen ICI/Zeneca/Monsanto fokussierten auf eine Mas-senanwendung im Verpackungsbe-reich, konnten aber aufgrund des hö-heren Preises traditionelle petroche-misch hergestellte Kunststoffe nichtvom Markt verdrängen. Dies führtedazu, dass zwar die Forschung inten-siv weitergeführt, eine kommerzielleNutzung von PHB aber nicht voran-getrieben wurde.

Das Augenmerk des hier vorgestell-ten Projekts liegt deshalb produktsei-tig auf einer anderen Qualität diePHB, ihrer Biokompatibilität. DieseEigenschaft eröffnet den Einsatz in derMedizintechnik. Für diese High-value-low-volume-Produkte spielt der Her-

stellungspreis des Polymers nichtmehr die entscheidende Rolle. Durchdas Scale-up eines am UFZ entwickel-ten und patentierten umweltfreundli-chen Verfahrens zur Biosynthese undAufarbeitung sollen die verfahrens-technischen Grundlagen geschaffenwerden, die auch zur schnelleren Eta-blierung als bioabbaubares Polymer

für Massenanwendungen beitragenkönnen.

Biosynthese

Genauso groß wie das Spektrum derPHA-bildenden Bakterien [2] ist dieAuswahl der möglichen Kohlenstoff-quellen [3]. In den meisten Fällen

Einleitung

Auf meist petrochemischer Basis her-gestellte Polymere sind aufgrund ih-rer vielfältigen Anwendungsmöglich-keiten aus dem täglichen Leben nichtmehr wegzudenken, stellen aber an-dererseits wegen ihrer Unverrottbar-keit ein zunehmendes Abfallproblemdar. Daher gibt es neben dem Aus-bau von Recyclingsystemen seit län-gerer Zeit Bemühungen, zumindesteinen Teil dieser Kunststoffe durchbioabbaubare Polymere zu ersetzen.Neben Polylactiden (PLA) und Poly-glycoliden (PGA) hat dabei die Grup-pe der Polyhydroxyalkansäure (PHA)besonderes Interesse gefunden. PHAsind hydrophobe aliphatische Poly-ester, die von einer ganzen Reihe vonBakterien unter bestimmten Mangel-bedingungen bei gleichzeitigem Koh-lenstoffüberschuss als Kohlenstoff-speicher in Form von intrazellulärenGranula akkumuliert werden. DieForschung konzentriert sich beson-ders auf Poly-β-hydroxybuttersäure(PHB), die am längsten bekannte undam besten untersuchte PHA [1].

PHB ist thermoplastisch verform-bar, kann daher durch Standardme-

Abb. 1: Der Metabolismus von methanothrophen Bakterien (modfiziertnach [7]).

34 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

werden verschiedene Zucker als Roh-stoff eingesetzt, jedoch sollte Methanein bevorzugtes Substrat für die PHA/PHB-Synthese sein, weil es hohe Aus-beuten gewährleistet, in großen Men-gen in Form von Erdgas vorhandenund eine relativ billige Rohstoffquelleist. Außerdem bietet Methan den Vor-teil, dass das Substrat so selektiv ist,

Methans: Methanol ➝ Formaldehyd➝ Ameisensäure ➝ Kohlendioxid.Auf der Stufe des Formaldehyds kannder benötigte Kohlenstoff entwederüber den Serinweg oder über den Ri-bulose-Monophosphatweg (RuMP-Weg) assimiliert werden. Bakterien,die das Methan via Serinweg verwer-ten, sind in der PHB-Synthese beson-

te Methylocystis sp. GB 25 an derMischkultur beträgt ≥ 90 %. Die rest-lichen 10 % entfallen auf Begleitflora,die etwa zur Hälfte aus zwei metha-nolverwertenden Bakterienstämmen,von denen einer als Methylophilusmethylotrophus identifiziert wurde,und zur anderen Hälfte aus anderenHeterotrophen besteht. Erste Versuche

te sich bei der Prozessoptimierung alsgünstigste Variante bezüglich PHB-Ge-halt, PHB-Bildungsgeschwindigkeit,Ausbeute und Molekulargewicht er-wiesen:

Weitere Auswahlkriterien, wie nied-rige Viskosität der Kulturflüssigkeit,geringer Wert des chemischen Sauer-stoffbedarfs (CSB) des Prozesswassersund gute Aufarbeitungseigenschaftender Biomassesuspension, untermau-erten diese Wahl.

Nach grundlegender Optimierungim 40 l-Fermenter, erfolgte das Sca-le-up in den kleintechnischen Maß-stab in einem 400 l-Druckfermenter(Druck ≤ 5 bar). Dieser ist mit zu-sätzlich Regelkreisen ausgestattet, mitdenen die Gelöstsauerstoff- und Ge-löstmethankonzentration im Prozesskonstant und die Ammoniumstickst-off- und Phosphatkonzentration imoptimalen Bereich gehalten werdenkann. Eine Anlage zur Gasreinigunggestattet es, in zukünftigen Versuchendas Prozessabgas von Kohlendioxid zureinigen und dem Prozess wieder zu-zuführen, was eine umweltschonende-re Prozessführung und eine höhereEffizienz des Verfahrens erwarten lässt.

Die PHB-Synthese zeichnet sichdurch einen „Short time“-Prozess aus,d. h. nach 24 h ist die Akkumulationnahezu beendet. Im Verlauf der Ak-kumulation, der in Abbildung 3 füreine Serie von Versuchen unter Phos-phatmangel dargestellt ist, steigt derPHB-Gehalt in den ersten 12 h aufetwa 40 % der Biomasse an, was be-reits etwa 80-85 % des Gehalts nach24 h entspricht. Die Zunahme des Mo-lekulargewichts der PHB verläuft zeit-

dass die Fermentation unsteril durch-geführt werden kann. Perspektivischkann das Methan bzw. Erdgas auchdurch Biogas ersetzt werden, wodurchdie Nutzung nachwachsender Rohstof-fe und die Realisierung von Stoff- undEnergiekreisläufen denkbar ist. DieVerwendung von Methan als Rohstoff-

ders effizient und weisen eine höhereAusbeute der PHB-Akkumulation auf[6]. Dazu gehört die Hauptkompo-nente der von uns genutzten methan-verwertenden Mischkultur, Methylo-cystis sp. GB 25 (DSM 7674), die sichdurch hohe Wachstumsgeschwindig-keit (0,29 h-1) und PHB-Ausbeute aus-

zu deren Verwertungsspektren zeig-ten, dass diese Ameisensäure undFormaldehyd als Kohlenstoffquellenutzen können.

Zellen von Methylocystis sp. GB 25sind in Abbildung 2a in einer Diffe-rential-Interferenzkontrast-Aufnahmedargestellt. Die eingelagerten PHB-Granula lassen sich nach einer Nilrot-färbung mittels Fluoreszenzanregunggut abbilden, wie Abbildung 2b ver-deutlicht.

Die Arbeiten zur Biosynthese erfol-gen in Druckfermentoren unter Phos-phatmangel als initiierender Faktor fürdie PHB-Bildung. Dieser Mangel hat-

Abb. 2: A) Zellen von Methylocystis sp. GB 25 im Differential-Interferenzkontrast, 1200 fach. B) PHB-Granula inZellen von Methylocystis sp. GB 25 nach Nilrotfärbung, Fluoreszenzanregung (Filter B2), 1200 fach.

A B

basis für die PHB-Synthese im techni-schen Maßstab ist ein Novum. Am UFZwurden die Grundlagen für ein sol-ches nicht wachstumsassoziiertes,zweistufiges Verfahren entwickelt undpatentiert [4,5].Methanotrophe Bakterien sind unterverschiedensten Mangelbedingungenin der Lage, intrazellulär PHB zu ak-kumulieren. Der Stoffwechselweg ver-läuft dabei wie in Abbildung 1 darge-stellt über die Oxidationsprodukte des

zeichnet. Wie der Stoffwechselweg ver-deutlicht, können bei der Oxidationvon Methan Stoffwechselprodukte ge-bildet werden, die inhibierend wirken.Daher ist es zwingend, nicht mit Rein-kulturen, sondern mit definiertenMischkulturen zu arbeiten. Die Stabi-lität der Mischkultur wurde über ei-nen Zeitraum von 4 Jahren mittels mi-krobiologischer und molekularbiolo-gischer Methoden nachgewiesen. DerVolumenanteil der Hauptkomponen-

Abb. 3: Prinzipieller Prozessverlauf der Akkumulation von PHB über 24 hunter Phosphatmangel.

Abb. 4: PHB-Gehalt, Restbiomassekonzentration und Phosphatkonzentra-tion während der PHB-Synthese im kleintechnischen Maßstab.

PHB-Gehalt 40 - 50 %Ausbeute YCH4

PHB 0,53 g PHB/g CH4

Mittleres Molekulargewicht Mw ≥ 2 x 106 g/mol(Hochtemperatur-GPC)

Sonderband | 2003 | 35BIOKATALYSEBIOKATALYSE

lich analog dazu und erlaubt daher,schon in der Biosynthese so genannte„Tailor-made“ PHB zu erzeugen.

Abbildung 4 zeigt beispielhaft denProzessverlauf unter Phosphatmangelim kleintechnischen Maßstab. Mitdem Absinken der Phosphatkonzen-tration im Fermentationsmedium wirddie PHB-Bildung initiiert. Das weitereAnsteigen der Restbiomassekonzen-tration in den ersten drei Stunden re-sultiert aus dem Wachstum, das durchden Restphosphatgehalt noch ermög-licht wird.

Die in diesen Prozessen syntheti-sierte PHB ist ein Homopolymer miteinem hohen Molekulargewicht von M≥ 2 x 106 g/mol und einer engen Mo-lekulargewichtsverteilung M

w/M

n-1 <

5 (Hochtemperatur-GPC). Hohe Mo-lekulargewichte sind wichtig, da jedeVerarbeitung des Polymers mit einemAbbau von Molekulargewicht einher-geht. Abbildung 5 gibt einen Überblicküber die Molekulargewichte und Un-einheitlichkeiten der akkumuliertenPHB nach 24 h in einer Serie von 9Versuchen unter Phosphatmangel undunterstreicht die Reproduzierbarkeitdes Molekulargewichts der gebildetenPHB.

Zusammenfassend können folgen-de Vorteile der Gewinnung von PHBaus Methan abgeleitet werden:– Kostengünstiges, gut verfügbaresSubstrat;– Unsterile Prozessführung durchhohe Substratselektivität möglich;– Hohe Biosyntheseausbeuten;– Hohes mittleres Molekulargewichtund enge Molekulargewichtsvertei-lung des synthetisierten Polymers;– „Tailor-made“ Produktion von PHBdurch Variation der Prozessbedingun-gen möglich;– Niedrige kinematische Viskosität(0,96 bis 1,2 mm2/s) der Kulturflüs-sigkeit;– Niedrige CSB-Werte (200-900 mg/l) des anfallenden Prozesswassers;– Rückführung oder energetischeNutzung des Fermentationsgases mög-lich.

Aufarbeitung

Das Hauptproblem bei der PHA-Ge-winnung besteht in der Abtrennungder Nicht-PHA-Zellbestandteile(NPCM, Non-PHA-Cell-Matter).Durch die sehr unterschiedlichenchemischen und physikalischen Ei-genschaften der verschiedenen Zell-bestandteile lassen sich PHA undNPCM weder durch Extraktion nochdurch Zell-Lyse in einem einzigen Auf-arbeitungsschritt ohne Kontaminatio-

nen der Polyester trennen. Die dahernotwendigen mehreren Aufarbei-tungs- und Reinigungsschritte vonBiomasse und gewonnenem Polymerführen in den meisten Fällen zu PHB-Verlusten und einem Molekularge-wichtsabbau, was zu einer Ver-schlechterung der Werkstoffeigen-schaften führt.

Die Gewinnung von PHA erfolgt inden meisten Veröffentlichungen mit-tels Extraktion aus der Biotrocken-masse der PHA-Produzenten [8]. Da-bei liefern Verfahren, bei denen ha-logenierte Kohlenwasserstoffe einge-setzt werden bezüglich der Reinheitund des Molekulargewichts der ge-wonnenen Polymere, zumindest imLabormaßstab, oft sehr gute Ergeb-nisse. Da aber bereits bei geringemPolymergehalt in der Lösung schwerprozessierbare Gele gebildet werden,sind hohe Lösungsmittelüberschüsseerforderlich.

Dies führt jedoch bei biologischabbaubaren Werkstoffen, die mitpreiswerten, petrochemisch gewon-nenen Polymeren konkurrieren müs-sen, zu Marketingproblemen. Des-halb wurden auch extraktive Verfah-ren beschrieben, welche ohne denEinsatz von halogenhaltigen Lösungs-mitteln auskommen. Die Verminde-rung der Folgen auf Umwelt und Ge-sundheit geht jedoch oft zu Lasten derQualität der PHA.

Wegen der oben bereits erwähn-ten geringen Löslichkeit von PHA mitkurzen Seitenketten, insbesonderevon PHB, ist das Scale-up des Aufar-beitungsprozesses vor allem aufgrundder hohen Mengen an Lösungsmittelntechnisch relativ aufwendig und ko-stenintensiv.

Daher wurden weitere Aufarbei-tungsvarianten, wie die oxidative undenzymatische PHA-Gewinnung, vorge-stellt [9], die auf wässriger Basis ar-beiten und auf eine möglichst voll-ständige Auflösung der NPCM zielen.

Hier sollten im Vergleich zu extrakti-ven Verfahren die erzielbaren Ausbeu-ten deutlich höher sein. Nachteilig istoft ein noch vorhandener geringerAnteil an NPCM im PHA.

Am UmweltforschungszentrumLeipzig-Halle GmbH wurde in den ver-gangenen Jahren ein Aufarbeitungs-verfahren im Labormaßstab entwik-kelt und patentiert [10], das durcheine reduktive chemische Vorbehand-lung den nachfolgenden enzymati-

arbeitung bestätigte die prinzipielleEignung des Verfahrens. Eine weiter-gehende Analyse der Teilschritte desbis dahin nur im Labormaßstab ver-wendeten Aufschlusses ergab aller-dings erheblichen Änderungsbedarfim technologischen Ablauf des Ver-fahrens beim Scale-up. So war es not-wendig, für die Entwässerungsschrit-te Ersatz für die im Labormaßstabbenutzte Becherzentrifugation zu fin-den. Deshalb wurden Versuche mit-tels Tellerseparator und Mikrofiltra-tion unternommen, wobei sich insbe-sondere die Cross-Flow-Mikrofiltra-tion als geeignete Alternative in allenAufarbeitungsstufen erwiesen hat. Dieerreichten mittleren Permeatflüssevon 30-50 l/mh sind auch für dieÜberführung in den technischenMaßstab ausreichend. Für den Ern-teschritt wird der Einsatz eines Sepa-rators favorisiert, da es dort gelingt,einen Teil der Begleitflora abzutren-nen.

Der Anstieg der PHB-Reinheit imVerlauf der Aufarbeitung ist in Abbil-dung 7 exemplarisch dargestellt. Ab-bildung 8 illustriert Proben aus un-terschiedlichen Aufarbeitungsstufen.Die Reinheit der so gewonnenen PHBliegt bisher bei 95-97 %. Die für me-dizintechnische Anwendungen not-wendige Reinheit wird momentandurch Nachextraktion erreicht. Diesführt zwar bereits zu einer deutlichenVerringerung des Lösungsmittelein-satzes um mehr als die Hälfte, ange-strebt wird aber, eine ausreichendeReinheit bereits im Aufschlussverfah-ren zu erreichen. Dazu werden An-passungen in der chemischen Vorbe-handlung und dem enzymatischenAufschlussschritt vorgenommen.

Von den Industriepartnern Bio-In-genieurtechnik und Messo-Chemie-technik wurde auf der Grundlage dergesammelten Daten zur Biosyntheseund Aufarbeitung ein Verfahrenssche-ma für eine Pilotanlage einschließlichder Stoff- und Energieströme erarbei-tet.

Einsatz in derMedizintechnik

PHB weist gegenüber den synthetischhergestellten biodegradierbaren Poly-estern den Vorteil auf, dass das Poly-mer als chemisch reiner Stoff ohneKatalysator- oder sonstige Synthesere-ste vorliegt. Nachteilig ist die relativhohe Sprödigkeit und geringe Reiß-festigkeit, die auf die isotaktischeStruktur zurückzuführen ist. Durchdie Herstellung von Copolymeren oderPolymerblends von PHB mit anderen

Abb. 5: Durchschnittliches Molekulargewicht und Uneinheitlichkeit derPHB nach 24 h Akkumulation aus mehreren Versuchen.

Abb. 6: Prinzipschema des che-misch-enzymatischen Auf-schlussverfahrens (CEA).

schen Aufschluss erheblich erleich-tert. Das Verfahren ist in Abbildung 6schematisch dargestellt. Ziel des lau-fenden Projekts ist die Weiterentwick-lung dieses “chemisch-enzymatischenAufschlussverfahrens” (CEA), dasScale-up in den 400 l-Maßstab unterBerücksichtigung der weiteren Über-führung des Verfahrens in den tech-nischen Maßstab sowie der Nachweisausreichender Produktqualität fürmedizintechnische Anwendungen.

Eine gemeinsam mit dem Indu-striepartner Messo-Chemietechnikmittels des CEA vorgenommene Auf-

36 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

PHA, ataktischer PHB, aber auch an-deren bioabbaubaren Polymerenoder die Zugabe von Weichmachernkönnen diese Nachteile umgangenwerden.

PHB ist vollständig biologisch ab-baubar. Das Degradationsprodukt derPHB, die 3-Hydroxybuttersäure, istein normales Stoffwechselprodukt imBlut von Wirbeltieren, was auch alsIndiz für eine sehr gute Biokompati-bilität gilt. Die in vivo-Degradation vonPHB erfolgt sehr langsam [11]. An-wendungsmöglichkeiten von PHBsind deshalb dort zu erwarten, woeine längere Verweilzeit oder höhereStabilität gegenüber der physiologi-schen Umgebung, aber letztlich docheine vollständige Resorption benötigtwird. Beispiele sind Anwendungenzur Behandlung komplizierter Kno-chenbrüche, zur Nervenregeneration,Implantate für das kardiovaskuläreSystem oder den Gastrointestinaltraktsowie als Material für das Tissue En-gineering [12].

Ein für große Implantate aus PLA,PGA und deren Copolymeren be-schriebenes heterogenes Degradati-onsverhalten mit möglichen negativenEffekten auf das Zellsystem durch Ak-kumulation von Abbauprodukten[13] wurde für PHB bisher nicht be-obachtet, weshalb eine bessere Bio-kompatibilität und zunehmende bio-

medizinische Anwendung erwartetwerden kann.

Die prinzipielle Eignung von aufder Basis von Methan gewonnenerPHB als resorbierbares Implantatma-terial ist vom Kooperationspartner ander Universität Rostock bereits nach-gewiesen worden. So belegen Lang-

ren, zeigten ausgezeichnete Ergebnis-se zur Biokompatibilität. Anhalts-punkte für chronische entzündlicheVeränderungen oder metaplastischeEntartungen waren nicht zu verzeich-nen. Ebenfalls positive Erfahrungenwurden mit PHB-Patchmaterialien(Abb. 9) zum Verschließen von De-fekten im Gastrointestinalbereich ge-macht [15]. Hier werden spezielleAnforderungen an das Material ge-stellt, wie das Abdichten des Gewe-bedefekts zur Vermeidung von Ver-wachsungen, die Unterstützung derGewebeneubildung, Resistenz gegen-über Darmenzymen aber auch Eigen-schaften wie Flexibilität und Nähbar-keit, die insbesondere von PHB erfülltwerden.

Ziel des laufenden Projekts ist es,die Eignung von mittels CEA gewon-nener PHB als Biomaterial zu prüfen.Neben einer gleichbleibenden Quali-tät verschiedener Chargen sollte dasMolekulargewicht ausreichend hochsein, da Verarbeitung und Sterilisati-on zu einem beträchtlichen Abbauführen. Das Molekulargewicht ist dar-über hinaus entscheidend für die Kri-stallinität und die Degradation der

Moment laufenden in vitro-Zellver-träglichkeitstests erfolgt die in vivo-Testung an einem favorisierten PHB-Produktmuster aus der CEA-Aufarbei-tung im Vergleich zum herkömmli-chen Verfahren der Lösungsmittelex-traktion.

Literatur

[1] Lee S.Y., Biotechnol. Bioengin. 49(1996), 1-4.

[2] Valentin H.E., Lee E.Y., Choi C.Y., Stein-büchel A., Appl. Microbiol. Biotechnol.40 (1994), 710-716.

[3] Anderson A.J., Dawes E.A., Microbiol.Rev. 54 (1990), 450-472.

[4] Wendlandt, K.-D., Jechorek, M., Helm,J., Stottmeister, U., Polymer Degradati-on and Stability 59 (1998), 191-194.

[5] Wendlandt, K.-D., Jechorek, M., Helm,J., Stottmeister, U., J. Biotechnol. 86(2001), 127-133.

[6] Asenjo, J.A., Suk, J.S., J. Ferment.Bioeng. 64 (1986), 271-278.

[7] Hanson, R.S., Hanson, T.E., Microbiol.Rev. 60 (1996), 439-474.

[8] Holmes, P.A., Wright, L.F., Patent EP15123B1, 03.09.80, ICI.

[9] Cumming, R.H., Rees, P., Watson, J.S.,Patent WO 9411491, 26.05.94, Zeneca,Monsanto.

[10] Schumann, D., Müller, R.A., Patent WO0168892, 20.09.01, UFZ.

[11] Babel, W., Riis, V., Hainich, E., Plasteund Kautschuk 37 (1990), 109-115.

[12] Freier, T., Sternberg, K., Behrend, D.,Schmitz, K.-P., In: Biopolymers (Hrsg.:A. Steinbüchel), Bd. 10 (2003), 247-280.

[13] Therin, M., Christel, P., Li, S., Garreau,H., Vert, M., Biomaterials 13 (1992),594-600.

[14] Saß, M., Behrend, D., Schaffer, J.,Schmitz, K.-P., Biomed. Techn. 40(1995), 401-402.

[15] Behrend, D., Nischan, C., Kunze, C.,Saß, M., Schmitz, K.-P., Med. Biol. Eng.Comp. 37 (1999), 1510-1511.

Korrespondenzadresse

Dr. Karin-Dagmar WendlandtUmweltforschungszentrum Leipzig-Halle GmbHSektion SanierungsforschungPermoserstraße 15D-04318 LeipzigTel.: 0341-235 2281Fax: 0341-235 2492eMail: wendland@san.ufz.de

Abb. 7: Anstieg der PHB-Reinheit während des chemisch-enzymatischenAufschlussverfahrens (CEA).

Abb. 8: Proben aus un-terschiedlichen Aufar-beitungssstufen: Fer-menterablauf (links),nach chemischer Vorbe-handlung (mitte), nachenzymatischem Auf-schluss (rechts).

PHB und damit auch für die mecha-nischen Eigenschaften. Der medizini-sche Einsatz macht zudem einen aus-reichenden Reinheitsgrad erforder-lich, wobei insbesondere der Rests-tickstoffgehalt, der auf Verunreinigun-gen mit Zellbestandteilen hinweist,von Bedeutung ist.Erste Ergebnisse bestätigen die prin-zipielle Eignung von PHB, die nachdem umweltfreundlichen CEA aufge-arbeitet wurde, als Biomaterial hin-sichtlich des Molekulargewichts undder mechanischen Eigenschaften. Dienotwendige Reinheit wird aber bishernur durch Nachreinigung erreicht.Entsprechend der Ergebnisse der im

Abb. 9: PHB-Patchmaterial.

zeituntersuchungen, dass PHB für denklinischen Einsatz hervorragend ge-eignet ist [14]. Versuche mit intra-peritonealen und subcutanen Implan-taten aus PHB in Ratten, Kaninchenund Meerschweinchen, teilweise mitImplantationszeiten von bis zu 2 Jah-

Sonderband | 2003 | 37BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Einleitung

Eine schwere Organschädigung machthäufig eine Transplantation zwingendnotwendig, wenn alle pharmakologi-schen und interventionellen Therapi-en ausgeschöpft sind. Seit der erstenNierentransplantation im Jahre 1963sind in Deutschland bis Ende 2002insgesamt 63.276 Transplantationendurchgeführt worden; allein im Jah-re 2002 wurden insgesamt3.298 Transplantationen vorgenom-men [1].

Die großen Erfolge der Transplan-tationsmedizin in den letzten zweiJahrzehnten sind nicht zuletzt der Exi-stenz immunsuppressiver Medika-mente zu verdanken. Zu einem Mei-lenstein in der Transplantationsmedi-zin wurde vor etwa 25 Jahren der Ein-satz des Medikamentes Cyclosporin A(CsA). Mit Hilfe von immunsuppres-siv wirkenden Medikamenten wie demCsA konnten die Überlebenschancen

von Transplantaten erheblich verbes-sert werden, da das Risiko einer Ab-stoßung des fremden Organs durchdas körpereigene Immunsystem ver-mindert wird. Trotz dieser Erfolgebleibt das neue Organ ein Fremdor-gan und wird bisher durch keinedenkbare Therapie voll akzeptiert. Dieimmunsuppressive Therapie mussdeshalb während der gesamten Über-lebenszeit des Transplantats fortgesetztwerden. Der Einsatz von Immunsup-pressiva bedarf jedoch einer genauenKontrolle, da das therapeutische Fen-ster der Dosierung relativ schmal ist.Nach oben wird es durch das Auftre-ten ernsthafter Nebenwirkungen be-grenzt. Eindeutig ist, dass die oft er-heblichen Nebenwirkungen durcheine Verringerung der Medikamenten-Dosis eingeschränkt werden können.Dabei ist jedoch ein Verlassen des the-rapeutischen Fensters nach unten miteinem Verlust der immunsuppressivenWirkung zu vermeiden.

Cyclosporin A

Cyclosporin A ist das am häufigstenverwendete Medikament zur thera-peutisch induzierten Immunsuppres-sion in der Transplantationsmedizin.CsA ist ein cyclisches Undecapeptidmit einer Molekularmasse von1202,6 Da, das neben einer Reihestrukturverwandter Cyclosporine vondem Pilz Tolypocladium inflatumgams als Hauptprodukt produziertwird [2]. Die Ausscheidung von CsAerfolgt vorwiegend über die Leber, woeine ausgedehnte Metabolisierungdurch das Cytochrom P450 3A-Systemstattfindet. Mehr als 30 Metabolite sindbekannt. Während toxische Effektevon CsA in in-vitro Modellen und kli-nischen Studien ausreichend erforschtwurden, wird der Einfluss von CsA-Metaboliten auf die Toxizität nochkontrovers diskutiert [3,4]. Die CsA-Metabolite zeigen nach klinischen undexperimentellen Erfahrungen jedoch

ebenfalls eine immunsuppressive Wir-kung [4]. CsA bindet im Komplex mitdem Immunophilin Cyclophilin A(Cyp) an die Ca2+- und Calmodulin-abhängige Protein-Phosphatase Calci-neurin (Cn) und hemmt damit des-sen Phosphatase-Aktivität. In Folgedieser Hemmung wird die cytoplasma-tische Untereinheit des Transkripti-onsfaktors NF-AT durch Cn nicht mehrdephosphoryliert und kann damitnicht in den Zellkern eindringen. Die-ses führt u.a. zu einer Inhibierung derInterleukin-2 Bildung und somit zueinem Ausbleiben der T-Zell-Immun-antwort [5].

Tacrolimus

Der Wirkstoff Tacrolimus (FK506)wurde 1995, nachdem er bereits inJapan, England und den USA positiveWirksamkeit gezeigt hatte, auch inDeutschland für die Prophylaxe derTransplantatabstoßung zugelassen.

BIOSENSORIK

Überwachung derImmunsuppressions-Therapienach Organtransplantation mitHilfe einer wirkungsbezogenenAnalysenmethode� Dr. Bernfried Specht1, Dr. Manfred Fobker2, Dr. Beate Vollenbröker3,1, Dr. Michael Erren2, Dr. Ulrich Müller2, Dipl.-Ing. Jan Hendrik Koch3, PD Dr. HelgeHohage3, Prof. Dr. Friedrich Spener 4 und Dr. Norbert Bartetzko1*1Inventus BioTec Gesellschaft für innovative Bioanalytik, Biosensoren und Diagnostika mbH & Co. KG, Nottulner Landweg 90, D-48161 Münster,2Institut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin, Universität Münster, D-48149 Münster3Medizinische Poliklinik D, Universität Münster, D-48149 Münster4Institut für Biochemie, Universität Münster, D-48149 Münster

Mit Hilfe eines Biosensors wurde ein Assay, bestehend aus Pharmakon und Rezeptormolekülen, entwickelt, der anstelle der Konzentration von Cy-closporin A (CsA) die immunsuppressive Aktivität von CsA und seiner Metabolite bestimmt. Der Variationskoeffizient (CV) für den klinisch relevanten Be-reich (50-300 nM CsA) beträgt für den Rezeptorassay 7,2% (innerhalb der Serie) und 10,1% (von Tag zu Tag). Der Messbereich des Tests umfasst 10-500nM mit einer analytischen Nachweisgrenze von 5 nM. Patientenproben wurden mit dem Rezeptorassay und zwei etablierten Routinemethoden vermes-sen und statistisch ausgewertet. Die Korrelation zwischen Rezeptorassay und Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay (r = 0,599, n = 193) sowie zwi-schen Rezeptorassay und der Hochleistungs-Flüssigchromatographie (r = 0,615, n = 150) wurde berechnet. Der Rezeptorassay zeigte im Vergleich zudiesen Methoden eine bessere Übereinstimmung mit hämatologischen und klinisch-chemischen Parametern. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass dieKomplexbildungsaktivität der vermessenen CsA-Analoga mit deren in Zellkulturexperimenten festgestellten immunsuppressiven Aktivität korreliert.

Keywords: Immunsuppressiva, Immunophiline, Transplantation, Immunsuppression, Rezeptorassay, Biosensor, Biacore.

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Tacrolimus ist ein von dem Pilz Strep-tomyces tsukubaensis sezernierteshydrophobes Makrolidlacton und wur-de 1987 erstmals isoliert [6]. Vier Jah-re später fanden die ersten klinischenStudien mit FK506 statt [7]. In weite-ren kontrollierten Studien wurde dieklinische Wirkungsweise bei Organ-transplantationen bestätigt [8,9]. DieMetabolisierung erfolgt ebenso überdas Cytochrom P450 3A-System. Ins-gesamt sind acht Metabolite mit unter-schiedlicher immunsuppressiver Akti-vität bekannt. Obwohl FK506 struktu-rell nicht mit CsA verwandt ist, weisenbeide den gleichen Wirkmechanismusauf. FK506 bindet zwar ein anderesImmunophilin („Tacrolimus bindingprotein 12 (FKBP12)“) als CsA (CsAbindet an Cyclophilin), beide dimerenKomplexe – Immunophilin/Immun-suppressivum – binden jedoch an Cal-cineurin und unterdrücken dessenPhosphataseaktivität [5].

Die Bildung der ternären in-vivoWirkkomplexe lässt sich mit Hilfe desBIACORE®2000-Gerätes, einem opti-schen Biosensor der FirmaBiacore AB, nachweisen (Abb. 1).Durch den Einsatz dieses Geräts ist esmöglich, Wechselwirkungen zwischenunmarkierten Biomolekülen währendder Analyse in Echtzeit zu detektieren[10]. Im Gegensatz zu einer Konzen-trationsbestimmung, wie sie bei denbisher angewandten Methoden erfolgt,wird mit diesem Rezeptorassay dieAktivität einer Probe, nämlich die„Komplexbildungsaktivität“ des Im-munsuppressivums unter Einbezie-hung der im Blut vorhandenen Meta-bolite, ermittelt.

Ergebnisse

Ausbildung der ternären in-vivo Wirkkomplexe auf derSensoroberfläche desBiacore-GerätesMit Hilfe des BIACORE-Gerätes konn-ten die in-vivo Wirkkomplexe zwi-schen Cyp, Cn und CsA sowie FKBP,FK506 und Cn sehr erfolgreich auf derSensoroberfläche nachgebildet wer-den. Abbildung 1 zeigt schematischden Aufbau der zur Bestimmung derimmunsuppressiven Aktivität von CsAund FK506 verwendeten Assays. Cnwird direkt auf der Oberfläche desSensorchips immobilisiert. Eine wäß-rige Pufferlösung des MedikamentsCsA bzw. FK506 fließt nach Zusatz derImmunophiline Cyp bzw. FKBP konti-nuierlich über die Oberfläche des Sen-sorchips. Bindet der in dieser Lösunggebildete dimere Komplex aus Cyp undCsA bzw. aus FKBP und FK506 an im-

mobilisiertes Cn, verändert sich derrefraktive Index in der Nähe der Sen-soroberfläche. Damit verschiebt sichder Resonanzwinkel, wodurch die An-bindung online detektiert werdenkann. Die dimeren Komplexe aus Cyp/CsA und FKBP/FK506 zeigen ein rechtunterschiedliches Verhalten bzgl. ihrerAnbindung an immobilisiertes Calci-neurin und dem Abdissoziieren vonCalcineurin (Abb. 2). Im Falle des di-meren Komplexes aus Cyp/CsA zeigt dieKurvenform mit k

a= 1,08 x 105 M-1x s-1

die sehr schnelle Ausbildung desternären Komplexes, das baldigeErreichen des Gleichgewichtszustandsund die ebenso sehr schnelle Disso-ziation des ternären Komplexes mitk

d= 0,0191 s-1. Im Falle des dimeren

Komplexes aus FKBP/FK506 zeigt dieKurvenform mit k

a=3,37 x 104 M-1 x s-1

eine langsamere Ausbildung des ter-nären Komplexes im Vergleich zu Cyp/CsA. Dahingehend dissoziiert der ter-näre Komplex aus FKBP/FK506/Cn mitk

d= 2,43 x 10-3 x s-1 um einen Faktor 10

langsamer als der ternäre Komplex ausCyp/CsA/Cn. Besonders der um denFaktor 10 kleinerer k

d-Wert im Falle

des ternären Komplexes FKBP/FK506/Cn liefert den entscheidenden Beitragfür die größere Stabilität dieses Kom-plexes. Dieses Ergebnis steht im Ein-klang mit der Tatsache, dass die not-wendige Konzentration an FK506 in derPhase der Erhaltungstherapie ca. umden Faktor 15 niedriger ist als die Kon-zentration des CsA.

Aufbau des CyclosporinA-Rezeptorassays amBiacoreIm Falle des Medikaments CsA wurdeam Biacore ein Rezeptorassay aufge-baut. Durch Auftragung der relativenSignale im Gleichgewichtszustand ge-gen die eingesetzte CsA-Konzentrationlässt sich eine Kalibrierkurve für CsAerstellen. Es ergibt sich ein Messbe-reich von 10 – 500 nM mit einer Nach-weisgrenze von 5 nM. Im klinisch re-levanten Bereich von 50 – 300 nM CsAbeträgt der Variationskoeffizient (CV)in der Serie (intra-day) 7,2% und dervon Tag zu Tag (inter-day) 10,1%. Fürdie HPLC-Methode, die zur Überwa-chung von klinisch auffälligen Patien-ten eingesetzt wird, ergibt sich ein Wertvon 5,1% (intra-day) und 6,9% (in-ter-day) für einen Konzentrationsbe-reich von 104 – 280 nM. Mit der in derklinischen Routine zur Überwachungvon Transplantationspatienten benutzteFluoreszenz-Polarisations-Immunoas-say-Methode (FPIA) werden Variati-onskoeffizienten für die „inter-day“-Bestimmung von 5,5% bei 67 nM CsA,5,1% bei 166 nM CsA und 4,9% bei332 nM CsA erhalten.

Komplexbildungverschiedener CyclosporinA-Derivate mit Calcineurinund Cyclophilin A imVergleich zu Cyclosporin ADie Untersuchung der Komplexbildungvon verschiedenen CsA-Derivaten -Metaboliten, natürlichen Cyclospori-nen und künstlichen Derivaten - mitdem BIACORE ergab sehr unterschied-liche Fähigkeiten der verschiedenenSubstanzen, den ternären Komplexauszubilden (Tab. 1). Es zeigte sich,dass die mit dem BIACORE ermittel-ten Komplexbildungsaktivitäten gut mitden Ergebnissen von Zellkulturexpe-rimenten korrelieren. Interessant sinddie Ergebnisse der häufig untersuch-ten primären Metabolite AM1 undAM4N (Tab. 1). Da diese Metabolite alserste Abbauprodukte von CsA häufigin Patientenproben vorkommen, ist die

Abb. 1: Ausbildung der ternären Komplexe aus Calcineurin, Immunsup-pressivum und Immunophilin (Cyp/CsA/Cn bzw. FKBP/FK506/Cn) auf derSensoroberfläche und das daraus resultierende Resonanzsignal.

Tab. 1: Fähigkeit verschiedener CsA-Derivate zur Komplexbildung im Vergleich zu CsA.

Cyclosporin-Analoga Komplexbildung in vitro im Vergleich Immunsuppressive Aktivität in Zellkulturzu CsA (0 - 400 nM) (Biacore) im Vergleich zu CsA (0 – 400 nM) [2,11,12]

Cyclosporin A 100 % 100 %Metabolit AM9 (18,0 ± 4,5) % (9,2 - 14,0) %Metabolit AM4N (52,3 ± 7,3) % (3,5 - 8,2) %Metabolit AM1 (81,4 ± 11,3)% (2,5 – 16)%Metabolit AM1c (9,2 ± 1,9)% 3%MeAla-6-CsA (2,1 ± 0,1) % schwache immunsuppressive WirkungCyclosporin G (Nva-2-CsA) (85,6 ± 11,0) % starke immunsuppressive WirkungCyclosporin D (15,7 ± 2,7) % schwache immunsuppressive AktivitätCyclosporin F (18,4 ± 2,0) % keine signifikante immunsuppressive Aktivität

Sonderband | 2003 | 39BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Bestimmung ihrer Wirkung zur Be-stimmung der Gesamtwirkung wichtig.AM1 und AM4N weisen eine recht hoheAktivität von 81,4 % bzw. von 52,3 %im Vergleich zur Muttersubstanz auf.Werden diese Ergebnisse jedoch mitdenen aus Zellkulturexperimenten ver-glichen, so zeigen sich deutliche Un-terschiede. Copeland et al. [11] sowieMurthy et al. [12] finden eine deut-lich schwächere immunsuppressiveWirkung (bezogen auf CsA), währendder BIACORE-Test eine deutlich grö-ßere Komplexbildungsaktivität zeigt.Eine eindeutige Erklärung für diesesResultat fehlt bisher. Es ist jedoch gutdenkbar, dass die Metabolite AM1 undAM4N durch die Zellen schlechter auf-genommen werden als andere Cy-closporin-Analoga und deshalb nurmäßig immunsuppressiv wirken. Beider BIACORE-Messung steht dagegenjeweils die ganze Menge zur Komplex-bildung zur Verfügung.

Bewertung desRezeptorassays durchVermessung vonPatientenprobenDie Möglichkeit der Bestimmung derimmunsuppressiven Aktivität in einerProbe im Gegensatz zur Konzentrati-onsbestimmung von CsA soll die Aus-sagekraft des entwickelten Rezeptoras-says im Vergleich zu den etabliertenCsA-Analysenmethoden erheblich ver-bessern. Die Ergebnisse der mit derBIACORE-Methode analysierten Blut-proben wurden mit dem Statistikpro-gramm EVAPAK nach einer Methodevon Passing-Bablock statistisch ausge-wertet und mit den Ergebnissen derAnalysensysteme – HPLC und FPIA -verglichen. Dabei korrelieren die Er-gebnisse von BIACORE und FPIA miteinem Korrelationskoeffizient von0,599 (n = 193) und von BIACOREund HPLC mit einem Korrelationsko-effizient von 0,615 (n = 150). Die mitHilfe des BIACORE-Assays ermitteltenWerte sind um 15,5 % größer als dieWerte, die mit dem FPIA erhalten wur-den, und um 27,5 % größer als dieHPLC-Werte. Da mit der Methode derHPLC die reine CsA-Konzentration be-stimmt wird, hat die Anwesenheit vonMetaboliten offensichtlich einen rechtgroßen Einfluss auf die BIACORE-Be-stimmung. Die bei der FPIA-Methodezum Einsatz kommenden Antikörpererkennen neben CsA die primärenMetabolite AM1 und AM9 [13]. AM1zeigt eine recht hohe Komplexbil-dungsaktivität (81,4 %, Tab. 1), AM9hingegen nur eine Komplexbildungs-aktivität von 18 % (Tab. 1). Aufgrundder Tatsache, dass AM1 und AM9 mit

den Analysensystemen FPIA und BIA-CORE erfasst werden, kann die im Ver-gleich zur HPLC geringere Abweichungder FPIA-Werte von den BIACORE-Werten gut erklärt werden. Der Meta-bolit AM4N zeigt keine Kreuzreaktivi-tät mit den monoklonalen Antikörpern[13], weist jedoch eine recht hoheKomplexbildungsaktivität von 52,3 %(Tab. 1) auf. Die Miterfassung solcherMetabolite wie AM4N mit dem BIA-CORE-Assay erklärt die Tatsache, dassmit diesem Assay im Vergleich zumFPIA größere CsA-Äquivalenzwerte ge-funden werden.

Die Ergebnisse der CsA-Bestim-mung mit den verschiedenen Analysen-systemen von 58 Transplantationspa-tienten wurden weiterhin mit dem Sta-tistikprogramm SPSS nach einer Me-thode von Spearman auf vorhandeneKorrelationen mit klinischen Daten hinuntersucht (Tab. 2). Bei der BIA-CORE-Methode weisen in allen Fällendie Korrelationen mindestens ein Si-gnifikanzniveau von kleiner 0,05 auf,auch zeigt die BIACORE-Methode imSchnitt wesentlich bessere Korrelatio-nen als die beiden anderen MethodenFPIA und HPLC.

Die Korrelation der Ergebnisse er-gab eine gute negative Korrelation dermit dem BIACORE gemessenen CsA-Äquivalent-Werte und der absolutenZahl an Leukozyten, B-Lymphozytenund cytotoxischen T-Zellen sowie einegute Korrelation der mit dem BIA-CORE gemessenen CsA-Äquivalent-Werte und dem prozentualen Wert derMonozytenzahl, der Basophilenzahl

und der T-Lymphozytenzahl im Blut.Eine signifikante Korrelation zwischenden Ergebnissen der mit dem BIACO-RE gemessenen CsA-Äquivalent-Werteund der Konzentration der Zellen desImmunsystems beweist folglich einendirekten Zusammenhang zwischendem Messwert für die Aktivität von CsAund seinen Metaboliten und der Im-munsuppression des Patienten.

Die Korrelation zwischen den BIA-CORE-Ergebnissen und den Leberwer-ten Bilirubin und alkalischer Phos-phatase sind deutlich besser als dieKorrelation zwischen den FPIA-Ergeb-nissen und den Leberwerten. Im Falledes Bilirubins weist die HPLC-Metho-de im Vergleich zur BIACORE-Metho-de eine stärkere Korrelation (0,593 vs.0,343) auf, jedoch liegt hier das Sig-nifikanzniveau nur bei kleiner 0,05.

Eine positive Korrelation mit den CsA-Werten weist daher auf einen Zusam-menhang zwischen der CsA-Konzentra-tion bzw. der Komplexbildungsaktivi-tät der Probe und der Toxizität von CsAund seinen Metaboliten für die Leberhin. Es ist bekannt, dass besondersCsA-Metabolite für die toxische Wir-kung des Medikaments verantwortlichsind [4]. Hohe Konzentrationen an CsAund seiner Metabolite können zurSchädigung der Leber und somit zueiner Einschränkung der de novo-Cholesterinsynthese führen, wodurchdie negative Korrelation mit dem Pa-rameter Cholesterin erklärt werdenkann. Die Verringerung des Choleste-rinspiegels bzw. der Blutfette führt zueiner Herunterregulierung der Pankre-asfunktion mit einer verminderten Se-kretion von Amylase. Weiterhin wird

Die Anzahl der Sternchen zeigt eine Unterscheidung zwischen zwei unterschiedlichen

Signifikanzniveaus; Korrelationskoeffizienten (Spearman):

**Signifikanzniveau: p < 0,01 * Signifikanzniveau: p < 0,05

Tab. 2: Korrelationen zwischen CsA-Analysensystemen und Zellen desImmunsystems sowie verschiedenen Markern.

Biacore FPIA HPLCLeukozyten -0,242* -0,171 -0,309Monozyten % 0,265* 0,040 0,041Basophile % 0,372** 0,261 0,137T-Lymphozyten % 0,464** 0,305* 0,253B-Lymphozyten -0,305* -0,132 -0,301cytotox. T-Zellen -0,260* -0,233 0,121Cholesterin -0,290* -0,113 -0,346Bilirubin 0,343** 0,176 0,593*alkalische Phosphatase 0,304** 0,088 0,178Amylase -0,384** -0,118 -0,112

Abb. 2: Vergleich der dimeren Komplexe Cyp/CsA (schwarze Kurve) und FKBP/FK506 (rote Kurve) bzgl. Ihrer An-bindung an immobilisiertes Calcineurin und dem Abdissoziieren von Calcineurin.

40 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

die Amylase physiologischerweise fastvollständig in den Gastrointestinaltraktabgesondert. Eine häufige Nebenwir-kung von CsA sind gastrointestinaleBeschwerden (Gastritis, Durchfälle,Erbrechen), wodurch eine verstärkteElimination der Amylase aus dem Kör-per resultiert.

Aussicht

Die Überwachung der Immunsuppres-sion und die Erstellung von Therapie-bereichen wird in den kommendenJahren durch die Kombination ver-schiedener Immunsuppressiva auf-grund zahlreicher Arzneimittelinterak-tionen zunehmend schwieriger. Insbe-sondere für die Vielzahl von Metaboli-ten, die in stark variierender und ingrößerer Konzentration als die Mutter-substanz im Blut vorkommen können,ist die immunsuppressive Aktivität und

Toxizität schwer abzuschätzen. DieMöglichkeit der Bestimmung der Ak-tivität von Immunsuppressiva in einerPatienten-Probe (im Gegensatz zurKonzentrationsbestimmung) verbes-sert die Aussagekraft des Rezeptor-as-says im Vergleich zu den etabliertenAnalysenmethoden erheblich und op-timiert die Steuerung der medikamen-tösen Therapie nach Transplantation.Weiterführende Studien sind notwen-dig, um zu beweisen, dass die Verbes-serung der Analytik durch Einführungdieses Rezeptorassays auch klinisch zueinem Anstieg der Überlebensrate desTransplantats führt.

Literaturliste

[1] Statistik Eurotransplant: http://www.transplant.org

[2] von Wartburg, A., Traber, R., Prog.Allergy 38 (1986), 28-45.

[3] Fahr, A., Clin. Pharmacokinet. 24(1993), 472-495.

[4] Christians, U., Sewing, K.F., Clin.Biochem. 28 (1995), 547-559.

[5] Liu, J., Albers, M.W., Wandless, T.J.,Luan, S., Alberg, D.G., Belshaw, P.J.,Cohen, P., MacKintosh-C, Klee, C.B.,Schreiber, S.L., Biochemistry 31(1991), 3896-3901.

[6] Kino T., Hatanaka, H., Miyata, S., etal., J. Antibiot. (Tokyo) 40 (1987),1256-1265.

[7] Fung J., Todo S., Tzakis, A., Alessiani,M., Abu-Elmagd, K., Jain, A., Bronster,O., Martin, M., Gordon, R., Starzl, T.E.,Transplant. Proc. 23 (1991), 1902-1905.

[8] Shapiro R., Jordan, M., Scantlebury,V., Fung, J., Jensen, C., et al., Trans-plant. Proc. 25 (1993), 669-672.

[9] Pham, S.M., Kormos, R.L., Hattler,B.G., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11(1996), 764-72.

[10] Malmqvist M. Biochem. Soc. Trans.27 (1999), 335-340.

[11] Copeland, K.R., Yatscoff, R.W., McKenna,R.M., Clin. Chem. 36 (1990), 225-229.

[12] Murthy JN, Yatscoff RW, Soldin SJ.,Clin. Biochem. 3 (1998), 159-163.

[13] Schütz, E., Svinyrov, D., Shipkova, M.,Niedmann, P.-D., Armstrong, V.W.,Wieland, E., Oellerich, M., Clin. Chem.44 (1998), 2158-2164.

Korrespondenzadresse

Dr. Norbert BartetzkoInventus BioTec, Gesellschaft fürinnovative Bioanalytik, Biosensorenund Diagnostika mbH & Co. KGNottulner Landweg 90D-48161 MünsterTel.: 02534-800 126Fax: 02534-800 124eMail: dr.bartetzko@inventus-biotec.com

WIRKSTOFF-ENTWICKLUNG

Chemoenzymatische Synthesevon Oligosacchariden undglykosylierten Naturstoffen� Dr. Jürgen Seibel, Prof. Dr. Klaus Buchholz, Abteilung für Technologie der Kohlenhydrate, Technische Universität Braunschweig

Forschritte in den Biowissenschaftenführten in den letzten Jahren zur Iden-tifizierung von Kohlenhydraten, die alsSchlüsselelemente der molekularenErkennung, Signaltransduktion, Zell-adhäsion und Kommunikation die-nen. Neben Untersuchungen zurFunktionen des Genoms und Pro-teoms stellt die Untersuchung des Gly-koms eine besondere Herausforde-rung dar. Die mannigfache Struktur-diversität der Glykokonjugate (Oligo-saccharide, Oligopeptide, Oligoprote-ine) begründet deren hohe Spezifitätbei der Erkennung anderer Molekü-le und somit den medizinischen Ein-satz. Diese Strukturvielfalt der Glyko-konjugate erschwert jedoch deren Zu-gang und Analyse. Oft können dieseStrukturen nur totalsynthetisch in be-grenzten Mengen hergestellt werden.Deshalb sind neue ökologische undökonomische Zugänge zum Scale-up

der Glykokonjugate von großer Be-deutung.

Der Einsatz von Biokatalysatorenhat sich als Methode der Wahl erwie-sen, um Produkte aus Kohlenhydra-ten als Rohstoffe selektiv und wirt-schaftlich herzustellen. Das Problemder Selektivität stellt sich in besonde-rem Maße bei Kohlenhydraten, da hiersowohl Regioselektivität, bei meist 3bis 5 Verknüpfungsmöglichkeiten derZucker als Bausteine, und Stereose-lektivität gleichzeitig zu gewährleistensind. Aus einer ungewöhnlich hohenZahl von Isomeren ist in der Regel nurein Produkt erwünscht und nutzbar.

Umweltaspekte

Die klassischen Synthesen von Oligo-sacchariden erfolgen mit großem Auf-wand an Hilfschemikalien (Schutz-gruppenchemie) und in organischen

Lösungsmitteln, enzymatisch dagegenumweltfreundlich im wässrigen Mi-lieu. Daraus ergibt sich eine drasti-sche Umweltentlastung sowie Resour-censchonung, da mit Zuckern über-wiegend nachwachsende Rohstoffeeingesetzt werden. Der Einsatz vonKohlenhydraten und enzymatischenSynthesewegen zur Vermeidung orga-nischer Lösungsmittel und Reduktionchemischer Hilfsstoffe bedeutet einenpräventiven Charakter der Umweltent-lastung. Beim Einsatz von Glyko-syltransferasen werden sowohl Roh-stoffe (Edukte) als auch Energie ein-gespart, gleichzeitig wird die anfallen-de Schadstoffmenge (Schwermetalle,Lösungsmittel) komplett eliminiert.Darüber hinaus lässt sich aufgrundder hohen Selektivität (Regio- und Ste-reoselektivität) von Biokatalysatorendie Bildung von Nebenprodukten weit-gehend vermeiden.

Transglycosidierungen

Eine spezielle Gruppe von Enzymen,Glukansucrasen (GTF) nutzt preiswer-te, industriell verfügbare Substrate,wie Saccharose, Stärke oder Inulin,zur Synthese verschiedener Oligo- undPolysaccharide mit Glukose und Fruk-tose als Bausteinen. Einige werdentechnisch genutzt, um z. B. Gluko- undFruktooligosaccharide, Cyclodextrine,Dextran u. a. für die Anwendung in Le-bensmitteln, Kosmetika und Pharma-ka herzustellen [1,2]. Die Vielfalt derProduktpalette ist beträchtlich. MittelsGlykosyltransferasen können in wäss-riger Lösung Glykosylreste auf unter-schiedliche Akzeptoren übertragenwerden. Damit lässt sich ein weitesSpektrum von Strukturen – bishermeist Saccharide und Derivate – gly-kosilieren, ein interessantes Potenzi-al für die Anwendung.

Sonderband | 2003 | 41BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Abb. 2: Wir-kungsmechanis-mus der Glyko-peptid-Hybrid-Naturstoffe.

Biopharm AG und der X-Zyme GmbHdurchgeführt.

Literatur

[1] Buchholz, K., Monsan, P.: Dextransu-crase, In: Handbook of Food Enzymo-logy, (Hrsg.: Whitaker, J.R., Voragen,A.G.J., Wong D.W.S.), M. Dekker, NewYork (2003), 589-603.

[2] Buchholz, K. Seibel, J., Isomaltooligo-saccharides, In: Oligosaccharides inFood and Agriculture (Hrsg.: Eggles-ton, G., Coté,G.L.) ACS Publication,Oxford University Press (2003).

[3] Demuth, B., Jördening, H.-J., Buch-holz, K, Biotechnol. Bioeng. 62 (1999),583-592.

[4] Demuth, K., Jördening, H.-J., Buch-holz, K., Carbohydr. Res. 337 (2002),1811-1820.

[5] Ragupathi, G., Coltart, D.M., Williams,L.J., Koide, F., Kagan, E., Allen, J.,Harris, C., Glunz, P.W., Livingston, P.O.,Danishefsky, S.J., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 99 (2002), 13699-13704.

Abb. 3: Bei einer Vielzahl tumorassoziierter Antigene handelt es sich umGlykoproteine.

Abb. 1: Typen von Bindungen, die durch Dextransucrase aus Leuconostocmesenteroides NRRL B-1299 gebildet werden [1].

Mit der Dextransucrase lassensich eine Vielzahl von Oligosaccha-riden synthetisieren, indem das En-zym einen Glukoserest von Saccha-rose als Substrat auf andere Mono-oder Oligosaccharide überträgt,meist mit einer α -1,6-Bindung[1,2]. Als Beispiel sei die Synthesedes Disaccharids Leukrose, ein Sac-charose-Isomer mit anderer (1-5statt 1-2-) glykosidischer Verknüp-fung genannt. Mittels kinetischerMessungen sind die optimalen Be-dingungen für diese Reaktion ermit-telt worden [3]; sie ist bis zum Pi-lotmaßstab weiterentwickelt wor-den, da Leukrose als nicht-karioge-nes Süßungsmittel von Interesse ist.Neben der Nutzung des präbioti-schen Effekts werden solche Produk-te für dermatologische und kosme-tische Zwecke angewandt (Cremesu.a.) [1,2].

Die Funktionalisierung und Glyko-sylierung von Sacchariden bietet wei-tergehende Perspektiven, da gezeigtwerden konnte, dass auch Zucker-derivate, wie Zuckeralkohole, Zuk-kersäuren und sogar ungesättigteZucker, glycosyliert werden können[4] (Abb. 1).

Projektziele

Gemäß der Gesundheitsorganisation(WHO) sterben 6 Millionen Men-schen jährlich an Krebs. Die Krebs-forschung stellt somit eines der wich-tigsten Gebiete der Pharmaindustriedar. Der Markt wird auf circa 30 Mil-liarden US $ beziffert.

Ein erfolgreich eingesetztes Che-motherapeutikum ist Taxol®. Dieseswird ausgehend von 10-Desacetyl-baccatin III, das in Ausbeuten von ei-nem Kilogramm pro 3.000 kg Nadelnder in Europa heimischen GemeinenEibe (Taxus baccata) zugänglich ist,in vier Schritten synthetisiert.

Die geringe Wasserlöslichkeit er-schwert die Aufnahme und Applika-tion dieses Wirkstoffs. In dem Ver-bundprojekt wird eine Glyko-syltransferasegenbibliothek aufge-baut und ein funktionelles Screeningdurchgeführt auf Enzyme, dieGlyksoyleinheiten auf diesen Natur-stoff übertragen können, um die Lös-lichkeit und Bioverfügbarkeit we-sentlich zu erhöhen und somit dienotwendige tägliche Dosis drastischzu reduzieren (Abb. 2). Dies giltebenfalls für das in der klinischenPhase befindliche Chemotherapeuti-kum Epothilon.In weiteren Projekten wird die en-zymatische Synthese von Oligosac-

chariden und Glycopeptiden bzw. -lipiden verfolgt (Abb.3). Diese Mo-leküle sind an einer Vielzahl von zel-lulären Prozessen beteiligt. Ihnenwird eine Schlüsselrolle bei der Re-gulation des Immunsystems zugewie-

sen [5]. Sie bieten somit ideale Vor-aussetzungen, um selektivere, scho-nende Therapien mit geringerer sy-stemischer Toxizität durchführen zukönnen.

Zur Änderung ihrer Spezifität wer-den Transferasen der Zufallsmutage-nese unterworfen; so wird versucht,maßgeschneiderte Enzyme für dieSynthese von Oligosachchariden undden Einsatz in der Produktion zu op-timieren.

Ausblick

Es ist zu erwarten, dass ein leistungs-fähiger Biokatalysator aus einem ge-netisch veränderten Bakterienstammin einem optimierten Reaktor fürhohe Wirtschaftlichkeit sorgt. Zurzeitentwickeln führende Firmen (BASF,Fluka, Schering) eine große Zahl anBiokatalysatoren für die organische

Synthese. Doch nicht nur der Pro-duktions- oder Verkaufswert der neuentwickelten Glykosyltransferasen,sondern die hohe Umweltrelevanzund die um mehrere Größenordnun-gen darüber hinausgehende Wert-

schöpfung der mit Katalysatoren er-zeugten Pharmaka bestimmt diehohe ökonomische Bedeutung.

Danksagungen

Die Arbeiten zur Kinetik der Dextran-sucrase wurden durch das EU-Pro-jekt „Structure-function relationshipsof glycosyl-transferases“ gefördert.Das beschriebene DBU-Projekt wirdin Kooperation mit der Combinature

Korrespondenzadresse

Dr. Jürgen SeibelTechnische UniversitätBraunschweigTechnische Chemie-Abteilung für Technologieder KohlenhydrateLanger Kamp 5D-38106 BraunschweigTel.: 0531-391 72 62eMail: j.seibel@tu-bs.de

42 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

genutzten Wirkstoffe oft eine schlech-te Pharmakokinetik oder sind gardurch die Entwicklung von Resisten-zen unwirksam geworden. Für die kli-nische Praxis stehen als Wirkstoff-gruppen lediglich vier Substanzklas-sen zur Verfügung: Polyene, Azole, Al-lylamine/Thiocarbamate und Fluoro-pyrimidine.

Derzeitiger Stand derForschung und Technik

Nahezu alle klassischen Antibiotikawurden durch Optimierung von Sub-stanzen erhalten, die eine antimikro-bielle Wirkung im Ganzzellen-Scree-ning zeigten. Die Verfahren haben je-doch den Nachteil, dass sie unemp-

Problemstellung

Die meisten heute gebräuchlichen An-tiinfektiva sind Derivate von Substan-zen, die bereits länger als 30 Jahre ver-wendet werden. Ein immer stärkerwachsendes Problem stellt dabei dieFähigkeit der Mikroorganismen dar,sich anzupassen und Resistenzen zuentwickeln (Abb. 1).

Insbesondere sind Pilzinfektionenproblematisch, die nur durch einegeringe Zahl spezifisch antimykotischwirksamer Substanzen bekämpft wer-den können. Die Häufigkeit schwererund teilweise lebensbedrohlicher Pilz-infektionen nimmt beim Menschenstetig zu, da die Zahl immundefekterPatienten bedingt durch vermehrteintensivmedizinische Eingriffe (z. B.Organtransplantationen, aggressiveKrebstherapien) und durch die expan-dierende Zahl von HIV Patienten an-steigt. Insbesondere Candida albi-cans ist einer der wichtigsten oppor-tunistischen Krankheitserreger.

Zurzeit verfügbare Wirkstoffe gegenMykosen zeigen unerwünschte Neben-wirkungen aufgrund Arzneimittel-be-dingter Toxizität und riskanter Arznei-mittelinteraktionen. Zudem zeigen die

findlich sind und der Wirkort gefun-dener Substanzen meist unbekanntist. Hierbei ist nicht zu unterscheiden,ob die Wirkung proteinspezifisch to-xisch oder allgemein zytotoxisch ist.Deshalb hat sich die pharmazeutischeForschung in den vergangenen Jah-ren auf eine Zielort-gerichtete Tech-nologie konzentriert.

Abb.1: Globale Entwicklung von Resistenzen gegen klinisch relevante Antibiotika (seit 1967).

WIRKSTOFFSCREENING

Hefezellen als Bioindikatorenzur schnellen Identifizierunghochselektiverumweltfreundlicher Wirkstoffe� Prof. Dr. K.-D. Entian1, Dr. Dietmar Eschrich2, Dr. Jürgen Recktenwald2, Dr. Thomas Gassenmeier2, Dr. Andrea Sättler2, Dr. Jörg Hauf3, Dr. Joachim Klein4,Dr. Martina Rimmele4

1 Institut für Mirobiologie; J.W. Goethe-Universität Frankfurt, 2 Phenion GmbH & Co KG; Frankfurt, 3 SRD GmbH – Scientific Research DevelopmentGmbH; Oberursel, 4 RiNA GmbH – Netzwerk RNA-Technologien GmbH; Berlin

Zahlreiche mikrobielle Schadorganismen werden aufgrund der stetig steigenden Resistenzbildungen gegen vorhandene Wirkstoffe zu einem akuten undschwerwiegenden Zukunftsproblem. Zum Schutz von Mensch und Umwelt ergibt sich daher ein zunehmender Bedarf an Wirkstoffen mit hoher Spezifität,der durch den heutigen Stand der Technik nur bedingt gedeckt wird. Diese brisante Situation macht die Suche nach neuen Antibiotika zu einem existen-ziellen Problem von großem öffentlichen Interesse und hoher wirtschaftlicher Relevanz für die einschlägige Industrie. Des Weiteren sind viele gegenwär-tig eingesetzte Pestizide (Pflanzenschutzmittel und Biozide) aus Umweltaspekten bedenklich. Die Entwicklung selektiver, für Nicht-Schadorganismenuntoxischer Substanzen ist daher dringend erforderlich. In dem hier beschriebenen Projekt werden Hefezell-basierte targetorientierte Testverfahren zumEinsatz kommen (TOP-Verfahren, Target-orientiertes Proteinscreening), mit deren Hilfe hochselektive umweltverträgliche Wirkstoffe für die chemischeund pharmazeutische Industrie identifizierbar sind. Diese TOP-Verfahren kombinieren die Vorteile eines Zielort-basierenden Verfahrens mit den Vorteileneines Ganzzell-Screenings.

Keywords: Screening-Systeme – Saccharomyces cerevisiae – Wirkstoffe – RNA-Aptamere – humanpathogene Pilze.

Sonderband | 2003 | 43BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Der Vorteil Zielort-basierender invitro Ansätze, bei denen es sich umzellfreie biochemische Testsystemehandelt, ist, dass völlig neue Zielortefür Antiinfektiva bestimmt werdenkönnen. Ein Nachteil dieser Systemeist, dass eine große Menge falsch-po-sitiver Treffer detektiert wird. Die imbeschriebenen Projekt genutzten Test-systeme greifen Vorteile der bisheri-gen in vitro und in vivo Testverfahrenauf und nutzen sie zur IdentifizierungTarget-spezifischer und intrazellulärwirksamer Stoffe.

Problemlösung

In Vorarbeiten wurden Testsysteme aufBasis des Modellorganismus Saccha-romyces cerevisiae entwickelt, die esermöglichen, interessante Target-spe-zifische Wirkstoffe zur Pilzbekämp-fung zu identifizieren. Das „Target-orientierte Proteinscreening“ (TOP-Screening) erlaubt, im GanzzellsystemSubstanzen zu identifizieren, die se-lektiv die Funktion eines vorgegebe-nen Enzyms oder Proteins inhibieren.Die Inhibierung ist dabei an das

Wachstum der Zelle gekoppelt. AlsZielproteine dienen Gene aus Schad-mikroorganismen, die in Saccharo-myces cerevisiae heterolog expri-miert werden. In diesen Assays ist esnicht nur möglich neue Target-spezi-fische Substanzen, sondern auch bis-her unbekannte Wirkorte von Antiin-fektiva zu identifizieren.

Die Testsysteme sind so flexibel,dass im Projekt Naturstoffe, Stoffe derkombinatorischen Chemie und auchRNA-Aptamere eingesetzt werden kön-nen.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Karl-Dieter EntianJohann Wolfgang Goethe-UniversitätFrankfurtInstitut für MikrobiologieMarie-Curie-Str. 9D-60439 FrankfurtTel.: 069-7982 9525Fax: 069-7982 9527eMail: entian@em.uni-frankfurt.de

NOVEL BIOACTIVES

Wirkstoffe aus extremophilenMikroorganismen� Dr. Guido Meurer, BRAIN AG; Dr. Stephanie Grond, Universität Göttingen; HD Dr. Arnulf Kletzin, Technische Universität Darmstadt & ZEB e.V.; Dr. RalfGrote und Prof. Dr. Garabed Antranikian, Technische Universität Hamburg-Harburg

Neue, z.B. durch Viren verursachte, Krankheiten und die auch in Westeuropa zunehmende Bedrohung durch Infektionen mit Antibiotika-resistentenKrankheitserregern machen die Entdeckung und Entwicklung neuartiger Wirkstoffgrundgerüste dringend notwendig. Bei der Suche nach neuen Wirk-stoffquellen gewinnt neben der in den letzten Jahren bevorzugt eingesetzten kombinatorischen Chemie zur Synthese bioaktiver Substanzen die Untersu-chung von Mikroorganismen aus natürlichen Habitaten wieder an Bedeutung. Ziel dieses Kooperationsprojekts ist es, unter Anwendung moderner mole-kularbiologischer, genetischer und naturstoffchemischer Verfahren Mikroorganismen aus extremen Habitaten als Quelle von Wirkstoffen zu erschließenund die kontinuierliche industrielle Produktion dieser Substanzen ohne schädigende Eingriffe in den Lebensraum zu sichern. Die diesen Biosyntheselei-stungen zugrunde liegende genetische Information wird in Form von Genbanken verfügbar gemacht. Zur nachhaltigen und ressourcenschonenden Pro-duktion neuartiger Wirkstoffe werden anschließend die für die Wirkstoffbiosynthese relevanten genetischen Komponenten in heterologen, für die Kulturin Fermentationsanlagen kompatiblen Wirtssystemen exprimiert.

Keywords: Rekombinante Naturstoffe, extremophile Mikroorganismen, heterologe Expression, Biosynthesegencluster, nachhaltige Produktion.

GlobaleHerausforderungen:Neue Wirkstoffe

Trotz eines weltweit mit zweistelli-gen Zuwachsraten expandierendenPharma-Markts für einzelne Pro-dukte (s. Tab. 1) sehen wir unsdurch die Verbreitung neuartigerKrankheitserrreger (z.B. SARS) unddas Wiederauftreten von Antibiotika-resistenten, pathogenen Bakterienzunehmend einer globalen Gesund-heitskrise ausgesetzt. Die Branchereagiert darauf unter enormem fi-nanziellem Aufwand mit dem Einsatzultrahochdurchsatzfähiger Scree-ningsysteme und der Erstellung gro-ßer chemisch-synthetischer Sub-stanzbibliotheken, ohne aber damitbislang der sich abzeichnenden Si-tuation entscheidend begegnen zukönnen.

Extremophile alsRessource neuartigerWirkstoffe

In jüngster Zeit ist daher eine zaghaf-te Rückbesinnung auf die zuletzt starkvernachlässigten natürlichen Wirkstof-fe zu beobachten. In der Tat spielenNaturstoffe und vor allem ihre Deri-vate als Wirkstoffe für therapeutischeAnwendungen nach wie vor eine do-minante Rolle. So basieren etwa die

Hälfte der weltweit bedeutendstenMedikamente auf Naturstoffen. Auchbei den Neuzulassungen liegt der An-teil der Naturstoffe und ihrer Derivateheute bei über 30% [1,2]. Dabei stelltdie Gruppe der Actinomyceten denHauptteil der Wirkstoffproduzenten.Um wirklich neuartige Grundgerüsteaufzufinden, muss aber vermehrt aufandere, bislang unbeachtet gebliebe-ne Ressourcen zurückgegriffen wer-den. Hier sind in letzter Zeit vor allem

marine Habitate in den Fokus der Na-turstoffforschung gerückt.

Extremophile Mikroorganismen,insbesondere Archaea, wurden bishervor allem im Hinblick auf ihre biotech-nologische Nutzung untersucht. Fak-tisch wird ihre Bedeutung bis heutemit der Anwendung extrem (thermo-stabiler Enzyme gleichgesetzt. Tatsäch-lich sind alle bislang im Labor kulti-vierbaren und charakterisierten Ar-chaea entweder extrem thermophile

Produkt Indikation/Wirkprinzip Hersteller 2000 Umsatz Prozent Anteil am Prozent jährliches(US$ Mrd.) globalen Umsatz Wachstum

Losec/Prilosec gastrointestinale Erkrankung AstraZeneca 6,1 1,9 + 9Lipitor LDL Cholesterin-Senker Pfizer 5,4 1,7 + 44Zocor Cholesterin-Senker Merck & Co 4,4 1,4 + 15Norvasc Bluthochdruck Pfizer 3,3 1,1 + 15Ogastro/Prevacid Protonenpumpen-Hemmer Abbott 3,1 1,0 + 33

Tab. 1: Aufstellung der weltweit meistverkauften Medikamente. Quelle: Drug Monitor, IMS HEALTH World Re-view 2001.

44 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Cofaktoren der Methanogenese oderthermoprotektive Substanzen wie daszyklische Bisphosphoglycerat. Das ausextrem halophilen Bakterien isolierteEctoin wird ebenfalls bereits kommer-ziell angeboten. Aus Beobachtungender AG Kletzin ist bekannt, dass bei-spielsweise die Kulturüberstände desthermoacidophilen Archaeons Acidia-nus ambivalens korrosive Sideropho-re unbekannter Struktur enthalten.Über diese Substanzen komplexierenund absorbieren die Organismen Me-talle - eine Eigenschaft, die sie für diebiotechnologische Anwendung bei„sanften“ Metalllaugungsprozessenprädestiniert. Aber auch medizinischkönnten sie von Interesse sein, etwazur günstigen Beeinflussung vonKrankheitsverläufen, bei denen z.B.freie Eisen-Ionen als wesentlicher Fak-tor zur Pathogenität von Mikroorganis-men beitragen.

Die meisten schwefelabhängigenArchaea scheiden Substanzen aus, dieden normalerweise wasserunlöslichenSchwefel auf noch ungeklärte Weisehydrophiler und damit für die Mikro-organismen zugänglich machen. Soproduziert Thermococcus (Archaea)niedermolekulare zyklische Poly-sulfide, die antifungal wirken[10,11]. Auch aus thermophilen Ver-tretern des Genus Streptomyces wur-den neben Enzymen verschiedene Se-kundärmetabolite isoliert. So wurdendie Regulationsaktivitäten des Grana-ticin-Bildners S. thermoviolaceus de-tailliert untersucht [12] und Carote-noide [13] sowie einige neuartige An-tibiotikastrukturen (u.a. Strepturi-din, Antibiotic S) zeigen, dass ein er-hebliches Wirkstoffpotential in extre-mophilen Mikroorganismen ungenutztschlummert. Es besteht daher die be-gründete Hoffnung, dass weitere, völ-

lig neuartige Metabolite extremophi-ler Mikroorganismen gefunden wer-den, die auch sekundär immunologi-sche, onkologische und cytotoxischeAktivitäten zeigen.

Nachhaltige Herstellungvon Wirkstoff-Kandidaten

Extreme Habitate stellen meist äußerstempfindliche Ökosysteme dar und sindzudem für den Menschen oftmals nurschwer zugänglich. Wegen der techni-schen und ökologischen Probleme deseigentlichen „bioprospecting“ ist diewiederholte Entnahme von Mikroorga-nismen zur Produktion von Naturstof-fen im Großmaßstab damit praktischunmöglich. Auch ihre Kultivierungstellt eine erhebliche Herausforderungdar, denn die spezifischen Gegebenhei-ten ihres extremen Lebensraums las-sen sich, wenn überhaupt, selbst un-ter großem technischen Aufwand nurunzureichend nachstellen. Dies unddie Tatsache, dass „naturidentische“Nährstoffangebote in der Regel nurmangelhaft simuliert werden können,ist oft ausschlaggebend für die gerin-ge „Ausbeute“ in Kultur. Isolierungs-und Kultivierungsmethoden müssendaher insbesondere den extremen Le-

bensbedingungen Rechnung tragen.Faktoren wie Nährstofflimitierungen,Sauerstoffabschluss, pH-Wert oderTemperatur sind bei der Kultivierungs-optimierung zu beachten.

In einem durch die Deutsche Bun-desstiftung Umwelt (DBU) gefördertenKooperationsvorhaben wird dieserProblemkomplex erstmals durch kon-sequente Anwendung moderner natur-stoffchemischer, biologischer und ge-netischer Verfahren bearbeitet. Primär-ziel des Projekts ist es, anhand neuerbioaktiver Sekundärmetabolite denNachweis zu erbringen, dass extremo-phile Mikroorganismen eine wertvol-le Quelle von Wirkstoffen darstellen.Die Arbeitsgruppe Prof. Antranikianträgt hierzu ihr erhebliches Know-howbei der Etablierung und Bearbeitung

Organismen aus vulkanischen Quellen,extrem halophile aus nahezu gesättig-ten Salzlösungen oder es handelt sichum strikt anaerobe Methanproduzen-ten (Abb. 1). Nicht alle extremophi-len Mikroorganismen kommen jedochaus dem Reich der Archaea. Vielmehrwerden in zunehmender Anzahl auchBakterien in extremen Habitaten ge-funden [3].Über die biosynthetischen Fähigkeitenextremophiler Mikroorganismen hin-sichtlich der Produktion von Wirkstof-fen weiß man bislang nur wenig. Vorallem Naturstoffe mit geringem Mole-kulargewicht sind aufgrund bislangunzureichender Analysen nur wenigebekannt. Jüngste Fortschritte der Tief-see-Biotechnologie zeigen aber eineunerwartet hohe, neuartige mikrobi-elle Diversität. Genauere Untersuchun-gen auf enzymatische Aktivitäten oderSekundärstoffe stehen zwar erst am An-fang [4], belegen aber, dass auch beiden extremophilen Vertretern der Bak-terien und Archaea niedermolekularebioaktive Substanzen eine wichtigeRolle spielen. In Analogie zu bakteri-ellen Wirkstoffen, die oftmals primärgegen artverwandte Konkurrenten wir-ken, konnten antibiotisch wirksamePeptide (Halocine und Sulfolobicine)aus Halobakterien und Sulfoloben (ex-trem halophilen bzw. thermophilen Ar-chaea) beschrieben werden, die selek-tive Wirksamkeit gegen hyperthermo-phile Crenarcheota (Sulfolobus sp.)zeigen [5,6,7].

Bioaktive Substanzen ausExtremophilen

Als peptidogene Wirkstoffe stellen dieHalocine das haloarcheale Äquivalentder sogenannten Bacteriocine dar. De-ren wohl bekannteste Vertreter sind dieLantibiotika mit ungewöhnlichen Ami-nosäuren wie Lanthionin, die von derGruppe der „lactic acid bacteria“(LAB) produziert werden. Seit Jahr-hunderten werden LAB zur Fermenta-tion und Konservierung von Nahrungs-mitteln eingesetzt. So wundert es nicht,dass bereits 1928 mit Nisin aus Lac-tococcus lactis das erste Lantibioti-kum aufgrund seiner inhibitorischenEigenschaften gegenüber anderen LABisoliert wurde [8]. Bislang ist es aberder einzige kommerziell genutzte Ver-treter der Bacteriocine.

Die Wirkungsweise der Halocinewurde bisher nur für das Halocin H6aufgeklärt. Es inhibiert einen halobak-teriellen Na+/H+ Antiporter [9]. Bei-spiele für das Potenzial der Archaeaals Quelle von Substanzen mit noch un-geklärtem Wirkstoffpotential sind die

Abb. 1: Bioprospecting extremer Habitate: Probenentnahme am LakeBogoria, Kenia.

Abb. 2: Antimikrobieller Plattendif-fusionstest mit Extrakten extremo-philer Isolate. Aktivitiät gegen denIndikatororganismus zeigt sich alsklarer Hof um die Auftragsstelle.

Testkeim Ordnung ReichStaphylococcus aureus Firmicutes (gram+; low GC) BacteriaBacillus subtilis Firmicutes (gram+; low GC) BacteriaEscherichia coli Proteobacteria BacteriaPseudomonas stutzeri Proteobacteria BacteriaMycobacterium smegmatis Actinobacteria BacteriaMicrococcus luteus Actinobacteria BacteriaSporidiobolus johnsonii Basidiomycetes EukaryaCandida glabrata Ascomycetes EukaryaHalobacterium sp. YC-819-9 Euryarchaeotes Archaea

Tab. 2: Panel mikrobieller Testkeime als Indikatororganismen in Platten-diffusionsassays.

von Sammlungen extremophiler Mi-kroorganismen bei. Das von BRAINund Arbeitsgruppen der TU Darmstadtgegründete „Zentrum für molekulareEvolution und Biodiversität e.V.“ (ZEB)bearbeitet eine Sammlung thermoaci-dophiler Archaea aus dem Bestand vonProf. W. Zillig. Diese Ressourcen wer-den im Rahmen des Projekts auf dieBiosynthese neuartiger Wirkstoffe un-tersucht. In der ersten Phase werdenKulturüberstände und -extrakte er-zeugt (TUHH, ZEB) und biologisch

Sonderband | 2003 | 45BIOKATALYSEBIOKATALYSE

(BRAIN, ZEB) charakterisiert. Die che-mische Analyse der neuen Substanzenführt die AG Grond in Göttingen durch.

Relativ neu ist auch der Einsatzmolekulargenetischer Methoden inder Wirkstofffindung. Er beruht auf derKenntnis der genetischen Informationzugrundeliegender Biosynthese-Gen-cluster und nutzt Sequenzähnlichkei-ten innerhalb von Genfamilien zurDetektion neuer Gene. Die Verfahrensind somit selektiv für bestimmte Wirk-stoffgruppen (z.B. Polyketide) undstellen, vor allem durch zunehmendeAutomatisierung, eine leistungsstarkeErgänzung traditioneller Screening-Methoden (chemische bzw. Aktivitäts-profilierung) dar. Für die moderneNaturstoffchemie rückt somit die engeZusammenarbeit mit der Molekular-biologie neben die traditionell beste-henden Kooperationen mit Mikrobio-logen.

Gene für Schlüsselenzyme und gan-ze Gencluster für sekundärmetaboli-sche Stoffwechselwege priorisierterKandidaten werden in der zweiten Pro-jektphase in Form von Cosmid- undBAC Klonen gesichert. Mittels rekom-binanter Biosynthese in leicht ma-nipulierbaren hochaktiven Wirkstoff-produzenten wie Streptomyces oderPseudomonas werden anschließendneue bzw. neuartige Aktivitäten zu-nächst im Labormaßstab identifiziertund nachfolgend Methoden und Ver-fahren für eine effiziente wie nachhal-tige Produktion der Wirkstoffe eta-bliert. Das Potenzial dieser Technolo-gie zur Expression von Wirkstoff-Bio-syntheseclustern wurde in den vergan-genen Jahren bereits eindrucksvolldurch Versuche mit Polyketidsynthe-se- und NRPS-Clustern unterstrichen[14]. Einer der neuesten Erfolge ist dieheterologe Expression des Epothilon-Biosyntheseclusters aus dem Myxo-bakterium Sorangium cellulosum inStreptomyces coelicolor [15].

Um Wirkstoffe aus Extremophilenrekombinant darzustellen und zu cha-rakterisieren, wird von Expressions-klonen oder -banken zunächst ein an-timikrobiell ausgerichtetes Aktivitäts-profil aufgenommen sowie ein se-quenzhomologes Screening nachWirkstoffbiosynthese-Genclusterndurchgeführt. Aus positiven Klonenwerden dann die aktiven Substanzenisoliert und einer weiteren Analyse un-terzogen. Biologische Testsysteme hier-für umfassen sowohl so genannte Pri-märscreening-Assays (z.B. Viabilitäts-untersuchungen an unterschiedlichenZelllinien) als auch komplexere zel-luläre Screeningsysteme mit rekombi-nanten Signaltransduktionsmodulen

fik entsprechend normiert. Auffällig,wenn auch nicht unerwartet, ist diehohe Rate von Extrakten, die dasWachstum des extremophilen Indika-torstamms Halobacterium sp. inhibie-ren. Dagegen überrascht die relativhohe Zahl an antifungal wirkendenExtrakten im Primärscreen. Gerade beiden fungalen Indikatorstämmen konn-ten neben einer direkten Wachstums-hemmung auch physiologische Verän-derungen im Wachstum beobachtetwerden. So ist eine Reihe von Extrak-ten in der Lage, die Sporulationsfähig-keit des Basidiomyzeten Sporidiobo-lus johnsonii zu unterdrücken oderdrastisch zu verzögern, was sich eben-falls im Assay ablesen lässt.

Zytotoxizitätsbestimmung. Die To-xizität eines Extrakts auf CHO-K1 Zel-len wird im Projekt standardisiert ineiner Verdünnung von 1:1.000 be-stimmt und in Prozent Überlebensra-te, verglichen mit der reinen Lösungs-mittelkontrolle, angegeben. In Abbil-dung 4 sind die bislang getesteten Ex-trakte sowie die zugehörigen Medien-kontrollen gemäß ihrer Zytotoxizitätgruppiert. Der prozentuale Anteil dereinzelnen Gruppen ist als Balken wie-dergegeben. Auch hier sind die Ergeb-nisse mit den Medienkontrollen abge-glichen und entsprechend bereinigt.Nach Abgleich zeigen demnach etwa5% der getesteten Extrakte eine signi-fikante Zytotoxizität.

Chemische Profilierung. Parallelzum Aktivitätsscreening werden alleRohextrakte chemisch-analytisch cha-rakterisiert. Die effizienten Methodender TLC (Dünnschichtchromatogra-phie) mit ausgewählten Sprühfärberea-genzien und die gekoppelte HPLC-UVund HPLC-MS sind als Analyseverfah-ren gut etabliert. Durch die kontinu-ierliche Verbesserung der verfügbarenTechnologien (z.B. HPLC/MS-MS) unddie gezielte Verwendung von Datenban-ken zur Dereplikation führen sie im-mer schneller zu aussagekräftigen Er-gebnissen.

Primärhit-Rohextrakte aus Extremo-philen werden über HPLC fraktioniertund ihre chemischen wie biologischenProfile aufgestellt. Über den Abgleichmit Datenbanken werden Wirkstoff-kandidaten mit neuen biologischenund/oder chemischen Eigenschaftenidentifiziert und Produzenten für dieScale-up-Kultivierungen priorisiert, umpotenziell neuartige Wirkstoffe im prä-parativen Maßstab zu isolieren.

Priorisierung

Priorisierte Kandidaten aus den ver-schiedenen Primärscreening Assays

(Rezeptoren, „Responsive Elements“etc.). Diese rekombinanten zellbasier-ten Testsysteme (cell-based Assays)erlauben die frühzeitige Beantwortungimmunologisch wie onkologisch rele-vanter Fragestellungen und ermögli-chen somit eine zielgerichtete Entwick-lung aussichtsreicher Kandidaten fürentsprechende Indikationen.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Primärhitsin Prozent

Staphylococcus aureus

Bacillus subtilis

Micrococcus luteus

Escherichia coli

Pseudomonas fluorescens

Mycobacterium smegmatis

Sporidiobolus johnsonii

Candida glabrata

Halobacterium sp. YC-819-9

Indikatororganismen

Prozentuale Verteilung von Primärhits

80-100

60-80

40-60

< 20

Bereinigte Zytotoxizität

Kulturextrakte

Medienkontrollen0

20

40

60

80

100

Viabilität in Prozent

Anteil derExtrakte in

Prozent

Zytotoxische Aktivität von Rohextrakten

Abb. 3: Prozentuale Verteilung von Primärhits im Plattendiffusionsassay.

Abb. 4: Zytotoxische Aktivität von Rohextrakten gegen CHO-K1 Zellen.

Primärscreeningextremophiler Neuisolateund Stämme

Im Rahmen einer vorgeschalteten Pi-lotphase haben die Kooperationspart-ner bestehende Techniken und Assay-Systeme zur Erschließung neuer undneuartiger Sekundärmetabolite extre-mophilen Ursprungs überprüft und,wenn nötig, neue Methoden und Pro-zesse etabliert. Beispielsweise wurdedie Extraktherstellung für die erste Pro-jektphase bei allen Verbundpartnernevaluiert und standardisiert. Parallelwurde eine geschützte Online-Daten-

bank entwickelt, um allen Projektpart-nern jederzeitig den Zugriff auf sämtli-che aktuellen Daten zu ermöglichen.

Die Analyse des Wirkstoffpotenzialsneuer Isolate erfolgt zunächst klassischüber das biologische und chemischeScreening der Rohextrakte. In dieserPhase wird vor allem die antimikrobi-elle Aktivität der Extrakte gegen ein

Panel von bakteriellen, archealen undfungalen Indikatorstämmen (Abb. 2,Tab. 2) sowie ihre Zytotoxizität gegen-über eukaryontischen Zelllinien (CHO-K1 Zellen) getestet.

Screening antimikrobieller Aktivi-täten. Abbildung 3 zeigt die relativeHäufigkeit und Verteilung antimikro-bieller Aktivitäten einiger Rohextraktegegenüber verschiedenen Indikator-stämmen. Da auch Bestandteile derverschiedenen Extraktlösungen unterUmständen hemmend auf das Wachs-tum der Testkeime wirken können,wurden Kontrollen durchgeführt unddie experimentellen Werte in der Gra-

46 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

werden in der zweiten Projektphasenaturstoffchemisch weitergehend un-tersucht. Für die Strukturaufklärung,Charaktierisierung und biologischeTestung neuartiger Strukturen sind je-doch ausreichende Substanzmengen(5-20 mg) notwendig. In einer Reihevon Fermentationen (10-50 l) wirddaher zunächst genügend Zellmateri-al für die Isolierung der aktiven Sub-stanzen und für die Konstruktion vonGenbanken angezogen. Zurzeit läuftbereits die Strukturanalyse mehrer Ver-bindungen, die auf diese Weise isoliertwurden.

Für eine differenzierte Analyse undEntwicklung strukturneuer Wirkstoff-kandidaten werden anschließend zel-luläre Assay-Systeme angewendet.BRAIN hat hierzu eine Tool-Box ent-wickelt, die es ermöglicht, funktionellgekoppelte cell-based Assays modularaufzubauen. Elemente dieses modula-ren Baukastens sind neben verschie-densten Säugerzellen auch Plasmid-vektoren für die Expression von Re-zeptoren, intrazellulären Signaltrans-duktionsproteinen und spezifischenReportergenen. Je nach Fragestellungkönnen diese Elemente de novo zu ei-nem zellbasierten Testsystem aufgebautwerden, das ein funktionell gekoppel-tes und quantitativ auslesbares Signalerzeugt.

Mit Hilfe dieser cell-based Assayskönnen Agonisten und Antagonistenvon medizinisch relevanten zellulärenZielstrukturen gescreent und identifi-ziert werden. Zusätzlich ermöglichensie es aber auch, wichtige Informatio-nen über den Wirkmechanismus (Sig-naltransduktion) der pharmakolo-gisch wirksamen neuen Naturstoffe zugewinnen. Im Fokus dieser Arbeitenstehen Rezeptoren, die im Zusammen-hang mit neoplastischen oder immu-nologischen Krankheitsbildern stehen.

Ein flexibles Vektorsystemzur rekombinantenProduktion neuartigerWirkstoffe im großenMaßstab

Aufgrund der Tatsache, dass extremo-phile Mikroorganismen nur unter er-heblichem technischen Aufwand kul-tiviert und dabei in der Regel nur ge-ringe Substanzmengen gewonnen wer-den können, besteht ein hohes Inter-esse an der heterologen Expressiongenetischer Information aus extremo-philen Quellen in leicht handhabaren,(biosynthetisch) kompetenten Wirts-stämmen. Für die Nutzung des geneti-schen Potentials priorisierter Isolateund die rekombinante Darstellung der

[6] Price L.B., Shand R.F., J. Bacteriol.182 (2000), 4951-4958.

[7] Haseltine C., Hill T., Montalvo-Rodri-guez R., Kemper S.K., Shand R.F.,Blum, P., J. Bacteriol. 183 (2001),287-291.

[8] Rogers L.A., J. Bacteriol. 16 (1928),321-325.

[9] Meseguer, I., Torreblanca, M., Konishi,T., J. Biol. Chem. 270 (1995), 6450-6455.

[10] Ritzau M., Keller M., Wessels P., Stet-ter K.O., Zeeck, A., Liebigs Ann.Chem. (1993), 871-876.

[11] Morita K., Kobayashi, S., TH Lett. 6(1966), 573-577.

[12] Brabban A., Edwards, C., J. Appl.Microbiol. 83 (1997), 430-437.

[13] Hoshino T., Yoshino Y., Guevarra E.D.,Ishida S., Hiruta T., Fujii R., NakaharaT. J. Ferment. Bioeng. 77 (1994), 131-136.

[14] Cane D.E., Walsh C.T., Khosla, C.,Science 282 (1998), 63-68.

[15] Tang L., Shah S., Chung L., Carney J.,Katz L., Khosla C., Julien, B., Science287 (2000), 640-642.

Korrespondenzadresse

Dr. Guido MeurerBRAIN Biotechnology Research AndInformation Network AGDarmstädter Str. 34D-64673 ZwingenbergTel.: 06251-9331 29Fax: 06251-9331 11eMail: gm@brain-biotech.de

Wirkstoffe im großtechnischen Maß-stab sind zwei Kriterien von entschei-dender Bedeutung. Einerseits solltendie Klone einer Genbank möglichstgroße Genomfragmente tragen, damitdie für die Wirkstoffe verantwortlichenBiosynthesegencluster vollständig klo-niert werden können. Andererseitswäre es vorteilhaft, die klonierte ge-netische Information in verschiedenenWirten exprimieren zu können, umdas geeignetste System für die Produk-tion des jeweiligen Wirkstoffes zu fin-den. Hierzu hat BRAIN ein BAC Vek-torsystem (pLIL®EX) entwickelt, dasüber die gewünschte Insertkapazitätvon bis zu 300 kb verfügt. Außerdemermöglicht es, durch Konversion desVektors in verschiedene wirtsspezifi-sche Shuttle-Vektoren einzelne Hitklo-ne oder ganze Genbanken in ausge-wählten Expressionswirten zur Ex-pression zu bringen (Abb. 5). DieDarstellung der Genbanken erfolgt beiBRAIN bzw. durch die AG Kletzin undist eng mit dem Fortschreiten der che-mischen Aufarbeitungen korreliert.

Zusammenfassung

Bereits zum gegenwärtigen Zeitpunktdes Primärscreenings, dessen erstePhase vor kurzem mit der Erstellungeines Sets priorisierter Kandidatenabgeschlossen wurde, ist ersichtlich,dass extremophile Mikroorganismeneine attraktive Ressource für völligneuartige Wirkstoffe darstellen. Erstechemische Analysen zeigen, dass Ex-

tremophile eine Reihe bioaktiver Sub-stanzen produzieren, die bisher un-bekannt waren bzw. therapeutischnicht genutzt werden. Jetzt kommt esdarauf an, mithilfe der neu entwickel-ten genetischen Tools eine großtech-nisch realisierbare nachhaltige Pro-duktion der Wirkstoffe zu ermögli-chen. Parallel wird das Primärscree-ning auch in den weiteren Projektpha-sen fortgesetzt werden, um aus den zurVerfügung stehenden Organismen einmöglichst vollständiges und umfang-reiches Kandidatenset zu generieren.Neben den schon genannten Ressour-cen werden zunehmend auch extre-mophile Stämme aus den Sammlun-gen der BRAIN AG sowie der Arbeits-gruppe Grond eingebunden, um da-mit die Diversität weiter zu erhöhen.

Literatur

[1] Demain, A.L., Nature Biotechnology 16(1998), 3-4.

[2] Pramik, M.J., Genetic EngineeringNews 1 (1998), 8ff.

[3] a) Hanada S., Takaichi S., Matsuura K.,Nakamura, K., Int. J. Syst. Evol. Micro-biol. 52 (2002),187-193. b) Ozkan M.,Desai S.G., Zhang Y., Stevenson D.M.,Beane J., White E.A., Guerinot M.L.,Lynd, L.R., J. Ind. Microbiol. Biotech-nol. 27 (2001), 275-280.

[4] Deming J. W., Curr. Opin. Biotech. 9(1998), 283-287.

[5] Prangishvili D., Holz I., Stieger E.,Nickell S., Kristjansson J.K., Zillig, W.,J. Bacteriol. 182 (2000), 2985-2988.

Abb. 5: Schematische Darstellung der Funktionsweise des pLIL®EX Vektorsystems.

Sonderband | 2003 | 47BIOKATALYSEBIOKATALYSE

L-GLYCEROL-3-PHOSPHAT

Genetische Optimierung derBäckerhefe zur Produktion vonL-Glycerol-3-Phosphat� Huyen Thi Thanh Nguyen M.S.1, Almut Dieterich2, Prof. Dr. Ulf Stahl1, Dr. Elke Nevoigt1

1Institut für Biotechnologie, Fachgebiet Mikrobiologie und Genetik, Technische Universität Berlin, 2 Versuchs- und Lehranstalt für Brauerei in Berlin (VLB)

L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P) ist ein Zwischenprodukt des Zellstoffwechsels, das den Zucker- mit dem Glycerolmetabolismus und der Biosynthese derGlycerolipide verbindet. Als potenzieller Precursor für die enzymatische Synthese von Monosacchariden und Phospholipiden ist L-G3P von großem wirt-schaftlichen Interesse, insbesondere im Rahmen der Entwicklung neuartiger Pharmaka. Die Gewinnung dieser Substanz aus gentechnisch veränderterBäckerhefe erlaubt die Nutzung nachwachsender Rohstoffe, z. B. Melasse, und ermöglicht die preiswerte Bereitstellung großer Mengen an stereoche-misch reinem L-G3P. Die intrazelluläre L-G3P-Konzentration in der Hefe S. cerevisiae konnte bisher durch gezielte Veränderung des Metabolitflussesbereits auf das 100fache gesteigert werden. Die entscheidenden Schritte zum Erfolg waren gezielte Modifikationen der Enzymaktivitäten in den zu- undabführenden Stoffwechselwegen sowie die Erhöhung von verfügbarem NADH, welches für die Biosynthese von L-G3P essenziell ist.

Keywords: Hefe, Saccharomyces cerevisiae, L-G3P, Glycerol, NADH, Monosaccharide, Phospholipide.

hohen Arbeitsaufwands, entweder fürdie Bereitstellung elaborierter Aus-gangsstoffe oder für die Aufreinigungdes L-Enantiomers aus komplexenProduktgemischen, sind diese Me-

thoden aber für großtechnische Ver-fahren unwirtschaftlich. Auch derEinsatz von isolierten Enzymen führtnicht zum Durchbruch, da entwederdie Kofaktorregeneration ein unge-

löstes Problem bleibt (Einsatz vonGlycerolkinase und ATP als Phos-phatdonor [3]) oder das verwende-te Enzym nur Regio- aber keine Ste-reoselektivität aufweist (Einsatz vonPhosphatase und Pyrophosphat alsPhosphatdonor [4,5]). Letzteresführt dazu, dass das gewünschte L-Enantiomer nur zu 50% gebildetwird.

Eine bisher ungenutzte Möglich-keit besteht darin, L-G3P auf biotech-nologischem Weg herzustellen, undzwar mit Hilfe einer genetisch modi-fizierten Bäckerhefe. Die Vorteile ei-nes solchen Verfahrens liegen auf derHand: Es entsteht nur das L-Enantio-mer, sämtliche Kofaktoren werdendurch den Zellstoffwechsel bereitge-stellt und billige und nachwachsen-de Rohstoffe wie Melasse könneneingesetzt werden.

Die Position von L-G3P imHefestoffwechsel

S. cerevisiae bildet L-G3P aus Zuk-kern im Rahmen der Glycerolbiosyn-these durch Reduktion des Glyko-lyseintermediats DHAP (Abb. 1). Die-ser Schritt wird von der cytosolischenNAD-abhängigen Glycerol-3-Phos-phat-Dehydrogenase (GPD) kataly-siert. Das entsprechende Enzym wirdvon den beiden Isogenen GPD1 undGPD2 kodiert. Die Dephosphorylie-rung von L-G3P zu Glycerol erfolgtdurch die Glycerol-3-Phosphatase

L-G3P – ein vielseitigerAusgangsstoff fürenzymatische Synthesen

Das natürlich vorkommende L-Enantio-mer der Glycerophosphorsäure (L-G3P) ist ein viel versprechender Aus-gangsstoff für die Synthese von Mono-sacchariden und Glycerophospholipi-den. Diese Substanzklassen sind vonbesonderem Interesse für die Entwick-lung neuartiger Medikamente und Impf-stoffe gegen Krebs und Infektionskrank-heiten. Erste Erfolge hat die Pharmako-logie damit bereits vorzuweisen [1,2].

Monosaccharide können aus L-G3Püber das Zwischenprodukt Dihydro-xyacetonphosphat (DHAP) mit Hilfevon Aldolasen stereospezifisch synthe-tisiert werden. Glycerophospholipidewerden derzeit großtechnisch mit Hilfevon Phosphoroxychlorid hergestellt,einer Substanz, die giftig und nur un-ter Gefahr zu handhaben ist. Die Ent-wicklung eines enzymatischen Verfah-rens, das in Anlehnung an den natür-lichen Biosyntheseweg von L-G3P aus-geht, ist daher wünschenswert.

Vorteile der bio-technologischen Produktionvon L-G3P gegenüber denherkömmlichenHerstellungsverfahren

Es existieren verschiedene Protokol-le für die chemische Synthese von L-G3P (vgl. Merck-Index). Aufgrund des

Abb. 1: Skizze der hier relevanten Stoffwechselwege, Enzyme und Geneder Bäckerhefe. Abkürzungen: L-G3P, L-Glycerol-3-phosphat; DHAP, Dihy-droxyacetonphosphat; GAP, Glycerolaldehyd-3-phosphat; FBP, Fruktose-1,6-biphosphat; TPI1, Triosephosphatisomerase; GPP1/2, cytosolischeGlycerol-3-phosphatase; GPD1/2, Glycerol-3-phosphatdehydrogenase;GUT2, mitochondriale FAD-abhängige Glycerol-3-phosphatdehydrogena-se; PDC1/2/5, Pyruvatdecarboxylase; NDE1/2, externe mitochondrialeNADH-Dehydrogenase; ADH1, Alkoholdehydrogenase. Die zur Akkumula-tion von L-G3P modifizierten Gene sind rot gekennzeichnet.* Diese Enzyme übertragen Reduktionsäquivalente von NADH direkt bzw.indirekt auf die Atmungskette und sind daher nur bei Kultivierung der Zel-len in Anwesenheit von Sauerstoff relevant.

48 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

(GPP), die ebenfalls durch zwei Iso-gene, GPP1 und GPP2, kodiert wird.Außerdem benötigt die Hefe L-G3Pzur Biosynthese von Glycerolipiden,die wichtige Bestandteile der Bio-membranen sind. Ausgehend von L-G3P wird der erste Schritt in Rich-tung dieser Glycerolipide von der L-G3P-Acyltransferase katalysiert.

Gezielte Beeinflussung derAktivität auf- undabbauender Enzyme

Wenn L-G3P in der Hefe angestautwerden soll, muss seine Biosyntheseverstärkt und die Weiterverstoffwech-selung unterbunden werden. Es wur-de bereits gezeigt, dass eine Erhö-hung der Aktivität des Enzyms GPDden Kohlenstofffluss ausgehend vonder Glukose wirksam in RichtungGlycerol lenken kann, die GPD somitdas geschwindigkeitsbestimmendeEnzym der Glycerolbildung bei S. ce-revisiae ist [6]. Eine etwa 20facheErhöhung der GPD-Aktivität wurdeerreicht, indem das Gen GPD1, einesder beiden Isogene des Enzyms, inhoher Kopiezahl in der Hefe expri-miert wurde. Dazu wurde das ent-sprechende Gen unter der Kontrolleseines natürlichen Promotors in einMulticopy-Plasmid kloniert und indie Hefe eingebracht. Um den Ein-fluss der Überexpression von GPD1zu untersuchen, wurde ein Ver-gleichsstamm erstellt, indem ein lee-rer Vektor in den Wildtypstammtransferiert wurde.

Die deutliche Erhöhung der GPD-Aktivität in der Multicopy-Transfor-mante wirkte sich allerdings nicht aufden metabolischen Vorläufer vonGlycerol aus, so lange die Aktivität desabbauenden Enzyms GPP nicht redu-ziert war (Abb. 2, Ausgangsstamm).Offenbar reicht die GPP-Aktivität imWildtyp aus, um das durch die erhöh-te GPD-Aktivität zusätzlich gebildeteL-G3P sofort und vollständig zu Glyce-rol weiterzuverstofffwechseln.

Wenn jedoch die Dephoshorylie-rung zu Glycerol unterbunden wur-de (Abb. 1), führte die GPD1-Über-expression zu der erwünschten Ak-kumulation von L-G3P. Bereits dieAusschaltung eines der beiden Isoen-zyme (gpp1∆) erhöhte den intrazel-lulären G3P-Gehalt sichtbar, wenngleichzeitig die Aktivität der GPD ge-steigert wurde (Abb. 2). Die zusätz-liche Deletion des zweiten Isogens(gpp1∆ gpp2∆), gleichbedeutendmit der vollständigen Aufhebung derzellulären GPP-Aktivität, war im Hin-blick auf die erwünschte Akkumula-

tion der Zielsubstanz noch wirkungs-voller. Kombiniert mit der GPD-Über-produktion stieg der G3P-Spiegel imVergleich zum Ausgangsstamm aufdas 26fache an (Abb. 2).

Das Wachstumsverhalten der Hefewurde durch die Deletion von GPP1und GPP2 nur geringfügig negativ be-einflusst. Allerdings hatte die Über-produktion von GPD1 in allen Stäm-men eine Verringerung der Wachs-tumsgeschwindigkeit zur Folge. Dieskann durch den Netto-Verlust an ATPund die Anstauung des cytotoxischenIntermediats Acetaldehyd erklärt wer-den. Beides sind Nebeneffekte derStoffwechselverschiebung in Rich-tung L-G3P, die durch die stark er-höhte GPD-Aktivität ausgelöst werden[7]. Die Doppelmutante gpp1∆gpp2∆ mit GPD1-Überexpressionweist eine im Vergleich mit dem Wild-typstamm um etwa 30% reduzierteWachstumsgeschwindigkeit auf.

Einfluss von osmotischemStress auf dieAkkumulation von L-G3P inden genetisch modifiziertenHefestämmen

Es ist bekannt, dass hyperosmotischerStress in der Lage ist, den Hefemeta-bolismus in Richtung Glycerol zu len-ken. Das verstärkt gebildete Glycerolwirkt unter diesen Bedingungen demWasserausstrom aus den Zellen ent-gegen. Die Forcierung der Glycerol-biosynthese wird bei osmotischemStress hauptsächlich durch die Induk-tion der Transkription von GPD1 re-guliert. Außerdem gibt es eine Reiheweiterer, weniger drastischer Enzym-aktivitätsveränderungen, die ebenfallszur beschriebenen Stoffwechselver-schiebung beitragen könnten [8,9].

Das Gen GPD1, welches in verschie-denen Hefestämmen überexprimiertwurde (siehe oben), steht unter der

Kontrolle seines natürlichen Promo-ters. Daher wurde erwartet, dass diebereits erhöhte Aktivität der GPD inden entsprechenden Stämmen weitersteigt, wenn die Zellen osmotischemStress ausgesetzt werden. Tatsächlichführte die Zugabe von 0,5 M NaCl zueiner etwa vierfach erhöhten GPD-Enzymaktivität in dem Stamm gpp1∆gpp2∆ mit GPD1-Überexpression(Tab. 1). Eine wesentliche Erhöhungdes L-G3P-Spiegels blieb allerdingsaus – ein Hinweis darauf, dass es ne-ben der spezifischen GPD-Aktivitätandere Faktoren gibt, die in dem mo-difizierten Hefestamm die L-G3P-Ak-kumulation begrenzen. Mögliche limi-tierende Faktoren sind die cytosoli-sche Verfügbarkeit von NADH, einemwichtigen Kofaktor für die Synthesevon L-G3P (Abb. 1 und unten), odereine Produktinhibierung der GPDdurch L-G3P.

Die Verfügbarkeit voncytosolischem NADH alslimitierender Faktor für dieErhöhung des L-G3P-Gehalts

Bei der Batch-Fermentation im Schüt-telkolben, in der die in Abb. 2 gezeig-ten Daten erhoben wurden, stand denZellen Sauerstoff zur Verfügung. Es istmöglich, dass unter diesen Bedingun-gen ein Teil des cytosolischen NADH,welches von der GPD als Kofaktor be-nötigt wird, in respiratorische Prozes-se abfließt und damit nicht für die L-G3P-Synthese zur Verfügung steht.Sauerstofflimitierung schaltet dieseProzesse aus. Weder die externe mi-tochondriale NADH-Dehydrogenase(NDE1/2) noch der so genannteGlycerolphosphat-Shuttle (GUT2)können Elektronen über die Atmungs-kette auf den Endakzeptor Sauerstoffüberführen (Abb. 1) [10]. Deshalbwurde die Fermentation mit demStamm gpp1∆ gpp2∆ mit GPD1-Über-

Abb. 2. Intrazelluläre Akkumulation von L-G3P im Ausgangsstamm, dergpp1∆ Einfach- und der gpp1∆ gpp2∆ Doppelmutante von S. cerevisiaejeweils mit und ohne Überexpression des Gens GPD1. Für die Extraktionwurden die Zellen in glukosehaltigem Mineralmedium im Schüttelkolbenkultiviert und in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase geerntet.Die gezeigten Daten sind Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zweibzw. drei unabhängigen Experimenten.

Kultivierungs- Spezifische GPD-Aktivität Intrazelluläre L-G3P-Konzentrationbedingungen (U/mg protein) (mg/g Hefetrockenmasse)Referenz1) 2.3 ± 0.8 4.5± 0.5Hyperosmotischer Stress2) 9.0 ± 2.1 5.2 ± 0.7Sauerstofflimitierung3) 2.7 ± 0.3 7.2 ± 1.3

1) Aerobe Batch-Fermentation in Mineralmedium im Schüttelkolben.

2) Zugabe von 0,5 M NaCl zum Kultivierungsmedium.

3) Die Schüttelkolben wurden mit Gäraufsätzen versehen, so dass zwar die Freisetzung des entstehenden CO2 ermöglicht wurde, jedoch nicht die Zufuhr von O

2.

Tab. 1: Auswirkungen von hyperosmotischem Stress und Sauerstofflimitierung auf die intrazelluläre Akkumulationvon L-G3P in der gpp1∆ gpp2∆ Doppelmutante mit Überexpression des Gens GPD1. Die Zellen wurden in gluko-sehaltigem Mineralmedium im Schüttelkolben vorkultiviert. Anschließend wurden die Batch-Fermentationen indem angegebenen Medium mit einer OD600 von etwa 1,5 beimpft und kultiviert, wie in der Tabelle ausgewiesen.Nach 4 Stunden wurden die Zellen für die Messung der spezifischen GPD-Aktivität und die Extraktion von L-G3Pgeerntet. Die gezeigten Daten sind jeweils Mittelwerte mit Standardabweichungen aus zwei unabhängigen Expe-rimenten.

Sonderband | 2003 | 49BIOKATALYSEBIOKATALYSE

expression auch unter Sauerstofflimi-tierung durchgeführt. Bei nur minima-ler Aktivitätssteigerung der GPD, dieauf die Induktion des IsoenzymsGpd2p zurückzuführen ist [11], steigtdie intrazelluläre Konzentration von L-G3P verglichen mit der aerobenBatch-Fermentation um 60% (Tab. 1).Dieses Ergebnis beweist, dass die Ver-fügbarkeit von cytosolischem NADHein wichtiger limitierender Faktor fürdie L-G3P-Akkumulation in dem mo-difizierten Hefestamm ist. Als Alterna-tive zur Nutzung anaerober Fermen-tationsbedingungen ist eine genetischeOptimierung der Hefestämme denk-bar. Das bedeutet eine simultane Aus-schaltung aller Gene, deren Produktean den genannten Prozessen beteiligtsind, nämlich NDE1, NDE2 und GUT2.

Erhöhung der Verfügbarkeitvon NADH durchVerminderung desMetabolitflusses durch diealkoholische Gärung

Auch wenn es gelungen ist, die Über-tragung der Elektronen von NADH aufdie Atmungskette vollständig zu unter-binden (siehe oben), bleibt in derHefe der Hauptweg für die Reoxidi-dation des glykolytisch gebildetenNADH die alkoholische Gärung. DieGPD muss bei der Synthese von L-G3Pmit der Alkoholdehydrogenase (ADH)um das Reduktionsäquivalent NADHkonkurrieren. Wird der Metabolitfluxdurch die alkoholische Gärung redu-ziert, steigt die Konkurrenzfähigkeitder GPD um das NADH. Bereits 1918konnte Carl Neuberg zeigen, dass He-fen wesentlich mehr Glycerol produ-zieren, wenn innerhalb der alkoholi-schen Gärung der Akzeptor für NADH,das Acetaldehyd, mit Hilfe von Sulfitkomplexiert und so aus dem Reakti-onsgemisch entfernt wird. Auch aufgentechnischem Weg wurde derNADH-Verbrauch während der alko-holischen Gärung gedrosselt. Die Re-duzierung sowohl der Aktivität derADH [12] als auch der Pyruvatdecar-boxylase (PDC) [6] führte zu einerVerschiebung des Stoffwechsels inRichtung Glycerol auf Kosten der Etha-nolbildung.

Im Rahmen der hier vorgestelltengenetischen Optimierung wurde dasGen PDC2 deletiert, um den Fluxdurch die alkoholische Gärung zu ver-mindern. PDC2 kodiert einen positi-ven Regulator der Transkription vonPDC1 und PDC5, den Strukturgenenfür die PDC in S. cerevisiae.

Das Gen PDC2 wurde mittels der„one-step gene disruption method“

zunächst in der gpp1∆-Einfachmu-tante deletiert, was zu der Mutantegpp1∆ pdc2∆ führte. Um die Drei-fachmutante gpp1∆ gpp2∆ pdc2∆ zuerhalten, sollte die gpp1∆ gpp2∆-Doppelmutante mit dem gleichen Ver-fahren modifiziert werden. Dies warjedoch nicht möglich, da vermutlichein Wachstumsdefekt der Dreifach-mutante eine direkte Selektion ver-hinderte. Ein kleiner methodischerUmweg führte jedoch zum Erfolg. DieStämme gpp1∆ gpp2∆ und gpp1∆pdc2∆ wurden miteinander gekreuzt,die Sporulation induziert und aus denSporen ein Stamm selektiert, der diegewünschte Dreifachmutation gpp1∆gpp2∆ pdc2∆ trug. Dieser Hefe-stamm reicherte etwa 12,8 mg/g He-fetrockenmasse L-G3P an. Dieses Ni-veau konnte noch um über 30% ge-steigert werden, wenn zusätzlich dasGen GPD1 überexprimiert und damitder Metabolitfluss in Richtung L-G3Pverstärkt wurde. Der letztgenannteStamm akkumuliert 17 mg/g Hefe-trockenmasse L-G3P; diese Konzen-tration beträgt das rund 100fache derAusgangssituation (Abb. 2). Aller-dings bildet die Dreifachmutante inGlukose als Kohlenstoffquelle kaumBiomasse. Die Ursache für denWachstumsdefekt, der bei pdc2∆auch von anderen Autoren beobach-tet wurde [13,14], ist unbekannt. Bis-lang schien plausibel, dass der Flussdurch die Glykolyse aufgrund vonNAD-Mangel reduziert wird. Dieskonnte jedoch nicht bestätigt werden.

Die erhöhte Kapazität zur NADH-Re-generation im Rahmen der GPD-Re-aktion hätte sonst den Wachstumsde-fekt der pdc2∆-Mutante aufhebenmüssen.

Ausblick

Die L-G3P Konzentration in S. cere-visiae konnte bisher auf das 100fa-che angehoben werden. Allerdingszeigt gerade der Stamm, der hervor-gerufen durch die PDC2-Deletion diehöchste L-G3P-Akkumulation auf-weist, im zuckerhaltigen Medium dasgeringste Wachstum. Um die Biomas-seproduktion während der großtech-nischen Fermentation zu beschleuni-gen, ist daher eine zeitliche Entkop-pelung von der L-G3P-Bildung wün-schenswert. Dies könnte durch denEinsatz von Ribozymen in Kombi-nation mit einem induzierbaren Pro-motor erreicht werden. Eine andereHerangehensweise besteht darin, diemolekularen Ursachen für den Wachs-tumsdefekt, der durch die PDC2-De-letion erzeugt wird, zu finden unddurch geeignete Modifikationen auf-zuheben.

Die biotechnologische Gewinnungeines Stoffwechselendprodukts endetin der Regel mit der Aufreinigung ausdem Medium. Das energiereichephosphorylierte Zwischenprodukt L-G3P wird hingegen auch bei maxi-maler intrazellulärer Anstauung nichtausgeschieden. Folglich wäre einZellaufschluss nötig, um L-G3P zu ge-

winnen. Dies mindert jedoch dieWirtschaftlichkeit des Verfahrens.Daher werden sich zukünftige Arbei-ten darauf konzentrieren, die Hefe-stämme so zu modifizieren, dass siedie Zielsubstanz in das Medium ent-lassen. Damit wird nicht nur die Auf-arbeitung vereinfacht, sondern auchdie Produkthemmung der GPD auf-gehoben, sodass eine weitere Steige-rung der Ausbeute möglich sein soll-te.

Literatur

[1] Koeller, K. M., Wong, C. H., Nat. Bio-technol. 18 (2000), 835-841.

[2] Unger, C., Eibl, H., Onkologie 24(2001), 18-23.

[3] Crans, D. C., Whitesides, G. M., J. Am.Chem. Soc. 107 (1985), 7019-7027.

[4] Pradines, A., Klaebe, A., Perie, J.,Paul, F., Monsan, P., Tetrahedron 44(1988), 6373-6386.

[5] Schoevaart, R., van Rantwijk, F., Shel-don, R. A., J. Org. Chem. 65 (2000),6940-6943.

[6] Nevoigt, E., Stahl, U., Yeast 12 (1996),1331-1337.

[7] Nevoigt, E., Pilger, R., Mast-Gerlach,E., Schmidt, U., Freihammer, S.,Eschenbrenner, M., Garbe, L., Stahl,U., FEMS Yeast Res. 2 (2002), 225-232.

[8] Nevoigt, E., Stahl, U., FEMS Microbiol.Rev. 21 (1997), 231-241.

[9] Blomberg, A., FEMS Microbiol. Lett.182 (2000), 1-8.

[10] Bakker, B. M., Overkamp, K. M., vanMaris, A. J. A., Kötter, P., Luttik, M. A.H., van Dijken, J. P., Pronk, J. T.,FEMS Microbiol. Rev. 25 (2001), 15-37.

[11] Påhlman, A. K., Granath, K., Ansell, R.,Hohmann S., Adler, L., J. Biol. Chem.276 (2001), 3555-63.

[12] Drewke, C., Thielen, J., Ciriacy, M.,J. Bacteriol. 172 (1990), 3909-3917.

[13] Hohmann, S., Mol. Gen. Genet. 241(1993), 657-666.

[14] Flikweert, M. T., Kuyper, M., van Maris,A. J., Kotter, P., van Dijken, J. P.,Pronk, J. T., Biotechnol. Bioeng. 66(1999), 42-50.

Korrespondenzadresse

Dr. Elke NevoigtInstitut für BiotechnologieFachgebiet Mikrobiologie undGenetikTechnische Universität BerlinGustav-Meyer-Allee 2513355 BerlinTel.: 030-314 275 97Fax: 030-314 275 92eMail: e.nevoigt@lb.tu-berlin.de

Abb. 3. Intrazelluläre Akkumulation von L-G3P in der gpp1∆ gpp2∆ Dop-pel- und der gpp1∆ gpp2∆ pdc2∆ Dreifachmutante von S. cerevisiae je-weils mit und ohne Überexpression des Gens GPD1. Die Zellen wurdenzunächst in Medium mit nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen imSchüttelkolben vorkultiviert, um das Wachstum der Mutante mit derPDC2-Deletion zu ermöglichen. Anschließend wurden die Batch-Fermen-tationen in glukosehaltigem Medium mit einer OD600 von etwa 1,5 beimpft.Nach 6 Stunden Inkubation unter Sauerstoffabschluss wurden die Zellenfür die Extraktion von L-G3P geerntet. Die gezeigten Daten sind Mittelwer-te mit Standardabweichungen aus zwei unabhängigen Experimenten.

50 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

WIRKSTOFFVORSTUFEN

Umweltverträgliche Synthesechiraler 2-Oxazolidinone� Dr. Martin Bertau1, Dr. Thomas Daußmann2, 1 Institut für Biochemie, TU Dresden, 2 JFC - Jülich Fine Chemicals GmbH

Die moderne Synthesevariante zur Herstellung der für viele moderne Wirkstoffe essenziellen chiralen 5- und 4,5-disubstituierten 2-Oxazolidinonen aus-gehend von βββββ-Ketoestern umgeht klassische umweltgefährdende Verfahren durch einen hochstereoselektiven intramolekularen, cyclisierenden Curtius-Abbau. Der für die Einführung der stereochemischen Information erforderliche biokatalytische Schlüsselschritt zur βββββ-Hydroxyester-Zwischenstufe besitztbezüglich seiner Aufarbeitung noch erhebliches Entwicklungspotenzial. Ursache sind vom Biokatalysator Saccharomyces cerevisiae produzierteBioemulgatoren, welche bei extraktiver Aufarbeitung die Wertstoffgewinnung aus der wässrigen Phase infolge Bildung stabiler Gele und Schleime erheb-lich beeinträchtigen. Die durch die Aufwändigkeit der Aufarbeitungssequenz bedingten Produktverluste von bis zu 20% werden durch biokatalytischenAbbau der Bioemulgatoren vermieden, wodurch die Gesamtausbeute der 2-Oxazolidinonsynthese von ca. 75% auf ≥96% gesteigert werden kann.

Einleitung

Chirale 5- und 4,5-funktionalisierte2-Oxazolidinone sind für die phar-makologische Wirksamkeit vielermoderner Wirkstoffe essenzielleStrukturglieder [1,2]. Ihre Synthe-se ist sehr aufwändig und verwen-det häufig hochaggressive Reagenzi-en, wie z.B. Phosgen oder schwer-metallkatalytisch aktiviertes Kohlen-monoxid [3]. Infolge der oft har-schen Reaktionsbedingungen gehtwertvolle Stereoinformation wäh-rend der Synthesesequenz verloren,gleichzeitig steigen Materialaufwandund Abfallmengen. Ein brauchbaresumweltverträgliches Synthesekon-zept muss daher weitgehend auf um-weltgefährdende Chemikalien ver-zichten und gleichzeitig die Zielver-bindung mit hoher Atomökonomieund Stereoisomerenausbeute lie-fern.

2-Oxazolidinonsynthese

Dieser hohe synthetische Anspruchwird als Eintopfprozess über einehochselektive intramolekulare Sex-tettumlagerung unter vollständigerRetention der Stereokonfigurationrealisiert, welcher die stereoisome-renreinen 2-Oxazolidinone ausge-hend von kommerziell günstigerhältlichen β-Ketoestern erzeugt[4]. Das Einführen der Stereoinfor-mation über eine Ganzzellbiotrans-formation ist alternativlos hinsicht-lich der Realisierbarkeit der contra-thermodynamischen stereoselekti-ven reduktiven Synthese cyclischerβ-Hydroxyester (Abb. 1).

Damit vereinigt dieses Verfahrendie Vorteile der Biokatalyse im Sin-

ne der Nachhaltigen Chemie mit denVorteilen der Eintopfsynthese untergänzlicher Umgehung umweltgefähr-dender Reagenzien. Die Verfügbar-keit der cyclischen β-Hydroxyesterin hoher Stereoisomerenreinheit istdie zentrale Grundvoraussetzung fürdie Oxazolidinonsynthese.

Downstream-Processing

Die zentrale Komplikation bei derAufarbeitung von Ganzzellbiotrans-formationen ist erheblicher Pro-duktverlust durch Gel- und Schleim-bildungsphänomene. Typischerwei-se wird die Emulgationsproblematikdurch große Lösungsmittelmengenoder im Labormaßstab durch die ge-fahrbelastete Zentrifugation derEther/Wasser-Gemische gelöst [5].

Das neue Verfahren verfolgt dieenzymatische Spaltung der von derHefe ins Medium sezerniertenBioemulgatoren (Abb. 2). Dieserdoppelt-biokatalytische Ansatz ausmikrobieller Reduktion und enzy-matischer Spaltung der Bioemulga-toren ist somit auch für konfigura-tiv und thermisch labile β-Hydroxy-ester geeignet. Finanzintensive Inve-stitionen in teure Alternativtechno-logien werden so vermieden, derZeitfaktor wird erheblich reduziertund die für die Stereoisomerenver-teilung kritische Zeitspanne der Pro-duktaufarbeitung wird drastischminimiert.

Nebenproduktproblematik

Während der Aufarbeitung reagierenβ-Hydroxyester unter thermischer Be-lastung (destillative Reinigungsopera-tionen) durch Wasserabspaltung zureaktiven Michael-Systemen. Verlusteentstehen auch durch Hydrolyse derβ-Ketoester-Substrate, die unter spon-taner Abspaltung von CO

2 zu reakti-

produktbildende destillative Reini-gungsschritte zu umgehen.

Schlussbemerkung

Die Deemulgation der Kulturbrühe/Lösungsmittel-Gemische und die Un-terdrückung kritischer Nebenreaktio-nen kann die Gesamtausbeute der 2-Oxazolidinonsynthese von ca. 76% auf≥96% steigern. Die hohe Ausbeute,erreicht durch die Kopplung zweierbiokatalytischer Teilschritte, belegtden hohen innovativen Charakter die-ses umweltschonenden Verfahrens.

Referenzen

[1] Sugiyama, S., Watanabe, S., Inoue, T.,Kurihara, R., Itou, T., Ishii, K., Tetrahe-dron 59 (2003) 3417-3425.

[2] Zurenko, G.E., Gibson, J.K., Shinabar-ger, D.L., Aristoff, P.A., Ford, C.W.,Tarpley, W.G., Curr. Opin. Pharmacol.1 (2001), 470-476.

[3] Ager, D.J., Prakash, I., Schaad, D.R.,Chem. Rev. 96 (1996), 835-875.

[4] Bertau, M., Bürli, M., Hungerbühler,E., Wagner, P., Tetrahedron: Asymme-try 12 (2001), 2103-2107.

[5] Davoli, P., Forni, A., Moretti, I., Prati,F., Torre, G., Enzyme Microbiol. Tech-nol. 25 (1999), 149-152.

Korrespondenzadresse

Dr. Martin BertauTechnische Universität DresdenInstitut für BiochemieD-01062 DresdenTel.: +49-(0)351-463-38355Fax: +49-(0)351-463-35506eMail: martin.bertau@chemie.tu-dresden.dewww.chm.tu-dresden.de/bc

Abb. 1: Oxazolidi-nonsynthese.

ven Ketonen führt. Diese unselektivenReaktionen beeinträchtigen Stereose-lektivität und Ausbeute. Sie bedingenso Verluste in der Wertschöpfungsket-te und stellen ein Entsorgungsproblemdar. Vor allem aber ist die Anwesen-heit energiereicher instabiler Neben-produkte gerade bei thermischen Auf-arbeitungsprozeduren kritisch. Derdoppelt-biokatalytische Ansatz dientdazu, thermisch belastende, neben-

Abb. 2: Vergleich der Aufarbei-tungsverfahren.

Sonderband | 2003 | 51BIOKATALYSEBIOKATALYSE

PHOSPHOLIPASEN

Phospholipasen in der Biokatalyse� Prof. Dr. Renate Ulbrich-Hofmann, Fachbereich Biochemie/Biotechnologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Phospholipasen sind ubiquitär vorkommende hydrolytische Enzyme, die für die spezifische Spaltung der vier Esterbindungen in Glycerophospholipidenverantwortlich sind. Entsprechend unterscheidet man Phospholipase A1, Phospholipase A2, Phospholipase C und Phospholipase D. Phospholipase Dnimmt eine Sonderstellung ein, da sie in Gegenwart von alkoholischen Komponenten ein hohes Transphosphatidylierungspotential besitzt, das seit lan-gem im chemischen Labor und in der Industrie zur Biotransformation von Phospholipiden genutzt wird. In dem vorliegenden Artikel werden die wichtig-sten Phospholipasen, die bisher biokatalytisch genutzt wurden, zusammengestellt. Es zeigt sich, dass die natürlichen Ressourcen bei weitem nicht aus-geschöpft sind. Für Phospholipase D, die für die Gewinnung neuer Phospholipide und Phospholipidanaloga prädestiniert ist, werden einige aktuelle For-schungsergebnisse aus der Hallenser Arbeitsgruppe unter dem Aspekt der biotechnologischen Anwendung dargelegt.

Keywords: Alkylphospholipide, Glycerophospholipide, Phospholipasen, Transphosphatidylierung.

im Phospholipidmolekül (insgesamtsind 4 Esterbindungen vorhanden)charakterisiert. So ist PhospholipaseA

1 (PLA

1) spezifisch für die Abspal-

tung der Fettsäure in der sn-1-Positi-on des Glycerolgerüsts und Phospho-lipase A

2 (PLA

2) für die in der sn-2-

Position. Phospholipase C (PLC) ka-talysiert die Hydrolyse der Phospho-diesterbindung an der glycerolstän-

digen Seite und Phospholipase D(PLD) an der Seite der polaren Kopf-gruppe. Darüber hinaus gibt es eini-ge spezielle Enzyme, die eine zusätz-liche Spezifität hinsichtlich der pola-ren Alkoholkomponente besitzen, wiedie phosphatidylinositol-spezifischePLC (PI-PLC) oder die glycosylphos-phatidylinositol-spezifische PLD (GPI-PLD).

In der biochemischen Grundlagen-forschung haben Phospholipasen, ins-besondere PLA

2, PLC und PLD viel

Aufmerksamkeit auf sich gezogen, seitihre Beteiligung in der Signalübertra-gung bei Zellregulations- und Mem-brantransportprozessen zunehmendbekannt wurde.

Phospholipide als Träger-,Zusatz- und Wirkstoffe

Die amphiphile Struktur der Phospho-lipide (polar/unpolar) bedingt einebesondere Eigenschaft, denen die Ver-bindungen ihre große Bedeutung inder Natur, aber auch in den verschie-densten Praxisbereichen verdanken.Oberhalb einer kritischen Konzentra-tion bilden Phospholipide definiertesupramolekulare Strukturen aus(Abb. 2), deren Typ (Micellen, Dop-pelschichten, Liposomen, hexagona-le Phasen u.a.) von der Ladung undgeometrischen Gestalt des Phospho-

Phospholipasen in derNatur

Phospholipasen bilden eine Gruppevon Enzymen, deren natürliche Funk-tion in der spezifischen Hydrolyse vonPhospholipiden (genauer: Glycero-phospholipiden) zu sehen ist. Glycero-phospholipide stellen die Hauptbe-standteile biologischer Membranendar und besitzen hinsichtlich ihrerchemischen Feinstruktur eine großeVariabilität. In größeren Mengen kom-men Phospholipide auch in Pflanzen-samen (z.B. von Soja, Raps und Son-nenblumen) sowie in Hühnerei vor.Das gemeinsame Merkmal aller Phos-pholipide ist die Phosphorsäuredi-ester-Struktur mit einer apolaren undeiner polaren Ester-Komponente. InGlycerophospholipiden (Abb. 1) wirdder apolare Molekülteil durch einenDiacylglycerol-Rest gebildet, währenddie polare Komponente durch einehydrophile (geladene oder ungelade-ne) hydroxylgruppenhaltige Verbin-dung wie Cholin, Ethanolamin (beidemit positiver Ladung), Serin (zwitter-ionisch), Glycerol oder Inositol (bei-de ungeladen) beigesteuert wird. DieDiacylreste stammen von Fettsäuren,deren Zusammensetzung in natürli-chen Phospholipiden sehr heterogenist, sowohl was die Kettenlängen (imAllgemeinen zwischen C

12 und C

22) als

auch was den Sättigungsgrad anbe-trifft. Das C2-Atom im Glycerolrest istein chirales Zentrum, weshalb einestereospezifische Unterscheidung derC- Reste erforderlich ist, die durch die„stereospezifische Nummerierung(sn)“ erfolgt. Die natürlich auftreten-den Phospholipide leiten sich vom1,2-Diacyl-sn-glycerol ab.

Die Spezifität der in der Natur ge-fundenen Phospholipasen ist primärdurch die zu spaltende Esterbindung

Abb. 1: Chemischer Aufbau eines Glycerophospholipids und Angriffsortder Phospholipasen.

Tab. 1: Phospholipasen in der Biokatalyse. (Literaturangaben finden sich in [6], zu PLA1 in [7]).

Phospholipase Quelle Molekulare Masse pI pH-Optimum (kDa)

PLA1 Fusarium oxysporum 5,0PLA2 Schweinepankreas 13,9 7,4 7,9-8,4

Rinderpankreas 14,0 6,4; 7,6 8,5; 8,0Schlangengift (Naja naja naja) 13,4 5,1 7-9Bienengift (Apis mellifica) 19,0 10,5 8,0

PLC Bacillus cereus 23,0 6,6-8,0Clostridium perfingens 43,0 5,4

PI-PLC Bacillus cereus 29,0 5,4 7,2-7,5PLD Weißkohl 92 4,7 5,5

Streptomyces chromofuscus 50-57 5,1 8Streptomyces hachijoensis 16 8,6 7,5Streptomyces lydicus 56 7,4 6Streptomyces sp. (Asai Kasai; Sigma) 46 4,2 5,5Streptomyces antibioticus 64,0 6,5 5,5Streptomyces PMF 53,864 9,1 4-6Streptoverticillium cinnamoneum 18,2 8,44 8,5

53,879 6,0

52 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

lipidmoleküls sowie dem Medium, indem sie sich befinden, abhängt. An-dererseits sind Phospholipide meta-bolisierbar und darum sehr umwelt-freundlich. Als Strukturbildner, z.B.in Form von Liposomen oder alsMono- bzw. Doppelschichten auf Trä-geroberflächen, aber auch einfach alsEmulgatoren besitzen sie breite prak-tische Bedeutung. In der pharmazeu-tischen Industrie spielen Phospholi-pide eine wichtige Rolle als Träger fürArzneistoffe und als Füllstoffe. Auchbei der Herstellung von Kosmetikabesitzen sie einen hohen Stellenwert

fe benötigt, z. B. in der Druck- undFotoindustrie, in der Textil- und in derBaustoffindustrie.

Aktuelle Forschungsergebnisse,die für verschiedene Vertreter bzw.Abkömmlinge der Phospholipideeine entscheidende Rolle als sekun-däre Botenstoffe (second messenger)in biologischen Signalwandlungspro-zessen nachweisen konnten [1], lie-ferten einen neuen Zugang zum Ver-ständnis wichtiger Zellregulationsvor-gänge, wie sie für die Entstehung undTherapie vieler bisher noch nichtoder schwer zu beherrschender

und Tumoren, aber auch bei Alzhei-mer-Erkrankungen und Diabeteskonnten therapeutische Effekte vonPhospholipidstrukturen gefundenwerden. Seit vielen Jahren ist be-kannt, dass verschiedene Lysophos-phatidylverbindungen (Abb. 3a) die-se Funktion erfüllen, wobei sie aller-dings zu schnell metabolisiert wer-den, um nachhaltig wirksam zu sein.Dieser Nachteil führte zur Entwick-lung der strukturmodifizierten Al-kyllysophospholipide [3] (Abb. 3b).Eine neue Generation von Phospho-lipidanaloga mit Antitumorwirkungstellen die Alkylphosphatester, auchAlkylphospholipide genannt, dar(Abb. 3c), die sich gegenüber denEtherphospholipiden durch eine ver-besserte chemische und metaboli-sche Stabilität auszeichnen [4]. Einweiteres bedeutendes Forschungsge-biet betrifft die Anwendung von Phos-pholipiden als Transfektionsvektorenfür die Gentherapie [5].

Phospholipasen zurBiotransformation vonPhospholipiden

Entsprechend den vielfältigen Einsatz-bereichen von Phospholipiden be-steht ein großes Interesse an ver-schiedenen Varianten der natürlichenPhospholipide. Dazu gehören parti-elle Abbauprodukte der natürlichenPhospholipide wie die Lysophospho-lipide, Diacylglycerole oder Phospha-tidsäuren, die durch PLA

2, PLC bzw.

PLD erzeugt werden können. Die Ver-wendung dieser Enzyme zur Gewin-nung der genannten Produkt erlaubtim Vergleich zur chemisch durchge-führten Hydrolyse eine hohe Regio-und Stereoisomerenreinheit. Außer-dem ist eine Prozessführung untermilden umweltfreundlichen Bedin-gungen möglich, die weitere uner-wünschte Nebenreaktionen geringhält.

Eine Sonderstellung unter den hy-drolytisch wirksamen Phospholipa-sen nimmt die PLD ein. Neben ihrerFähigkeit, die Spaltung der Esterbin-dung zwischen dem Phosphatrest unddem polaren Alkohol zu katalysieren,ist sie in der Lage, die Umesterung andieser Bindung zu katalysieren, wennein geeigneter Alkohol angebotenwird (Abb. 4). In der Labor- sowieindustriellen Praxis wird sie schonseit längerer Zeit zur Synthese vonPhospholipiden mit modifiziertenpolaren Kopfgruppen benutzt. Mangeht dann meist von Phosphatidylcho-lin aus und tauscht das Cholin alsKopfgruppenkomponente gegen die

in der Natur seltener auftretendenReste Serin, Glycerol o. a. aus, wo-durch die aufwändige Isolierung dernatürlich vorkommenden Produkteumgangen wird. Vor allem aber in-teressiert man sich auch für die Ein-führung unnatürlicher Kopfgruppen,die den resultierenden Phospholipi-den neue Eigenschaften verleihen.Aliphatische primäre und sekundäreAlkohole, cyclische nichtaromatischeund aromatische Alkohole, Nucleosi-de, Saccharide und eine Vielzahl wei-terer hydroxylgruppenhaltiger Ver-bindungen gehören zu den auf dieseWeise in Phospholipidstrukturen ein-geführten Komponenten (Zitate in[6]).

Die molekularen Eigenschaften dereinzelnen Phospholipasen und damitauch ihre spezifischen Eigenschaftenals Biokatalysatoren hängen – wiedies allgemein bei Enzymen der Fallist – stark von dem Organismus ab,aus dem sie gewonnen werden. Diegebräuchlichsten Quellen für die ein-zelnen, in der Biokatalyse angewand-ten Phospholipasen sind in Tabelle 1zusammengestellt. Man erkennt ausdem relativ begrenzten Organismen-spektrum, das zur Gewinnung dereinzelnen Phospholipasen herangezo-gen wurde, dass hier noch ein weitesFeld brach liegt. Oftmals wird die Iso-lierung der Enzyme in ausreichendenMengen zum limitierenden Faktor fürihre Anwendung. Gravierende Fort-schritte sind hier durch die Nutzungrekombinanter Produktionsstrategienzu erwarten. In der eigenen Arbeits-gruppe gelang im Rahmen des Ver-bunds “Biokatalyse” die Ausarbeitungeines Verfahrens zur Gewinnung ei-ner rekombinanten PLA

2, das zur Um-

setzung in den Industriemaßstab ge-eignet sein sollte.

Phospholipase D – einprominenter Biokatalysatormit vielen Unbekannten

Obwohl PLD-haltige Pflanzenextrak-te von Chemikern schon seit etwa 50Jahren zur Modifizierung der Kopf-gruppe in Phospholipiden genutztwerden und das Enzym mittlerweileauch Einzug in die industrielle Phos-pholipidsynthese gehalten hat, istüber die Struktur der PLD und ihremolekularen Eigenschaften bis vorkurzem kaum etwas bekannt gewe-sen. Diese Situation hat sich seit we-nigen Jahren geändert. Heute findetman mehr als 500 Eintragungen zurPLD in der NCBI GenBank, die vonder weiten Verbreitung des Enzymsund der großen Strukturvielfalt zeu-

als Emulgatoren und Liposomenma-terial. Ein großer Bedarf für Phospho-lipide besteht darüber hinaus in derLebensmittelindustrie. Als Zusatz zuMargarine, Käse, Schokolade, Back-waren, Teigwaren und Instantproduk-ten (Milchpulver, Kakao, Backmi-schungen) bewirken sie die Bildungund Stabilisierung von Emulsionen,binden Wasser oder verändern Kris-tallisationseigenschaften. Auch in vie-len anderen Industriezweigen werdenPhospholipide als wichtige Zusatzstof-

Krankheiten (Tumoren, Immun-krankheiten, Alzheimer, Diabetes)von entscheidender Bedeutung sind.

Eng verknüpft mit der Bedeutungvon Phospholipiden für pathologi-sche Vorgänge in der Zelle ist dieWirkung exogener Phospholipidebzw. Phospholipidanaloga auf zellu-läre Prozesse, wie sie in der pharma-kologischen Forschung seit etlichenJahren untersucht wird [2]. Bei derAktivierung der körpereigenen Im-munabwehr gegenüber Infektionen

Abb. 2: Supramolekulare Strukturen der Phospholipide.

Abb. 3: Phospholipidabkömmlinge und -analoga.

Sonderband | 2003 | 53BIOKATALYSEBIOKATALYSE

gen. Trotzdem sind nach wie vor nurwenige PLDs in isolierter reiner Formgewonnen worden, und es existiertbisher nur eine Raumstruktur, die derPLD aus Streptomyces sp. strain PMF[8].

In der eigenen Abteilung gelang dieEntwicklung einer Reinigungsmetho-de, die auf einer durch Calciumionen-vermittelten hydrophoben Chromato-graphie [9] beruht und sich als äu-ßerst effektiv für die Reinigung pflanz-licher PLDs herausstellte. Obwohlsich in jüngster Zeit nur einige aus-gewählte PLD-Typen in der industri-ellen Praxis behauptet haben, scheintdas natürliche Reservoir bei weitemnicht ausgeschöpft. Insbesonderepflanzliche Materialien überraschenimmer wieder mit neuen Befunden.So sind auf der Genebene allein inArabidopsis thaliana 12 verschiede-ne PLD-Isoenzyme identifiziert wor-den, die sich in 4 verschiedene Un-terklassen einordnen lassen. Da sichaus den Gensequenzen bisher keiner-lei Informationen über das Trans-phosphatidylierungspotential der En-zyme ableiten lassen, ist jedoch überihre biotechnologische Nutzbarkeitbisher schwer zu befinden. Zwei sehrungewöhnliche PLD-Typen wurdenkürzlich in Mohnkeimlingen [10]entdeckt. Während eines der Enzymeeine sehr große Transphosphatidylie-rungspotenz besitzt, wirkt das ande-re ausschließlich hydrolytisch. BeideEnzyme sind im Gegensatz zu den bis-her bekannten pflanzlichen PLDs gly-kosyliert und durch Zinkionen akti-vierbar.

In der Hallenser Arbeitsgruppe ge-lang vor kurzem auch die Identifizie-rung, Klonierung und rekombinanteExpression von zwei homologen PLD-Isoenzymen (PLD1 und PLD2) ausWeißkohl, der traditionellen PLD-Quelle [11]. Wie nahezu alle bisherbekannten PLDs gehören PLD1 undPLD2 der PLD-Superfamilie an, derenVertreter durch zwei konservierte ka-talytische Motive mit der SequenzHXKX

4DX

6G(G/S) charakterisiert sind.

Mit allen pflanzlichen PLDs teilenPLD1 und PLD2 das Vorkommen ei-ner C2-Domäne (bestehend aus 130Aminosäuren), die für die Ca2+-ver-mittelte Phospholipidbindung an dieProteinstruktur verantwortlich ist.Mittels massenspektrometrischerAnalysen konnte die aus der Pflanzeisolierte Form der PLD als N-termi-nal acetylierte PLD2 identifiziert wer-den [12]. Erste Informationen zurTertiärstruktur des Enzyms wurdenmittels limitierter Proteolyse und ge-richteter Mutagenese erhalten [13].

Sie sprechen für eine sehr flexibleStruktur des Enzyms, insbesondereim N-terminalen Bereich des erstenkatalytischen Motivs.Besonders wichtige Aspekte für dieAuswahl einer PLD zur Transphospha-tidylierung sind einerseits die Spezi-fität hinsichtlich des Substrats und desAkzeptoralkohols, andererseits dieerreichbaren Ausbeuten an Trans-phosphatidylierungsprodukt in derKonkurrenz mit der hydrolytischenReaktion (Abb. 4). Aufgrund der ho-hen Transphosphatidylierungspotenzder PLD ausgewählter Streptomyces-Stämme sind pflanzliche PLDs in derbiotechnologischen Anwendung inden letzten Jahren etwas in den Hin-tergrund getreten. Unsere Erfahrun-gen zeigen jedoch, dass pflanzlichePLDs eine größere Variabilität in derSubstratstruktur zulassen. So versagtdie bewährte PLD aus Streptomycessp. (Sigma) in der Gewinnung von Al-kylphosphatestern, wie dem thera-peutisch interessanten Octadecylp-hospho-L-Serin, während hier diePLD aus Weißkohl akzeptable Umsät-ze liefert [14].

Neben den Enzym-inhärenten Ei-genschaften spielt für den Erfolg derTransphosphatidylierungsreaktiondie Strukturierung der Substratmole-küle, die durch das Reaktionsmedi-um beeinflußt ist, eine entscheiden-de Rolle. Obwohl im Allgemeinen Re-aktionssysteme, die aus einem unpo-laren organischen Lösungsmittel undeiner wässrigen Phase bestehen, alsvorteilhaft angesehen werden, zeigtenVersuche mit immobilisierter PLD,dass Transphosphatidylierungreaktio-nen auch in rein wässrigen Reaktions-medien durchgeführt werden kön-

nen, was besonders unter dem Aspektder Biokompabilität und Umwelt-freundlichkeit von Bedeutung ist[15].

Ausblick

Wie exemplarisch für PLD ausgeführt,ist das Anwendungspotential vonPhospholipasen für die Gewinnungneuer Phospholipide und Phospholi-pidanaloga bei weitem noch nicht er-schöpft. Der gegenwärtig stattfinden-de rasante Fortschritt in der Genom-aufklärung mikrobieller, pflanzlicherund tierischer Organismen liefertneue Impulse für die Auffindung neu-er Phospholipasen. Vor allem aberwird die Grundlage gelegt für kombi-natorische gentechnische Methodenzur Konstruktion von Phospholipasenmit Eigenschaften, die für die ge-wünschte Reaktion maßgeschneidertsind.

Literatur

[1] Divecha, N., Irvine, R. F., Cell 80(1995), 269-278.

[2] Namba, Y, in: Phospholipids Hand-book (Cevc, G, Hrsg.), Marcel Dekker,New York, (1993), 879-894.

[3] Zeisig, R., Arndt, D., Brachwitz, H.,Pharmazie 45 (1990), 809-817.

[4] Hilgard, P., Klenner, T., Stekar, J.,Unger, C., Cancer Chemother. Phar-macol. 32 (1993), 90-95.

[5] Yanagihara, I., Kaneda, Y., Inui, K.,Okada, S., Mol. Cell. Biol. Hum. Dis. 5(1995), 64-82.

[6] Ulbrich-Hofmann, R., in: Enzymes inLipid Modification (Bornscheuer, U.T.,Hrsg.), Wiley VCH, Weinheim, (2000),219-262.

[7] Clausen, K., Eur. J. Lipid Sci. Technol.103 (2001), 333-340.

[8] Leiros, I., Secundo, F., Zambonelli, C.,Servi, S., Hough, E., Structure 8(2000), 655-667.

[9] Lambrecht, R., Ulbrich-Hofmann, R.,Biol. Chem. Hoppe-Seyler 373 (1992),81-88.

[10] Oblozinsky, M., Schoeps, R., Ulbrich-Hofmann, R., Bezakova, L., Biochim.Biophys. Acta 1631 (2003), 153-159.

[11] Schäffner, I., Rücknagel, K.-P., Mans-feld, J., Ulbrich-Hofmann, R., Eur. J.Sci. Technol. 104 (2002), 79-87.

[12] Schöps, R., Schierhorn, A., Schäffner,I., Mansfeld, J., Ulbrich-Hofmann, R.,J. Protein Chem. 21 (2002), 407-411.

[13] Younus, H., Schöps, R., Lerchner, A.,Rücknagel, K.-P., Schierhorn, A.,Saleemuddin, M, Ulbrich-Hofmann,R., J. Protein Chem. (2003), im Druck.

[14] Aurich, I., Dürrschmidt, P., Schier-horn, A., Ulbrich-Hofmann, R., Bio-technol. Lett. 24 (2002), 585-590.

[15] Dittrich, N., Ulbrich-Hofmann, R.,Biotechnol. Appl. Biochem. 34 (2001),189-194.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Renate Ulbrich-HofmannMartin-Luther-Universität Halle-WittenbergFachbereich Biochemie/BiotechnologieKurt-Mothes-Str. 3D-06120 HalleTel.: 0345-552 48 64Fax: 0345-552 73 03 oder 552 70 13eMail: ulbrich-hofmann@biochemtech.uni-halle.deWeb: www.biochemtech.uni-halle.de/biotech

Abb. 4: Transphosphatidylierung durch PLD.

54 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

AMIDASEN

Extremophile Amidasen für dieenantioselektive Synthese vonAmino- und Carbonsäuren� Dipl.-Biol. Ksenia Egorova1, Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian1, Dr. Stefan Buchholz2, Dr. Stefan Verseck2, Dr. Harald Trauthwein2, Dr. ShukrallahNa’amnieh3, 1 Technische Mikrobiologie, TU Hamburg-Harburg, 2 DEGUSSA AG, 3 X-Zyme GmbH

Ziel des von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) geförderten Projekts „Extremophile Amidasen“ ist es, Amidasen aus extremophilen Mikroor-ganismen für die enantioselektive Synthese von Amino- und Carbonsäuren nutzbar zu machen. Im Rahmen eines umfangreichen Screenings wurdenneue Amidase-produzierende Mikroorganismen identifiziert. Die korrespondierenden Enzyme wurden aufgereinigt und charakterisiert. Im Verlauf desProjekts sollen ausgewählte Amidasen rekombinant in E. coli exprimiert und mit Hilfe optimierter Fermentationsverfahren für industrielle Anwendungs-tests produziert werden.

Keywords: Amidasen, Psychrophile, Thermophile, Amino- und Carbonsäuren

ten Enzyme aus psychrophilen bzw.psychrotoleranten Mikroorganismeneine wichtige Rolle spielen. Für alldiese Problemstellungen bieten Enzy-me aus den entsprechenden extremenHabitaten einen viel versprechendenLösungsansatz. Dies trifft insbesonde-re für das Gebiet der Amid-hydroly-sierenden Enzyme zu.

Ziele des Projekts

Ziel des vorliegenden Vorhabens ist dieumweltfreundliche Gewinnung vonAmino- und Carbonsäuren aus Amidendurch den Einsatz von neuentdecktenAmidasen aus extremophilen Mikro-organismen. Im Rahmen des Projektssollen die neuentdeckten Amidasenzunächst weitergehend charakterisiert

und durch den IndustriepartnerDEGUSSA AG auf ihre industrielle Re-levanz untersucht werden. Anschlie-ßend erfolgt die Klonierung und Ex-pression priorisierter industrieller Ami-dasen im industriellen Produktions-stamm E. coli. Die Herstellung rekom-binanter Enzyme erfolgt unter optimier-ten Fermentationsbedingungen im 300-Liter Maßstab, um ausreichende Men-gen für anwendungstechnische Versu-che zur Verfügung stellen zu können.

Industrielle Bedeutung vonAmidasen

Amidasen (EC 3.5.1.4) katalysierendie stereospezifische Hydrolyse vonAmiden zu freien Carbonsäuren undAmmonium, sodass zu nahezu 100

Prozent die gewünschte chirale Ami-no- bzw. Carbonsäure hergestellt wird.In letzter Zeit wurde eine Reihe voninteressanten mikrobiellen Amidasendetektiert [1]. Industriell eingesetztwerden aber nur die Amidasen ausden mesophilen Bakterien Pseu-domonas putida, Klebsiella sp., Och-robactrum antropi SV3 und Myco-bacterium neoaurum. Die übrigenAmidasen weisen deutlich geringerespezifische Aktivitäten auf und habenaufgrund zu geringer Stabilität oder zuhoher pH-Optima noch keinen Einzugin industrielle Produktionsverfahrengehalten. Der Einsatz thermoaktiverAmidasen ist in vielen Fällen vorteil-haft, da größere Umsatzraten erzieltwerden können und die Substrate beihohen Temperaturen besser löslichsind.Zum Thema Amidasen wurden an derTUHH zahlreiche Vorarbeiten durch-geführt. Diese umfassten u.a. die Ent-wicklung einer neue Methode zur De-tektion von Amidasen in Polyacryl-amid-Gelen (Abb. 1), das Screeningnach Amidase-produzierenden Mikro-organismen (Neuisolate und literatur-bekannte Stämme) sowie die Reini-gung und partielle Charakterisierungvon Amidasen aus ausgewählten Stäm-men (Tab. 1).

Amidasen ausextremophilenMikroorganismen

Die in den Neuisolaten nachgewiese-nen Amidasen werden mit Hilfe

ExtremophileMikroorganismen alsQuelle neuartigerBiokatalysatoren

Biokatalysatoren - Enzyme bzw. Mi-kroorganismen - spielen eine Schlüs-selrolle bei der Herstellung wertvol-ler Verbindungen für die chemischeund pharmazeutische Industrie. MitHilfe von Enzymen können chemo-,stereo- und regioselektive Transfor-mationen durchgeführt werden, wo-hingegen chemische Syntheseverfah-ren zu Racematen führen, die aufwän-dig getrennt werden müssen. Obwohldie Natur über eine Vielzahl stereose-lektiver Biokatalysatoren verfügt, wer-den bislang nur wenige Enzyme in dersynthetischen Chemie eingesetzt.

Insgesamt ist der Einsatz von Enzy-men aus extremophiler Mikroorganis-men in der Fein- und Spezialchemiezurzeit kaum ausgeprägt. Eine hoheToleranz gegenüber organischen Lö-semitteln, Detergenzien oder Salzensind für viele Enzyme aus mesophilenMikro-organismen oftmals nicht ge-geben. Auch die Toleranz gegenüberhohen Substratkonzentrationen ist di-rekt proportional zur Raum-Zeit-Aus-beute und oftmals ein Knock-out-Kri-terium für die Realisierung biokataly-tischer Verfahren. Aber auch niedrigeTemperaturen sind bei einigen Prozes-sen zur Stabilisierung des Substratsoder zur Erhöhung der Selektivitätwünschenswert, wobei aber die Akti-vität des Biokatalysators trotzdemmöglichst hoch sein sollte. Hier könn-

Abb. 1. Detektion von Amidasen mittels PAGE. Das Gel wurde mit Hydro-xylamin und Eisen(III)chlorid behandelt. 1 – Aufgereinigte Amidase, 2 –Zymogram des Enzyms.

Sonderband | 2003 | 55BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Tab. 1: Aktivitätsoptima und Substratspezifität neudetektierter Amidasen.

Mikroorganismus Wachstumstemp. Expression des Optimale Aktivität Substrat-des Stammes [°C] Wildtyp-Enzyms des Wildtyp-Enzyms spektrum

Pseudonocardia thermophila 50 konstitutiv 70°C, pH 7 Al, Ar, Zy, AsThermocrispum municipale 50 induzierbar 70°C, pH 6 Al, Zy, AsPaenibacillus sp. 4K 50 induzierbar 70°C, pH 6 Al, Ar, Zy, AsRalstonia sp. 4K 45 induzierbar 60°C, pH 6 AlBacillus sp. 4K 55 induzierbar 70°C, pH 7 AlArthrobacter sp. 34-1 20 induzierbar 50°C, pH 7 Al, Ar, Zy, AsArthrobacter sp. 17-2 20 induzierbar 50°C, pH 7 Al, Ar, Zy, AsArthrobacter sp. 19-3 15 induzierbar 50°C, pH 7 Al, Zy, As

Al - Aliphatische Amide, Ar - Aromatische Amide, Zy - Zyklische Amide, As – Aminosäureamide.

chromatographischer Methoden biszur Homogenität gereinigt und imDetail charakterisiert. Zur weiterenCharakterisierung der Enzyme wer-den HPLC-Untersuchungen (Hydro-lyseprodukte, Enantioselektivität) er-folgen. Als Substrate werden Amino-säuren und aromatische Carbonsäu-ren eingesetzt, mit dem Ziel, regio-selektive Umsetzungen zu identifizie-ren. Diese relativ aufwändigen Ar-beitsschritte werden an der TUHHund bei der DEGUSSA gemeinschaft-lich durchgeführt. Parallel dazu wer-den pH- und Temperaturoptima, derEinfluss verschiedener Metallionen,Detergenzien und Inhibitoren auf dieausgewählten Enzyme bestimmt.Im Bereich der Klonierung und Ex-pression verfügt die Firma X-Zymeüber ein breites Spektrum von Vek-toren und Expressionsstämmen. MitHilfe dieser Systeme wird es möglichsein, die im beantragten Vorhaben zubearbeitenden Amidasen effizient in

rekombinanter Form gewinnen zukönnen. Die so in ausreichendenMengen vorliegenden rekombinan-ten Amidasen werden abschließendfür anwendungstechnische Versucheeingesetzt, mit dem Ziel, enantiome-renreine Amino- und Carbonsäurenherzustellen. Ziel der Versuche ist es,die Leistungsfähigkeit der neuenAmidasen bilanzierend unter Beweiszu stellen und Aussagen zur Wirt-

schaftlichkeit und Umweltfreundlich-keit des Verfahrens zu machen.

Literatur

[1] Banerjee, A., Sharma, R., Banerjee,U.C., Appl Microbiol Biotechnol 60(2002), 33-44.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Dr. h.c. GarabedAntranikianTU Hamburg-HarburgTechnische MikrobiologieKasernenstr. 1221073 HamburgTel.: 040-42878-3117Fax: 040-42878-2582eMail: antranikian@tuhh.de

BIOPROZESSENTWICKLUNG

Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung� Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz1 , Dipl.-Biotech. Robert Puskeiler1, Dr.-Ing. Klaus Kaufmann2, Dr. Gernot John3, Dr.-Ing. Matthias Arnold4,1Lehrstuhl für Bioverfahrenstechik, Technische Universität München, Garching, 2H+P Labortechnik AG, Oberschleissheim, 3Precision Sensing GmbH, Re-gensburg, 4DASGIP AG, Jülich

Die Fortschritte in der Biotechnologie erlauben es heute, Stoffwechselwege in Mikroorganismen gezielt so zu verändern, dass natürliche und nichtnatür-liche Produkte mit hohen Ausbeuten und Selektivitäten hergestellt werden könnten. Ein zentrales Problem ist gegenwärtig jedoch die zügige Umsetzungdieser Potenziale in industrielle Produktionsverfahren. Hierzu werden oftmals bis zu 10 Jahre und mehr benötigt. Zielsetzung dieses Verbundvorhabensist daher die Bereitstellung der technologischen Grundlagen zur Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung: Hierzu wird ein Modul mit 48 Rührkesselreakto-ren im 5-10 ml-Maßstab entwickelt, mit paralleler nicht-invasiver Optosensorik zur online pH- und pO2-Messung ausgestattet und mit einem Labor-Robo-ter automatisiert, um sowohl Stamm-, als auch Prozessentwicklung zeiteffektiv unter kontrollierten Reaktorbedingungen durchführen zu können.

Keywords: Parallele Rührkesselreaktoren, Miniaturisierung, Optosensorik, Automatisierung, Stammentwicklung, Bioprozessentwicklung.

Einleitung

Biotechnologische Verfahren konntenbisher immer dann industriell eta-bliert werden, wenn die marktfähigenProdukte nicht oder nur mit größe-rem Aufwand chemisch synthetisiertwerden können. Diese biotechnolo-gischen Verfahren zeichnen sich imVergleich zu chemischen Synthesen inder Regel durch einen geringeren En-ergieverbrauch aus, sind zielgerich-teter (weitgehende Vermeidung vonNeben- und Abfallprodukten) und res-

sourcenschonender, wenn nachwach-sende Rohstoffe eingesetzt werden.

Die Fortschritte in der biotechno-logischen Grundlagenforschung und-anwendung, insbesondere der Ge-nomforschung und Molekularbiolo-gie, erlauben es, neben der (hetero-logen) Überexpression von ProteinenStoffwechselwege gezielt so zu verän-dern, dass natürliche (aber auchnichtnatürliche) Produkte wie bei-spielsweise Aminosäuren, Vitamine,Nucleotide oder ‚chiral buildingblocks’ zunehmend in wirtschaftlich

konkurrenzfähigen Ausbeuten herge-stellt werden könnten.

Das Kernproblem ist gegenwärtigjedoch die zügige Umsetzung in tech-nisch realisierbare und wirtschaftlicheVerfahren. So vergehen heute oftmalsbis zu 10 Jahre bis zur industriellenRealisierung eines biotechnologischenVerfahrens. Eine Ursache für die lan-gen Entwicklungszeiträume ist die un-genügende Integration der Arbeits-schritte– Biokatalysatorentwicklung undScreening,

– Bioprozessentwicklung im Labor-maßstab und– Überführung in den Produktions-maßstab.

Die bisherige sequentielle Vorge-hensweise mit qualitativ und quanti-tativ sehr unterschiedlichen Techni-ken führt teilweise zu der paradoxenSituation, dass versucht wird, einen„Schüttelkolben“ im m3-Maßstab zurealisieren, was nur in seltenen Fäl-len wirtschaftlich erfolgreich ist. Bei-spielsweise produziert die amerika-nische Firma Amgen den Block-bu-

56 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Abb. 2: Simulation der magnetischen Flussdichte (in Tes-la) eines magnetisch-induktiven Rührantriebs für eineneinzelnen Rührkesselreaktor im Bioreaktorblock: Resul-tierendes Drehmoment auf den Rührkörper 0.0031 Nm beigleichzeitiger Tragkraft von 0.4 N (der diametral magneti-sierte Dauer-Ringmagnet befindet sich in einem Rühror-gan – Reaktor und Rührorgan sind nicht dargestellt - undwird durch das induzierte Magnetfeld in Rotation ver-setzt. Das Magnetfeld wird über 4 symmetrisch angeord-nete Kupferspulen mit Eisenkernen und –polschuhen in-duziert. Die Kupferspulen sind hierbei über ein Eisen-Rückschlussblech mit einander verbunden. Zur Simulati-on wurde die Software COSMOS/DesignSTAR-EMS ein-gesetzt).

Abb. 1: Prinzipschema der apparativen Komponenten zur Hochdurch-satz-Bioprozessentwicklung.

ster Erythropoetein (EPO) in ‚rollerbottles’, die in Hunderten von Ein-heiten nebeneinander betrieben wer-den.

Auch die enormen quantitativenUnterschiede beispielsweise bei derWirkstoffsuche im Hochdurchsatz-Verfahren und der heutigen Biopro-zessentwicklung im sequentiell be-triebenen Labor-Bioreaktor lasseneine zügige Umsetzung in neue Pro-duktionsprozesse bisher nicht zu.

Die heutige sequentielle Vorge-hensweise führt sogar dazu, dass vie-le potentielle biotechnologische Pro-duktionsverfahren bereits in einersehr frühen Entwicklungsphase nichtweiter verfolgt werden, wenn mit denbestehenden Paralleltechniken dasPotential vieler Biokatalysatorenprinzipiell nicht erkannt werdenkann oder aufgrund des enormenZeit- und Personalaufwands bei dersequentiellen Vorgehensweise nurwenige Biokatalysatoren intensiveruntersucht werden können.

Parallelreaktoren

Der klassische Parallelreaktor in derBiotechnologie ist der Schüttelkol-ben, mit dem seit dem letzten Jahr-hundert einfache Satzversuche imParallelansatz manuell durchgeführtwerden [1]. Wesentliche reaktions-technische Unterschiede zwischendem Reaktionsgefäß Schüttelkolbenund dem Reaktionsgefäß Rührkes-selreaktor - dem klassischen Pro-duktionsreaktor der Biotechnologie- sind der geringere Sauerstoffein-trag, das weitaus geringere Verhält-nis der maximalen lokalen Energie-dissipation zum mittleren Leistungs-eintrag und die fehlende Kontrollewichtiger Prozessgrößen (wie bei-spielsweise pH oder pO

2) beim

Schüttelkolben. Dies führt dazu,dass Reaktionsverläufe in den mei-sten Fällen nicht direkt vom Reakti-onssystem Schüttelkolben in das Re-aktionssystem Rührkesselreaktorübertragen werden können und da-mit in der Bioprozessentwicklungzusätzliche personal- und zeitinten-sive sequentielle Experimente in La-borbioreaktoren erforderlich sind.

Technische Ansätze dieses Pro-blem zu lösen, sind die Bereitstel-lung von parallelen Rührkesselein-heiten oder parallelen Kleinreakto-ren in einem Inkubator mit intermit-tierender Dosierung und parallelerpH-Kontrolle [2]. Die Anzahl paral-leler Bioreaktoren ist jedoch be-schränkt (max. 16). Eine weitereParallelisierung ist auf Basis dieser

Technologieplattform praktischnicht möglich.

Eine weitere einfache Möglich-keit, noch weitaus mehr Reaktorenparallel zu betreiben, ist die Verwen-dung von Mikrotiterplatten zur Satz-Kultivierung von Mikroorganismen.Mikrotiterplatten weisen jedoch innoch stärkerem Maße dieselben re-aktionstechnischen Restriktionenwie Schüttelkolben auf [3].

Eine parallele online Messung vonpH und pO

2 ist mit den etablierten

Messtechniken (pH- und pO2-Elek-

troden) bei hoher Parallelisierungund geringen Reaktionsvoluminanicht möglich. Eine Möglichkeit zurÜberwindung dieser Problematikkönnten Mikrosensoren darstellen,wenn diese kostengünstig in jedesder parallelen Reaktionsgefäße in-tegriert werden können. Erste Ansät-ze hierzu sind vor kurzem in Mikro-titerplatten zur Messung von pHoder pO

2 realisiert worden [4].

Die parallele Regelung von Pro-zessgrößen wie pH für 48 oder mehrParallelreaktoren ist prinzipiell

nicht durch Parallelisierung vonkonventionellen Eingrößenreglernzu realisieren, da ein Aktor (Pum-pe, Dosiereinheit) mehrere Parallel-reaktoren intermittierend mit Titra-tionsmittel bedienen muss.

Lösungsansatz:Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung

Zielsetzung dieses Verbundvorha-bens ist daher die Bereitstellung dertechnologischen Grundlagen zurHochdurchsatz-Bioprozessentwick-lung. Im Einzelnen sind dies (sieheAbb. 1):– Sterilisierbarer Bioreaktorblockmit 48 parallelen Rührkesselreakto-ren im 5–10 ml-Maßstab (Lei-stungseintrag mit ‚schwebendemMagnetrührer’, Sauerstoffeintragnach dem ‚gas-inducing’-Prinzip,Temperaturkontrolle, sterile Be-und Entgasung, sterile Probenah-me).– Parallele Optosensorik als ‚Sen-sorblock’ unterhalb des Reaktor-

blocks zur parallelen online Bestim-mung von pH und pO

2 in jedem Re-

aktionsgefäß mit kurzer Totzeit undhoher Abtastrate.– Parallele rechnergeführte Prozes-skontrolle zur Automatisierung derParallelreaktoren mit Hilfe eines La-bor-Roboters als Aktor (8-fach par-allele intermittierende Dosierungvon Korrekturmittel und Substraten,Probenahmen und at-line Analysenvon Zelldichte und Metabolitkonzen-trationen).

Bioreaktorblock

Zentrales Element des Bioreaktor-blocks ist die Antriebseinheit für 48parallele Rührkesselreaktoren.Hierzu wurden verschleißfreie VA-RIOMAGR-Vielfachantriebe in ihremWirkungsgrad mit Hilfe von umfang-reichen Simulationsstudien opti-miert, sodass hohe Grenzdrehzahlenvon bis zu 2500 rpm mit neu ent-wickelten, gas-induzierenden Rühr-organen erreicht und zuverlässigaufrecht erhalten werden können(siehe Abb. 2). Das von stationärenMagnetspulen zwischen den Reakti-onsgefäßen erzeugte magnetischeDrehfeld wird dabei so angeordnet,dass die Rührorgane auf einer vor-gegebenen Reaktorhöhe frei schwe-ben können.

In den Bioreaktorblock wurdenneben dem magnetisch-induktivenVielfachantrieb zwei Wärmetauscherinstalliert: Der erste zur Tempera-turkontrolle der parallelen Bioreak-toren und der zweite zur Kühlungder Reaktorköpfe, um die Verdun-stungsverluste beim Betrieb der Re-aktoren herabzusetzen.

Die sterile Gaszufuhr in die Kopf-räume und die Entgasung der einzel-nen Parallelreaktoren über individu-elle Leitrohre, die gleichzeitig als Ste-rilbarriere für die Nadeln eines Pi-pettier-Roboters dienen, befindetsich zur Zeit in Entwicklung.

Sonderband | 2003 | 57BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Abb. 4: Modulkonzept der parallelen Optosensorik: Eine Zentraleinheit ist über ein Bus-Interface mit mehrerenOptik-Untersetzern verbunden. Die Zentraleinheit übernimmt dabei Steuerung, Phasendetektion und Stromver-sorgung.

Gas-induzierendeRührorgane

In Rührreaktoren wird der Sauerstoff-eintrag in das Reaktionsmedien bei Vo-lumenbegasung primär durch denLeistungseintrag des Rührorgans undsekundär durch die Gasleerrohrge-schwindigkeit bestimmt. Eine Primär-dispergierung der Gasphase, wie sieim klassischen Rührkesselreaktorüber einen Gasverteiler am Reaktor-boden erfolgt, ist in parallel angeord-neten ‚ml-Bioreaktoren’ jedoch nursehr aufwändig zu realisieren: Die Re-aktionsgefäße müssten mit einem in-dividuellen Gasverteiler versehen wer-den. Der Gasverteiler müsste sicher-stellen, dass in jedem der parallelenReaktionsgefäße exakt die gewünsch-te Gasleerrohrgeschwindigkeit erzieltwird.

Kleine Reaktionsgefäße haben je-doch im Vergleich zu Labor-Rührkes-selreaktoren ein weitaus höheresOberfläche/Volumenverhältnis. Damitbesteht bei Verwendung eines geeig-neten Rührorgans prinzipiell die Mög-lichkeit, auf eine Primärdispergierungder Gasphase durch einen Gasvertei-ler zu verzichten, wenn es gelingt, dieGasphase, die sich über der Flüssig-keitsoberfläche befindet, direkt im‚ml-Bioreaktor’ zu dispergieren. Eingeeignetes Rührorgan muss also zweiEigenschaften besitzen: Axiale Förde-rung von der Flüssigkeitsoberflächezum Boden des Reaktionsgefäßes(‚Einsaugen’ der Gasphase) und ef-fektive Dispergierung der Gasphase inmöglichst kleine Gasblasen mit hoherStoffaustauschfläche (hohe lokale En-ergiedissipation).

Hierzu wurde eine Reihe von un-terschiedlichen, frei schwebenden undmagnetisch-induktiv angetriebenen,Gas induzierenden Rührorganen ent-wickelt [5] (Beispiel siehe Abb. 3a,3b).

Mit Hilfe dieser Rührorgane werdenbei Drehzahlen bis 2200 rpm Stoff-übergangskoeffizienten k

La von 0.15 -

0.2 s-1 möglich (die Messung erfolgtemit der dynamischen Sulfitmethode).Damit werden Sauerstoffeintragslei-stungen wie in technischen Rührkes-selreaktoren ermöglicht.

Bei solchen ‚gas-inducing reac-tors’ ohne Primärdispergierung derGasphase über einen Gasverteiler ver-bleibt als einzige Steuergröße für denSauerstoffeintrag die Rotationsge-schwindigkeit des Magnetrührorgans,dass eine Doppelfunktion übernimmt:Erzeugung des notwendigen Gas-durchsatzes (Gasleerohrgeschwindig-keit) und Realisierung des erforderli-

chen Leistungseintrags zur Dispergie-rung der Gasphase.

Optosensorik

Die optische Messung von pH- undSauerstoffkonzentrationen mit Mikro-sensoren durch transparente Gefäß-wände ist mit ‚Sensor-Mikrotiterplat-ten’ mithilfe der konventionellen Lu-mineszenzintensitätsmessung [4] be-reits heute technisch möglich. ZurNutzung der von Störungen der Probeunabhängigen, zeitaufgelösten Lumi-neszenzmessung durch Phasendetek-tion [6] für ein paralleles Messsystemwird zur Zeit eine parallele opto-elek-tronische Detektionseinheit entwickelt.

Abb. 3: a) Prinzipskizze eines miniaturisierten Rührkesselreaktors im Bio-reaktorblock mit einem Durchmesser von 15,5 mm. b) Prinzipskizze einesfrei schwebenden, Gas induzierenden Magnetrührorgans (Aufsicht undSchnittbild, 1 Pumpkanäle, 2 Dauermagnete).

a b

Abb. 5: Systemarchitektur des online Prozessinformations- und Steue-rungssystems: Die zunächst bearbeiteten Teilsysteme sind durch schwar-ze Schrift gekennzeichnet.

Die Hauptaufgabe besteht in einemNeu-Design der Signalauswertung.Nach dem modularen Konzept wirddie Phasendetektion von der Optik ge-trennt sein (siehe Abb. 4). Zwischenihnen sind nur elektrische Verbindun-gen notwendig, deren Abschirmungvom Magnetfeld der Rührer gesichertsein muss.

Es werden Optik-Untersetzer ent-wickelt, die direkt unter dem Reakti-onsgefäß platziert werden. Dabei wer-den Temperatureffekte aus der Nähezum beheizten Reaktionsraum durchgeeignete Referenzen im optischenSystem unterbunden. Besondere Auf-merksamkeit wird der Auswahl vonkostengünstigen Filtern gewidmet, umFolienfilter einsetzen zu können.

Parallele Prozesskontrolle

Die bedingt durch die parallele Ar-beitsweise im Vergleich zu konven-tionellen Systemen sehr große Anzahl

58 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Abb. 7: Photo eines Pi-pettierroboters mit einemPrototypen des Bioreak-torblocks.

von Einzelinformationen erfordertneue Wege sowohl bei Informations-logistik als auch in der Benutzerin-teraktion in den Phasen Versuchs-planung, -durchführung und –aus-wertung sowie der Systemintegration:

Die parallele, intermittierendeKontrolle von 48 oder mehr Paral-lelbioreaktoren mit nur 8 parallelenAktoren (Dosierstrecken eines La-borroboters) stellt eine neue Dimen-sion dar: Die massiv parallelen, kon-kurrierenden Aufgaben müssen un-ter Berücksichtigung sich individu-ell dynamisch verändernder Biopro-zesse ausgeführt werden. Eine solche‚Scheduling’- Strategie wird zur Zeitauf der Basis der Theorie für Echt-zeitsysteme erarbeitet.

Die im Aufbau befindliche System-architektur ist in Abbildung 5 darge-stellt.

Kultivierung vonEscherichia coli inminiaturiertenRührkesselreaktoren

Escherichia coli wurde in einem de-finierten Mineralmedium mit 25 g L-1

Glucose als Kohlenstoffquelle und Vor-lage von Antischaum CLEROL 265 (0,1mL L-1) in miniaturisierten Rührkes-selreaktoren kultiviert.

Das Zulaufmedium enthielt nebenGlukose (400 g L-1) noch folgendeKomponenten: MgSO

4*7H

2O (20 g L-

1), EDTA (13,0 mg L-1), CoCl2*6H

2O

(4,15 mg L-1), MnCl2*4H

2O (24,9 mg

L-1), CuCl2*2H

2O (2,5 mg L-1), H

3BO

3(5,0 mg L-1), Na

2MoO

4*2H

2O (4,15

mg L-1), Zn(CH3COO)

2*2H

2O (21,7

mg L-1), Fe(III)-zitrat (47,6 mg L-1).Die Satzkultivierung wurde in mi-

niaturisierten Rührkesselreaktoren(15,5 mm Innendurchmesser) miteinem Prototypen-Magnetantrieb so-wohl mit kommerziellen Standard-Magnetrührer, als auch mit einem neuentwickelten, Gas induzierenden Ma-gnetrührsystem durchgeführt. DieDrehzahl wurde über die gesamteKultivierungsdauer von 16 h bei kon-stant 2200 rpm gehalten. Die Kultivie-rung wurde ohne Sauerstoffpartial-druckmessung und -kontrolle durch-geführt. Mit Hilfe eines Laborroboters(siehe Abb. 7) wurden mit einer Fre-quenz von 1 h-1 automatisch Probenentnommen. Die pH Kontrolle erfolg-te durch einen modellgestützten Pro-portionalregler mit einem Stelleingriffpro Stunde (pH-Sollwert 6,8). Als Ti-trationsmittel wurde 4 M NaOH mitHilfe des Laborroboters zugegeben.

Nach Verbrauch der Ausgangsmen-ge Glukose wurde ein linear steigen-

Abb. 6: Erste Parallelkultivierung von E. coli im Bioreaktorblock mit automatisierter at-line pH-Kontrolle, at-lineBiomasseanalytik und intermittierender Substratdosierung: Vergleich verschiedener Magnetrührersysteme (V = 5-6 mL, n = 2200 rpm, T = 37 °C, pH = 6.3-7.0, cKorr = 4 M NaOH, Mineralsalzmedium, cS0 = 25 g L-1 Glucose, cF = 400g L-1 Glucose, Dosierfreqenz = 15 h-1).

des Dosierprofil mit einem Ausgangs-volumenstrom von 40 µL h-1 und ei-ner Steigung von 5 µL h-2 realisiert.Die Zugabe des Zulaufmediums er-folgte ebenfalls automatisiert durchden Laborroboter mit einer Frequenzvon 15 h-1.

In den vom Laborroboter entnom-menen Proben wurde automatisiertdie optische Dichte OD

650nm mit Hilfe

eines Mikrotiterplatten Photometersbestimmt (siehe Abb. 7). Der Korre-lationskoeffizient OD/Biotrockenmas-se (BTM) wurde gravimetrisch mit je1 mL Probe nach Ende der Fermenta-tion bestimmt.

Die pH-Messung erfolgte mit einemIntervall von 1 h-1 automatisiert in han-delsüblichen Mikrotiterplatten, wel-che immobilisierte pH-sensitive Fluo-reszenzfarbstoffe enthalten (Hydro-plate HP96T, Presens, Regensburg).Die Fluoreszenzfarbstoffe werden perbottom-bottom Messtechnik ebenfallsim Mikrotiterplatten Photometer aus-gelesen. Die Kalibrierung erfolgte mitPhosphatpufferlösungen (150 mM)bei pH 5, 6, 7, und 8.Das Ergebnis der Kultivierung zeigtAbbildung 6. Die Kultivierung mit dem

Gas-induzierendem Rührsystem er-möglichte exponentielles Wachstumvon E. coli im anfänglichen Satzbetriebbis zu einer Zelldichte von 6,3 g L-1.Der Reaktor mit dem kommerziellenStandard-Magnetrührer zeigte bereitsim Satzbetrieb geringeres Wachstumder E. coli Zellen.

Nach Verbrauch der vorgelegtenGlukose in den parallelen Rührkessel-reaktoren wurde bei einer Prozesszeitvon 9 h das linear ansteigende Gluco-se-Dosierprofil gestartet. Dabei wur-de im Reaktor mit dem Gas induzie-renden Magnetrührsystem innerhalbvon 7 h eine Zelldichte von über 20 gL-1 Biotrockenmasse erreicht. DerStandard-Magnetrührer ermöglichtelediglich eine maximale Zelldichte von5 g L-1 BTM.

Ausblick

Möglichkeiten und Grenzen dieserneuen Technologien zur Hochdurch-satz-Bioprozessentwicklung (sieheAbb. 7) - Bioreaktorblock, paralleleOptosensorik und parallele Prozes-skontrolle - sollen simultan währendihrer Entwicklung an verschiedenen

Beispielprozessen und biologischenBeispielsystemen evaluiert werden.

Literatur

[1] Büchs, J., Biochem. Eng. J. 7 (2001),91-98.

[2] Weuster-Botz, D., Chem. Ing. Tech.74 (2002), 1762-1766.

[3] John, G.T., Dissertation, Universitätdes Saarlandes (2001).

[4] Duetz, W.A., Ruedi, L., Hermann, R.,O’Connor, K., Büchs, J., Witholt, B.,Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000),2641-2646.

[5] Puskeiler R., Zacher K.-H., Weuster-Botz, D., Deutsche PatentanmeldungDE 10260691.9 (2002).

[6] Klimant, I., Deutsche Patentanmel-dung DE 10101576.3 (2001).

Korrespondenz

Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-BotzLehrstuhl für Bioverfahrenstechik,Technische Universität MünchenTel.: 089-289 157 12Fax: 089-289 157 14eMail: d.weuster-botz@lrz.tum.deweb: www.mw.tum.de/biovt/

Sonderband | 2003 | 59BIOKATALYSEBIOKATALYSE

MIKROTITERPLATTEN-REAKTOREN

Mikrotiterplatten-Reaktoren mitintegrierten pH-Sensoren undAutodisplay in E. coli zurevolutiven Enzymentwicklung� Prof. Dr. Elmar Heinzle1, staatl. gepr. LMChem. Svenja Weiß1, Prof. Dr. Otto Wolfbeis2, Dipl. Chem. Sarina Arain2, Prof. Dr. Ingo Klimant3, Dr. GernotJohn4, Dr. Christian Krause4, Dr. Thomas Räbiger5, Günther Müller6, Dr. Harald Waltenberger6, Dr. Joachim Jose7, Dipl.-Biol. Eva Schultheiss7

1 Technische Biochemie, Universität des Saarlandes, Saarbrücken, 2 Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik, Universität Regensburg3 Institut für Analytische Chemie, Mikro- und Radiochemie, TU Graz, 4 Presens GmbH, Regensburg, 5 BMG Labtechnologies GmbH, Offenburg6 MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, 7 Pharmazeutische und Medizinische Chemie, Universität des Saarlandes, Saarbrücken

Ein limitierender Schritt zur Ausschöpfung des enormen biokatalytischen Potenzials ist das quantitative Screening von Biokatalysatoren. In diesem Pro-jekt wurden parallel neue Methoden zum Autodisplay von Enzymen in E.coli und zum quantitativen Screening Säure-umsetzender Enzyme in Mikrotiter-platten erarbeitet. Es wurden 96-Well-Mikrotiterplatten mit integrierten optischen Sensoren entwickelt, die über einen pH-unempfindlichen Referenzfarb-stoff verfügen, weitgehend kalibrierfrei sind, auch in Flüssigkeiten mit Eigenfluoreszenz einsetzbar sind und mit denen in konventionellen Readern ge-messen werden kann. Dazu mussten jeweils geeignete Beschichtungstechniken für Platten mit Rund- und Flachboden entwickelt werden. Mit diesenMikrotiterplatten-Reaktoren wurden zunächst Mischungsstudien durchgeführt, wobei festgestellt wurde, dass je nach den eingestellten ParameternMischzeiten von unterhalb einer Sekunde bis mehrere Minuten resultieren. Geeignete Bilanzierungsmethoden wurden entwickelt und implementiert. Da-mit konnten bei geeigneter Pufferung die kinetischen Parameter von Esterasen bestimmt werden. Unter Einsatz eines Autodisplay-Systems in E. coliwurde eine neue Esterase entwickelt, welche derzeit evolutiv verbessert wird.

Keywords: 96-Well-Mikrotiterplatten-Reaktoren, pH-Optosensor, Mischen, Autodisplay, evolutive Enzymentwicklung, Esterase.

nen. Einer der Parameter, die sichwährend Reaktionen am häufigstenändern, ist der pH-Wert. Durch Mes-sung des pH-Werts in Mikrotiterplat-ten sollen Umsetzungen von Säurenund Basen und damit die Fortschritteentsprechender Reaktionen quantita-tiv verfolgt werden.

Mikrotiterplatten mitintegrierten, optischenpH-Sensoren

Eine schnelle und einfache Methodezur Bestimmung der Aktivität neuerEnzymvarianten ist das Screenen mitHilfe optischer Sensoren. Um dieNachteile eines gelösten Indikatorswie Pipettierfehler, Kontamination derProbe, Inhibitor- oder Akzeleratorwir-kung der Farbstoffe zu vermeiden,wurden Sensorfilme in die Böden von96er Rundboden-Mikrotiterplattenintegriert. Der Sensor enthält nebendem pH-sensitiven Fluoreszenzfarb-stoff einen inerten Referenzfarbstoff.Durch diese interne Referenzierungwerden Einflüsse auf das Signal wieSchwankungen der Intensität der

Lichtquelle oder der Empfindlichkeitdes Detektors sowie ungleichmäßigeDicke der Sensorspots minimiert, waszu einer besseren Reproduzierbarkeit

der Messwerte führt. Beide Farbstoffesind in ein protonenpermeables Po-lymer eingebettet, welches in90%igem Ethanol gelöst ist. Definier-te Volumina dieses Sensorcocktailswerden in die Wells der Mikrotiter-platte pipettiert. Nach dem Verdunstendes Lösungsmittels bleibt ein dünnerSensorfilm am Boden zurück. DasAuslesen der Fluoreszenzsignale imMikrotiterplatten-Reader erfolgt vonunten (Abbildung 1).

Es wurden zwei pH-Sensoren ent-wickelt. Der Sensor HP96T enthält alspH-Indikator Carboxyfluorescein (An-regung bei 485 nm, Emission bei538 nm) und als ReferenzfarbstoffSulforhodamin (Anregung: 540 nm,Emission: 590 nm). Beide Farbstoffesind kovalent an das lineare HydrogelPoly-HEMA (Polyhydroxyethylme-tacrylat) gebunden, um einerseits einAuswaschen der Farbstoffe durch dieProbe zu verhindern und andererseitsein definiertes Verhältnis zwischenIndikator und Referenz zu gewährlei-sten. Der Indikator des zweiten pH-Sensors HP96L ist ebenfalls Carboxy-fluorescein, der Referenzfarbstoff ein

Einleitung

In der pharmazeutischen und chemi-schen Industrie ist das Screening nachneuen und verbesserten Biokatalysa-toren von großer Bedeutung. Die Mi-niaturisierung und Vereinfachung derScreeningtests ist aus ökologischerund ökonomischer Sicht sehr wich-tig. Durch solche Test sollten für neuebiokatalytische Prozesse möglichstschon in sehr frühen Entwicklungs-phasen relevante, quantitative kineti-sche Daten ermittelt werden [1]. Da-durch können frühzeitig Potenzialeaber auch Limitierungen erkannt wer-den, womit Möglichkeiten eröffnetwerden, die Fehler frühzeitig zu be-heben oder eine andere, mehr Erfolgversprechende Richtung einzuschla-gen. Das Screening sollte möglichstschon mit den industriell relevantenSubstraten, die oft keine Chromopho-re besitzen, durchgeführt werden. Diegrundlegende Idee der hier beschrie-benen Arbeiten ist der Einsatz vonbreit einsetzbaren Mikrotiterplatten-Reaktoren, die in einer Vielzahl vonReaktionen eingesetzt werden kön-

Abb. 1: Prinzipielle Funktion despH-Fluoreszenzsensors. Sensor-schicht mit Indikator- und Refe-renz-Fluoreszenz-Farbstoff ist amBoden von jedem Well aufge-bracht.

60 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Rutheniumkomplex (Anregung:485 nm, Emission: 620 nm). Da dieFluoreszenz des Referenzfarbstoffsdurch Sauerstoff gelöscht wird, wur-de er in Sauerstoff-impermeable Par-tikel eingebettet, während der Indi-kator kovalent an diese Partikel ge-bunden ist. Die Partikel wurden zu-sammen mit Graphit in einem Hydro-gel dispergiert. Graphit dient als op-tische Isolierung und schirmt denSensor vor den optischen Eigenschaf-ten der Probe wie Fluoreszenz oderTrübung ab.

Speziell die Zusammensetzung derSensorcocktails HP96L stellt hoheAnsprüche an die Beschichtungstech-nik. Die Sensoren werden mit Hilfeeines neu entwickelten Verfahrens inForm kleiner runder Spots in Mikro-titerplatten eingebracht. Das Haupt-augenmerk bei der Entwicklung derBeschichtungstechnik lag auf den Ei-genschaften der Sensor-Cocktails, diesich durch eine hohe Viskosität, eineschnelle Sedimentation und ihre star-ke Adhäsion an Oberflächen aus-zeichnen. Als Basisgerät für die Be-schichtung dient ein Tecan Miniprep60 mit einem gefederten 8-Kanal-Kamm. Alle Geräteteile, die mit demSensor-Cocktail in Kontakt kommen,sind mit einer speziellen hydropho-ben Beschichtung versehen. Durchden Einsatz kleinster Dispenser-Sprit-zen können selbst Volumina unter1 µl, wie sie bei dem Coating desoptisch isolierten Sensors Verwen-dung finden, mit einer hohen Genau-igkeit reproduzierbar dispensiertwerden. Das Beschichten der Kavitä-ten erfolgt im Kontakt, wobei defi-nierte Tropfen des Sensor-Cocktailsauf der Oberfläche abgesetzt werden.Unebenheiten in den Mikrotiterplat-ten, die zu einer abweichenden Spot-charakteristik führen können, wer-den durch einzeln gefederte Dispens-ernadeln nivelliert. Mit der so eta-blierten Beschichtungstechnik kön-nen bis zu 400 Sensorplatten pro Taghergestellt werden.

Die Eigenschaften beider pH-Sen-soren sind in Tabelle 1 zusammen-gefasst. Beide Sensoren weisen eineschnelle Ansprechzeit auf, wobei diedes optisch nicht isolierten SensorsHP96T kleiner ist als die des optischisolierten Sensors HP96L. Die Genau-igkeit beider Sensoren liegt unter0.05 pH-Einheiten, die Auflösungsogar unter 0.01 pH-Einheiten. Wiebei allen optischen pH-Sensoren ließsich eine gewisse Querempfindlich-keit gegenüber der Ionenstärke (IS)nicht vermeiden. Während das Signaldes optisch nicht isolierten Sensors

durch trübe und fluoreszierende Pro-ben beeinflusst wird, zeigt der op-tisch isolierte Sensor keinerlei Quer-empfindlichkeit gegenüber diesenSubstanzen. Abbildung 2 zeigt die Ka-librationskurven der beiden Senso-ren mit dem Nährmedium AC Broth(A 3465, Sigma, Taufkirchen) sowie

Tab. 1: Eigenschaften der pH-Sensoren HP96T und HP96L.

HP96T HP96LMessbereich pH 5-8 pH 5-8Ansprechzeit (t90) < 10 s < 60 sGenauigkeit < 0,05 pH < 0,05 pHAuflösung < 0,01 pH < 0,01 pHQuerempfindlichkeiten Ionenstärke; trübe und Ionenstärke

fluoreszierende Proben

Abb. 3: Mischverhalten in Mikrotiterplatten. Zugabe von Lauge mit einerPiezo-Nanoliterpumpe. Schüttelfrequenz: 240 Upm, Reader: FLUOstarGalaxy (BMG Labtechnologies GmbH, Offenburg). HPTS – 8-Hydroxypy-ren-1, 3, 6-trisulfonsäure, gelöster pH-Indikator.

des Standardpuffers aufweisen. Beitrüben oder fluoreszierenden Probenist es also vorteilhaft, einen Sensormit optischer Isolierung zu verwen-den, da sonst für jede dieser Probeneine eigene Kalibrationskurve not-wendig ist.

Mischen inMikrotiterplatten

Allgemein wird angenommen, dassdas Mischen in Gefäßen mit kleinerwerdenden Volumina immer leichterwird. Wir konnten mit Hilfe von Farb-stoffen und mit Hilfe der neu entwik-kelten 96er Mikrotiterplatten mit in-tegriertem pH-Sensor das Mischver-

mit einigen seiner Bestandteile. DieIntensitäten des Sensors HP96T sindbei Verwendung von Fleisch- undHefeextrakt sowie des Nährmediumshöher als bei Standardpuffer (Merck,Darmstadt), wogegen die des optischisolierten Sensors HP96L keinen Un-terschied zu der Kalibrationskurve

Abb. 2: Kalibrationskurven der Miktrotiterplatten mit (HP96L) und ohne (HP96T) optischer Isolierung beiVerwendung von AC-Nährlösung und einige ihrer Bestandteile sowie Standardpufferlösung als Vergleich. R –Intensitätsverhältnis. pH-Indikator: Carboxyfluorescein (Anregung bei 485 nm, Emission bei 538 nm).Referenzfarbstoff: HP96T - Sulforhodamin (Anregung: 540 nm, Emission: 590 nm), HP96L - Rutheniumkomplex(Anregung: 485 nm, Emission: 620 nm).

halten bei Zugabe von Lauge studie-ren [2]. Dabei stellte sich heraus,dass das Mischen mit den in vielenMikrotiterplatten-Readern eingebau-ten Dosier- und Schüttelfunktionenmeist nur Mischzeiten in der Größen-ordnung von Minuten erlaubt. Diesist für viele kinetische Untersuchun-gen, bei denen Substrate oder Lau-gen bzw. Säuren zur pH-Regelungzugegeben werden sollen, nicht ak-zeptabel. Das Mischen in 96er Mikro-titerplatten konnte auch mit mathe-matischen Modellen beschriebenwerden (Abbildung 3). Für eine all-fällige pH-Regelung in Mikrotiterplat-ten werden geeignete Zugabe- undSchüttelprozeduren benötigt.

Quantitative Bestimmungder Enzymkinetik inMikrotiterplatten

In den entwickelten Sensor-Mikroti-terplatten können pH-Änderungensehr genau gemessen werden. Damit

Sonderband | 2003 | 61BIOKATALYSEBIOKATALYSE

ist ein Vergleich der Aktivität ver-schiedener Enzyme direkt durch deneinfachen Vergleich der pH-Änderun-gen möglich. Quantitative Analysenvon Umsatzkurven sind jedoch nurdurchführbar, wenn Bilanzen allerdie pH-Änderung beeinflussendenGrößen aufgestellt werden. Wir ha-ben solche Bilanzen für Substrate,Produkte und für alle anderen pH-Puffersysteme aufgestellt. Unter Be-rücksichtigung der immer zu gewähr-leistenden Ladungsneutralität in Io-nenbilanzen und unter Einbeziehungder Dissoziationskonstanten konnteso der Zusammenhang zwischen derbeobachteten pH-Änderung und demReaktionsfortschritt quantitativ be-schrieben werden [3]. Damit konn-ten sowohl die maximalen Raten alsauch die Michaelis-Menten Konstan-ten für eine Penicillin Amidase be-stimmt werden. Diese neu entwickel-te Methode wurde auf verschiedeneEnzyme angewendet, unter anderemauf die Esterase EsjA, die in diesemArtikel noch genauer beschriebenwird. In Abbildung 4 sind die Um-setzungen von drei Naphthylesternmit diesem Enzym gezeigt. Die ein-gesetzten Säurekomponenten habeneinen sehr großen Einfluss auf dieKinetik der Esterspaltung. α-Naph-thylacetat wurde deutlich am schnell-sten umgesetzt, während die Aktivi-tät für α -Naphthylcaproat kaummessbar war.

Autodisplay

Enzyme sind dank ihrer einzigartigenEigenschaften, wie z. B. Selektivitätund Spezifität, von großem Interes-se für einen Einsatz in der pharma-zeutischen Industrie, der Medizinund im Umweltschutz. Um sie jedochtechnisch nutzen zu können, ist eserforderlich, sie an die speziellen Re-aktionsbedingungen, wie sie in che-misch-technologischen Prozessenauftreten, anzupassen. Für eine sol-che Optimierung hat sich die Metho-de der gerichteten Evolution be-währt. Der evolutive Ansatz bestehtdarin, dass das Enzym in dem Be-reich, der für die Substratspezifitätverantwortlich ist, zufallsvariiert wird(Variation) und anschließend ausder Vielzahl an entstandenen Varian-ten diejenigen identifiziert werden,die ein vorgegebenes Substrat umzu-setzen in der Lage sind (Selektion).Der innovative Ansatz in diesem Pro-jekt besteht darin, die Variation ei-ner Esterase an der Zelloberflächevon Escherichia coli durchzuführen,wobei jede Zelle eine definierte Va- Abb. 5: Enzym-Evolution mit dem Autodisplay-System.

Abb. 4: Hydrolyse vonNaphthylestern durch dieEsterase EsjA in Mikroti-terplatten-Reaktoren(HP96T, Presens, Regens-burg). 2mM a-Naphthyla-cetat (a-NA), -butyrat (a-NB) und -caproat (a-NC),5mM Phosphatpuffer mit2.5% DMSO. Die Symbolekennzeichnen die pH-Messergebnisse, die Lini-en die daraus berechne-ten Substratverläufe.

riante in hoher Kopienzahl trägt. Dashat den Vorteil, mit der selektionier-ten Enzymvariante gleichzeitig dasdafür kodierende Gen zu isolierenund somit Aufschluss über die Struk-tur zu erhalten (Abbildung 5). DieVerwendung eines Ganzzellbiokata-lysators birgt aber noch weitere Vor-teile. So entfällt eine zeit- und kosten-aufwändige Präparation des Enzymsund es können auch nicht-membran-permeable Substrate umgesetzt wer-den. Bei dem hier verwendeten Sy-stem zur Oberflächenexpression,dem Autodisplay System, bietet sichdarüber hinaus die Möglichkeit, dieneu erzeugte Variante schließlich in

zum Transport über die innere Mem-bran, gefolgt von der Passagierdomä-ne, an die sich ein Verbindungsstück,der so genannte Linker, anschließtund schließlich am C-Terminus dieeigentliche Transportdomäne. Diesefaltet sich als Porin-ähnliche Struk-tur, als so genanntes β-Fass, in dieäußere Membran ein und entlässtdadurch den Passagier an die Ober-fläche (Abbildung 6). Wird anstelleder kodierenden Region für den na-türlichen Passagier die für ein ande-res Protein eingesetzt, wird diesesProtein über den gleichen Mechanis-mus zur Oberfläche transportiert. Mitdieser Methode wurden bereits eineReihe unterschiedlicher rekombi-nanter Proteine an der Oberflächevon E. coli Zellen exprimiert, u. a.CTB [5], bovines Adrenodoxin[6,7]oder Sorbit Dehydrogenase ausRhodobacter sphaeroides [8]. Eingroßer Vorteil des Autodisplay Sy-stems ist, dass die Lebensfähigkeitder Bakterien nicht negativ beein-flusst wird, d. h. die Überprodukti-on der Passagier-Transportproteinestört die Integrität der äußeren Mem-bran nicht. Ein weiterer Vorteil desAutodisplays ist seine hohe Expres-sionsrate: Bis zu 5 % des Gesamtpro-teingehalts kann der Anteil rekom-binanter Proteine betragen [5]. An-hand der Elektronen übertragendenAktivität des Adrenodoxins konnte

reiner Form in den Zellüberstand se-kretieren zu können.

Das Autodisplay System macht sichden Sekretionsmechanismus der sogenannten Autotransporter-Proteine[4] für die Oberflächenexpressionvon Proteinen zu nutze. Bei der Fa-milie der Autotransporter-Proteinehandelt es sich um Ein-Komponen-ten-Transporter, d. h. diese Proteinewerden von der Zelle als Vorläufer-moleküle synthetisiert, die alle Infor-mationen zur Sekretion enthalten. Essind also keine weiteren Proteineoder Cofaktoren notwendig. Ein sol-ches Vorläufermolekül besitzt am N-terminalen Ende ein Signalpeptid

62 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Tab. 2: Lage einzelner Mutationen in einem Teilbereich von EsjA.

EsjA EAVITAGLGA AAPPALKAAL DALAEGATPD FASRQQAIRK ALLAAAATVSKlon1 GKlon2Klon3 G S TKlon4 DKlon5 G GKlon6 G S T SKlon7 G S T

auf der Oberfläche eine Zahl von1,8 x 105 Molekülen ermittelt wer-den [6]. Darüber hinaus scheint dieGröße des Passagiers kaum einenEinfluss auf die Expressionstärke zuhaben, was ein Vorteil des Autodis-plays gegenüber dem für ähnlicheFragestellungen eingesetzten Phage-Display sein kann.

Entwicklung einerEsterase

In diesem Projekt wurde die für dieEsterase EstA aus Burkholderia gla-dioli kodierende Region über PCRmit den für das Autodisplay notwen-digen Genregionen verknüpft [9]. An-schließend wurde die Expression desdadurch kodierten Fusionsproteins inder Außenmembran über eine Anti-körper-Farbreaktion nachgewiesen.Um zu überprüfen, ob das Fusions-protein nach außen orientiert ist undnicht etwa zum Periplasma hin, wur-den ganze Zellen mit Proteinase K be-handelt, anschließend die äußereMembran präpariert und einer We-sternblotanalyse unterzogen. Protei-nase K ist zu groß, um über die äu-ßere Membran zu gelangen, d. h. siekann nur verdauen, was sich an derOberfläche einer Zelle befindet. Inder Tat konnte die Passagierdomänein der Außenmembran Proteinase-K-behandelter Zellen nicht mehr nach-gewiesen werden. Dies war ein ein-deutiger Hinweis darauf, dass sichEstA an der Zelloberfläche befindet.Anschließend konnte die Aktivität vonEstA an der Zelloberfläche mit meh-reren Methoden qualitativ nachgewie-sen werden. Die spezifische Aktivitätvon EstA wurde über die Freisetzungvon p-Nitrophenol aus p-Nitrophe-

nylacetat, die photometrisch bei 405nm verfolgt wurde, als 1,7 mU/mgProtein bestimmt.

Um eine Esterase mit höherer Ak-tivität einsetzen zu können, wurde alszweites Enzym die Esterase ApeE ausSalmonella typhimurium mit Hilfedes Autodisplay Systems an die Zell-oberfläche gebracht. Es wurde jedochnicht das komplette Enzym transpor-tiert, sondern lediglich die das aktiveZentrum bestimmenden Domänen.Unter Zuhilfenahme des multiplen Se-quenzalignments mit anderen Ester-asen auf Aminosäureebene konntendie für die Aktivität verantwortlichenkonservierten Bereiche von ApeEidentifiziert werden. Nur der Teil vonApeE mit diesen Aktivitätsdomänenwurde mit den Autotransporterdomä-nen verknüpft. Auf diese Weise ent-stand eine neue, am Reißbrett kon-struierte Esterase, die EsjA genanntwurde. Auch deren Oberflächenstän-digkeit wurde über einen Proteinase-K-Verdau ganzer Zellen nachgewie-sen. Bei den Aktivitätsbestimmungenzeigte sich, dass EsjA etwa 15mal ak-tiver war als EstA. Durch die so er-haltene, stark gesteigerte Enzymakti-vität war es möglich, die Esteraseak-tivität ganzer Zellen innerhalb weni-ger Minuten in pH-sensitiven Mikro-titerplatten zu messen.

Screening

Ausgehend von EsjA wurden über Er-ror-prone PCR zwei Bibliotheken mitZufallsvarianten dieser Esterase her-gestellt und mittels Autodisplay ander Oberfläche von E. coli expri-miert. Das Prinzip der Error-pronePCR Reaktion besteht darin, dass dieFehlerhäufigkeit der Taq-Polymerasedurch suboptimale Reaktionsbedin-gungen, wie z. B. unterschiedlicheKonzentrationen der einzelnen Nu-kleotide, Zugabe von unnatürlichenNukleotiden oder Zumischen vonMangan, erhöht wird. Dadurchkommt es zum fehlerhaften Einbauvon Nukleotiden. In diesem Projekthat sich ein Verhältnis von dGTP/dATP von 5 und der Zusatz von 1 mMManganchlorid in den Error-pronePCR-Ansatz bewährt. Die größere derbeiden Bibliotheken enthielt 8,25 x103 Zellen mit einer durchschnittli-chen Mutationsrate von 11 Amino-säureaustauschen pro Esterasemole-kül (Tabelle 2). Insgesamt wurden8 Einzelzellklone einer komplettenSequenzanalyse im Esterasebereichunterzogen. Dabei zeigte sich, dassbestimmte Aminosäuren in mehrerenKlonen mutiert waren. Diese „HotSpots“ waren Asparagin an Position71, das in fünf Klonen jeweils durch

Asparaginsäure ausgetauscht wordenwar, Glutaminsäure an Position 175,die in sechs Klonen durch Glycin er-setzt wurde und Alanin an der Posi-tion 215, an der sich in fünf KlonenThreonin befand. In jeweils vier Klo-nen wurden die Aminosäuren Phe-nylalanin an Position 205 bzw. Histi-din an Position 334 durch Serin bzw.Leucin ersetzt. Von den acht sequen-zierten Klonen hatte keiner die glei-che Aminosäuresequenz, wobei sichdie Klone 1 bis 5 und Klon 8 am ähn-lichsten sind. Dagegen weisen dieKlone 6 und 7 Mutationen auf, die insonst keinem der analysierten Kloneauftreten. Interessant ist auch, dassim Bereich von Aminosäure 71 bis175 nur in einem der analysiertenKlone Mutationen stattgefunden hat-ten. Die Bibliothek von Esteraseva-rianten wird nun unter Einsatz derpH-sensitiven Mikrotiterplatten ei-nem Screening auf Hydrolyse vonseitens der Industrie zur Verfügunggestellten, technisch interessantenSubstraten unterzogen.

Literatur

[1] Tholey, A., Heinzle, E., Adv. Biochem.Eng. Biotechnol. 74 (2002), 1-19.

[2] Weiß, S., John, G.T., Klimant, I.,Heinzle, E., Biotechnol. Prog. 18(2002), 821-830.

[3] John, G.T., Heinzle, E., Biotechnol.Bioeng. 72 (2001), 620-627.

[4] Jose, J., Jähnig, F., Meyer, T.F. Mol.Microbiol. 18 (1995), 378-380.

[5] Maurer, J., Jose, J., Meyer, T.F., J.Bacteriol. 179 (1997), 794-804.

[6] Jose, J., Hannemann, F., Bernhardt,R., Chembiochem. 2 (2001), 695-701.

[7] Jose, J., Bernhardt, R., Hannemann,F., J. Biotechnol. 95 (2002), 257-68.

[8] Jose, J., Handel, S., Chembiochem. 4(2003), 396-405.

[9] Schultheiss, E., Paar, Ch., Schwab, H.,Jose, J., J. Mol. Cat. B: Enzymatic 18(2002) 89-97.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Elmar HeinzleTechnische BiochemieUniversität des SaarlandesGebäude 2D-66123 SaarbrückenTel.: 0681-302 29 05Fax: 0681-302 29 05eMail: e.heinzle@mx.uni-saarland.deWeb: www.uni-saarland.de/fak8/heinzleAbb. 6: Oberflächenexpression mit Hilfe des Autotransporter Sekretionsmechanismus.

Sonderband | 2003 | 63BIOKATALYSEBIOKATALYSE

DNA-CHIPS

Entwicklung einer innovativen DNA-Chip-Technologie zur industriellenHerstellung rekombinanter Proteineund zur Identifizierung vonMikroorganismen� Dipl.-Biol. Daniel G. Weber2, Dipl.-Phys. T. Injinaash3, Dr. Tino Polen1, Dipl.-Ing. K. Dembowski3, Dipl.-Biol. Andrea Veit1, Dipl.-Phys. U.Lehmann4, Dr. Ker-stin Sahm2, Dr. Volker F. Wendisch1, Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian2, Prof. Dr.-Ing Jörg Müller3, Prof. Dr. Hermann Sahm1

1Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich, 2Technische Mikrobiologie, Technische Universität Hamburg-Harburg, 3Mikrosystemtechnik,Technische Universität Hamburg-Harburg, 4SLS Micro-Technology GmbH

Ziel des Projekts ist die Etablierung und Optimierung der DNA-Chip-Technologie. Es wurden E. coli-DNA-Chips für die globale Genexpressionsanalyseetabliert und validiert. In Anwesenheit des Überflussmetaboliten Acetat zeigten die Chemotaxis- und Flagellengene erhöhte Expression. Die Expressionvon Genen, die für die Kohlenstoffquellen-Verwertung wichtig sind, waren verringert. Einige Gene der generellen Stressantwort wiesen eine erhöhte Ex-pression auf.Für die Lebensmittelindustrie wird ein Oligonukleotid-Chip zum schnellen Nachweis von mikrobiellen Populationen als Kontaminationskontrolle entwik-kelt. Von entscheidender Bedeutung ist dabei, dass der Oligonukleotid-Chip in der Lage sein wird, lebende Mikroorganismen von abgestorbenen Mikroor-ganismen (d. h. nicht teilungsfähigen) zu unterscheiden. Dies ist insbesondere in der bierbrauenden Industrie von Wichtigkeit.Um ein schnelles und Rohstoffeinsatz verminderndes Druckverfahren für DNA-Chips zu entwickeln, wurde mit Hilfe der in der Mikrosystemtechnik eta-blierten Methoden ein multifunktioneller Druckkopf und ein dazugehöriger Basis-Chip mit modifizierter Oberfläche hergestellt.

Keywords: E.coli-DNA-Chips, Genexpressionsanalyse, Oligonukleotid-Chip, Kontaminationskontrolle, Mikrosystemtechnik, Druckkopf, Basis-Chip.

ren. Die globalen Expressionsanalysengewähren neue Einblicke in globaleRegulationsvorgänge sowie neue An-sätze zur Optimierung biotechnologi-scher Prozesse. Daher wurden in derJülicher Arbeitsgruppe als erstes E.coli-DNA-Chips mithilfe eines DNA-Chip-Roboters nach dem an der Stan-ford University entwickelten Verfahren

[5] hergestellt und validiert (sieheAbbildung 1) [2,4].

Acetat verursacht globaleExpressionsveränderungenin E. coli

In E. coli kann Acetat als Kohlenstoff-und Energiequelle für das Wachstum

dienen, während andererseits hoheAcetatkonzentrationen das Wachstumdieses Bakteriums hemmen. E. coli istaber auch in der Lage, Acetat selbstzu bilden und zwar sowohl anaerobin der Gärung als auch bei ausreichen-der Sauerstoffversorgung im Über-flussmetabolismus.

Zunächst wurden die globalen Ex-pressionsmuster bei Wachstum aufAcetat bzw. auf Glucose als einzigerKohlenstoff- und Energiequelle be-stimmt. Im Vergleich zum Wachstumauf Glucose wiesen die Gene der En-zyme zur Acetat-Aktivierung, des Tri-carbonsäure-Zyklus und des Glyoxy-lat-Wegs sowie der Schlüsselenzymeder Gluconeogenese, z. B. der Phos-phoenolpyruvat-Carboxykinase, er-höhte mRNA-Spiegel bei Wachstumauf Acetat auf.

Für die Bestimmung der globalenExpressionsmuster in Anwesenheitvon Acetat wurde E. coli auf Komplex-medium unter pH-neutralen Bedin-gungen mit bzw. ohne 20 mM Acetat

GenomweiteExpressionsanalysen imModellorganismusEscherichia coli

Escherichia coli ist der bakterielleModellorganismus und wird zudem inbiotechnologischen Prozessen zurProduktion von Proteinen oder Ami-nosäuren, z. B. Insulin oder L-Phenyl-alanin, eingesetzt. Dabei kommt eshäufig zur unerwünschten Bildung vonEssigsäure, die das Wachstum hemmtund die Produktbildung verringert.Die aerobe, bei Überschuss von Koh-lenstoff- und Energiequelle stattfin-dende Acetatbildung wird als Über-flussmetabolismus bezeichnet. Mithil-fe der DNA-Chip-Technik [1,2,3] kannman den Expressionsstatus aller Geneeines Organismus gleichzeitig bestim-men [1,4]. Diese Technik ist damit ge-eignet, die für einen physiologischenZustand, wie etwa den Überflussme-tabolismus, wesentlichen Gene mitveränderter Expression zu identifizie-

Abb. 1: Hierarchische Clusteranalyse von Genen mit mindestens 2-fachveränderter Expression. Bei Vergleich des Wachstums auf den C-QuellenGlucose oder Glycerin mit dem auf Acetat, Propionat, Lactat oder Frukto-se wurden bekannte Regulationsphänomene zur Validierung der E. coli-Genom DNA-Chips nachgewiesen.

64 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

kultiviert. Bei dieser Acetatkonzentra-tion wird das Wachstum auf Komplex-medium nur geringfügig gehemmt.Unter diesen Bedingungen wurdenhauptsächlich drei Gruppen von Ge-nen mit veränderter Expression iden-tifiziert [4]. Die Gruppe der Chemo-taxis- und Flagellen-Gene sowie dieGruppe der Gene der generellenStressantwort zeigten erhöhte mRNA-Spiegel. Demgegenüber waren diemRNA-Spiegel der Gruppe der Genezur Aufnahme und Verwertung ande-rer C-Quellen als Glucose verringert.Es wurde gezeigt, dass die erhöhteExpression der Chemotaxis- und Fla-gellen-Gene phänotypisch zu erhöh-ter Mobilität von E. coli in Anwesen-heit von 20 mM Acetat führt [4]. Wei-terhin konnte durch Expressionsana-lysen gezeigt werden, dass die Zuga-be von 20 mM Natriumchlorid odervon 40 µM Carbonyl-Cyanid-3-Chlo-rophenylhydrazon (CCCP), einemEntkoppler des transmembranen pH-Gradienten, nicht zu den gleichenExpressionsveränderungen wie dieZugabe von Acetat führt. Die Genex-pressionsveränderungen durch Ace-tat beruhen also nicht auf einer ent-koppelnden Wirkung oder einer Er-höhung der Osmolarität des Medi-ums, sondern sind für Acetat spezi-fisch [4].

Bei den Genexpressionsanalysenzur Bildung von Acetat im Über-flussmetabolismus wurden Genex-pressionsveränderungen bestimmt,die bei steigender Acetatbildung auf-treten. Anhand aerober kontinuierli-cher Kulturen von E. coli wurde ge-zeigt, dass steigende Acetatbildungnur in einem sehr engen Bereich mitsteigendem Glucoseangebot korre-liert. DNA-Chip-Analysen dieser Kul-turen ergaben eine verringerte Ex-pression von Genen des Tricarbon-säure-Zyklus, des Glyoxylat-Wegs undder Atmungskette. Daher wird vorge-schlagen, dass die sich daraus erge-bende verringerte Kapazität zur Oxi-dation von Acetyl-CoA im TCA-Zyklusdie Acetatbildung unter diesen Bedin-gungen erklärt.

Einsatz einesOligonukleotid-Chips zurIdentifikation vonMikroorganismen in derbierbrauenden Industrie

Mikrobielle Kontamination ist ein be-deutender ökonomischer Faktor inder Lebensmittelproduktion. Das Vor-kommen unerwünschter Mikroorga-nismen bedeutet Qualitätsverlustoder sogar Unbrauchbarkeit des Pro-

dukts und nur nach Nachweis mikro-bieller Unbedenklichkeit für die Ge-sundheit des Verbrauchers werdenLebensmittel für den Vertrieb freige-geben. Die Tatsache, dass die etablier-ten Nachweismethoden zwei bis sie-ben Tage Zeit benötigen, führt zu lan-gen Zwischenlagerzeiten fertiger Le-bensmittel. Auch die Sensitivität istbei den angewandten Methoden einProblem.

In der bierbrauenden Industriekommt es hauptsächlich zu Konta-minationen der Gattung Lactobacil-lus. Seltener lassen sich Arten derGattungen Pediococcus, Pectinatusund Megasphaera nachweisen. BeiPectinatus sp. und Megasphaera sp.handelt es sich um anaerobe Arten,die bisher nur selten auftraten. Mitt-lerweile gewinnen sie aufgrund derangewandten Technologien aller-dings an Bedeutung. MikrobielleKontaminationen mit den Bakterien-gattungen führen zu einer Trübungund damit zu einem Qualitätsverlust.Die Mikroorganismen werden durchzeitraubende Kultivierung nachgewie-sen, eine Spezifizierung gelingt erst

durch die Polymerase-Ketten-Reakti-on (PCR). In den Brauereien wird zu-meist eine Kombination aus kultivie-rungsabhängigen und molekularbio-logischen Methoden eingesetzt, daeine Anreicherungskultur oft nochVoraussetzung für eine ausreichendeDetektionssensitivität der PCR ist [6].Ebenso sind kommerziell erhältlicheKits zum Nachweis bierkontaminie-render Bakterien auf Voranreiche-rung angewiesen. Ein weiterer Grundfür die Kombination beider Metho-den ist, dass die PCR nicht in der Lageist zwischen lebenden, d.h. teilungs-fähigen, Mikroorganismen und toten,d.h. nicht teilungsfähigen, Bakterien-zellen zu unterscheiden. Die Fragenach der Teilungsfähigkeit ist für diebierbrauende Industrie allerdingsvon besonderem Interesse, da aus-schließlich diese Organismen zu ei-ner Trübung des Biers und damit zueinem Qualitätsverlust führen. Es istdaher für die bierbrauende Industrievon entscheidender Bedeutung, einezeitsparende Nachweismethode ein-zusetzen, die es ermöglicht, lebende,teilungsfähige Organismen von den

abgestorbenen, nicht teilungsfähigenOrganismen separat zu detektierenund zu identifizieren.

Intergenic Spacer Regions(ISR) als Nachweislebender Mikroorganismen

Zur Identifikation aktiver, teilungsfä-higer Organismen eignen sich die In-tergenic Spacer Regions (ISR). Diessind Sequenzabschnitte zwischen der16S rDNA und der 23S rDNA bzw. 23SrDNA und 5S rDNA, die artspezifischsind und tRNA-codierende Gene ent-halten können(siehe Abbildung 2).

Während der RNA-Prozessierungwird bakterielle rRNA durch Spaltungaus einem gemeinsamen Vorläufer(prä-rRNA) freigesetzt. Die relevantenrrn-Gene der prä-rRNA liegen in derAnordnung 16S-23S-5S vor. Das Ope-ron wird in einer einzigen prä-rRNAtranskribiert, aus der die reifen rRNA-Moleküle (16S, 23S, 5S), ebenso wiedie tRNAs, durch Spaltung freigesetztwerden. Die übrigen Bereiche der In-tergenic Spacer Regions werden zuNukleotiden abgebaut. Dieser Abbaufindet ebenso nach dem Absterben derMikroorganismen statt. Da es in totenZellen zu keiner Transkription mehrkommt, sind vier Stunden nach demZelltod die Intergenic Spacer Regionsnicht mehr nachweisbar. Im Gegen-satz dazu lassen sich die 16S rDNA unddie 23S rDNA noch Tage nach demZelltod nachweisen [8]. Somit stellendie Intergenic Spacer Regions eine op-timale Möglichkeit zum Spezies-spe-zifischen Nachweis von lebenden, d.h.teilungsfähigen Organismen dar. Eineeindeutige Identifizierung der Mikro-organismen anhand der IntergenicSpacer Regions wird so ermöglicht[9].

Entwicklung desOligonukleotid-Chips

Oligonukleotid-Chips bieten die Mög-lichkeit, das Vorkommen einer gro-ßen Anzahl von Nukleinsäuresequen-zen auf kleinsten Raum schnell undzuverlässig zu bestimmen.

Zum Nachweis aktiver, teilungsfä-higer Organismen wird in der Tech-nischen Mikrobiologie der TU Ham-burg-Harburg ein Oligonukleotid-Chip-System entwickelt, das die rele-vanten bierkontaminierenden neunaeroben Stämme der Gattungen Lac-tobacillus und Pediococcus, sowiedie drei anaeroben Stämme der Gat-tungen Megasphaera und Pectinatusanhand ihrer 16S rRNA und ihrer In-tergenic Spacer Regions identifiziert.

Abb. 2: Lage und Aufbau der Intergenic Spacer Region im rrn Operon. Beiden Sequenzen TCTA und GGT handelt es sich um die 3´- und 5´- Endender Intergenic Spacer Regions [7].

Abb. 3: Signalintensitäten des Oligonukleotid-Chip Basissystems. EineSäule repräsentiert den Mittelwert der Fluoreszenzsignalintensitäten von16 benachbarten Spots.

Sonderband | 2003 | 65BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Zu diesem Zweck werden spezifi-sche Sonden entwickelt, die auf dasvorhandene Oligonukleotid-Chip Ba-sissystem übertragen werden. Das ent-wickelte Basissystem ist gekennzeich-net durch hohe Signalintensitäten, eingeringes Backgroundsignal und einehohe Spezifität (siehe Abbildung 3),das eine Diskriminierung von einereinzigen Basenfehlpaarung ermöglicht.

Am Ende der Entwicklung steht einOligonukleotid-Chip, der einen kom-binierten Nachweis von 16S rRNA undISR RNA erlaubt, um so einen Spezies-spezifischen Nachweis zu erhalten, derAngaben zur Teilungsfähigkeit der de-tektierten Mikroorganismen ermög-licht.

Thermopneumatischbetriebenes DNA-ChipDruckkopfsystem inMikrosystemtechnologie

FunktionsweiseUm ein schnelles und Rohstoffeinsatz-verminderndes Druckverfahren fürDNA-Chips zu entwickeln, wurde mitHilfe der in der Mikrosystemtechniketablierten Methoden ein multifunk-tioneller Druckkopf und ein dazuge-höriger Basis-Chip mit modifizierterOberfläche hergestellt.

Der Druckkopf kann als in zweiFluidnetzwerke unterteilt angesehenwerden, die durch eine Anordnungvon Membranen in einer Silizium-schicht voneinander getrennt sind(siehe Abbildung 4). Eines der Netz-werksysteme besteht aus den Fluidik-kanälen, getrennten Reservoiran-schlüssen für unterschiedliche Medi-en sowie den Austrittdüsen und dientzur Förderung der auf den Basis-Chipaufzubringenden DNA-Suspension.Der andere Fluidiknetz ist ein isolier-tes System von Fluidikkanälen, Heize-lementen und elektrischen Anschlüs-sen, das mit einer Aktuatorflüssigkeitgefüllt wird (siehe Abbildung 5).

Es wird der thermopneumatischeEffekt genutzt, um die Aktuatorflüssig-keit zur Expansion zu bringen unddadurch eine Auslenkung der in Sili-zium strukturierten Membran zu be-wirken. Die Membranauslenkung ver-ursacht den Austritt der Mediumtrop-fen an den Düsen. Als Steuersignal fürdie Heizelemente wird eine statischeSpannung mit einem Rechtecksignalüberlagert. Der Pegel der DC-Span-nung wird so eingestellt, dass die Tem-peratur der Aktuatorflüssigkeit in derUmgebung der Heizelemente unmit-telbar unter der Verdampfungstempe-ratur gehalten wird. Der Rechteckim-puls löst den eigentlichen Vorgang des

Entstehens von Verdampfungsblasenund folglich auch die Membranaus-lenkung aus. Die dadurch an den Dü-sen entstehenden Tropfen werdendurch Berührung mit der Basis-ChipOberfläche auf den Glas-Chip abge-setzt. Ein Vorteil dieses Aktuator-Prin-zips liegt in der Möglichkeit einer ho-mogenen Integration der Aktuatorele-mente in das Fluidiknetz durch Struk-turierungs- und Beschichtungsprozes-se der Mikrosystemtechnik, wie Pho-tolithographie, plasmaunterstützte Ätz-und die Kathodenzerstäubungsprozes-se für die Heizmaterialien in situ.

Eigenschaften undCharakteristiken desDrucksystems

Die Abscheidung einer teflonartigenSchicht [10] als plasmapolymerisier-ter Phase wird verwendet, um einehydrophobe Filmoberfläche herzustel-len, die sich mit Hilfe des Photolitho-graphieprozesses strukturieren lässt.Die Langzeitstabilität und dadurchauch die sicheren Haftungseigenschaf-ten der Teflonschicht auf diversenOberflächen werden mittels eines imPECVD Verfahren abgeschiedenen he-xamethylhaltigen Zwischenfilms er-reicht. Durch die teflonartige Schichtkann auf dem Basis-Chip eine matrix-förmige Anordnung der hydrophobenund hydrophilen Bereiche realisiertwerden, die eine genaue Lokalisierungder abgesetzten Tropfen bewirkt. DieKontaktwinkelmessungen auf derChip-Oberfläche mit destilliertemWasser als Medium liefern Werte vonüber 108° für die Teflonschicht.

Die auf Kapillarwirkung beruhen-de Düsenstruktur in der Silizium-schicht wurde durch eine plasmaun-terstützte Ätztechnik mit Hilfe von SF

6,

CHF3 und O

2 Gasen realisiert [11]. Um

einen übersprechfreien und einge-grenzten Tropfenaustritt zu gewährlei-sten, wird der Ausgangsbereich derDüsen mit dem hydrophoben Teflon-film beschichtet.

In den Fluidikkanälen zwischen deneinzelnen Aktuatorkavitäten befindensich mehrere Flusswiderstände in

Form von Verjüngungsbereichen. Die-se dienen als Dämpfung für eineDruckwellenübertragung zwischenden Aktuatormembranen. Die Kanäleim Silizium werden mithilfe des plas-maunterstützten isotropen Ätzprozes-ses in einer SF

6-Gas-Atmosphäre mit

einer Photolackmaskierung struktu-riert. Die Strukturierung der Aktua-

und Leiterbahnen, unterschiedlicheGeometrien. Die zweite Möglichkeitwurde in diesem System gewählt, dadafür die Anzahl an Herstellungs-schritten reduziert ist. Pyrex dient alsSubstrat für die Heizdrähte, um dieoptische Ausrichtung beim anodi-schen Bonden auf dem Siliziumsub-strat zu erleichtern.

Die Heizdrähte werden in einer imKathodenzerstäubungsprozess span-nungsfrei abgeschiedenen Chrom-Pla-tin-Wolfram Schicht strukturiert. Wolf-ram dient als Opferschicht, die alsMaskierung dient und im letzten Her-stellungsschritt der Heizelemente ent-fernt wird. Chrom dient als eine Haft-schicht zwischen Pyrex-Oberflächeund Platinschicht und wurde wegenseiner Diffusionseigenschaften ge-wählt. Die Hauptkriterien für den Wahlvon in einem Sputterprozess abge-schiedenen Platin für die Heizelemen-te waren Langzeitstabilität und chemi-sche Beständigkeit über dem ganzenBetriebstemperatur-Bereich. DieSchichtdicken betragen 50 nm fürChrom und bis 200 nm für Platin. DieLänge der Heizstrecke variiert zwi-schen 70 µm bis 300 µm. Die gering-ste Wert Breite der Mikroheizdrähtebeträgt 4 µm. Die Werte für die Be-triebsleistung der Heizelemente liegenzurzeit im Bereich von 10-15 mW. Derelektrische Widerstand eines Platin/Chrom Heizelementes mit Abmessun-gen 5 µm x 70 µm bzw. 9 µm x300 µm (siehe Abbildung 6) liegt bei100 Ohm [12].

Abb. 4: Schema des Druckkopfsystems.

tormembran erfolgt durch anisotropesnasschemisches Ätzen entlang der 111-Kristallebene des Siliziumsubstrats ineiner Kaliumlauge-Lösung. Die Trans-portkanäle und das Reservoir in derPyrexschicht werden durch einen iso-tropen Ätzprozess in einer hochpro-zentigen HF-Lösung strukturiert. AlsMaskenmaterial dienen für die verwen-deten Silizium- und Pyrex-ÄtzverfahrenPolysilizium und Siliziumnitrid, die imNiederdruck- bzw. plasmaunterstütz-ten Abscheideverfahren (LPCVD,PECVD) hergestellt werden. Die struk-turierten Substrate werden schließlichdurch anodisches Bonden bei 350°Cund bis 900 V Spannung verbunden.Um die Siliziumwafer miteinanderdurch das feldunterstützte Bondverfah-ren zu verbinden, wird als Zwischen-schicht eine in einem Kathodenzerstäu-bungsprozess abgeschiedene Pyrex-schicht verwendet.

Verschiedene Strukturen könnenals Heizelemente gewählt werden. Ih-nen ist gemeinsam, dass der elektri-sche Widerstand der Heizfläche grö-ßer ist als der der Leiterbahnen. Al-ternativ können unterschiedliche Ma-terialien gewählt werden oder, beigleichem Material von Heizelementen

Abb. 5: Draufsicht auf den Aktua-tor-Array mit den Fluidikkanälenfür die Aktuatorflüssigkeit, Mem-branen und Heizelementen.

Abb. 6: Foto einer Dampfblasezwischen der quadratischen Ak-tuatormembran und dem Heizele-ment mit Abmessungen 9 µm x300 µm.

Es wurde untersucht, inwieweitsich ein Standard-Tintenstrahldruk-ker für den Einsatz zum Drucken aufeinem Objektträger auf Basis des ent-wickelten Druckkopfsystems eignet.Hierfür wurde ein HP-DeskJet 500mit einer Auflösung von 300 dpi ver-wendet. Für die Positionssteuerungdes Druckkopf-Chips wurde ein Pro-gramm in der ProgrammierspracheQuick BASIC geschrieben und eineDruck-Testreihe auf einem Objektträ-

66 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

ger durchgeführt. Den Ausdruckenwar zu entnehmen, dass die Genauig-keit der Positionssteuerung für dieVerwendung mit dem eigenen Druck-kopf ausreichend ist. Für die elektro-nische Ansteuerung des Druckkopfdü-sen wurden die Signale direkt von derSteuerungsplatine des Druckers überangelötete Stiftleisten abgenommen.Ein solcher Drucker eignet sich auf-grund seiner Präzision hervorragendfür die Positionssteuerung des spezi-ellen Druckkopfs. Für den Druck aufeinem oder auch gleichzeitig mehre-ren Objektträgern ist die Mechanikdes Druckers noch geeignet zu verän-dern. Hierzu gehören insbesondereder Ersatz des Papiereinzugs durcheinen Vorschub in Y-Richtung und dieAnpassung des Druckabstandes zumMedium. Mithilfe eines einfachen PC-Programms lassen sich dann unmit-

telbar die geeigneten Positionen an-steuern.

Prinzipiell ist auch die Verwendungder Druckkopfsteuerung für die Aus-gabe der Flüssigkeiten möglich. Da dieelektrischen Eigenschaften der Druck-kopfsteuerung bekannt sind, wird ge-genwärtig ein (analoges) Interfacezwischen der vorhandenen Elektronikund dem neuen Druckkopf entwickelt,sodass dadurch von der Drucker- bzw.Software-Seite keinerlei Veränderun-gen gegenüber einem üblichen Druck-vorgang notwendig sind. Lediglich imAnwender-Programm selbst sind ent-sprechende Anpassungen (Positionen,Druckzeichen etc.) vorzunehmen.

Referenzen

[1] Wendisch, V.F., J. Biotechnol. 104(2003), 273-285.

[2] Polen, T., Wendisch, V.F. (2003)Appl. Biochem. Biotechnol. (2003) inpress.

[3] Wendisch, V.F., Zimmer, D.P., Kho-dursky, A.B., Peter, B.J., Cozzarelli,N., Kustu, S., Analytical Biochemistry290 (2001), 205-213.

[4] Polen, T., Rittmann, D., Wendisch,V.F., Sahm H., Appl. Environ. Micro-biol. 69 (2003), 1759-1774.

[5] Khodursky, A.B., Bernstein, J.A.,Peter, B.J., Rhodius, V., Wendisch,V.F., Zimmer D.P. Methods Mol. Biol.224 (2003), 61-78.

[6] Loch-Ahring, S., 21. Kölner Brauer-tag der VLB Berlin (15.5.2002).

[7] Loughney, K., Lund, E., Dahlberg, J.E., Nucleic Acids Res. 10 (1982),1607-1624.

[8] Schmid, M., Schmitz-Esser, S., Jet-ten, M., Wagner, M., Environ. Micro-biol 3 (2001), 450-459.

WIRKSTOFFSCREENING

Entwicklung von innovativenMikrotiterplattenreaktoren zurBewertung des Abbaus und derToxizität neuer Wirkstoffe auf Basisvon Mikrosomen und Säugerzellen� Prof. Dr. Elmar Heinzle1, M.Technol. Rahul Ravi Deshpande1, Dr. Udo Bock2, Dr. Gernot John3, Dr. Christian Krause3, Dr. Günther Müller4, Dr. Harald Wal-tenberger4, Dr. Ruth Maas5, 1 Technische Biochemie, Universität des Saarlandes, 2 Across Barriers GmbH, Saarbrücken, 3 PreSens GmbH, Regensburg, 4

MicroCoat Biotechnologie GmbH, Bernried, 5 Pharmacelsus GmbH, Saarbrücken

Es werden neue Methoden zur Testung von Wirkstoffen erarbeitet, bei denen 96er-Mikrotiterplatten zur Messung der Sauerstoffaufnahmerate eingesetztwerden. Die neu entwickelten Sensorplatten sollen somit helfen, das Screening von neuen Wirkstoffen schneller und kostengünstiger zu gestalten.

Keywords: 96-Well-Mikrotiterplatten-Reaktoren, Sauerstoff-Optosensor, Hepatocyten, Cytochrom P450.

Die Einführung neuer Wirkstoffe undChemikalien setzt neben den Tests fürdie angestrebte biologische Wirksam-keit umfangreiche Tests des Abbaus,z. B. in der Leber, der Toxizität immenschlichen Organismus und derÖkotoxizität voraus. Diese Tests sindkostspielig und involvieren in vielenFällen Tierversuche. Daneben gibt es

kaum Methoden kostengünstig dasSpektrum der Nebenwirkungen immenschlichen Metabolismus breit zuuntersuchen. In diesem Projekt werdenneue, effektive Screening-Methoden zurBestimmung der Aktivität und des Ab-baus von Wirkstoffen und Chemikali-en und zur Bestimmung metabolischerAktivitäten von Säugerzellen erarbeitet.

Dies geschieht unter Einbeziehung vonneu zu entwickelnden Mikrotiterplat-ten mit integrierter Sauerstoff-Messung.Zur Erreichung des Ziels arbeiten vierkleinere Unternehmen mit einer uni-versitären Forschungsgruppe zusam-men.

Die Firmen PreSens und MicroCoatentwickeln und produzieren Beschich-

tungen für Mikrotiterplatten für dieOnline zu beobachtenden Zellkultu-ren. Für die Zellkultivierung müssenneue Sensoren für Flachbodenplattenmit integrierter Sauerstoffmessungentwickelt werden. Diese müssen be-sonderen Anforderungen hinsichtlichHaftung, Langzeitstabilität und Quer-empfindlichkeit genügen. Für primä-

[9] Gürtler, V., Stanisich, V.A., Microbio-logy 142 (1996), 3-16.

[10] Mex, L., Müller, J., Membrane Tech-nology 115 (1999),5-9.

[11] Krusemark, O., Feustel, A., Müller, J.,µTAS’98 (1999), 399-402.

[12] Injinaash, T., Müller, J., ProceedingsSensor 2003: 11th InternationalConference Sensor, Nürnberg(2003), 375-379.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Jörg MüllerMikrosystemtechnikTU Hamburg-HarburgD-21073 HamburgTel.: 040-428 783 029Fax: 040-428 782 396eMail: j.mueller@tuhh.deWeb: www.tu-harburg.de/mst/deutsch/index.shtml

Sonderband | 2003 | 67BIOKATALYSEBIOKATALYSE

re Zellkulturen müssen diese zusätz-lich mit einer zellkompatiblen Schichtversehen werden (Abbildung 1). Plat-ten dieser Art wurden neu konzipiertund werden derzeit entwickelt. Dabeiwerden geeignete Kombinationen vonFarbstoffen und geeignete Verfahrender Sensoraufbringung erarbeitet.

Die Firmen AcrossBarriers undPharmacelsus entwickeln unter zu Hil-fenahme der entwickelten Mikrotiter-platten und unter Benutzung neu ent-wickelter Methoden der quantitativenAuswertung und Analyse neue Verfah-ren zum Testen des Abbaus von Phar-mazeutika und der Vitalität von Pri-märzelllinien. Es werden Mikrosomenmit den entsprechenden P-450-Cyto-chromen der Leber zur Bestimmungder Kinetik des Abbaus von Wirkstof-fen und Chemikalien eingesetzt. DieAnalyse der Substanzen soll durch dieBestimmung der Sauerstoffver-brauchsrate abgelöst werden. Da-durch können der Durchsatz erhöhtund Kosten und Materialverbraucherheblich reduziert werden.

In einem zweiten Einsatzgebiet wirdmit ganzen Zellen der Abbau vonWirkstoffen untersucht. Im in vitro

Abb. 1: Flachboden-Mikrotiterplatte mit integrierter optischer Sauerstoff-messung und zellkompatibler Beschichtung.

Bereich werden in der letzten Zeit vorallem isolierte Rattenhepatozyten alsModell zur Identifizierung und Cha-rakterisierung pharmakologischerMetabolite von Arzneistoffen verwen-det. Die Lebensfähigkeit und die me-tabolische Aktivität sollen mit Hilfeeiner Sauerstoffplatte durch die Be-stimmung der Sauerstoffaufnahmerateüberprüft werden. Während des Ab-baus von Arzneistoffen soll die Aktivi-tät der Zellen auf die gleiche Weisegemessen werden. Die ArbeitsgruppeTechnische Biochemie der Universi-

tät des Saarlandes entwickelt neueMethoden zur Quantifizierung von Re-spirationsraten in suspendierten undadhärenten Zellkulturen. Dabei wer-den mathematische Modelle entwik-kelt und eingesetzt, die Stofftransport,Respiration und andere metabolischeAktivitäten beschreiben. Es werdenzwei Arten von respiratorischen Mes-sungen in Mikrotiterplatten durchge-führt. Die eine beruht auf einer konti-nuierlichen stationären Messung,während bei der anderen die Dyna-mik der Änderung der Sauerstoffkon-

zentration bedingt durch den Stoff-transport und die biologische Aktivi-tät zur Bestimmung der Sauerstoffauf-nahmerate verwendet wird. Die Vali-dierung der Methode geschieht durchVergleiche mit Kultivierungen in Bio-reaktoren. Dies geschieht vornehm-lich mit CHO Zellen, die auf einem de-finierten Medium wachsen können.Später folgt eine Validierung mit be-kannten Wirkstoffen. Mit einer robu-sten adhärenten BHK-Zelllinie werdendie Methoden der Sauerstoffmessungmit adhärenten Zellen erarbeitet undgetestet. Diese Methoden werden ineiner späteren Phase des Projektsauch auf Hepatozyten angewendet.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Elmar HeinzleUniversität des SaarlandesTechnische BiochemieGebäude 2D-66123 SaarbrückenTel.: 0681-302 29 05Fax: 0681-302 29 05eMail: e.heinzle@mx.uni-saarland.deWeb: www.uni-saarland.de/fak8/heinzle

Schüttelkolben undenkbar. Der Ef-fekt unterschiedlicher Medienkom-ponenten ist relativ, und daher ist dasbeste Medium oder der beste Stammin der Schüttelkultur auch die besteOption für den Rührkessel“ (Abb. 1).Derartige Aussagen finden sich häu-

figer in der Literatur [2]. Diese Hal-tung ist eher von der Hoffnung ge-prägt als von einer detaillierten Ana-lyse der tatsächlichen Verhältnisse.Eine quantitative Änderung des Ni-veaus der Produktkonzentrationoder -ausbeute wird allgemein erwar-

tet. Es gibt allerdings genügend Bei-spiele, bei denen sich auch die qua-litative Rangfolge von Stämmen oderMedien beim Wechsel von Reaktor,Betriebsweise oder Maßstab ändert.Dafür gibt es mindestens drei Grün-de:

Unterschiede vonPrimärscreening zurProduktion

„Aufgrund der sehr hohen Anzahl anEinzelexperimenten ist eine Stamm-oder Medienoptimierung ohne

BIOVERFAHRENSTECHNIK

Primärscreening von Mikroorganismenunter Fed-Batch-Bedingungen� Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs1, Dipl.-Ing. (FH) Markus Jeude1, Priv. Doz. Dr. rer. nat. Doris Klee2, Dipl.-Chem. Barbara Dittrich2, Dr.-Ing. Tibor Anderlei31Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, RWTH Aachen, 2Lehrstuhl für Textilchemie und Makromolekulare Chemie, RWTH Aachen, 3AC Biotec, in Jülich

In der modernen Fermentationstechnik werden zunehmend Biotransformationen in der Fed-Batch-Betriebsweise durchgeführt. Diese nicht-kontinuierli-che Betriebsweise wird aufgrund der Tatsache benötigt, dass ausbeuteminimierende Stoffwechselphänomene in einer Batch-Prozessführung nicht kon-trolliert werden können. Der Fed-Batch-Betrieb ermöglicht in vielen Fermentationsprozessen eine optimale Ausbeute an Biomasse und/oder Produkt. ZuBeginn einer Bioprozessentwicklung steht das Primärscreening mit der Suche und Generierung geeigneter Produktionsstämme und -medien. Da diestatistische Wahrscheinlichkeit gute oder verbesserte Stämme und Medien zu finden relativ gering ist, müssen sehr viele Experimente durchgeführt wer-den. Der Aufwand für jede einzelne Kultur muss daher so gering wie möglich gehalten werden. Um den erforderlichen hohen Durchsatz zu erreichen,werden im Primärscreening ausschließlich Schüttelreaktoren verwendet. Grundsätzlich werden die Schüttelreaktoren im Batch betrieben, wohingegendie Produktionsprozesse unter Fed-Batch-Bedingungen laufen. Eine fehlerhafte Auswahl von Stämmen und Medien im Primärscreening aufgrund einesungeeigneten Testsystems wirkt sich auf die gesamte folgende Prozessentwicklung aus und kann in der Regel nicht mehr kompensiert werden [1].

Keywords: Primärscreening, Fermentationstechnik, Prozessentwicklung, Fed-Batch; Schüttelreaktoren, Bioverfahrenstechnik.

68 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Durch mangelndes verfahrenstech-nisches Wissen über Schüttelreaktoren[1,3] und der Tatsache, dass bisherkeine online Messtechniken für Schüt-telreaktoren existierten, werden diesehäufig unbewusst unter Sauerstofflimi-tierung betrieben. Es ist inzwischenunbestritten, dass sich eine Sauerstoff-limitierung nicht nur quantitativ in derbiologischen Aktivität der Kulturen nie-derschlägt, sondern sich auch qualita-tiv auf die Auswahl der Stämme und derMedienzusammensetzungen auswirkt[1,6]. Das Wissen über die verfahrens-technischen Grundlagen des Stofftrans-fers in Schüttelreaktoren hat in den letz-ten Jahren allerdings enorm zugenom-men [4]. Durch die am Lehrstuhl fürBioverfahrenstechnik der RWTHAachen neu entwickelte Technik zurOnline-Bestimmung der Atmungsratenin Schüttelreaktoren (Handelsname:RAMOS) kann nun die biologische Ak-tivität der Mikroorganismen währendder Kultur verfolgt werden und es las-sen sich Sauerstofflimitierungen meistzweifelsfrei identifizieren [5]. Die Fra-ge der Sauerstoffversorgung der Mikro-organismen stellt daher bei richtigerHandhabung kein grundsätzliches Pro-blem bei der Übertragung von Ergeb-nissen aus Schüttelreaktoren in gerühr-te Fermenter dar.

Bei Schüttelreaktoren kann der pH-Wert nicht reguliert werden. Bei biolo-gischen Kulturen, die aufgrund ihrerspezifischen Stoffwechselaktivität zu ei-ner starken Veränderung des pH-Wertsneigen, sind suboptimale Verhältnissedie Folge. Die Effekte lassen sich durchZugabe von pH-Puffern zwar vermin-dern, diese Zugaben erhöhen aller-dings den osmotischen Druck, woraufdie Mikroorganismen mehr oder min-der empfindlich durch eine Verlänge-rung der lag-Phase und Reduktion derWachstumsrate reagieren können. InpH-geregelten Fermentern kann dage-gen der pH-Wert immer im optimalenBereich gehalten werden, und eskommt zu niedrigen osmotischenDrücken. Durch richtige Wahl einesPuffers, dessen Konzentration und An-fangs-pH-Wert lassen sich die Proble-me aber meist minimieren.

Als gravierendster qualitativer Unter-schied zwischen dem Primärscreeningund der Produktion ist die Betriebswei-se der verwendeten Reaktoren anzuse-hen. Durch die Entwicklung einer neu-en Nachfütterungstechnik, um diesenUnterschied zu eliminieren, soll bereitsbeim Primärscreening im Schüttelre-aktor unter ähnlichen Bedingungen(„Fed-Batch“) gearbeitet werden wiein der späteren Produktion. Besonde-rer Bedarf an einem hoch parallelisier-

ten geschüttelten Screeningsystem mitprozesshinreichender Betriebsweiseliegt in folgenden Bereichen vor:– Screening von Naturisolaten oderStammbanken auf neue Aktivitäten,– Screening von DNA-Mutanten, diedurch evolutive Techniken (z.B. errorprone PCR) erzeugt wurden,– Stammentwicklung durch konven-tionelle Mutagenese,– Entwicklung rekombinanter Stäm-me, bei denen das Fremdgen ins Chro-mosom integriert wird,– Medienentwicklung,– Expression von synthetischen cDNA-Banken,– Expression von DNA-Fragmentennicht kultivierbarer Mikroorganismen.

Auswirkungen der Batch-und Fed-Batch-Betriebsweise auf denMetabolismus vonMikroorgansimen

Der qualitative Unterschied zwischenBatch- und Fed-Batch-Betriebsweisewirkt sich auf Mikroorganismen phy-siologisch ganz unterschiedlich aus.Das ist ganz besonders ausgeprägt,wenn die Systeme folgende mikrobiel-le Eigenschaften aufweisen:

SpezifischeSubstratüberschussinhibierungUm die Kosten der Aufarbeitung zuminimieren, versucht man in der in-dustriellen Fermentation das Produktam Ende des Prozesses so hoch wiemöglich zu konzentrieren. Wird des-wegen eine hohe Anfangssubstratkon-zentration wie beim Batch-Prozess ein-gestellt, folgt daraus häufig eine Inhi-bierung des produktbildenden Stoff-wechselwegs [7].

Unspezifische Inhibierungaufgrund niedrigerWasseraktivität bzw. hohenosmotischen DrucksIm Batch werden alle Substrate mithoher Anfangskonzentration zur Ver-fügung gestellt. Dadurch kann es zu

Inhibierungen aufgrund niedrigerWasseraktivität bzw. hohen osmoti-schen Drucks kommen.

Overflow-MetabolismusHäufig wird bei hohem Substratan-gebot z.B. von Glucose im Batch-Be-trieb nach dem Einschleusen in denMikroorganismus eine nicht-voll-ständige Oxidation durchgeführt. Eskommt daher zur Bildung und Aus-scheidung von anaeroben Stoffwech-selprodukten wie z.B. Lactat, Acetat,Ethanol etc. Bekannte Mikroorganis-men dieser Klasse sind Saccharo-myces cerevisiae oder Escherichiacoli.

KatabolitreprimierteProduktbildungMit diesem Begriff werden Phänome-ne mechanistisch umschrieben, beidenen die Synthese der für die Pro-duktbildung notwendigen Enzyme

Mikroorganismen mit intakter Regu-lation der Expressionssysteme imBatch praktisch kein Produkt. Erstwenn die reprimierende Kohlenstoff-quelle fast aufgebraucht ist, wird dieKatabolitrepression aufgehoben. Diedann noch vorhandene geringe Men-ge an Kohlenstoffquelle kann im Ge-gensatz zum Fed-Batch-Betrieb zukeinen nennenswerten Produktmen-gen mehr umgewandelt werden.Durch ein im Batch durchgeführtesScreening werden lediglich jene Mi-kroorganismen mit defekter Regula-tion gefunden, die z.B. einen „leaky-Promotor“ aufweisen. Das konntez.B. bei der Hefe Hansenula poly-morpha explizit gezeigt werden. So-mit läuft die Expression bei diesenMikroorganismen schon bei relativhohen, normalerweise reprimieren-den Substratkonzentrationen odersogar konstitutiv ab, was uner-wünscht ist.

Abb. 1: Illustration der Problematik beim Wechsel von Bioreaktor, Betriebsweise und Maßstab.

bei hohen Konzentrationen z.B. derKohlenstoffquelle unterdrückt ist.Erst bei Unterschreiten der Dere-pressionsschwelle eines Operonswird die Enzymbildung induziert unddie Produktbildung eingeleitet. Insynthetischen Medien produzieren

SauerstofflimitierungBei besonders schnell wachsendenund sauerstoffverbrauchenden Mi-kroorganismen, wie z.B. E. coli,kann im Batch-Betrieb ab einer Bio-massekonzentration von 6-10 g/L inschikanelosen Schüttelreaktoren

Abb. 2: Fermentation der Hefe Hansenula polymorpha. Im Vergleich zumBatch mit einer Anfangssubstratkonzentration von 20 g/L konnte alterna-tiv durch Dosierung von 20 g/L Glucose im Fed-Batch-Prozess der Over-flow-Metabolismus und somit die Bildung von Ethanol und das diauxischeWachstum weitgehend unterdrückt werden.

Sonderband | 2003 | 69BIOKATALYSEBIOKATALYSE

häufig der benötigte Sauerstoff vomBioreaktor nicht mehr nachgeliefertwerden. In der Folge kommt es zueiner Ausscheidung von hemmendenanaeroben Stoffwechselnebenpro-dukten. Dadurch screent man unbe-wusst auch auf Unempfindlichkeitder Mikroorganismen gegenüberdiesen Ausscheidungsprodukten. Alsindustriell relevante Mikroorganis-men sind hier z.B. Corynebacteri-um glutamicum oder Pichia stipi-dis zu nennen.

In allen oben aufgeführten Fäl-len bringt eine Fed-Batch-Betriebs-

weise in der Produktion grundsätz-liche Vorteile, die in einem Scree-ning im Batch nicht nachgestelltwerden können. Abbildung 2 zeigtals Beispiel Ergebnisse von erstenVorarbeiten. Während die Batch-Kultur durch Overflow-Metabolis-mus Ethanol als Zwischenproduktbildet und später (14-17 h) wiederverbraucht (Diauxie), zeigt die imFed-Batch betriebene Kultur deut-lich eine einphasige metabolischeAktivität mit anschließender At-mung auf erhöhtem Niveau (Fed-Batch-Phase).

Literatur

[1] Büchs, J., Biochem. Eng. J. 7 (2001),135-141.

[2] Kennedy, M.J., Reader, S.L., Davies,R.J., Rhoades, D.A., Silby, H.W., J.Ind. Microbiol. 13 (1994), 212-216.

[3] Lockhart, W.R., Squires, R.W., Adv.Appl. Microbiol. 5 (1963), 157-187.

[4] Maier U., Büchs J., Biochem. Eng. J. 7(2001), 99-106.

[5] Anderlei T., Büchs J., Biochem. Eng. J.7, (2001)

[6] Clark, G.J., Langley, D., Bushell, M.E.,Microbiology 141 (1995) 663-669.

[7] Riesenberg D., Curr. Opin. Biotechnol.2 (1991), 380-384.

Korespondenzadresse

Prof. Dr.-Ing. Jochen BüchsRheinisch-Westfälische TechnischeHochschule (RWTH) AachenLehrstuhl für BioverfahrenstechnikWorringerweg 1D-52074 AachenTel.: 0241-802 55 46Fax: 0241-802 22 65eMail: buechs@biovt.rwth-aachen.de

BIOPHARMAZEUTIKA

Plant Made Pharmaceuticals(PMP) – Die Pflanze als Bioreaktor� PD Dr. rer. nat. Michael Kleine, Planton GmbH, Kiel

Humane antimikrobielle Peptide zählen zu einer neuen Klasse von Biopharmazeutika. Diese Peptide besitzen einen sehr effektvollen Wirkmechanismusder angeborenen Abwehr gegen Bakterien, Pilze und Viren. Die zunehmende Resistenzentwicklung verschiedener Erreger, wie sie gegenüber herkömmli-chen Antibiotika beobachtet wird, tritt bei humanen Peptiden nicht auf. Medizinisch können diese körpereigenen Proteine langfristig nur dann genutztwerden, wenn Produktionssysteme zur Verfügung stehen, die eine kostengünstige, sichere und nachhaltige Herstellung dieser Substanzen garantieren.Die PLANTON GmbH entwickelt und optimiert die Produktion von antimikrobiellen Peptiden in Kartoffelpflanzen. Die Pflanze ist der effizienteste und um-weltfreundlichste Bioreaktor der Erde: Sie nutzt das Sonnenlicht als Energie- und Kohlendioxid als Kohlenstoffquelle. Die nahezu identische Proteinbio-synthese in Mensch und Pflanze ermöglicht es, Kartoffeln als Bioreaktoren zur Erzeugung rekombinanter Biopharmazeutika zu nutzen. Das humane Ziel-protein wird in der Kartoffelpflanze produziert und in der Knolle angereichert. Das aus der Knolle isolierte rekombinante Protein kann für präklinischeund klinische Studien verwendet werden.

Keywords: Defensine, Biopharmazeutika, Kartoffel, antimikrobielle Peptide, HBD-2, Promotor-Tagging.

Eine umwelt- und ressourcenscho-nende Alternative zur Herstellung re-kombinanter Proteine in Zellkultur-systemen bietet die Produktion vonBiopharmazeutika in grünen Pflan-zen, die als autarke Bioreaktoren zurErzeugung humaner Proteine Ver-wendung finden [2].

Die PLANTON GmbH strebt diegroßtechnische Produktion einerKlasse humaner antimikrobieller Pep-tide - der Defensine - in Pflanzen an.Mit der Verwendung antimikrobiellerPeptide, die in mehrzelligen Organis-men einen evolutionär gesehen alten,aber sehr effektvollen Wirkmechanis-mus der angeborenen Abwehr gegenmikrobielle Erreger darstellen, kanneine neue Klasse antiinfektiver The-rapeutika entwickelt werden [3].

Der Markt für Antiinfektiva ist ei-ner der größten der Pharmabranchemit einem Volumen von über 23 Mrd.

US$ im Jahr 2002 (www.imshealth.com). Trotz der großen Anzahl anverschiedenen Antibiotika-Präparaten(150 FDA-genehmigte antibakteriel-le Medikamente in den USA) sind diemeisten Präparate chemisch gesehenAbkömmlinge von antimikrobiellenSubstanzen (z. B. Penicillin), die vonMikroorganismen wie Bakterien oderPilzen produziert werden. Die Wirk-samkeit dieser Substanzen in der me-dizinischen Praxis wird zunehmenddurch die Bildung resistenter Keimeeingeschränkt.

Antimikrobielle Peptide

Defensine sind Mediatoren der ange-borenen Abwehr in Mensch, Tier undPflanze [3].

In vitro Tests zeigten, dass sie anti-mikrobielle Aktivität gegen Gram-po-sitive und Gram-negative Bakterien

[5], Pilze [6], enkapsidierte Viren[7] und andere Parasiten besitzen. β-Defensine bilden dabei eine Gruppevon kationischen antimikrobiellenPeptiden mit einer Größe von 3-5kDa, die durch eine charakteristischeFaltung über Disulfidbrücken zwi-schen konservierten Cysteinen ge-kennzeichnet sind [8]. Ihre sehr ef-fiziente und stabile Wirkungsweisewird unter anderem auf die Permea-bilisierung von Zellmembranen desattackierenden Erregers zurückge-führt [9,10].

Die humanen β-Defensine HBD-2[11] und HBD-3 [12], die aus spezi-ellen menschlichen Hautzellen (Ke-ratinocyten) isoliert worden sind,weisen ein breites Wirkungsspektrumgegen humanpathogene Erreger auf.Erste biologische in vitro-Tests mitHBD-2 aus der menschlichen Hautzeigten, dass HBD-2 insbesondere

Einleitung

Rekombinante humane Proteine spie-len in zunehmendem Maße eine be-deutsame Rolle in der Diagnose undTherapie von Krankheiten. Mittlerweilebeträgt der weltweite Markt für rekom-binante Therapeutika mehr als 20 Mil-liarden (Mrd.) US$ mit jährlichenWachstumsraten von 20 bis 30 % [1].Zudem ist zu erwarten, dass im Zugeder Humangenomforschung und derdamit verbundenen Funktionsanalyseweitere menschliche Proteine isoliertwerden, die sich für den pharmazeu-tischen Einsatz verwenden lassen. Me-dizinisch gesehen können diese kör-pereigenen Proteine allerdings langfri-stig nur dann genutzt werden, wennProduktionssysteme zur Verfügung ste-hen, die eine kostengünstige, sichereund nachhaltige Herstellung biophar-mazeutischer Substanzen zulassen.

70 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

gegen Gram-negative Bakterien sowiegegen den Pilz Candida albicanswirkt. Daraus ergeben sich breite In-dikationsfelder in der Humanmedi-zin.

Die für HBD-2 und HBD-3 codie-renden Gene sind isoliert worden,sodass mit Hilfe gentechnologischerMethoden Produktionsverfahren fürbeide Peptide entwickelt werden kön-nen. Allerdings ist aufgrund ihrer an-timikrobiellen Aktivität keine effizien-te großtechnische Expression der re-kombinanten HBD-2 und HBD-3-Pep-tide in herkömmlichen mikrobiellenSystemen möglich.

Plant MadePharmaceuticals

Die Pflanze ist als photoautotropherOrganismus in der Lage, unter Aus-nutzung des Sonnenlichts, des Treib-hausgases Kohlendioxid und durchAufnahme von mineralischen Nähr-stoffen große Mengen an Biomasse,darunter auch Proteine, zu produzie-ren.

Die Pflanze bietet als Bioreaktor fürrekombinante Proteine ein energe-tisch günstiges, ressourcenschonen-des und ein im Sinne der Nachhaltig-keit umweltfreundliches Produktions-system. Angesichts des kostengünsti-gen, fast beliebig expandierbarenlandwirtschaftlichen Produktionsver-fahrens im Feldanbau, kann das ge-wünschte Humanprotein in großenMengen preisgünstig hergestellt wer-den.

Im Vergleich dazu erfordert dieKultivierung heterotropher Zellen inFermentationsanlagen einen hohenEnergieaufwand: Zum einen in Formeiner kostenintensiven „Fütterung“mit einer Kohlenstoffquelle, zum an-deren müssen die Kulturen perma-nent temperiert und belüftet werden.Darüber hinaus müssen aber auch dieAnlagen selbst aufwändig sterilisiertwerden, um eine Kultivierung der Or-ganismen überhaupt zu ermöglichen.Das pflanzliche System dagegen nutztdas Sonnenlicht als Energiequelle -lediglich für Anbau und Ernte mussEnergie aufgewendet werden. In Ta-belle 1 werden das pflanzliche, mi-krobielle und tierische System zurProduktion rekombinanter Proteinegegenübergestellt.

Neben den ökonomischen undökologischen Gesichtspunkten spre-chen viele qualitative Vorteile für denBioreaktor Pflanze zur Produktionrekombinanter Proteine, insbeson-dere solcher, die für die pharmazeu-tische Nutzung verwendet werden

sollen. Expressionssysteme in tieri-schen Zellen synthetisieren humaneProteine zwar korrekt, sind aber sehrteuer und darüber hinaus stark an-fällig gegenüber Umweltveränderun-gen, besonders wenn rekombinanteProteine im industriellen Maßstabgefertigt werden sollen [13,14]. Mi-krobielle Zellkultursysteme sinddiesbezüglich zwar stabiler, jedochoft nicht in der Lage komplexe hu-mane Proteine richtig zu synthetisie-ren und zu falten, sodass diese Mo-leküle ihre biologische Aktivität ein-büßen.

Die Kartoffel als PMP-System

Die PLANTON GmbH konnte mit derExpression eines antimikrobiellenPeptids im pflanzlichen System bereitserfolgreich zeigen, dass sich Defensi-ne grundsätzlich in Pflanzen herstel-len lassen. Als Produktionssystem wirddie Kartoffelpflanze verwendet. DieseKulturart bietet wesentliche Vorteilegegenüber anderen Arten:– Einfache Transformation und Rege-neration.– Schnelle, klonale Vermehrung.

– Kultur-und Erntebedingungen welt-weit etabliert.– Industrielle Prozessierung etabliert(Stärkeproduktion).– Ertragsorgan Kartoffelknolle lager-und transportfähig.– Große Biomassenproduktion mög-lich (>300 dt Kartoffelknollen/ha).– Keine Auskreuzungsgefahr desTransgens, da Blüten obsolet.

Darüber hinaus eignet sich das Sy-stem aus folgenden Gründen insbe-sondere für die Biopharmazeutika-Produktion:– GRAS (generally recognised assafe) – Organismus– Klonale Vermehrung, Erstellungeiner genetisch identischen Popula-tion und damit hohe homogene Pro-duktqualität gewährleistet.– Erstellung und permanente Erhal-tung einer transgenen Masterlinie(Produktionslinie) möglich.– Evtl. Einkreuzung von Fremdpol-len hat keinen Einfluss auf die Pro-duktqualität, da vegetatives Ernteor-gan (Kartoffelknolle).– Monitoring von Pflanzenviren eta-bliert.

Entwicklung hocheffizienterExpressionskassetten

Ziel der PLANTON GmbH ist es, dieExpression des pflanzlichen Produk-tionssystems um ein Vielfaches zu stei-gern und damit eine hohe Ausbeutean rekombinantem Protein zu erzie-len (30–150 mg/kg Kartoffelknollen).Des Weiteren soll die Expression und

Abb. 1: Schematische Darstellung des PMP-Prozesses.

Faktor Transgene Mikroben1 Säuger-Pflanzen zellen

Produktionskosten gering gering - mittel hochZeitaufwand2 mittel gering - mittel mittelScale up Kosten gering hoch3 hoch3

Vermehrung leicht leicht schwerProduktivität hoch mittel - hoch mittelProduktqualität hoch mittel hochund -homogenitätGlykosylierungsmuster4 abweichend keine abweichendKontaminationsrisiko nein ja5 ja6

Daten-Monitoring mittel leicht leichtEthische Bedenken existent gering existentGMP7-Konformität machbar etabliert etabliertLagerung transgenen leicht/RT mittel/-20°C schwierig/N2

Materials

1 Bakterien, Hefen; 2 Herstellung transgener Organismen;3 teure Anlagen zur Kultivierung und

Tierhaltung; 4 im Vergleich zum humanen Glykosylierungsmuster; 5 Endotoxine; 6

Humanpathogene; 7 Good Manufacturing Practice8 (aus: Entwicklung und Anwendung der

Technologieplattform „Molekulares Farming“, Strategiepapier zum BMBF Workshop,

Braunschweig, November 2001).

Tab. 1: Eigenschaften verschiedener Systeme zur Herstellung rekombi-nanter Proteine.

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Sonderband | 2003 | 71BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Einlagerung des Proteins in das Er-tragsorgan – die Kartoffelknolle – di-rigiert werden. Dazu soll eine opti-mierte Expressionskassette in einembinären Vektor entwickelt werden. Siesoll zudem eine schnelle und effizien-te Fusionierung und/oder Austauschverschiedener genetischer Elemente(wie Promotoren und andere Genele-mente) ermöglichen, um eine optima-le, individualisierte Expressionskas-sette für das jeweils zu exprimieren-de Gen zur Verfügung zu stellen.

Promotoren

Der Weg zu einem effizienten pflanz-lichen Expressionssystem führt überdie Wahl des richtigen Promotors.Promotoren bestimmen nicht nur dieExpressionsstärke eines Transkripts,sondern entscheiden auch darüber, inwelchem Gewebe und zu welchemEntwicklungszeitpunkt der Pflanze dasTranskript gebildet wird. Hierzu ste-hen PLANTON bereits verschiedenePromotoren zur Verfügung.

Um aber knollenspezifische Pro-motoren aus der Kartoffel zu isolie-ren und für die Produktion von Bio-pharmazeutika in der Pflanze einzu-setzen, wird das so genannte Promo-tor-Tagging angewendet.

Dazu werden Kartoffelpflanzen miteinem binären Vektor (pPROMTAG)transformiert, der auf seiner T-DNAein promotorloses Reportergen (GUS)besitzt. Dieses Reportergen codiert fürein Enzym, das eine Substratumset-zung zu einem blauen Farbstoff kata-lysiert. Dabei integriert die T-DNAtransformierter Pflanzen in das Kar-toffelgenom. Überall dort, wo sich dasReportergen in unmittelbarer Nähe zueinem aktiven Promotorelement be-findet, wird das Gen transkribiert unddas Enzym gebildet. Die Pflanzenor-gane, in denen das Enzym aktiv ist,werden durch die Blaufärbung sicht-bar gemacht.

Im nächsten Schritt erfolgt dann dieIsolierung und molekulare Analyseder unbekannten Promotorregionmittels inverser PCR (Abb. 2). Hierzuwird die genomische DNA der selek-tierten Linien isoliert, mit einem Re-striktionsenzym inkubiert, das einmalim Reportergen und einmal in der un-bekannten genomischen DNA schnei-det. Es folgt die Zirkularisierung derRestriktionsfragmente durch Ligationund schließlich die Amplifikation derunbekannten Region (Abb.2, hell-blaue Bereiche) durch PCR mit spe-zifischen Primern, die an die beidenbekannten flankierenden DNA-Regio-nen aus dem Reportergen binden.

schließend auf ein Co-Kultivierungs-medium übertragen.

Die durch die Inkubation der Agro-bakterien mit dem Kartoffelgewebe insPflanzengenom integrierte T-DNA ent-hält neben den Expressionkassetten zu-sätzlich einen Selektionsmarker, der dieSelektion erfolgreich transformierter,regenerierter Pflanzen ermöglicht. Nurtransgene Sprosse können auf solch ei-nem Medium wachsen.

Nach der Co-Kultivierung mit denAgrobakterien erfolgt das Übersetzender Pflanzenteile (Explantate) auf ein

weiteres Kultivierungsmedium. Nach ca.3-5 Wochen bilden sich erste Sprosse,die abgeschnitten und auf ein Spross-Elongations-Medium gesetzt werden.Nach weiteren 2-3 Wochen erfolgt derTransfer dieser Sprosse zur Bewurze-lung auf Murashige/Skoog-Medium. An-schließend werden die bewurzeltentransgenen Pflanzen zur Erstellung ein-zelner Kartoffellinien vermehrt. Von al-len Linien werden Langzeiterhaltungs-kulturen und Erdkulturen angesetzt. Zielist es, etwa 50–100 transgene Linien proExpressionskassette zu erzeugen.

Abb. 2: Promotor-Tagging aus genomischer Kartoffel-DNA.

Die so erzeugten PCR-Fragmentewerden sequenziert. Die anschließen-de Datenbank-Recherche ermöglichtes dann, die entsprechenden Promo-torbereiche in silico zu identifizieren.Alternativ dazu kann mit Hilfe der PCR-Produkte die physikalische Isolierungder Promotorregion aus genomischenBibliotheken erfolgen.

Die identifizierten und isoliertenPromotoren werden dann zur Funkti-onsanalyse vor Reportergene (GUS/GFP) ligiert und per Agrobacteriumin Kartoffeln überführt, um ihre ge-webespezifische Aktivität zu bestäti-gen.

Für die Detektion der knollenspe-zifischen Expression in der Promotor-Tagging Population wird das Mikro-knollen-System eingesetzt. Dazu wer-den die transformierten Kartoffeln aufein Medium überführt, dass dasWachstum von Mikroknollen indu-ziert. Das hat den Vorteil, dass bereits10 –12 Wochen nach der Transforma-tion die ersten Kartoffelknollen für dieweitere Analyse zur Verfügung stehen.

Das Mikroknollen-System (Abb. 3)wurde bereits erfolgreich zur Vorse-lektion transgener Pflanzen eingesetzt.Es konnte gezeigt werden, dass dasReportergen unter dem konstitutiven35S-Promotor auch in der Mikroknol-le exprimiert wird (Abb. 3A) und da-mit ein Screening der Mikroknollenmit Hilfe des GUS-Assays möglich ist.Dieses einfache Nachweisverfahrenermöglicht ein schnelles Sichten einergroßen Anzahl an transgenen Kartof-fellinien.

Transformation,Regeneration undSelektion transgenerKartoffelpflanzen

Für die Testung der neuen Expres-sionkassetten in der Kartoffel werdentransgene Pflanzen mit der Methodeder Sprosstransformation hergestellt.Hierzu werden Pflanzen unter steri-len in vitro Bedingungen vermehrtund für den Transformationsprozesseingesetzt. Die Sprosse der gewach-senen Pflanzen werden geschnittenund für die Erhaltung der Pflanzenauf ein Kulturmedium übertragensowie für die Transformation mitAgrobacterium tumefaciens ver-wendet.

Unter sterilen Bedingungen wer-den die Bakterien in einem Kultur-medium mit einem Antibiotikum vor-kultiviert. Danach erfolgt der eigent-liche Transformationsvorgang. Dafürwerden die Pflanzenteile in der Bak-teriensuspension inkubiert und an-

72 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Nach erfolgter Linienerstellung ausdem Promoter-Taggging-Ansatz mitdem pPROMTAG1-Vektor werden dieKartoffelpflanzen erneut vermehrtund auf ein Knolleninduktionsmedi-um überführt. Mit Hilfe dieses Medi-ums werden dann 10-12 Wochen spä-ter erste Mikroknollen in vitro an denKartoffelkulturen sichtbar. Diese Mi-kroknollen können dann direkt fürden GUS-Test zur Selektion von Pflan-zen, die eine knollenspezifische Blau-färbung aufweisen, herangezogenwerden.

Aufreinigungsprozess

Der PLANTON GmbH steht Gewächs-hausfläche zur Verfügung, die zur Er-zeugung von Kartoffelknollen aus trans-genem Pflanzenmaterial in Erdkulturengenutzt wird. Diese Knollen werden zurAufreinigung von rekombinantem Pro-tein verwendet. Es werden zunächstProteinmengen im mg-Bereich benö-tigt, damit reines und biologisch akti-ves ß-Defensin für die Aktivitätstests zurVerfügung steht. Nach Gewebeauf-schluss, Filtrations- und Zentrifugati-

onsschritten erfolgt die chromatogra-phische Aufreinigung. Die Reinheit desPeptids wird mittels Gelelektrophore-se und Massenspektrometrie kontrol-liert.

Biologische Aktivität derrekombinanten Peptide

Durch die Produktion von HBD-2 impflanzlichen System ist es erstmalsmöglich, β-Defensine in größerenMengen (mg-Mengen) zur Verfügungzu stellen. Mit diesem Material werdenTestverfahren entwickelt, die eine Viel-zahl von humanpathogenen Mikroor-ganismen einschließen. Neben den ein-zelnen Organismen zur Abschätzungdes Wirkungsspektrums der rekombi-nanten Peptide können aber auch ver-schiedene andere Parameter wie Salz-toleranz, Säurefestigkeit, Konzentrati-onsabhängigkeit sowie die Resistenz-entwicklung von pathogenen Erregernnach längerer Kultivierung der Orga-nismen unter Gabe von β-Defensinenintensiv untersucht werden.

Dazu sollen zunächst entsprechen-de biologische Testverfahren entwik-

kelt werden. Dabei werden die Pepti-de auf antimikrobielle Aktivität gegenverschiedene humanpathogene Erre-ger untersucht. Zunächst sind Stäm-me folgender, für die menschliche Ge-sundheit bedeutsamer Erreger, vorge-sehen:– Pseudomonas aeruginosa,– Escherichia coli,– Staphylococcus aureus,– Streptococcus pyogenes,– Candida albicans

Dieses Verfahren dient in einem er-sten Schritt zur Festlegung des Erreger-spektrums, das von den in Pflanzenproduzierten β-Defensinen erfolgreichbekämpft werden kann. Des Weiterensoll ein Mikroverdünnungstest mit o. g.Erregern eingesetzt und die „MinimalInhibitory Concentration“ (MIC) in Ab-hängigkeit von der Erreger-Konzentra-tion bestimmt werden.

Literatur

[1] Baez, J., Russell, D., Craig, J., Bio-pharm. 3 (2000).

[2] Giddings, G., Current opinion in Bio-technology 12 (2001), 450-454.

Abb. 3: Das Mikroknollen-System im GUS-Test (A) und in vitro (B).

[3] Zasloff, M., Nature 415 (2002), 389-395.

[4] Schröder, J.-M., Cell. Mol. Life Sci. 56(1999), 32 –46.

[5] Ong, P.Y., Ohtake, T., Brandt, C., Strick-land, I., Boguniewicz, M., Ganz, T.,Gallo, R.L., Leung, D.Y.M., N. Engl. J.Med. 347, 15 (2002), 1151-1159.

[6] Tran, D. Tran, P.U., Tang, Y.Q., Yuan, J.,Cole , T., Selsted, M.E., J. Biol. Chem.277 (2002) 3079-3084.

[7] Zhang, L., Yu, W. He, T., Yu, J., Caffrey,R.E., Dalmasso, E.A., Fu, S., Pham, T.Mei, J., Ho, J.J., Zhang, W., Lopez, P.,Ho, D.D., Science 298 (2002), 995-1000.

[8] Hoover, D.M., Rajashankar, K.R., Blu-menthal, R., Puri, A., Oppenheim, J.J.,Chertov, O., Lubkowski, J., J. Biol.Chem. 275 (2000) 32911-32918.

[9] Fehlbaum, P., Rao, M., Zasloff, M.,Anderson, G.M., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 97 (2000), 12723-12728.

[10] Lehrer, R.I., Ganz ,T., Ann. N. Y. Acad.Sci. 797 (1996), 228-239.

[11] Harder, J., Bartels, J., Christophers, E.,Schröder, J.-M., Nature 387 (1997),861.

[12] Harder, J., Bartels, J., Christophers, E.,Schröder, J.-M., J. Biol. Chem. 276(2001), 5707-5713.

[13] Giddings, G., Allison, G., Brooks, D.,Carter, A., Nature Biotechnology 18(2000), 1151-1155.

[14] Fischer, R., Emans, N., Transgenic Res.9 (2000), 279-299.

Korrespondenzadresse

Dr. Michael KleinePLANTON GmbHAm Kiel-Kanal 44D-24106 KielTel.: 0431-38015 0Fax: 0431-38015 11eMail: kleine@planton.de

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Sonderband | 2003 | 73BIOKATALYSEBIOKATALYSE

MYKOTOXINANALYTIK

Innovative Nachweisverfahrenfür Mykotoxine� Dr. Bernhard Reck1, Dr. Richard Dietrich2, Dr. Christine Bürk2, Björn Lauer3, Dr. Thomas Reinard3

1 R-Biopharm AG, Darmstadt, 2 Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch, LMU München, 3 LG Molekulargenetik, Universität Hannover

Mykotoxin-belastete Lebens- und Futtermittel stellen eine ernstzunehmende Gesundheitsgefährdung für Mensch und Tier dar. Eine Überwachung derSchimmelpilztoxine in unseren Nahrungsmitteln ist deshalb ein zentrales Anliegen des gesundheitlichen Verbraucherschutzes. Im Rahmen von zwei Pro-jekten werden innovative Weiterentwicklungen für den Einsatz von spezifischen Antikörpern zum Nachweis von Mykotoxinen verfolgt: Mit einem Mykoto-xin-Array sollen sechs der wichtigsten Mykotoxine in einem einfachen und schnellen immunologischen Test gleichzeitig erfasst werden. Ein Prototyp desArrays ist bereits in der Lage, Aflatoxine, Deoxynivalenol (DON), Fumonisin, T-2 Toxin und Zearalenon im jeweils relevanten Konzentrationsbereich (1 –1000 µg/kg) quantitativ zu detektieren. „Plantibodies“ gegen diverse Mykotoxine mit Bindungseigenschaften, die denen von Antikörpern ähnlich sind,werden in einem zweiten Projekt aus einer Phagenbank heraus entwickelt. Diese rekombinanten Antikörperfragmente können später in transgenenPflanzen produziert werden. So steht eine Möglichkeit zur preiswerten Herstellung von Antikörperfragmenten zur Verfügung, bei denen auf jegliche Im-munisierung und Einsatz von Tieren zur Antikörperproduktion verzichtet werden kann.

oxynivalenol (DON), das häufig inWeizen und Roggen vorkommt, undFumonisine, die fast ausschließlichin Maispflanzen nachgewiesen wur-den, und dadurch in getreidehaltigeKleinkindernahrung (Getreidebrei,Maisgries) gelangen können.

Mykotoxine sind niedermolekula-re (Molekulargewicht 300 - 500 Dal-ton) giftige Stoffwechselprodukte be-stimmter Schimmelpilze, von denenbis heute weit über 100 bekannt sind.Sie sind hitzestabil und werden durchherkömmliche Verarbeitungsprozes-se nicht abgebaut. Aufgrund ihrervielfältigen toxischen Wirkungen stel-len Mykotoxine eine große Gefahr fürdie menschliche Gesundheit sowohlhinsichtlich einer akuten als auch ei-ner chronischen Gesundheitsschädi-gung dar. Hervorzuheben sind vorallem das hohe mutagene und kan-zerogene Potenzial einiger Substan-zen. Schon in geringen Mengen sindsie für Warmblütler toxisch und kön-nen schwere, irreparable Schädigun-gen verursachen. Eine Aufnahme vonhochbelasteten Nahrungs- bzw. Fut-

termitteln in der Tierhaltung kann imExtremfall sogar zum Tod führen.Eine besonders hohe Toxizität weistAflatoxin B1 auf; sowohl hinsichtlichseiner akuten Toxizität (der 50%Wert der letalen Dosis lag im Tierex-periment bei ca. 5 mg /kg) als auchwegen der kanzerogenen Wirkung

nicillium). Die wichtigsten Vertre-ter der Mykotoxine sind in Tabelle 1zusammengefasst.

Gesetzliche Regelungen

In der Europäischen Union sind füreinzelne Mykotoxine bereits seit län-

Einleitung

Aflatoxin-belastete Pistazien, Ochra-toxin A in Rosinen, Deoxynivalenol(DON) in Weizenmehl sind nur dreiBeispiele, bei denen Mykotoxin-Be-lastungen während der letzten Mo-nate im Fokus der Gesundheitsbehör-den waren. Neben pathogenen Kei-men und Tierarzneimittelrückstän-den, wie Hormonen und Antibiotika,zählen toxische Schimmelpilzmeta-bolite zu den gesundheitsschädlich-sten Verunreinigungen in Lebensmit-teln [1].

So hat das Bundesinstitut für ge-sundheitlichen Verbraucherschutzund Veterinärmedizin (BgVV) bei-spielsweise schon am 06.07.2000 ineiner Pressemitteilung darauf hinge-wiesen, dass Kleinkindernahrung mitFusarientoxinen hoch belastet seinkann. Das BgVV forderte deshalb dieHersteller auf, die Rohwaren beimWareneingang besser zu kontrollie-ren und die Gehalte deutlich zu re-duzieren. Zu den wichtigsten Fusari-entoxinen zählen hauptsächlich De-

des Moleküls. Abbildung 1 gibt einenÜberblick über die vielfältigen ge-sundheitsschädigenden Wirkungender wichtigsten Mykotoxine.

Hinsichtlich ihrer Entstehung wirdunterschieden zwischen Mykotoxi-nen, die bereits vor der Ernte auf Ge-treide gebildet werden (Mykotoxinevon „Feldpilzen“ wie Fusarium) unddenen, die nach der Ernte aufgrundunsachgemäßer Lagerung im Ernte-gut entstehen (Mykotoxine von “La-gerpilzen” wie Aspergillus oder Pe-

gerem Höchstmengen. In der Ver-ordnung (EG) Nr. 466/2001 vom08. März 2001 zur Festsetzung derzulässigen Höchstgehalte an Konta-minanten in Lebensmitteln (Kontami-nantenverordnung) gilt für AflatoxinB1 eine Höchstmenge von 2 µg/kg,für die Summe von Aflatoxin B1, B2,G1 und G2 beträgt die Höchstmenge4 µg/kg. Dies gilt für Erdnüsse, Scha-lenfrüchte, getrocknete Früchte undGetreide, die zum direkten Verzehrbestimmt sind. Für Milch und

Abb. 1: Gesundheitsschädigende Wirkung von Mykotoxinen am Beispieleines Nutztiers.

Schimmelpilz- Mykotoxin Höchstmenge für Richtwerte fürgattung Lebensmittel FuttermittelAspergillus Aflatoxin 4 µg/kg 20 µg/kgPenicillium Ochratoxin A 3 µg/kg 20 µg/kgFusarium Deoxynivalenol 0,5 mg/kg 1 mg/kg

T-2 Toxin keine Empfehlung 0,5 mg/kgFumonisin 0,5 mg/kg 1 mg/kgZearalenon 50 µg/kg 0,5 mg/kg

Tab. 1: Schimmelpilzgattungen und deren Mykotoxine. Angabe der gesetz-lich geregelten oder von Gesundheitsbehörden empfohlenen Höchstmen-gen für Lebensmittel und der international empfohlenen Richtwerte fürFuttermittel.

74 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Milcherzeugnisse gilt ein noch stren-gerer Grenzwert: Hier darf ein Gehaltvon 0,05 µg Aflatoxin M1/kg nichtüberschritten werden. Aflatoxin M1entsteht bei Wiederkäuern nach Ver-zehr von Aflatoxin B1-haltigem Futter-mittel, und ist unter anderem in der

in Vorbereitung, in der neben Aflato-xinen und Ochratoxin A auch Höchst-gehalte für Deoxynivalenol, Fumoni-sine und Zearalenon in Lebensmittelnfestgelegt werden sollen [2].

Für Futtermittel sind die erlaubtenHöchstmengen von Aflatoxinen in der

USA, Kanada, Lateinamerika undAsien gelten. Tabelle1 gibt einenÜberblick über die für Lebensmittelgeltenden verbindlichen bzw. emp-fohlenen Höchstwerte sowie über dieRichtwerte für den Futtermittelbe-reich.

Eine enge Überwachung der My-kotoxin-Belastung unserer Lebens-und Futtermittel wird von allen ver-antwortlichen Stellen gefordert undstellt eine wichtige Aufgabe des vor-beugenden Verbraucherschutzes dar.

Nachweismethoden fürMykotoxine

Als Nachweisverfahren für Mykoto-xine stehen eine Reihe von physika-lisch-chemischen Methoden wieDünnschichtchromatographie (TLCoder HPTLC), Hochleistungsfüssig-keitschromatographie (HPLC) undGaschromatographie gekoppelt mitMassenspektrometrie (GC-MS) zurVerfügung, die zum Teil schon seitlängerem als Referenzmethoden eta-bliert sind [3,4,5]. Diese Methodenweisen in aller Regel eine hohe Emp-

findlichkeit mit niedrigen Nachweis-grenzen, bei gleichzeitig hoher Re-produzierbarkeit der Messmethodefür die einzelnen Mykotoxine bzw.Mykotoxinfamilien auf. Andererseitsbeinhalten die chromatographischenMethoden einen hohen Investitions-bedarf für die Geräte und einen gro-ßen Zeitbedarf für die einzelnen Mes-sungen. Darüber hinaus stellen diechromatographischen Methodenhohe Anforderungen an die Ausbil-dung des Laborpersonals.

Neben den klassischen Methodensind für den Nachweis der wichtig-sten Mykotoxine auf der Basis vonspezifischen Antikörpern immunolo-gische Testverfahren entwickelt wor-den, die heute kommerziell erhält-lich sind [6,7]. Außerdem wurdenauf der Basis von monoklonalen An-tikörpern Immunadsorbentien (Im-munoaffinitätssäulen, IAC) zur Iso-lierung von Mykotoxinen aus kom-plexen Lebensmitteln hergestellt, dieebenfalls kommerziell erhältlichsind. Solche IAC werden vorzugswei-se vor chromatographischen Analy-senverfahren zur Beseitigung von

Abb. 2: Molekülstrukturen von Aflatoxin B1, Deoxynivalenol (DON), Fumo-nisin B1, Ochratoxin A, T-2 Toxin und Zearalenon.

Abb. 3: Mykotoxinanalytik am Beispiel Aflatoxin. ELISAs erlauben preis-werte und schnelle Analysen zum Screenen von Aflatoxin-belasteten Pro-ben (Abbildung rechts unten), Positiv gemessene Proben werden in derRegel nach einer Aufreinigung über Immunaffinitätschromatographie mit-tels HPLC oder GC-Analyse bestätigt (Abbildung links unten).

Abb. 4: Schema eines kompetitiven Enzymimmun Assays. Grundlage einesimmunologischen Tests ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, die üblicher-weise in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte stattfindet. Die Vertiefungender Mikrotiterplattenstreifen sind mit einem Mykotoxin-spezifischen Anti-körper beschichtet. Zugegeben werden Standards bzw. Probelösung undenzymmarkiertes Mykotoxin (Enzymkonjugat). Freies und enzymmarkier-tes Mykotoxin konkurrieren um die Antikörperbindungsstellen (kompetiti-ver Enzymimmunoassay). Nicht gebundenes enzymmarkiertes Mykotoxinwird anschließend in einem Waschschritt wieder entfernt. Hinzugegebenwird Chromogen/Substrat (Tetramethylbenzidin (TMB)/Wasserstoffper-oxid), wobei infolge der Reaktion des gebundenen Enzymkonjugats dasfarblose Chromogen in ein blaues Endprodukt umgewandelt wird. DieZugabe von verdünnter Schwefelsäure als Stopp-Reagenz beendet denenzymatischen Prozess und führt zu einem Farbumschlag von blau nachgelb. Die Messung erfolgt photometrisch bei 450 nm; die Extinktion derLösung ist umgekehrt proportional zur Mykotoxin-Konzentration der Pro-be. Anhand einer Standardkurve kann graphisch manuell oder mit Hilfeeiner entsprechenden Software die Mykotoxin-Belastung einer Probe ineinfacher Weise ermittelt werden.

Milch der Tiere nachzuweisen. In dervon Deutschland umgesetzten Myko-toxin-Höchstmengenverordnung(MHmV) vom 02. Juni 1999 sind diegleichen Gehalte an Höchstmengen füralle anderen Lebensmittel geregelt.Die Höchstmengen für Ochratoxin Asind unlängst in der EU-Verordnung472/2002 vom 12. März 2002 fürGetreide mit 5 µg/kg (Rohware) und3 µg/kg (zum menschlichen Verzehrbestimmte Backwaren) festgelegt wor-den, während bei getrockneten Trau-ben die erlaubte Ochratoxin A Bela-stung auf 10 µg/kg limitiert wurde.Grenzwerte für andere Mykotoxinewerden derzeit in den entsprechendenGremien der EU-Kommission beraten;in Deutschland ist eine Neufassung derMykotoxin-Höchstmengenverordnung

Futtermittelverordnung geregelt.In Abhängigkeit von der Art des Fut-termittels und der Tiere liegen dieHöchstgehalte bei 5 bis 100 µg/kg.

Das Bundesministerium für Land-wirtschaft (BML) hat „Orientierungs-werte für Konzentrationen von De-oxynivalenol und Zearalenon im Fut-ter von Schwein, Rind und Huhn“(mg/kg Futter; bei 88 % Trockensub-stanz), bei deren Unterschreitung dieGesundheit und Leistungsfähigkeitnicht beeinträchtigt wird, veröffent-licht. Diese liegen für Deoxynivale-nol zwischen 1,0 und 5,0 mg/kg, fürZearalenon zwischen 0,05 und 0,5mg/kg.

International haben sich im Fut-termittelbereich Höchst- und Richt-werte etabliert, die vor allem in den

Sonderband | 2003 | 75BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Abb. 6: Schematische Darstellung eines Mykotoxin Arrays. Die einzelnen spezifischen monoklonalen Antikörpersind in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte nebeneinander angeordnet, während die Mykotoxin-Enzymkonjugateim Gemisch und freies, in den Proben enthaltenes Mykotoxin um die Bindungsplätze der Antikörper konkurrieren.Im dargestellten Beispiel würde für den Ochratoxin A- und den Fumonisin-Nachweis ein positives Ergebnis erhal-ten werden.

Matrixeffekten eingesetzt, die anson-sten eine korrekte Bestimmungenorm erschweren oder ganz verhin-dern würden.

Die immunologischen Tests zeich-nen sich durch eine einfache Hand-habung in der Testdurchführung undAuswertung aus, und sind vor allemgeeignet für die Bearbeitung von gro-ßen Probenzahlen. Im ELISA positivgemessene Proben werden üblicher-weise durch eine Referenzmethodewie beispielsweise HPLC bestätigt (s.Schema Mykotoxinanalytik, Abb. 3).

Grundlage eines immunologi-schen Tests ist die Antigen-Antikör-per-Reaktion, die üblicherweise aneiner Festphase, wie beispielsweisein den Kavitäten einer Mikrotiterplat-te, durchgeführt wird. Ein Mykoto-xin-spezifischer Antikörper ist ad-sorptiv an die Oberfläche einer Mi-krotiterplatte gebunden. Mykotoxinaus der Probe und Enzym-markier-tes Mykotoxin konkurrieren um dieAntikörper-Bindung. Man sprichtvom sogenannten kompetitiven En-zyme Linked Immunosorbent Assay(kompetitiver ELISA). Überschüssi-ge, nicht gebundene Reagenzien wer-den in einem Waschschritt entfernt.Chromogen wird hinzugegeben undvom gebundenen Enzym Konjugat inein gefärbtes Produkt umgewandelt.Die Messung erfolgt photometrischim Anschluß an die enzymatische Re-aktion. Mykotoxingehalte von unbe-kannten Proben werden anhand ei-ner Standardkurve ermittelt (Abb.4).

Alternativ lässt sich der ELISAdurch Kombination eines zusätzli-chen Farbstoffs und einer neutralenStopplösung visuell (ohne Photome-ter) auswerten. Damit steht ein Testzur Verfügung, der ohne apparativenAufwand und von nicht geschultemPersonal durchgeführt werden kann(Abb. 5).

Im Rahmen der von der DBU ge-förderten Projekte (13053/21 und13059) werden zwei Ansätze derWeiterentwicklung von immunologi-schen Tests verfolgt.

Mykotoxin AntikörperArray

Auf der Basis von monoklonalen An-tikörpern gegen sechs der wichtig-sten Mykotoxine sollen in einem Testgleichzeitig die Mykotoxine Aflatoxin,DON, Fumonisin, Ochratoxin A, T-2Toxin und Zearalenon in einer Le-bensmittel- bzw. Futtermittelprobeim relevanten Konzentrationsbereichdetektiert werden. Hierbei wird der

tion zwischen Antikörper und Ana-lyt. Mykotoxin einer Probe konkur-riert mit enzymmarkiertem Mykoto-xin um die Bindungsstelle am spezi-fischen Antikörper. Die einzelnen en-zymmarkierten Mykotoxine liegen ineinem an die Versuchsführung zu

tikörper auf der Mikrotiterplatte ge-bundene Enzymaktivität, die visuelloder photometrisch gemessen wird.Da es sich um eine kompetitive Re-aktion handelt, ist das Messsignalumgekehrt proportional zur Analyt-konzentration.

Im Rahmen des Projekts wurdenin Vergleichsuntersuchungen aus ver-schiedenen monoklonalen Antikör-pern und Peroxidase-Konjugaten, diezur Verfügung standen, für die My-kotoxin Array Entwicklung geeigne-te Reagenzien ausgewählt und durchTitration passende Kombinationenvon Antikörperbeschichtung und En-zymkonjugat im Detektionsgemischermittelt.

Abbildung 7 zeigt exemplarischStandardkurven für drei der in denArray implementierten Mykotoxin-Nachweisverfahren, wobei ein Ge-

Abb. 5: Beispiel einer visuellen Auswertung eines RIDASCREEN®FASTAflatoxin Tests. Teststreifen einer Mikrotiterplatte, von links nach rechts:Standard 1 (0 µg/kg), Standard 2 (1,7 µg/kg), Standard 3 (5 µg/kg), Stan-dard 4 (15 µg/kg), Standard 5 (45 µg/kg), Probe 1 (ca . 21 µg/kg), Probe 2(ca. 60 µg/kg), Probe 3 (unbelastete Probe).

optimierenden Gemisch vor („Uni-versaldetektor“). Der Mykotoxinge-halt einer Probe wird schließlichdurch Vergleich mit der Immunre-aktion bei Einsatz eines entsprechen-den Standards ermittelt. Als Maßdient die über den spezifischen An-

misch der entsprechenden enzym-markierten Mykotoxine eingesetztwurde. Die Inkubationszeit für denKompetitionsschritt (Standard + En-zymkonjugat) betrug 30 min. Mit die-sen Untersuchungen konnte gezeigtwerden, dass unter optimierten Ar-

Tab. 2: Mykotoxin Array: Untersuchungen mit einem Prototyp des Mykoto-xin Arrays mit 5 verschiedenen Mykotoxinen (vgl. Abbildung 7). Zusam-menstellung der 50% Dosis und der Messbereiche unter Berücksichtigungder Probenvorbereitung.

Mykotoxin monoklonaler Antikörper 50 % Dosis MessbereichAflatoxin 3E2 5 ppb 1 - 50 ppbDON 1H8 0,4 ppm 0,1 - 3 ppmFumonisin IC9 0,2 ppm 0,1 - 1 ppmT-2 Toxin 2E3 8 ppb 2 - 20 ppbZearalenon P8 40 ppb 10 - 100 ppb

Dies erlaubt die umfassende Beurtei-lung einer Probe hinsichtlich der Be-lastung mit den wichtigsten Mykoto-xinen in einem Schritt, während mitherkömmlichen immunologischenTestverfahren jeweils immer nur einParameter erfasst werden kann. EinSchema des Mykotoxin AntikörperArray ist in Abbildung 6 dargestellt.

Die Oberfläche der Mikrotiterplat-te stellt die feste Phase dar, auf derdie so genannte Reaktion zwischenAntikörper und Analyt statt findet. DieVertiefungen der Mikrotiterplattesind einzeln und in Reihe angeord-net (Array-Format) und mit den je-weils spezifischen Antikörpern direktbeschichtet. Das Testprinzip beruhtauf der bereits beschriebenen Reak-

Schwerpunkt der Arbeiten auf einemöglichst einheitliche und einfacheProbenaufarbeitung und eine kurzeGesamtanalysenzeit gelegt.

Der innovative Ansatz des Tests istdie simultane Erfassung von sechsMykotoxinen im gleichen Testformat.

76 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

ray-Bedingungen störende Wechsel-wirkungen zwischen den Enzymkon-jugaten nicht auftreten und somit einspezifischer und sensitiver Nachweisder Einzeltoxine möglich ist.

Tabelle 2 zeigt in einer Übersichtdie 50 % Dosis-Werte der Standard-kurven von fünf Mykotoxinen (Werteder in Abb. 7 dargestellten Standard-kurven und von zwei weiteren Myko-toxinen) sowie die korrespondieren-den Messbereiche. Die Messbereicheberücksichtigen bereits die Proben-vorbereitung mit einem Verdün-nungsfaktor von 10. Die Standardkur-ve für Aflatoxin weist hierbei die nied-rigste Nachweisgrenze mit etwa 1 µg/kg auf. Die kalkulierten Messberei-che für die dargestellten Mykotoxinebefinden sich in den relevanten Kon-zentrationsbereichen, die durch EURegulierungen bzw. Richtlinien fest-gelegt sind. Für Ochratoxin A liegtderzeit keine geeignete Kombinationvon Antikörper und Enzymkonjugatvor. Die Detektion dieses Mykotoxinskonnte deshalb noch nicht in denPrototyp des Mykotoxin Arrays inte-griert werden.

In den weiteren Arbeiten ist die Un-tersuchung von realen Poben (Null-proben und natürlich belasteten Pro-ben) und Vergleich der Ergebnissemit konventioneller Analytik wieHPLC und GC-MS vorgesehen. Fürdiese Untersuchungen stehen bereitseine ganze Reihe von Proben zur Ver-fügung, wobei erste Tests mit demMykotoxin Array eine gute Überein-stimmung mit den Vergleichsdaten er-gaben. Desweiteren wird an einerVerkürzung der Gesamtanalysezeitgearbeitet.

Plantibodies gegenMykotoxine

Das zweite hier vorgestellte Projektverfolgt die Etablierung eines alter-nativen, spezifisch bindenden re-kombinanten Antikörperfragments,das in der Lage ist den durch Immu-nisierung in diversen Tierspezies er-zeugten (polyklonalen) Antikörperoder monoklonalen Antiköper durcheine sehr viel kostengünstigere Va-riante zu ersetzen.

Rekombinante Antikörper stelleneine Alternative zu den klassischenpoly- und monoklonalen Antikör-pern dar. Bei der Herstellung von re-kombinanten Antikörpern werdendie Antikörpergene aus einer RNAPopulation heraus isoliert und sub-kloniert. Oft wird dabei das Mole-kül auf die variablen Teile reduziert,welche durch einen synthetischen

Linker verbunden werden („singlechain variable Fragments“ = scFv).Alternativ können entsprechendeFragmente auch aus synthetischenBanken selektiert werden, die bis zu1013 unabhängige scFv-Klone enthal-ten. Aus diesen Banken wird der ge-wünschte Antikörper in einem Ver-fahren selektioniert, welches „Pan-ning“ genannt wird. Ist ein Antikör-perfragment gefunden, wird diesesin Bakterien produziert (Abb. 8). Dabei diesem Verfahren nicht mit le-benden Tieren gearbeitet wird, kön-nen auch Antikörperfragmente ge-gen hochgradig toxische Stoffe iso-liert werden. Solche rekombinanten

Antikörper besitzen gleiche Affinitä-ten zu ihren Antigenen wie ein voll-ständiger Antikörper, weisen abernur ein Fünftel seiner Größe auf.

Allerdings haben bakteriell pro-duzierte scFvs auch einige Nachtei-le: Sie sind nicht glykosyliert undkönnen nur in relativ geringen Men-gen produziert werden.

Eine Weiterentwicklung der re-kombinanten Antikörper-Technolo-gie stellt der Transfer solcher Gen-fragmente in Pflanzen dar. In diesentransgenen Pflanzen kann das scFv-Fragment bis zu 6% des Gesamtpro-teins darstellen. Solche Proteine wer-den als „Plantibodies“ bezeichnet

und weisen gegenüber anderen Sy-stemen viele Vorteile auf:– Im Vergleich zu anderen Produk-tionssystemen können Plantibodiessehr billig und in großen Mengen her-gestellt werden.– Es besteht kein Infektionsrisiko fürden Menschen.– Funktional korrekt gefaltete undglycosylierte Antikörpermoleküle.

Die Technologie der „Plantibody“-Herstellung ist noch relativ neu underfordert gerade in der Anfangspha-se sehr viel Zeit. Neben mikrobiolo-gischen und molekularbiologischenMethoden wird auch die Technolo-gie der Transformation und Regene-ration von Pflanzen benötigt. Gängi-ge in der Molekularbiologie einge-setzte Pflanzen, wie Tabak oder Ara-bidopsis, sind zwar für den Labor-maßstab nutzbar, aber wenig für dieProduktion größerer Mengen an re-kombinanten Proteinen geeignet.

Folgende Arbeitsschritte sind not-wendig, um aus einer vorhandenenPhagen-Antikörper Bank einen ge-wünschten Antikörper zu selektierenund in Pflanzen zu exprimieren:1. Kopplung eines geeigneten Anti-gens an eine Matrix.2. Herstellen oder Einsatz einer fer-tigen scFv-Phage Display Library in ei-nem Selektionsverfahren (sog. „Pan-ning“, dieses wird in der Regel 3-5mal durchlaufen).3. Expression der selektierten Anti-körpergene in einem geeigneten Bak-terienstamm.4. Analyse der Antikörper-Antigen-Bindung.5. Subklonierung in einem binärenVektor.6. Transformation von Agrobacteri-um tumefaciens.7. Transformation von Pflanzen (Ta-bak, Erbse).8. Selektion und Regeneration derPflanzen.9. Analyse der transgene Pflanzen aufscFv-Expression.10. Kreuzen der Pflanzen, um stabilexprimierende Linien zu erhalten.11. Analyse der Expression in der sta-bilen Linie.

Aufreinigung des scFv ausder Pflanze

Es ist offensichtlich, dass der initialeAufwand viel größer ist als bei derHerstellung von monoklonalen Anti-körpern. Alleine die Generationszeitder zu regenerierenden Pflanzen kannein Jahr betragen. Andererseits stel-len „Plantibodies“, wenn sie erst ein-mal in einer Pflanze produziert wer-

Abb. 8: Panning von scFvs. Für die Selektion von scFvs werden Phagenverwendet, die jeweils die variablen Teile von Antikörpergenen als Fusi-onsprotein mit einem Hüllprotein enthalten. Auf diese Weise enthält derPhage zum Genotyp auch den passenden Phänotyp, den auf der Phagen-oberfläche exponierten scFv („Phage Display“). Für die Selektion wird dasAntigen an eine Matrix gekoppelt und die Phagenbank aus ca. 108 ver-schiedenen scFv-Phagen aufgegeben. Nur Phagen, die über den scFv andas Antigen gebunden sind, werden anschließend eluiert und in einer wei-teren Selektionsrunde („Panning“) eingesetzt. Nach drei bis vier Rundensind entsprechende Phagen angereichert.

Abb. 7: Standardkurven von Aflatoxin B1, Zearalenon und Deoxynivalenolim Mykotoxin Array Test mit einer Mischung der Enzymkonjugate. Inkuba-tionsfolge: Standard + Enzymkonjugat: 30 Minuten, Chromogen/Substrat:15 Minuten.

Sonderband | 2003 | 77BIOKATALYSEBIOKATALYSE

den, eine sehr preiswerte und effizi-ente Produktionsmethode für Antikör-per dar [8]. In diesen transgenenPflanzen kann das scFv-Fragment biszu 6% des Gesamtproteins darstellen,was bei proteinreichen Pflanzen wieErbsen eine Produktionsrate von 50kg/Hektar ermöglicht [9]. Die hohenErträge bei Erbsen ermöglichen eineProduktion der scFvs im Gewächs-haus. Daher ist eine in der Öffentlich-keit stark diskutierte Freisetzungtransgener Pflanzen überhaupt nichtnotwendig. In wenigen S-1 Gewächs-häusern kann der Jahresbedarf an denentsprechenden „Plantibodies“ ohneRisiko der Freisetzung transgenenMaterials produziert werden. Neben-bei ergibt sich durch die Anzucht ingeschlossenen Gewächshäusern einInvestitionsschutz des Produzenten.

Im Rahmen des DBU-gefördertenProjekts werden rekombinante Anti-körper gegen folgende Mykotoxinehergestellt:– Ochratxin A.– Fumonisin B1, welches eine wich-tige Bedeutung in der Lebensmittel-produktion hat.– Nivalenol, wogegen es bisher kei-ne Antikörper gibt.– Aflatoxine, hier liegt der Focus aufder Produktion eines scFv/ „Plantibo-dies“, der mehrere Mitglieder derGruppe der Aflatoxine gleichzeitig er-kennt. Auf diese Weise wird nur nochein einziger Antikörper benötigt, umeine ganze Stoffklasse zu detektieren.Ein ähnliches Konzept wurde von unsbereits zur Detektion pflanzlicher Po-tyviren (einer Virengruppe mit über300 Mitgliedern) erfolgreich ange-wandt [10].

Antikörper gegen die ersten bei-den Mykotoxine erlauben es, dieseTechnologie mit bereits etabiertenTechniken zu vergleichen, denn essind auch monoklonale Antikörpersowie kommerzielle Testsysteme ge-gen Ochratoxin A und Fumonisin B1erhältlich. Gegen beide Mykotoxinewurden bereits scFvs isoliert und inE. coli exprimiert (Abb. 9). Die Bin-dungsaffinität dieser scFvs wird mit-tels Oberflächen-Plasmon-ResonanzAnalyse (Biacore) untersucht. Par-allel dazu werden die scFvs in eineneigens konstruierten binären Vektorsubkloniert. Dieser ist für die Ex-pression von scFvs in Tabak und Erb-se hin optimiert. Es werden zunächsttransgene Tabakpflanzen hergestellt,die als „Proof of Principle“ dienensollen. Die Transformation von Erb-se, in der viel größere Proteinmen-gen produziert werden können,schließt sich wegen des deutlich hö-heren Aufwands bei der Transforma-

tion und Regeneration dieser Pflan-ze später an.

Literatur

[1] Otteneder, H., Majerus, P., DeutscheLebensmittelrundschau 97 (2001),334-338.

[2] Rosner, H., Mycotoxin Research 18A(2002), 1-5.

[3] Walker, F., Meier; B., Journal of AOACInternational 81 (1998), 741-748.

[4] Krska; R., Nachr. Chem. Tech. Lab. 47(1999), 553-556.

[5] Scott, P., J. Assoc. Off. Anal. Chem.65 (1982), 876-883.

[6] Usleber, E., Märtlbauer, E., Dietrich,R, Terplan, G, J. Agric. Food Chem.39 (1991), 2091-2095.

[7] Dietrich, R., Schneider, E., Usleber, E.,Märtlbauer, E., Natural Toxins 3(1995), 288-293.

[8] Daniell, H., Streatfield, S.J., Wycoff,K., Trends in Plant Sciences 6:(2001), 219-226.

[9] Jacobsen (ed.), 2001 Entwicklungs-konzept zur BMBF-Förderaktivität„BioProfile“; (Hannover).

[10] Hust, M., Maiss, E., Jacobsen, H.J.,Reinard, T., J, Virol Methods 106(2002), 225.

Abkürzungen

BGVV: Bundesinstitut für gesundheit-lichen Verbraucherschutz undVeterinärmedizin (heute BVL:Bundesamt für Verbraucher-schutz und Lebensmittelsicher-heit

ELISA: Enzyme Linked Immunosor-bent Assay (immunologischerTest)

DON: Deoxynivalenol (Mykotoxinaus Fusarium Schimmelpilzen)

scFv: single chain variable Fragment(rekombinantes Antikörper-fragment)

IAC: Immunaffinitätssäulen (Eng-lisch: immunoaffinity column)

HPLC: Hochleistungsflüssigkeitschro-matographie (Englisch: HighPerformance Liquid Chroma-tography)

ppb: parts per billion (µg/kg)ppm: parts per million (mg/kg)

Korrespondenzadresse

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Abb.10: Bakteriell produ-zierte scFvs sind relativinstabil und können nicht ingroßen Mengen produziertwerden. Daher werden dieGene in einem binären Vek-tor subkloniert um damitAgrobacterium tumefaci-ens zu transformieren. Die-ses Bakterium ist in derLage, einen Teil der aufdem Vektor liegenden Genein Pflanzenzellen (hier Erb-sen-Embryonen) zu trans-ferieren. Die Pflanzenstük-ke werden auf einem Se-lektionsmedium wieder zuvollständigen Pflanzen re-generiert, die das scFv ingroßen Mengen produzie-ren.

Abb. 9: Selektion von scFv-Phagen gegen Fumonisin B1. Die Elution derPhagen von der mit Fumonisin B1 gekoppelten Matrix erfolgte spezifischmit Fumonisin B1. Nach der vierten Panningrunde wurden die scFvs dererhaltenen Phagen sequenziert und analysiert.

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BULDING BLOCKS

Biokatalytische SyntheseenantiomerenreinerBuilding Blocks� Dr. Markus Kähler1, Dr. André Rieks1, Dr. Ulrike Kirchner1, Kerstin Wiggenhorn1, Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer2, Marlen Schmidt2, Angelika Eisner2,Dr. Wolfgang Petersen3, Frauke Ellerbrock3, Stefan Bollow3

1 Dr. Rieks GmbH, Uetersen, 2 Institut für Chemie und Biochemie, Abt. Technische Chemie und Biotechnologie, Universität Greifswald, 3 UNA-SynthGmbH, Uetersen

Die Herstellung enantiomerenreiner Verbindungen ist eine der großen Herausforderungen der biokatalytischen Synthese. Enantiomerenreine Alkoholebergen hinsichtlich ihrer Verwendung als Synthesevorstufen hochwertiger Pharmazeutika ein immenses Potenzial.Die im Rahmen des Vorhabens zu synthetisierenden sekundären Alkohole, insbesondere 1-Methoxy-2-propanol, 3-Butin-2-ol und 3-Hydroxytetrahydro-furan, stellen als Synthesevorstufen zahlreicher Wirkstoffe Schlüsselsubstanzen dar. Einer biotechnologischen Produktion dieser so genannten „BuildingBlocks“ steht allerdings entgegen, dass verfügbare Esterasen oder Lipasen nur moderate Spezifität und Enantioselektivität gegenüber diesen Verbindun-gen aufweisen.Ziel des Vorhabens ist daher, das Potenzial von Esterasen mithilfe der gerichteten Evolution hinsichtlich verfahrensrelevanter Parameter, insbesondereEnantioselektivität, Substratspezifität und Kälteaktivität, zu optimieren und somit die biotechnologische Produktion enantiomerenreiner Building Blockszu ermöglichen. Anhand des 1-Methoxy-2-propanols wird dargestellt, wie durch eine optimierte Prozessführung enantiomerenreine Alkohole mit hoherReinheit und Ausbeute umweltgerecht produziert werden können. Erste vorliegende ökologische Prozessdaten werden ebenfalls präsentiert.

Keywords: Enantioselektivität, Esterase, Kälteaktivität, Building Blocks.

Einleitung

BiokatalytischeBereitstellungenantiomerenreinerBuilding-BlocksDie Herstellung enantiomerenreinerVerbindungen ist eine der großenHerausforderungen der organischenSynthese, vornehmlich für die Ent-wicklung und Produktion pharmazeu-tisch relevanter Building Blocks. Vonvielen racemischen Wirkstoffen istbekannt, dass jeweils nur eines derbeiden Enantiomere wirksam, dasandere jedoch inaktiv ist oder Neben-wirkungen hervorruft. Beispielsweiseinteragiert ausschließlich das jeweili-ge (S)-Enantiomer der Entzündungs-hemmer Ketoprofen und Ibuprofenmit dem für die Krankheitssymptomeverantwortlichen Enzym Cyclooxyge-nase. Traurige Popularität erlangte inden 60er Jahren das teratogen wirken-de (S)-Enantiomer des unter demHandelsnamen Contergan® vertriebe-nen Schlafmittels Thalidomid.

Reine Enantiomere lassen sich ent-weder direkt durch stereoselektiveSynthese oder indirekt über die Auf-reinigung von Racematen darstellen.Im letzteren Fall entstehen in der Re-gel allerdings 50 Prozent Abfall in

Form der nichtgewünschten Stereo-isomere, sofern nicht alternative Ver-wendungsmöglichkeiten für diese be-stehen. Daher ist es sinnvoll, die sogenannte Chiralitätsinformation be-reits frühzeitig in das zu synthetisie-rende Molekül einzufügen, um nach-folgend die restliche Struktur sukzes-sive über adäquate organische Synthe-sen aufzubauen.

Für die Synthese von Feinchemika-lien wurden Biokatalysen im Laufe derletzten Jahre eine zunehmend attrak-tive Alternative gegenüber konventio-nellen chemischen Methoden. Bereitsheute werden eine Reihe wichtigerWirkstoffvorstufen, u. a. D-Hydroxy-phenylglycin oder (R)-Phenylglycidatökonomisch effizient in Biokatalyse-verfahren synthetisiert.

Eine konsequente Ausweitung desEinsatzes von Enzymen in nachhaltigumweltgerechten und ökonomischeffizienten Verfahren kann das Wert-schöpfungspotenzial von Biokatalysa-toren auch in der Wirkstoffsyntheseweiter ansteigen lassen.

Enantioselektive Biokatalyse:Lipasen und EsterasenInsbesondere Lipasen und Esterasenbieten sich auf Grund ihres Substrat-spektrums für einen Einsatz in Bio-

katalysen an [1]. Wichtige pharma-zeutische Synthesebausteine wie bei-spielsweise Alkohole, Amine, Carbon-säuren oder Ester lassen sich mit Hilfevon Lipasen oder Esterasen darstel-len [2].

Bisher erfolgte eine industrielleVerwirklichung der zahlreich publi-zierten Esterase- oder Lipase-Reak-tionen jedoch nur im begrenztenMaß. Kommerziell zugängliche odernatürlich vorkommende Lipasen undEste-rasen erfüllen die hohen Anfor-derungen, die in einem biokatalyti-schen Prozess an sie gestellt werden,meist nur unzureichend. Als Hinde-rungsgründe hierfür sind die nichtoptimalen Temperaturgrenzen für diekatalytische Aktivität, die engen Sub-stratspezifitäten oder die für unnatür-liche Substrate niedrigen Enantiose-lektivitäten der Enzyme verantwort-lich.

Temperaturabhängigkeitder StereoselektivitätBiokatalysen mit Hilfe kälteaktiverEnzyme bergen hinsichtlich der Über-windung genannter verfahrenstechni-scher Schranken ein hohes Problem-lösungspotenzial. Aufgrund ihrer ho-hen Flexibilität können kälteaktiveEnzyme ein breites Spektrum natür-

lich vorkommender und anthropoge-ner Substrate umsetzen. Ein weitererVorteil ist die Eigenschaft kälteakti-ver Enzyme, auch in Gegenwart ge-ringer Wassermengen hohe katalyti-sche Aktivitäten zu zeigen. Von her-ausragender Relevanz ist die Tatsa-che, dass Enzyme bei tieferen Tem-peraturen Substrate in der Regel miteiner deutlich höheren Enantioselek-tivität umsetzen. Die diesem aus Sichtder industriellen Anwendbarkeit in-teressanten Phänomen zugrundelie-genden molekularen Prinzipien wur-den von Rieks et al. am Beispiel deshydrolytischen Enzyms Penicillinami-dase detailliert diskutiert [3].

Biokatalytische Verfahren beiTemperaturen unterhalb von 30°Cführen letztendlich mit hoher Ausbeu-te zu sauberen, enantiomerenreinenWirkstoffen.

Zielsetzung

Ziel des Projekts ist die Integrationevolutiv verbesserter Esterasen inbiotechnologische Verfahren zur Her-stellung enantiomerenreiner sekun-därer Alkohole.

Die im Rahmen des Vorhabens zusynthetisierenden sekundären Alko-hole (Abb. 1), insbesondere 1-Me-

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thoxy-2-propanol (3a), 3-Butin-2-ol(2a) und 3-Hydroxytetrahydrofuran(1a) bergen hinsichtlich ihrer vielfäl-tigen Verwendung als Synthesevorstu-fen enantiomerenreiner Pharmazeu-tika ein immenses Potenzial.

Zahlreiche Medikamente könneneffizient und umweltschonend ausden genannten Schlüsselverbindun-gen synthetisiert werden. Enantiome-renreines 3-Butin-2-ol stellt beispiels-weise die Vorstufe für Thrombose-und Arteriosklerosemedikamente so-wie substituierte Alkinylharnstoffe,welche als Lipoxygenasehemmer be-schrieben werden, dar. 3-Hydroxyte-trahydrofuran kann als Baustein beider Synthese von antiviralen Wirkstof-fen, Atemwegstherapeutika oder Asth-mamitteln verwendet werden.

Sekundäre Alkohole, deren Substi-tuenten sich nur geringfügig hinsicht-lich ihrer Größe unterscheiden, las-sen sich mit bekannten Lipasen oderEsterasen nicht oder nur unbefriedi-gend in optisch reiner Form herstel-len. Entsprechend der so genanntenKazlauskas-Regel [4] werden übli-cherweise nur Verbindungen, die ei-nen großen (z. B. Aryl-) und mittle-ren (z. B. Ethyl-) Substituenten auf-weisen, mit hinreichender Enantios-elektivität umgesetzt. Zusätzlich zuder unbefriedigenden Enantioselek-tivität sind diese sekundären Alkoho-le bzw. deren Ester leicht flüchtig, waseine Racematspaltung unter Verwen-dung von Enzymen mit Aktivitätsop-tima bei 40-70°C, also dem Bereich,in dem kommerzielle Biokatalysato-ren optimal aktiv sind, zusätzlich er-schwert.

Im Rahmen des Projekts sollenbiotechnologische Verfahren zur Her-stellung enantiomerenreiner sekun-därer Alkohole zur Verwendung alspharmazeutische Wirkstoffvorstufenentwickelt werden. Gegenwärtig exi-stierende verfahrenstechnischeSchranken sollen durch den Einsatzausgewählter Lipasen oder evolutivverbesserter Esterasen sowie durchOptimierung von Prozessabläufenbeseitigt werden.

Hierfür soll das biokatalytische Po-tenzial gut charakterisierter Esterasendurch Methoden der gerichteten Evo-lution hinsichtlich verfahrensrelevan-ter Parameter (Substratspezifität, En-antioselektivität, ggf. Kälteaktivität)optimiert werden. Zusätzlich sollenanforderungsgerecht ausgewählte Li-pasen oder Esterasen aus psychrophi-len Mikroorganismen hinsichtlich ei-ner Verfahrenstauglichkeit getestetund gegebenenfalls in den Prozessintegriert werden.

Ergebnisse

Erzeugung enantioselektiverEsterasen durchgerichtete EvolutionZur Racematspaltung von 3-Hydro-xytetrahydrofuran (1a) und 3-Butin-2-ol (2a) wurden zunächst über 100kommerziell erhältliche Lipasen undEsterasen sowie mehrere rekombi-nante Esterasen aus Bacillus subti-lis, Bacillus stearothermophilus[5], Streptomyces diastatochromo-genes und Pseudomonas fluores-cens [6] auf ihre Aktivität gegenüberden entsprechenden Acetaten gete-stet. Zur Bestimmung der Aktivitätund Stereoselektivität gegenüber die-sen chiralen Alkoholen wurde einHochdurchsatz-Acetat-Assay verwen-det [7]. Hierbei führt die durch En-zymkatalyse freigesetzte Essigsäuremittels einer gekoppelten Enzymkas-kade zur proportionalen Bildung von

NADH, welches spektrophotome-trisch quantifiziert wird. Bei Einsatzoptisch reiner Acetate in zwei Vertie-fungen einer Mikrotiterplatte kann sodie Enantioselektivität abgeschätztwerden. Es zeigte sich, dass zwar eineganze Reihe von Enzymen Aktivitätaufweist, die Enantioselektivität warjedoch in allen Fällen sehr niedrig.Diese Beobachtung war nicht uner-wartet, da bei beiden Modellverbin-dungen die Substituenten am chira-len C-Atom annähernd gleich großsind, was entsprechend der Kazlaus-kas-Regel nur zu einer geringen En-antioselektivität führt.

Um eine effiziente Racematspal-tung dieser wichtigen Synthesebau-steine zu erzielen, wird daher dieStrategie der gerichteten Evolution[8-10] verfolgt (Abb. 2).

Im ersten Schritt werden hierfürBibliotheken der rekombinantenEsterasen durch Error-prone PCR

hergestellt. Dabei werden durch Er-höhung der Magnesiumchloridkon-zentration, Verwendung von Mangan-chlorid oder Variation der Nukleo-tidverhältnisse verstärkt Fehler beider Genamplifizierung erzeugt. Diemutierten Gene werden dann in ei-nen Expressionsvektor kloniert, die-ser transformiert und die erhaltenenTransformanten in Mikrotiterplattenals Bibliotheken abgelegt. Bisherwurden etwa 4000 Klone aus der er-sten Mutationsrunde, ausgehend vonBacillus stearothermophilus Ester-ase und einer p-Nitrobenzylesteraseaus Bacillus subtilis (BsubpNB)[11], unter Verwendung des Acetat-Assays als Hochdurchsatz-Sreening-Methode hinsichtlich ihrer Aktivitätgegenüber den Acetaten von 3-Hy-droxytetrahydrofuran und 3-Butin-2-ol untersucht. Dabei wurden eineganze Reihe von Varianten mit hoherAktivität gegenüber den Acetaten von3-Butin-2-ol und einige mit modera-ter Aktivität bezüglich dem Acetat von3-Hydroxytetrahydrofuran identifi-ziert. Erste Verifizierungen dieserMutanten in präparativen Biokataly-seansätzen ergaben, dass bereits en-antioselektivere Esterasen gefundenwurden. Die detektierte Steigerungder Enantioselektivität reicht nochnicht aus, um den Anforderungen anein technisches Verfahren zu genü-gen. Im weiteren Verlauf des Vorha-bens soll die Enantioselektivität die-ser Varianten durch weitere Mutati-onsrunden und Einbeziehung vonrationalem Proteindesign basierendauf der Struktur der BsubpNB-Ester-ase gesteigert werden.

Industrielle Umsetzung

Ziel des Vorhabens ist die Entwick-lung eines universellen biotechnolo-gischen Verfahrens zur Synthese en-antiomerenreiner sekundärer Alko-hole. Mit Hilfe einer kommerziell er-hältlichen Lipase aus Candida an-tarctica B (CALB) konnte bereitseine Racematspaltung des Synthese-baustein 1-Methoxy-2-propanoldurchgeführt werden. Entsprechendder Arbeit von Baumann et al. (12)weist dieses Enzym eine hohe Enan-tioselektivität für das (S)-Enantiomerauf. Aufgrund dieses sehr frühzeitigverfügbaren Enzym-Systems, das beiniedrigen Temperaturen und damitverbundener hoher Selektivität aus-reichend aktiv war, konnte für (S)-1-Methoxy-2-propanol bereits einVerfahren zur biotechnologischenSynthese enantiomerenreiner sekun-därer Alkohole erarbeitet werden.

Abb. 1: Strukturen der im Rahmen des Vorhabens untersuchten Synthese-bausteine.

Abb. 2: Schema der gerichteten Evolution und des Screenings von Ester-asen.

80 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Der inzwischen erreichte technischeStand genügt prinzipiell den Anfor-derungen der Produktion von enan-tiomerenreinem (S)-1-Methoxy-2-propanol im Kilogramm-Maßstab.Basierend auf dieser Entwicklungund bei Verfügbarkeit entprechendenantioselektiver Enzyme kann inKürze ebenfalls die enantiomerenrei-ne Herstellung der Zielsubstanzen 3-Hydroxytetrahydrofuran und 3-Bu-tin-2-ol erfolgen.

ÖkologischeProzessbetrachtung

Steigender Wettbewerb und gleich-zeitig wachsende Anforderungen inHinsicht auf produktionsintegriertenUmweltschutz erfordern bei der chir-alen Wirkstoffsynthese die Entwick-lung nachhaltiger Produktionsver-fahren. Beim Scale-up des im Labor-maßstab vorab entwickelten Synthe-severfahren der genannten Zielsub-stanz wurden deshalb vorzugsweiseökologisch relevante Prozessschrit-te berücksichtigt.

Beispielsweise konnten aufgrundeiner detaillierten Stoffstromkonzep-tion anfallende Prozessrückständereduziert werden. Diese Rückstän-de, deren Inhaltsstoffe alle biolo-gisch sehr gut abbaubar sind, kön-nen direkt einer kommunalen Klär-anlage zugeführt werden.

Häufig führt in Kläranlangen dermangelnde Zulauf von organischenC-Quellen zu einer Anreicherungstickstoffhaltiger Verbindungen. Ur-sache hierfür ist die natürliche Kopp-lung von Stickstoffeliminierung undKohlenstoffabbau (Nitrifikation/De-nitrifikation). In dem hier beschrie-benen Verfahren zur Synthese von(S)-1-Methoxy-2-propanol konnteder bislang als Reaktionsmediumverwendete Phosphatpuffer durcheinen Acetatpuffer (C-Quelle) sub-stituiert werden. Somit kann in denKläranlagen eine ausgewogene Stick-

stoff-Kohlenstoffbilanz erzielt undKosten durch den zusätzlichen Ein-trag von kohlenstoffhaltigen Substan-zen (wie z.B. Methanol, Citrat) re-duziert werden.

Für alle Kühlprozesse wird Brun-nenwasser aus eigener Förderungeingesetzt. Wertvolle Trinkwasser-ressourcen werden demnach nichtberührt. Infolge einer optimalen Re-aktionsführung bei niedrigen Tem-peraturen (10°C) erfolgt zudem kei-ne signifikante Erwärmung des Kühl-wassers. Dadurch und unter Vermei-dung produktberührter Wasserpha-sen (Festphasenextraktion, Vakuum-Kreislaufwasser, Prozessluftreini-gung) konnte das Kühlwasser ohneAufbereitung direkt in die Vorfluteingeleitet werden. Infolgedessen re-duziert sich der Entsorgungsauf-wand lediglich auf die kläranlagen-fähige Acetat-Lösung (Reaktionsme-dium).

Die Rückgewinnung aller einge-setzten Lösemittel reduziert den Ko-stenaufwand für Verbrauchsmittel er-heblich. Der Gesamt-Energieauf-wand liegt mit 29,43 kWh Strom und126,0 kg Dampf pro Batch sehrdeutlich unter dem vergleichbarerchemischer Verfahren. Die Energie-kosten betragen aus dem laufendenBetrieb heraus weniger als 10,00EUR je 3-L-Charge Produkt. DerKühlwasserbedarf (Brunnenwasser)beträgt 4,81 m3 je 3-L-Charge Pro-dukt mit Kosten, die unter jeder sinn-vollen Kalkulationsgrenze liegen(0,15 EUR/m3).

Die hieraus abgeleiteten Kenngrö-ßen wurden bereits in Vorbereitungder ökologischen und ökonomi-schen Evaluation bewertet. Danachzeichnen sich umweltrelevante Vor-teile gegenüber den chemisch-tech-nischen Prozessen ab. Im Weiterenstehen für das Zielprodukt nunmehrFeinarbeiten zur Installation und Do-kumentation eines validen Prozessesaus.

Ausblick

Die erfolgreiche industrielle Umset-zung der enantioselektiven Synthesevon (S)-1-Methoxy-2-propanol hat dieLeistungsfähigkeit biokatalytischerProzesse auch bei niedrigen Tempe-raturen belegt. Bezüglich einer Mini-mierung des Energiebedarfs, einerVermeidung toxischer Reagenzien undder Reduzierung von Abfallentsor-gungs- und Abwasseraufbereitungsko-sten erweist sich das biokatalytischeVerfahren zur Produktion enantiome-renreiner sekundärer Alkohole alsnachhaltig umweltgerecht.

In der kommenden Phase gilt es,die bereits etablierte technologischeBasis im Rahmen der Verwirklichungweiterer enantiomerenreiner Alkoho-le auszubauen und den Übergang vonder Molekularbiologie über den labor-technischen Ansatz bis hin zum ferti-gen Massenprodukt zu realisieren.

Apparativ ist das nunmehr etablier-te Verfahren flexibel auf vergleichba-re Synthesen übertragbar. Zielsetzungsoll nun in erster Linie die evolutiveSteigerung der Enantioselektivität aus-gewählter Esterasen, insbesondereder bereits vorliegenden BsubpNB-Esterase-Mutanten, gegenüber 3-Hy-droxytetrahydrofuran und 3-Butin-2-ol sein. Mit den Arbeiten zur weiterenOptimierung erster enantioselektive-rer Enzymmutanten über Error-pro-ne PCR wurde bereits begonnen. Par-allel werden kälteaktive Lipasen ausneuisolierten Psychrophilen nachSubstratspezifität und Enantioselekti-vität gescreent. Der Integration enan-tioselektiver Enzyme in das Synthese-verfahren folgt anschließend eine Op-timierung der Prozessabläufe unterBerücksichtigung der genannten öko-logischen und ökonomischen Para-meter. Aus dem Vorhaben wirdschließlich ein universelles umweltge-rechtes Verfahren zur effizienten Syn-these enantiomerenreiner sekundärerAlkohole resultieren.

Literatur

[1] Bornscheuer, U.T., Kazlauskas, R.J.,Hydrolases in Organic Synthesis -Regio- and Stereoselective Biotrans-formations, Wiley-VCH, Wein-heim(1999).

[2] Pandey, A., Benjamin, S., Soccol,C.R., Nigam, P., Krieger, N., Soccol,V.T., Appl. Biochem. 29 (1999), 119-131.

[3] Rieks, A., Kasche, V., Galunsky, B.,Nurk, A., Piotraschke, E., Biotechnol.Lett. 18 (1996), 455-460.

[4] Kazlauskas, R.J., Weissfloch, A.N.E.,Rappaport, A.T., Cuccia, L.A., J. Org.Chem. 56 (1991), 2656-2665.

[5] Henke, E., Bornscheuer, U.T., Appl.Microbiol. Biotechnol. 60 (2002),320- 326.

[6] Henke, E., Bornscheuer, U.T., BiolChem 380 (1999), 1029-1033.

[7] Baumann, M., Stürmer, R., Born-scheuer, U.T., Angew. Chem. 113(2001), 4329-4333.

[8] Bornscheuer, U.T., Pohl, M., Curr.Opin. Chem. Biol. 5 (2001), 137-143.

[9] Bornscheuer, U.T., Biocat. Biotransf.19 (2001), 85-97.

[10] Bornscheuer, U.T., Curr. Opin. Bio-technol. 13 (2002), 543-547.

[11] Henke, E., Pleiss, J., Bornscheuer,U.T., Angew. Chem. 114 (2002),3338-3341.

[12] Baumann, M., Hauer, B.H., Born-scheuer, U.T., Tetrahedron: Asymme-try 11 (2000), 4781-4790.

Korrespondenzadresse

Dr. Markus KählerDr. Rieks GmbHDeichstr. 25aD-25436 UetersenTel.: 04122-9066-43Fax: 04122-9066-53eMail: kaehler@riekslab.deWeb: www.riekslab.de

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Sonderband | 2003 | 81BIOKATALYSEBIOKATALYSE

ESTERASEN/LIPASEN

Esterasen und Lipasen auskultivierten und nicht-kultiviertenMikroorganismen� Prof. Dr. Uwe T. Bornscheuer, Dr. Anna Musidlowska-Persson, Dominique Böttcher1, Dr. Klaus Liebeton, Dr. Patrick Lorenz, Dr. Jürgen Eck, Dr. HolgerZinke2, Dr. Christa Schleper3, Prof. Dr. Peter Langer4, Dr. Harald Trauthwein, Dr. Andreas Karau, Dr. Stefan Buchholz5,1Universität Greifswald, Institut für Chemie und Biochemie, Abt. Technische Chemie und Biotechnologie, Greifswald, 2B.R.A.I.N. AG, Zwingenberg,3Institut für Mikrobiologie und Genetik, TU-Darmstadt, Darmstadt, 4Universität Greifswald, Institut für Chemie und Biochemie, Abt. BioorganischeChemie, Greifswald, 5Projekthaus Biotechnologie, Degussa AG, Hanau

Im Rahmen des von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) geförderten Verbundprojekts werden Enzyme aus mikrobiellen Isolaten sowie aus Me-tagenom-Genbanken verschiedenster Habitate isoliert, um Enzymbanken darzustellen. Die darin enthaltenen Biokatalysatoren (Lipasen/Esterasen) wer-den eingehend bezüglich ihres Substratspektrums und ihrer Enantioselektivität charakterisiert. Hierfür stehen sowohl effiziente Methoden für das Hoch-durchsatzscreening (HTS) im Mikrotiterplattenformat als auch zur Synthese zahlreicher chiraler racemischer Ausgangsverbindungen zur Verfügung. Einzweites Ziel des Verbundprojekts ist die Verfügbarmachung von rekombinanter Schweineleberesterase (rPLE). Ein im Vergleich zu kommerzieller PLEhochstereoselektives Isoenzym dieser für die organische Synthese wichtigen Esterase kann zwar durch Expression in der Hefe Pichia pastoris herge-stellt werden, die zu niedrige Produktivität dieses Expressionssystems erfordert jedoch eine Optimierung bzw. den Wechsel zu alternativen Wirtsorganis-men, um eine wirtschaftliche Vermarktung dieses Enzyms zu ermöglichen. Darüber hinaus werden Mutanten der PLE hergestellt und mittels HTS bezüg-lich Substratspektrum und Stereoselektivität charakterisiert.

Keywords: Metagenom, Lipase, Esterase, Hochdurchsatzscreening, PLE, Dominoreaktionen.

Einleitung und Zielsetzung

Enzymatische Prozesse, insbesonderestereoselektive Hydrolysen und Synthe-sen, gewinnen in der modernen Fein-chemie ständig an Bedeutung. Enzyma-tische Reaktionen können im Vergleichzur chemischen Katalyse häufig untermilderen Bedingungen bezüglich derVerwendung von organischen Lösungs-mitteln und Prozessparametern wieTemperatur, Druck und pH-Wertdurchgeführt werden. Ein weitererökologischer Vorteil von Biokatalysa-toren beruht auf der Eigenschaft derEnzyme, eine Vielzahl von Reaktionenstereo- und enantioselektiv zu kataly-sieren, sodass mehrstufige Synthesenmitunter verkürzt, Ausbeuten gestei-gert und Nebenprodukte minimiertwerden können. Biokatalytische Pro-zesse haben also ein erhebliches Po-tential zur Ressourcenschonung undUmweltentlastung [1-4].

Trotz großer Fortschritte in derMolekularbiologie und Enzymologieund dem exponentiell wachsendenVerständnis von Struktur-Aktivitätsbe-ziehungen von Biokatalysatoren stößtdie breite Einführung derartiger Ver-fahren in die industrielle Anwendungaufgrund der Nichtverfügbarkeit vongroßen Sammlungen an Enzymen und

biellen Biodiversität dar. Diese hoheDiversität bietet die Möglichkeit, idea-le Biokatalysatoren für die Mehrzahlindustrieller Anwendungen aufzufin-den [5,6].

Um eine möglichst rasche, zuver-lässige und anwendungsorientierteCharakterisierung dieser Enzyme zuermöglichen, werden diese mittelsHochdurchsatzscreening-Systemeneingehend bezüglich Aktivität und En-antioselektivität gegenüber einer Rei-he von Modellsubstraten charakteri-siert.

Zusätzlich wird im Rahmen desVorhabens die Expression der Schwei-neleberesterase (PLE) untersucht.PLE stellt derzeit eine der wichtigstenEsterasen für Anwendungen in derorganischen Synthese dar. Mit diesemEnzym konnte eine große Zahl optischreiner Verbindungen durch Asymme-trisierung oder durch Racematspal-tung dargestellt werden [7]. Die pro-blematische Anwesenheit einer Reihevon Isoenzymen der PLE in kommer-ziellen Präparationen aus der Schwei-neleber konnte durch Expression ei-nes spezifischen Isoenzyms in der HefePichia pastoris umgangen werden[8], welches zudem deutlich verän-derte Substrat- und Enantioselektivi-

täten (E>>100) in der Racematspal-tung sekundärer Alkohole im Ver-gleich zu käuflichen Präparaten (E~1-4) aufweist [9]. Allerdings ist die Pro-duktivität in der Herstellung des En-zyms mittels Pichia pastoris unbefrie-digend und es werden daher alterna-tive Expressionssysteme untersucht.

Die Gesamtstrategie ist in Abbildung1 veranschaulicht.

Vorgehensweise undErgebnisse

Identifizierung von neuenEsterasen und Lipasen inder kultivierten und nichtkultivierten BiodiversitätAls Ressource für das Auffinden neu-er und verschiedenartiger Esterasenund Lipasen werden sowohl die kulti-vierte Biodiversität in Form von um-fangreichen Stammsammlungen eu-bakterieller und thermophiler ar-chaealer Mikroorganismen als auchdie nicht-kultivierte Biodiversität inForm von so genannten Metagenom-Banken genutzt. Die Identifizierungder Gene solcher Enzyme kann überzwei verschiedene Strategien erfolgen.

Zum einen können unter Verwen-dung eines Agarplattentests mit Tri-

deren Bereitstellung in industriell er-forderlichen Mengen und Qualitätenauf erhebliche Barrieren. Besondersvielseitig einsetzbar sind Lipasen undEsterasen, die sich durch ein breitesSubstratspektrum, oft sehr hohe En-antioselektivität, sowie Aktivität undStabilität in organischen Lösungsmit-teln auszeichnen [1]. Derzeit sind je-doch nur etwa 50 verschiedene Lipa-sen/Esterasen auf dem Markt erhält-lich, die aber nicht immer die unter-schiedlichen Anforderungen, z.B. hin-sichtlich Substratspezifität, Enantio-selektivität und Prozessstabilität wech-selnder Fragestellungen, erfüllen kön-nen [1].

Ein vielversprechender Zugang zuneuen Biokatalysatoren besteht in derErstellung komplexer Metagenomban-ken. Da nur etwa 1% der in einemHabitat vorhandenen mikrobiellenDiversität durch traditionelle Kultivie-rungstechniken einer funktionellenoder genetischen Durchmusterungzugänglich gemacht werden können,stellt der Ansatz der direkten Extrak-tion von Umwelt-DNA idealerweise al-ler in einer Bodenprobe vorhandenenMikroorganismen, also ohne einenKultivierungsschritt, eine immenseErweiterung der verfügbaren mikro-

82 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

butyrin als Substrat die Klone bzw.Stämme identifiziert werden, die einaktives lipolytisches Enzym bilden(Abb. 2). Diese Vorgehensweise ba-siert auf der Expression der gesuch-ten Gene und dem Nachweis der Ak-tivität der korrespondierenden Enzy-me.

Ist ein Esterase-bildender Metage-nom-Klon gefunden worden, so wirddas zugehörige Gen durch eineTransposonmutagenese auf dem zwi-schen 8 – 40 kBp großem Metage-nom-Fragment identifiziert. Durcheine zufällige Insertion des Transpo-sons wird das gesuchte Gen inakti-viert. Der daraus resultierende Ver-lust der lipolytischen Aktivität deserzeugten Transposon-„Knock-out“Klons dient als Indikator für die Iden-tifizierung des gesuchten Gens.Durch eine Sequenzierung mit Trans-poson-spezifischen Primern kann diegesuchte flankierende DNA-Sequenzunmittelbar bestimmt werden.

Ist ein Esterase/Lipase-bildendesmikrobielles Isolat aus der kultivier-baren Biodiversität, der zweiten Res-source dieses Projekts, identifiziertworden, so wird von diesem Stammeine genomische Genbank in E. coliangelegt und diese über die gleicheVorgehensweise durchmustert, wiefür die Metagenom-Klone beschrie-ben.

Der zweite Ansatz bedient sich derSequenzinformation bereits bekann-ter Esterasen und Lipasen. Diese In-formation wird genutzt, um konser-vierte Proteinstrukturen zu identifizie-ren, die idealerweise nur in der En-zymklasse der Esterasen/Lipasen odersogar nur in einzelnen Familien die-ser Klasse auftreten. Über eine reverseGenetik werden von diesen konser-vierten Proteinstrukturen DNA-Se-quenzen abgeleitet, die dann als spe-

Im Laufe des Projekts wurdenbisher acht Metagenom-Banken aufKlone mit lipolytischer Aktivitätdurchmustert. Diese Banken umfas-sen zwei Plasmid-Banken mit Meta-genom-Fragmentgrößen von 3-12kBp („Activity Based Expression Li-braries“ (ABEL®)) sowie 6 Cosmid-bzw. Fosmid-Banken mit Fragment-größen von 35-45 kBp („Large In-sert Libraries“ (LIL®)). Obwohl nurBruchteile der Plasmidbanken un-tersucht wurden, ergibt sich bisherein Gesamtumfang der durchmu-sterten Metagenom-DNA von etwa6300 MBp, was bei einer durch-schnittlichen Genom-Größe von 4-5 MBp etwa 1500 Genom-Äquivalen-ten entspricht. Insgesamt konntenbisher über 500 Klone identifiziertwerden, die im ersten Test lipolyti-sche Aktivität zeigten. Tatsächlich istdie Auffindungsrate von aktiven Klo-nen in den Plasmid-Banken höherals in den Cosmid- und Fosmid-Ban-ken, was auf die Präsenz der Vek-tor-lokalisierten Promotoren zu-rückzuführen sein könnte, die eineheterologe Expression erleichtern.Unter der Annahme einer durch-schnittlichen Genomgröße von 4MBp ergibt sich für die ABELs® bzw.LILs® eine Effizienz der Identifizie-rung von 0,8 bzw. 0,2 Esterasen/Li-pasen pro Genomäquivalent. DieAnalyse von 30 vollständig sequen-zierten und annotierten eubakteri-ellen und 7 archaealen Genomenzeigt, dass die o.g. Auffindungsra-ten 80% bzw. 20% der gemäß An-notierung theoretisch auffindbarenEsterase/Lipase-Genen entspricht.Damit stellt sich der Aktivitäts-ba-sierte Ansatz für das Auffinden vonEsterasen/Lipasen in Plasmid-Ban-ken als sehr effizient dar und liefertsogar höhere Auffindungsraten alsdie Durchmusterung der kultivier-ten Biodiversität (siehe unten)(Abb. 3).

Die Sequenzierung der über dasAktivitäts-basierte Durchmusternvon Metagenom-Plasmidbankenidentifizierten Gene belegt, daß essich tatsächlich um neue und hochdiverse Gene handelt. Darüber hin-aus zeigte eine anfängliche Charak-terisierung der Enzyme hinsichtlichSubstratspezifität/Enantioselektivi-tät, Temperatur- und pH-Stabilitätauch die erwünschte funktionelleDiversität. Erwähnenswert ist an die-ser Stelle die Tatsache, dass äußerstthermostabile Enzyme auch in Me-tagenom-Banken gefunden wurden,die aus Bodenproben von nicht-ex-tremen Standorten erstellt wurden.

Abb. 2: Aktivitäts-basiertes Durchmustern von Metagenom-Banken nachlipolytischen Klonen. Die Trübungsklärung um einzelne Kolonien ist aufden enzymatischen Abbau des Tributyrins zurückzuführen und deutet aufdas Vorhandensein einer aktiven Esterase oder Lipase hin.

Abb. 1: Gesamtstrategie zur Erzeugung neuer Biokatalysatoren.

zifische Sonde zur Identifizierung ähn-licher Gene, also solcher, die auch fürEsterasen/Lipasen kodieren, verwen-det werden. Die Sonden können ent-weder in einer klassischen Kolonie-filterhybridisierung oder in einer PCReingesetzt werden. Auch diese Vorge-hensweise ist sowohl für die Identifi-zierung von Esterasen und Lipasen inMetagenom-Banken als auch in geno-mischen Banken von Lipase-positivenIsolaten geeignet.

Sonderband | 2003 | 83BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Abb. 4: Durch Domino-Reaktionen zugängliche Synthesebausteine.

Um auch die Esterase/Lipase-Genein den Metagenom-Banken finden zukönnen, die im Wirtsorganismus derGenbanken (E. coli) nicht exprimiertwerden und somit durch den Aktivi-täts-basierten Ansatz nicht identifi-zierbar sind, wurde der oben be-schriebene Sequenzhomologie-ba-sierte Ansatz etabliert. Es zeigte sich,dass sogar die verschiedenen Fami-lien von Esterasen und Lipasen, wieetwa die „echten“ Lipasen (Familie1 [10]) oder die „GGGX-Typ“-Ester-asen [11], welche zur Hydrolyse vontertiären Alkoholen befähigt sind,spezifisch adressiert werden können.So konnten z.B. in einem ersten Ver-such 19 verschiedene und neue„GGGX-Typ“ Carboxylesterasen inzwei Fosmid-Banken identifiziertwerden, ohne ein Gen einer anderenFamilie zu amplifizieren. Da die Po-sitionen dieser Klone auf den für dieKonservierung von LILs® verwende-ten Mikrotiterplatten andere sind, alsdie der über das Aktivitäts-basierteDurchmustern gefundenen Klone, istdie Verschiedenheit der Enzyme sehrwahrscheinlich und unterstreichtden komplementären Charakter bei-der „Screening“-Ansätze.

Die kultivierte Biodiversität inForm von Stammsammlungen bieteteine weitere Ressource für das Auf-finden neuer Esterasen und Lipasen.Auch hier konnten in einem erstenVersuch zahlreiche Kandidaten iden-tifiziert werden, die durch ihre lipo-lytische Aktivtität aufgefallen sind.Von 569 getesten Stämmen zeigten266 eine Hofbildung auf Tributyrin-Agarplatten. Von diesen wiesen 41Stämme eine echte Lipaseaktivitätauf, wie die Hydrolyse von Trioleinanzeigte. In jedem Fall stellt aber dieSammlung thermophiler archaealerOrganismen eine weitere vielverspre-chende Ressource für thermostabileCarboxylesterasen dar. Zusammenmit der Durchmusterung der nicht-kultivierten Biodiversität bietet die-ses Projekt einen umfassenden undkomplementären Ansatz zur Er-schließung neuer Esterasen und Li-pasen für die Feinchemie.

Die in Metagenom-Banken undder kultivierten Biodiversität identi-fizierten Enzyme werden in diesemVerbund einer Charakterisierungunterzogen, um Entscheidungskrite-rien für eine Priorisierung hinsicht-lich der Klonierung und Überexpres-sion der Kandidaten zu gewinnen.Schließlich sollen neue und verschie-dene Enzymproben gewonnen undfür Anwendungstests Dritten zur Ver-fügung stehen.

len. Dies schließt die Entwicklung ge-eigneter Methoden zur Enantiome-renanalytik (chirale HPLC und Gas-chromatographie) ein.

Hochdurchsatzscreeningder Biokatalysatoren

Die aus Metagenombanken zugäng-lichen Lipasen und Esterasen werdenmittels verschiedener Hochdurch-satz-Screeningsysteme (HTS) im Mi-krotiterplattenformat durchmustert.Die hierzu verwendeten Modellsub-strate stellen Ester vorwiegend se-kundärer und tertiärer Alkohole dar.Zur Bestimmung der Aktivität undStereoselektivität gegenüber chiralenAlkoholen wird zunächst ein Acetat-Assay verwendet [14]. Hierbei führtdie durch Enzymkatalyse freigesetz-te Essigsäure mittels einer gekoppel-ten Enzymkaskade zur proportiona-len Bildung von NADH, welches spek-trophotometrisch quantifiziert wird.Bei Einsatz optisch reiner Acetate inzwei Vertiefungen einer Mikrotiter-platte kann so die Enantioselektivi-tät abgeschätzt werden. Zusätzlicherlaubt ein weiterer HTS-Test die di-rekte Bestimmung der Syntheseakti-vität der Biokatalysatoren in organi-schen Lösungsmitteln [15]. Anschlie-ßend erfolgt mit aktiven und enan-tioselektiven Enzymen eine Umset-zung im präparativen Maßstab undeine Verifizierung durch chirale Gas-chromatographie bzw. HPLC.

Mit dieser Strategie wurden bereitseinige neu erhaltene Enzyme charak-terisiert. Danach zeigen alle Ester-asen Aktivität gegenüber den Modell-substraten. Selbst Ester tertiärer Al-kohole werden mit guter Aktivitätumgesetzt (Abbildung 5).

Optimierte ExpressionrekombinanterSchweineleberesterase(PLE)

Eine effiziente und stabile Enzymex-pression ist für die spätere industriel-le Produktion der Biokatalysatorenvon ausschlaggebender Bedeutung.Die verwendeten Systeme sollen hoheExpressionsraten bei niedrigen Induk-tions- und Medienkosten ermögli-chen. Des Weiteren sollte die Aufar-beitung des Biokatalysators möglichsteinfach und kostengünstig sein. Eineweitere Anforderung an ein möglichstuniverselles Expressionssystem isteine umfassende Flexibilität gegen-über unterschiedlichen, im Screeningaus verschiedenen Organismen iden-tifizierten Enzymen.

Substratsynthesen

Die Charakterisierung von neuenEsterasen und Lipasen hinsichtlichihres biotechnologischen Potenzialsmacht die Bereitstellung von Substra-

ten erforderlich. Durch effiziente Do-mino-Reaktionen [12,13] ist ein sehrbreites Spektrum an Verbindungenzugänglich (Abbildung 4), die mittelsder Hydrolasen in ihre optisch reinenVerbindungen überführt werden sol-

Abb. 3: Vergleich der Auffindungsraten von Esterase/Lipase-Genen beimAktivitäts-basierten Durchmustern von Plasmid- und Cosmid/Fosmid-Metagenom-Banken sowie zufällig ausgewählten Isolaten einer Stamm-sammlung.Die Klone der Metagenom-Banken und 569 Isolate wurden mittels Tributy-rin-Agarplatten auf ihre Fähigkeit zur Expression und aktiven Darstellungvon Esterasen/Lipasen untersucht. Für die Berechnung der Auffindungs-rate in den Metagenom-Banken wurde eine durchschnittliche Genomgrö-ße von 4 MBp angenommen. Zur Genomanalyse wurden 30 eubakterielleund 7 archaeale vollständig sequenzierte Genome auf das Vorhandenseinvon Esterase/Lipase-Genen untersucht.

84 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Bei der heterologen Expressionvon eukaryotischen, insbesondereaus tierischen Geweben stammendenEnzymen, sind bis dato nur unzurei-chend effiziente Expressionssystemebeschrieben worden. Die Verwen-dung von tierischen Proteinen undEnzymen, die direkt aus tierischenGewebe gewonnen werden, wird imZusammenhang mit in letzter Zeit auf-tretenden Krankheiten wie BSE immerkritischer gesehen. Dies verlangt einefermentative Expression solcher En-zyme, für die in mikrobiellen Syste-men aber wenig Erfahrungen vorhan-den sind.

ins Medium sekretiert wird. Die Auf-arbeitung enthält lediglich einenSchritt zur Zellabtrennung und an-schließender Aufkonzentrierung derLösung (Abb. 6).

In jüngster Zeit sind jedoch weite-re Expressionssysteme auf Basis vonHefen und Pilzen etabliert worden,deren Verwendbarkeit auf eukaryoti-sche Systeme, wie der PLE untersuchtwerden sollen [16,17]. Die weitereCharakterisierung und Optimierungdieser Systeme hinsichtlich ihrer Ex-pressionsleistung für die rPLE-Gewin-nung kann somit wesentliche Beiträ-ge und Strategien liefern, tierische

Aktivitäten dieser Biokatalysatorengegenüber verschiedenen Estern se-kundärer und insbesondere tertiä-rer Alkohole hin. Diese Verbindun-gen können zudem im Gramm-Maß-stab in wenigen Stufen synthetisiertwerden. Eine entsprechende Enan-tiomerenanalytik über Gaschroma-tographie wurde etabliert. Im wei-teren Projektverlauf stehen dieDurchmusterung weiterer Lipasenund Esterasen und Racematspaltun-gen im präparativen Maßstab mitausgewählten enantioselektiven En-zymen im Vordergrund. Für die in-dustrielle Herstellung rekombinan-

Abb. 6: Schematische Darstellungder Aufarbeitungsstrategie zurHerstellung rekombinanterSchweineleberesterase.

Abb. 5: Qualitativer Aktivitätstest für ausgewählte Esterasen und Substrate. Sek., sekundärer Alkohol; Tert., ter-tiärer Alkohol.

transformations, Wiley-VCH, Wein-heim.

[2] Liese, A., Seelbach, Wandrey, C.(2000) Industrial Biotransformations,Wiley-VCH, Weinheim.

[3] Patel, R.N. (2000) StereoselectiveBiocatalysis, Marcel Dekker, NewYork.

[4] Schoemaker, H.E., Mink, D., Wub-bolts, M.G., Science 299 (2003),1694-1697.

[5] Lorenz, P., Liebeton, K., Niehaus, F.Eck, J., Curr. Opin. Biotech. 13 (2002),572-577.

[6] Lorenz, P., Schleper, C., J. Mol. Catal.B Enzymatic 19-20 (2002) 13-19.

[7] Jones, J.B., Pure Appl. Chem. 62(1990), 1445-1448.

[8] Lange, S., Musidlowska, A., Schmidt-Dannert, C., Schmitt, J., Bornscheuer,U.T., Chem. Bio. Chem. 2 (2001), 576-582.

[9] Musidlowska, A., Lange, S., Born-scheuer, U.T., Angew. Chem. 113(2001), 2934-2936.

[10] Arpigny J.L. & Jaeger, K.-E., Biochem.J. 343 (1999), 177-183.

[11] Henke, E., Bornscheuer, U.T., Schmid,R.D. Pleiss, J. , Chem. Bio. Chem. 4(2003) 435-493.

[12] Langer, P., Eckardt, T., Angew. Chem.112 (2000), 4503-4506.

[13] Langer, P., Freifeld, I., Chem. Eur. J. 7(2001), 565-572.

[14] Baumann, M., Stürmer, R., Born-scheuer, U.T., Angew. Chem. 113(2001), 4329-4333.

[15] Konarzycka-Bessler, M., Bornscheuer,U.T., Angew. Chem. 115 (2003), 1449-1451.

[16] Gellissen, G., Appl. Microbiol. Biotech-nol. 54 (2000), 741-750.

[17] Devchand, M., Gwynne, D. I., J. Bio-technol. 17 (1991), 3-9.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Uwe T. BornscheuerInstitut für Chemie und Biochemie,Abt. Technische Chemie undBiotechnologie, Ernst-Moritz-ArndtUniversität GreifswaldSoldmannstr. 17D-17487 GreifswaldTel.: 03834-8643 67Fax: 03834-8643 46eMail: uwe.bornscheuer@uni-greifswald.dewww.chemie.uni-greifswald.de/biotech

So ermöglicht zwar das Pichia pa-storis-System erstmalig die heterolo-ge Expression rekombinanter PLE[8], doch muss die Produktivität auf-grund der niedrigen Ausbeuten nochwesentlich gesteigert werden. Auchdie pulsierende Zugabe von Metha-nol für das etablierte Pichia pasto-ris-System ist in der Praxis aufwän-dig.

Die Aufreinigung der rPLE ist da-gegen relativ einfach, da das Enzym

Enyzme mittels mikrobieller Systemefermentativ zu produzieren.

Zusammenfassung

In diesem stark interdisziplinär an-gelegten Vorhaben gelang es, effizi-ente Methoden zur Darstellung di-verser neuartiger Lipasen und Ester-asen zu etablieren. Erste Untersu-chungen mittels Hochdurchsatz-Screeningverfahren deuten auf hohe

ter Schweineleberesterasen wurdenAufarbeitungsstrategien entwickelt.Erste Untersuchungen zur Expressi-on der PLE in alternativen Wirtsor-ganismen zur Hefe Pichia pastoriswurden begonnen.

Literatur

[1] Bornscheuer, U.T., Kazlauskas, R.J.(1999) Hydrolases in Organic Synthe-sis - Regio- and Stereoselective Bio-

Sonderband | 2003 | 85BIOKATALYSEBIOKATALYSE

PHYTASE

Produktion der Phytase vonEscherichia coli� Dr. Gerhard Miksch1, Dr. Sophia Kleist1, Dr. Bernd Hitzmann2, Dr. Michael Arndt2, Dr. Karl Friehs1, Dr. Arno Cordes3, Prof. Dr. Erwin Flaschel11 Lehrstuhl für Fermentationstechnik der Technischen Fakultät, Universität Bielefeld, 2 Institut für Technische Chemie, Universität Hannover, 3 ASA Spezial-enzyme GmbH, Wolfenbüttel

Phytasen werden seit einigen Jahren in der Ernährung monogastrischer Nutztiere (z.B. Schweine und Geflügel) eingesetzt, um den Nährwert des Futtersdurch Aufschluss der im Futter enthaltenen Phytate zu erhöhen. Die industrielle Produktion der Phytasen erfolgt zur Zeit hauptsächlich durch Fermenta-tion von Pilzen (Aspergillus sp.), die Phytasen ins Medium sekretieren. Die Phytase von E. coli besitzt gegenüber pilzlichen Phytasen Eigenschaften, dieeine höhere Effektivität als Futteradditiv bedingen können. Dies betrifft insbesondere eine wesentlich höhere spezifische Aktivität, geringeres pH-Opti-mum, Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau im Tiermagen sowie Temperaturstabilität beim Pelletieren. Zur Überexpression und extrazellulärenProduktion der Phytase in E. coli wurde ein Expressionsvektor entwickelt, wobei ein Sekretionssystem auf der Basis der kontrollierten Expression deskil-Gens integriert wurde. Die extrazelluläre Produktion der Phytase wurde in Fermentationen mit Zufütterungsmodus untersucht. Zwei Zufütterungsstra-tegien wurden verglichen: Kontrolle der Zufütterung bei konstant geringer Glucosekonzentration und Kontrolle der Zufütterung bei konstant geringerSauerstoffkonzentration. Während die Zufütterung bei geringer Glucosekonzentration zu hoher Wachstumsgeschwindigkeit und zu einer schnellen Erhö-hung der Phytasekonzentration (120 U ml-1) führte, wurden mit der Zufütterung bei einer konstant niedrigen Sauerstoffkonzentration von 5-10 % höherePhytaseausbeuten, allerdings bei längerer Kultivierungszeit, erzielt. In Tierversuchen mit Schweinen und Geflügel zeigte die E. coli-Phytase eine höherePhosphor- und Calcium-Verdaulichkeit als kommerziell verfügbare pilzliche Phytasen.

Keywords: Escherichia coli, Phytase, Fermentation, Zufütterungsstrategien, Tierversuche, Futteradditiv.

Phytase als wichtigesFutteradditiv bei intensiverTierproduktion

Phytinsäure (myo-Inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisdihydrogenphosphat) ist dieHauptspeicherform für Phosphor inTierfutter, insbesondere bei Getreide.In dieser Speicherform ist der le-benswichtige Phosphor für monoga-strische Nutztiere (z.B. Schweine,Geflügel) nicht verfügbar. Phytase(myo-Inositol-hexakisphosphat-Phosphohydrolase, EC 3.1.3.8 für 3-Phytase bzw. EC 3.1.8.26 für 6-Phy-tase) hydrolysiert Phytat zu myo-Inositol und anorganischem Phos-phat. Da im Verdauungstrakt mono-gastrischer Tiere keine oder nursehr wenig Phytase vorhanden ist,wird Phytat nicht verdaut und rei-chert sich in den Fäkalien an. Aufdiese Weise führt Phytat zu einer ern-sten Umweltbelastung. Die Phos-phoranreicherung insbesondere inRegionen mit intensiver Tierhaltungist inzwischen zu einem globalenProblem geworden [1]. Außerdembeeinflusst Phytat die gesamte Er-nährung negativ, da unlösliche Kom-plexe mit lebenswichtigen Metallenwie Kalcium, Zink, Magnesium undEisen sowie Proteinen gebildet wer-den. Dies verringert den Wert vomFutter auf der Basis von Getreide undLeguminosen.

ergab, dass die DNA- und Aminosäu-resequenz mit wenigen Ausnahmenidentisch ist mit denen der saurenPhosphatase [5]. Aus einem Ver-gleich der kinetischen Parameter fürunterschiedliche Substrate (Phytin-säure und PNPP) wird ersichtlich,dass das Enzym bifunktionell ist. DiePhytaseaktivität ist allerdings wesent-lich ausgeprägter als die Aktivität dersauren Phosphatase (Tab. 1). DaspH-Optimum der E. coli-Phytaseliegt mit pH 4,5 niedriger als bei pilz-licher Phytase (pH 5,5). Es ist des-halb davon auszugehen, dass die E.coli-Phytase im sehr sauren pH-Mi-lieu des Tiermagens ihre Aktivitätbesser entfalten kann als die von Pil-zen.

Als besonders vorteilhafte Eigen-schaft der E. coli-Phytase gegenüberpilzlichen Phytasen wurde eine Re-sistenz gegen proteolytischen Abbaudurch Verdauungsenzyme im Magenfestgestellt. Darauf wird ausführlichim letzten Abschnitt eingegangen.

Expression der Phytase inE. coli

In normal wachsenden Zellen von E.coli ist die Expression des Phytasegenskaum messbar. Obwohl unter anae-roben Bedingungen die Phytase ingeringem Umfang exprimiert wird, istdie Konzentration viel zu gering für

Seit mehreren Jahren werden Phy-tasen industriell aus Pilzen (Asper-gillus sp.) gewonnen und dem Fut-ter von monogastrischen Tieren zu-gegeben [2]. Um verbesserte Phyta-sen zu erhalten, wurden verschiede-ne Organismen wie Bakterien, Pilzeund Pflanzen untersucht.

Besondere Eigenschaftender E. coli-Phytase

Verglichen mit allen bisher unter-suchten Phytasen aus den verschie-densten Organismen besitzt die Phy-tase aus E. coli die höchste spezifi-sche Aktivität. So ist diese etwa 8-fach aktiver als die kommerziell er-hältlichen Phytasen. Bei pH 4,5 wur-de eine spezifische Aktivität von1060 U mg-1 gemessen [5]. Die Ana-lyse einer reinen Phytase aus E. coli[3] zeigte, dass sie ähnliche Eigen-schaften besitzt, wie die bereits be-kannte saure Phosphatase [4]. DieSequenzierung der E. coli-Phytase

Phytase

pPhyt109

7.0 kb

Ap

ori

P-bgl

- Cm

kil

P-fic

Km

praktische Anwendungen. Da das En-zym im Periplasma der Zellen ange-reichert wird, müssen die Zellen auf-gebrochen werden. Für eine industri-elle Gewinnung wäre eine extrazellu-läre Produktion der Phytase wün-schenswert. Deshalb haben wir einenExpressionsvektor entwickelt, der dieVoraussetzung für eine hohe Expres-sion der Phytase und deren Sekretionins Kulturmedium bildet. Der Expres-

Abb. 1: Schematische Darstellungdes Expressionsvektors zur Pro-duktion der E. coli-Phytase.

Tab. 1: Kinetische Konstanten für die Hydrolyse von Natriumphytat und p-Nitrophenylphosphat (PNPP) durch die E. coli-Phytase.

Substrat KM (10-3 mol l-1) kcat (s-1) kcat/KM (105 s-1 M-1)

Phytinsäure 0,083 1131 136PNPP 36 4203 1,1

Anmerkung: Puffer pH 4,5 for Phytinsäure und pH 2,5 für PNPP;Substratkonzentration 0,03-9 mM für Phytinsäure und 6,25-70 mM für PNPP.

86 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

sionsvektor pPhyt109 (Abb. 1) wur-de auf der Basis eines Plasmids mithoher Kopienzahl (pUC19) herge-stellt. Für die Phytaseproduktion wur-de der konstitutive Promotor der β-Glucanase aus Bacillus amylolique-faciens verwendet, da der natürlichePromotor nur unter anaeroben Be-dingungen induziert wird [5]. Um Se-kretionskompetenz zu erreichen,wurde eine Sekretionskassette aufdem Expressionsvektor integriert. DieKassette beinhaltet das kil-Gen vomPlasmid ColE1 mit einem schwachenStationärphasenpromotor (fic), einInterposon zur Vermeidung unkon-trollierter Expression des kil-Genssowie die Gene für die Kanamycinre-sistenz (Km) und Ampicillinresistenz

zentrationen an sekretiertem Zielpro-teinen im Medium erreicht werdenkönnen. Die Regelung des Verfahrenserfolgte bisher jedoch nur so, dassdie C-Quelle in nicht reproduzierba-rer Form zugeführt wurde. Diese ein-fachen Strategien gewährleistennicht, die stationäre Wachstumspha-se gezielt zu einem gegebenen Zeit-punkt einzuleiten bzw. sie hinauszu-zögern. Daher sind Versuche zur fer-mentativen Gewinnung der Phytasedurchgeführt worden, bei denen zweiStrategien im Zulaufverfahren vergli-chen wurden: Regelung der Zufütte-rung von Glucose entweder über dieGlucosekonzentration oder die Sau-erstoffsättigung. Um eine Zufütterungvon Glucose über die aktuelle Glu-

die Glucosekonzentration auf 0,2 g l-1

gesunken war. Abbildung 3 zeigt,dass es mit dem entwickelten Systemmöglich ist, eine konstant niedrigeGlucosekonzentration während dergesamten Nachfütterungszeit zu hal-ten. Die Wachstumsgeschwindigkeitder Bakterien war relativ hoch (µ =0,5 h-1). Die Phytaseproduktion ins-gesamt sowie im Medium stieg wäh-rend der gesamten Nachfütterungs-periode schnell an, insbesonderewährend der stationären Phase. Dieproduzierte Phytase wurde fast voll-ständig ins Kulturmedium sekretiert.Bereits nach 14 h wurden 120 U ml-1

an extrazellulärer Phytase produziert.Die Fortsetzung der Fermentationüber diese Zeitspanne hinaus brach-te keinen weiteren Zuwachs an ex-trazellulärer Phytase.

sehr gering (0,1 g l-1), wobei keineAcetatbildung beobachtet wurde. Diebesten Ausbeuten an Phytase wurdenbei einer Sauerstoffkonzentration von5–10 % erreicht (Abb. 4). Die Aus-beute an extrazellulärer Phytase be-trug 140-180 U ml-1.

Um die Effektivität der Fermenta-tionen zu ermitteln, wurden die op-timalen Varianten aus beiden Nach-fütterungsstrategien hinsichtlich derSelektivität (Verhältnis von Phytase-aktivität zur produzierten Biomasse)miteinander verglichen (Abb. 5).Dabei zeigte sich, dass auch über dieeinfachere Strategie einer sauerstoff-geregelten Glucosezufütterung beiniedrigem Niveau des Sauerstoffpar-tialdrucks (pO

2) eine ähnlich gute

extrazelluläre Phytaseaktivität er-reicht werden kann wie mit Hilfe der

Phytase Pepsin PancreatinAspergillus A (von Aspergillus produziert) 25,9 22,6Aspergillus R (in Raps produziert) 32,2 26,7Peniophora 1,8 0Aspergillus T (von Trichoderma produziert) 8,1 0E. coli 94,6 91,1

Tab. 3: Phytaseaktivitäten (Restaktivitäten in %) nach Inkubation mit einerLösung, die Proteasen des Schweinemagens enthielt.

Tab. 2: Einfluss der Pelletierung auf die Phytaseaktivität (%).

Phytase Vor dem Pelletieren Nach dem Pelletieren bei60°C 70°C

Aspergillus A 100 (1850) 92,6 70,5Aspergillus R 100 (1830) 84,0 62,3Peniophora 100 (2670) 26,8 15,7Aspergillus T 100 (1750) 51,9 25,0E. coli 100 (410) 98,8 78,0

DO

ManifoldSauerstoff-elektrode

InjektorenEnzymlösung (GOD)

Pufferstrom

Zellen

Glucose

0 20 40 60 80 100 120Zeit (sec)

Sig

nal (

Uni

ts)

0123456

Bioreaktor Glucoselösung

Kalman-FilterVorhersage der Glucose-

konzentrationGlucosekonzentration

FIA-System

Abb. 2: Flussdiagramm des schnellen FIA-Systems zur Regelung der Glu-cosekonzentration.

(Ap) als Selektionsmarker [6].Durch die Expression des kil-Gensunter Kontrolle eines Stationärpha-senpromotors kann die Kultur ohneden zellschädigenden Einfluss des Kil-Peptids bis zur maximalen Zelldichtewachsen. Die Expression wird auto-matisch bei Eintreten in die stationä-re Phase induziert, was die Wachs-tumsphase auf natürlichem Wege vonder Produktionsphase trennt [7].

Extrazelluläre Produktionim Bioreaktor

Fermentationstechnische Untersu-chungen haben gezeigt, dass unterZulaufbedingungen recht hohe Kon-

cosekonzentration im Medium regelnzu können, ist eine schnellere Analy-tik erforderlich, als dies mit den der-zeit verfügbaren Fließinjektionssyste-men (FIA) möglich ist. Deshalb wur-de eine schnelle Fließinjektionsme-thode entwickelt, die bei der Produk-tion der E. coli-Phytase eingesetztwurde (Abb. 2) [8,9,10]. Fermenta-tionsexperimente wurden in einem 7L-Fermenter mit drei verschiedenenkonstant geringen Glucosekonzentra-tionen (0,3, 0,2 und 0,1 g l-1) durch-geführt. Da die Variante mit 0,2 g l-1

die besten Ergebnisse zeigte, wirddiese Variante hier beschrieben. DieZufütterung wurde nach einer Kulti-vierungszeit von 4,5 h gestartet, wenn

Bei der Zufütterungsstrategie mitkonstant geringem Sauerstoffgehaltund Regelung über die Gelöstsauer-stoffkonzentration wurden 4 Varian-ten mit unterschiedlicher Sauerstoff-konzentration verglichen: 2, 5, 10und 20 % Sättigung[10]. Die Wachs-tumsgeschwindikeiten der Bakterienwaren bei allen 4 Varianten sehr ge-ring (µ = 0,5 h-1). Die Bakterientrok-kenmasse stieg kontinuierlich wäh-rend der gesamten Fermentations-zeit. Die Glucosekonzentration warwährend der gesamten Fermentation

Regelung eines konstanten Glucose-niveaus.

E. coli-Phytase inTierversuchen

Im Institut für Tierernährung derFreien Universität Berlin wurde dievon uns produzierte E. coli-Phytasehinsichtlich der Eignung für die Pel-letierung sowie Phosphor- und Cal-cium-Verdaulichkeit bei ausgewähl-ten monogastrischen Tieren unter-sucht.

Abb. 3: Fermentation von E. coli bei konstant niedriger Glucosekonzentra-tion (0,2 g l-1) mit Regelung der Zufütterung durch die Glucosekonzentrati-on.

Sonderband | 2003 | 87BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Tab. 4: Phytaseaktivität (Restaktivität in %) verschiedener Phytasen nachInkubation (60 min bei 40°C) im Verdauungsüberstand aus verschiedenenSegmenten des Verdauungstrakts von Schweinen.

Phytase Speise- Magen Zwölffinger- Dünndarmröhre darm

Aspergillus A 98,5 60,4 93,6 54,5Aspergillus R 97,4 67,8 96,4 81,3Peniophora 96,8 59,2 94,8 84,8Aspergillus T 92,6 56,8 90,3 56,4E. coli 96,9 92,8 96,8 80,4

Die E. coli-Phytase besitzt im Ge-gensatz zu pilzlichen Phytasen eineoptimale Aktivität bei höheren Tem-peraturen [11]. Während pilzlichePhytasen nach einer Inkubation von20 Minuten bei 60°C nur noch 50 %Aktivität besitzen, sind dies bei derE. coli-Phytase über 70 %. Entschei-dend für die praktische Verarbeitung

derweise Resistenz gegenüber denim Tiermagen vorhandenen EnzymenPepsin und Pankreatin (Tab. 3).

In ähnlicher Weise war die E. coli-Phytase auch resistent gegenüberdem Verdauungsüberstand aus demTiermagen. Im Gegensatz dazu ver-loren pilzliche Phytasen – bedingtdurch proteolytische Enzyme und

unabhängigen Versuchen wurde dieEffektivität der E. coli-Phytase auf dieBioverfügbarkeit von P und Ca beiBroilern, Hennen und Ferkeln imVergleich mit einer kommerziellenAspergillus-Phytase (NATUPHOS vonBASF) untersucht [12]. Die Phyta-sen wurden einer Grundfuttermi-schung (ohne Zugabe von anorga-nischem P) in einer praxisüblichenKonzentration von jeweils 500 U/kgFutter zugegeben. Die Fütterungsver-suche wurden im Institut für Tierer-nährung der Freien Universität Ber-lin durchgeführt. Die P-Verdaulich-keit (Gesamtbilanz) bei Broilernwurde sowohl durch Zugabe vonAspergillus- als auch E. coli-Phyta-se erhöht, wobei die Erhöhung nur

der Aspergillus-Phytase betrug dieErhöhung weitere 18 %.

Die Ca-Verdauung wurde ebenfallsverbessert. Aufgrund einer relativgroßen Streuung der Einzelwertewaren die Differenzen nicht signifi-kant. Ähnliche Ergebnisse brachtenFütterungsversuche mit Junghennen.Dabei wurde die P-Verdauung mitder Aspergillus-Phytase um 18 %und mit der E. coli-Phytase um 25 %verbessert. In gleichem Ausmaßwurde die Gesamt-P-Verdaulichkeit– allerdings nicht signifikant – ver-bessert, wobei die E. coli-Phytase dieVerdaulichkeit deutlich mehr ver-besserte als die Aspergillus-Phytase(7 % gegenüber der Aspergillus-Phytase). Auf die Ca-Verdaulichkeit

Abb. 4: Fermentation von E. coli bei konstant niedriger Gelöstsauerstoff-konzentration (5 %).

Tab. 5: Einfluß der E. coli-Phytase auf die Verdaulichkeit von P und Ca bei Broilern im Vergleich zur Aspergillus-Phytase (Mittelwerte ± SD, P< 0,05).

Kontrolle (ohne Phytase) Kontrolle + Natuphos Kontrolle + E. coli-PhytaseGesamtverdaulichkeit (Balance)n 10 12 12P-Verdaulichkeit (%) 43,2 ± 10,2a 47,7 ± 5,2ab 51,5 ± 5,6b

rel. 100 110 119Ca-Verdaulichkeit (%) 37,1 ± 9,8 38,2 ± 9,2 39,4 ± 10,5rel. 100 103 106Präcaecale Verdaulichkeitn 4 4 4P-Verdaulichkeit (%) 48,0 ± 3,8a 53,3 ± 2,2a 62,0 ± 2,5b

rel. 100 111 129Ca-Verdaulichkeit (%) 43,1 ± 3,0 52,7 ± 9,4 54,4 ± 4,6rel. 100 122 126

Abb. 5: Selektivität von 2 Fermentationsstrategien: Kultivierung bei einerGlucosekonzentration von 0,2 g l-1 und bei konstanter Gelöstsauerstoff-konzentration von 5 %.

von Phytasen ist das Verhalten imKonditionierer beim Pelletierungs-prozess. Bei einer Konditionierungs-temperatur von 60 °C hat die E. coli-Phytase noch 99 % Aktivität, wäh-rend pilzliche Phytasen in Abhängig-keit von der Herkunft nur 84-93 %Aktivität zeigen. Bei einer Konditio-nierungstemperatur von 70 °C be-sitzt die E. coli-Phytase noch 78 %Aktivität, pilzliche Phytasen dagegenweitaus geringere Aktivitäten (Tab.2).

Da die Effektivität der Phytase we-sentlich von der Resistenz gegenüberproteolytischem Abbau im Tierma-gen abhängt, wurden verschiedenepilzliche Phytasen im Vergleich mitder E. coli-Phytase hinsichtlich Re-sistenz gegen die Hauptabbauenzy-me Pepsin und Pancreatin getestet[11]. Während alle getesteten pilz-lichen Phytasen durch proteolytischeAktivitäten inaktiviert wurden, zeig-te die E. coli-Phytase überraschen-

den niedrigen pH-Wert – einen be-trächtlichen Teil ihrer Aktivität (Tab.4).

Ein entscheidendes Kriterium fürdie Anwendung von Phytasen als Fut-teradditiv ist letztendlich die Erhö-hung der Phosphor- und Calcium-Verdaulichkeit des Futters. In drei

bei Zugabe von E. coli-Phytase signi-fikant war (Tab. 5). Die Aspergillus-und E. coli-Phytase erhöhten auchdie präcaecale P-Verdauung (Ver-daulichkeit vor der Darmpassage)um 11 % bzw. 29 %, wobei auch hiereine Signifikanz nur bei der E. coli-Phytase erreicht wurde. Gegenüber

hatte die Zugabe der Phytasen kei-nen signifikanten Einfluss.

Bei Ferkeln erhöhten beide Phyta-sen die P-Verdaulichkeit in weitaus stär-kerem Maße als bei Broilern und Hen-nen, d.h. 33 % durch Aspergillus-Phy-tase und 34 % durch E. coli-Phytase(Tab. 6). Ebenso deutlich war der Ef-

88 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

fekt beider Phytasen auf die Ca-Verdau-lichkeit (18 % bzw. 20 % gegenüberder Kontrolle).

Die Tierversuche zeigen, dass dieE. coli-Phytase die Bioverfügbarkeitdes gebundenen P in Futtermittelphy-taten signifikant stärker erhöhte alsdie Aspergillus-Phytase. Dieser Effektist offensichtlich darauf zurückzufüh-ren, dass die E. coli-Phytase wesent-lich stärker als die Aspergillus-Phyta-se vor proteolytischem Abbau im Tier-magen geschützt ist. Aufgrund dieserEigenschaft ist die E. coli-Phytase für

Kontrolle (ohne Phytase) Kontrolle + Natuphos Kontrolle + E. coli-Phytasen 5 5 5P-Verdaulichkeit (%) 26,8 ± 1,9a 35,5 ± 3,8b 35,8 ± 1,7b

rel. 100 133 134Ca-Verdaulichkeit (%) 55,8 ± 3,4a 65,7 ± 4,2b 67,2 ± 4,2b

rel. 100 118 120

Tab. 6: Einfluss der E. coli-Phytase auf die Gesamt-Verdaulichkeit (Balance) von P und Ca bei Ferkeln im Vergleichzur Aspergillus-Phytase (Mittelwerte ± SD, P< 0,05).

einen längeren Zeitraum im Magenaktiv als die Aspergillus-Phytase.

Literatur

[1] Jongbloed, A.W., Lewis, N.P, Mroz, Z.,Vet. Q 19 (1997), 130-134.

[2] Mroz, Z., Jongbloed, A.W., Kemme,P.A., J. Anim. Sci. 72 (1994), 126-132.

[3] Greiner, R., Konietzny, U., Jany, Kl.-D.,Arch. Biochem. Biophys. 303 (1993),107-113.

[4] Dassa, E., Cahu, M., Desjoyaux-

Cherel, B., Boquet, P.L., J. Biol. Chem.257 (1982), 6669-6676.

[5] Miksch, G., Kleist, S., Friehs, K., Fla-schel, E., Appl. Microbiol. Biotechnol.59 (2002), 685-694.

[6] Miksch, G., Fiedler, E., Dobrowolski,P., Friehs, K., Arch. Microbiol. 167(1997), 143-150.

[7] Miksch, G., Neitzel, R., Fiedler, E.,Flaschel, E., Appl. Microbiol. Biotech-nol. 47 (1997), 120-126.

[8] Hitzmann, B., Lammers, F., Weigel, B.,van Putten, A., Bioforum 12 (1993),450-454.

[9] Hitzmann, B., Broxtermann, O., Cha,Y.-L., Sobich, O., Stärk, E., Scheper,T., Bioprocess Eng. 23 (2000), 337-341.

[10] Kleist, S., Miksch, G., Hitzmann, B.,Arndt, M., Friehs, K., Flaschel, E.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 61(2003), 456-462.

[11] Igbasan, F.A., Männer, K., Miksch, G.,Borriss, R., Farouk, A., Simon, O.,Animal Nutr. 53 (2000), 353-373.

[12] Igbasan, F.A., Simon, O., Miksch, G.,Männer, K., Arch Animal Nutr. 54(2001), 117-126.

Korrespondenzadresse

Dr. Gerhard MikschUniversität BielefeldLehrstuhl für FermentationstechnikD-33501 BielefeldTel.: 0521-106 52 99eMail: gmi@fermtech.techfak.uni-bielefeld.de

OXIDASEN

Herstellung bakterieller Oxidasenzur Synthese chiralerFeinchemikalien� Dr. Birgit Geueke1, Priv.-Doz. Werner Hummel1, Dipl.-Ing. Ingo Knabben2, Dr. Simon Curvers2, Dr. Tibor Anderlei21 Institut für Molekulare Enzymtechnolgie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, 2 AC Biotec GmbH

wohl diese Enzyme hoch stereoselek-tiv sind. Der Cofaktor (FAD/FMN) istfest gebunden, sodass eine externeZugabe nicht erforderlich ist. Für En-zyme dieser Gruppe ist kein zusätzli-ches Coenzym-Regenerierungssystemerforderlich, da reduziertes FADH

2oder FMNH

2 durch Sauerstoff reoxi-

diert wird.

Bakterielle Oxidasen

Im Rahmen dieses Projekts sollendrei technisch interessante, FAD-ab-

In dem geplanten Projekt sollen für dreitechnisch interessante Oxidasen Ex-pressionssysteme entwickelt werden.Mit diesen Enzymen (L-Aminosäure-oxidase, D-Aminosäureoxidase undNADH-Oxidase) sollen neue Synthese-routen für die Herstellung eines brei-ten Spektrums an D- und L-Aminosäu-ren, Ketosäuren, Alkoholen und Keto-verbindungen eröffnet werden. Um dieenzymkatalysierten Reaktionen imtechnischen Maßstab rentabel durch-führen zu können, ist es notwenig, dieExpression und die Fermentation derZielenzyme molekularbiologisch undverfahrenstechnisch zu optimieren.

Stereoselektive Synthese

Feinchemikalien und chirale Vorläu-fermoleküle, die in der pharmazeuti-

schen und chemischen Industrie ein-gesetzt werden, müssen meist von sehrhoher Enantiomerenreinheit sein.Häufig existieren jedoch keine befrie-digenden chemischen Syntheserouten,die den Anforderungen an die Rein-heit des Produkts und an die Wirt-schaftlichkeit des Prozesses gerechtwerden. In den letzten Jahren wurdenunterschiedliche biokatalytische Syste-me zur Produktion chiraler Feinche-mikalien auch im industriellen Maß-stab etabliert, sodass Substanzen wieAlkohole, Amide und Aminosäuren

auch im Tonnenmaßstab enatiomeren-rein hergestellt werden können. Durchden Einsatz von Enzymen können ge-rade bei der Synthese chiraler Verbin-dungen schwermetallhaltige Katalysa-toren und aufwändige Aufarbeitungs-verfahren vermieden werden. Häufigeröffnen sich erst durch die Anwen-dung von Enzymen wirtschaftliche undumweltverträgliche Synthesewege fürdie Herstellung chiraler Substanzen.

Der Einsatz von Oxidasen für dieHerstellung chiraler Feinchemikalienwurde bisher wenig untersucht, ob-

Enzym E.C. Nummer Organismus LiteraturL-Aminosäureoxidase 1.4.3.2 Rhodococcus opacus DSM43250 [1,2]D-Aminosäureoxidase 1.4.3.3 Arthrobacter protophormiae DSM15035NADH-Oxidase 1.6.99.- Lactobacillus brevis DSM20054 [3,4]

Tab. 1: Übersicht über die in dem Projekt zu bearbeitenden Oxidasen.

Sonderband | 2003 | 89BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Abb. 2: Reaktion einer S-spezifischen, NAD-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase in Verbindung mit einer NADH-Oxidase zur Regenerierung von NAD.

Bioreaktoren (Online-Messtechnik)verknüpft [5]. Damit ist es nun mög-lich, in einer frühen Phase der For-schung und Bioprozessentwicklungaus den Messdaten extrem hilfreicheRückschlüsse auf die Kultivierungs-bedingungen und den physiologi-schen Zustand der Mikroorganis-men zu ziehen (Erkennung und Ver-hinderung von Limitierungen (z.B.Sauerstoff) und Inhibierungen, On-line-Verfolgung von mikrobiellenKulturen in Schüttelreaktoren, Er-mittlung von Kenngrößen (OTR,CTR, RQ, m

max, k

La) für ein sicheres

Scale Up). Damit führt der Einsatzder RAMOS-Technologie zu einereffektiveren und zeitsparenderenProzessoptimierung, da bereits aufdem Level von Schüttelkolben preis-werter und schneller wichtige Pro-zessdaten ermittelt werden können.

Durch die Entwicklung neuer Ex-pressionsstämme und die Optimie-rung ihrer Kultivierungsbedingun-gen soll in einem ersten Projektab-schnitt die kostengünstige Herstel-lung der drei Oxidasen ermöglichtwerden.

Literatur

[1] Geueke, B., Hummel, W., EnzymeMicrobial Technology 31 (2002), 77-87.

[2] Geueke, B., Hummel, W., ProteinExpression Purification 28 (2003),303-309.

[3] Hummel, W., Riebel, B., Biotechnolo-gy Letters 25 (2003), 51-54.

[4] Geueke, B., Riebel, B., Hummel, W.,Enzyme Microbial Technology 32(2003), 205-211.

[5] Anderlei, T., Büchs, J., BiochemicalEngineering Journal 7 (2001), 157-162.

Korrespondenzadresse

Dr. Tibor AnderleiProf.-Rehm-Str. 1D-52428 JülichTel.: 024 61-980 119Fax: 024 61-980 450eMail: t.anderlei@acbiotec.com

Abb. 3: Schüttelkolben, die an das Respiratory Activity Monitoring System(RAMOS) angeschlossen sind.

hängige Oxidasen untersucht wer-den, die zur stereoselektiven Darstel-lung verschiedener Feinchemikalieneingesetzt werden können (Tabelle1).Diese Enzyme wurden bei Screening-studien identifiziert und nach derReinigung und Charakterisierungwurde ihr präparatives Potenzial un-tersucht. Die Aminosäureoxidasenlassen sich erfolgreich in der Synthe-se von Ketosäuren und enantiome-renreiner Aminosäuren einsetzen,während die NADH-Oxidase in Kopp-lung mit verschiedensten NADH-ab-hängigen Dehydrogenasen zur Rege-nerierung von NAD verwandt werdenkann (Abbildung 1, 2).

Beim Einsatz von Enzymen imtechnischen Maßstab sind die Bioka-talysatoren oft der entscheidende Ko-stenfaktor. Aus diesem Grund ist eswichtig, die Produktion der Enzymemöglichst kostengünstig zu gestalten.Die beiden entscheidenden Faktorensind die Entwicklung effizienter Ex-pressionssysteme und die Optimie-rung des Herstellungsprozesses.

Verschiedene bakterielle Wirts-stämme sollen zur heterologen Ex-pression der Oxidasen vergleichenduntersucht werden und die Optimie-

Abb. 1: Reaktion der D- und L-Aminosäureoxidasen.

rung der Kultivierungsbedingungensoll in parallelen Kleinkultursystemenablaufen.

In diesem Projekt wird die RAMOS-Anlage zur Prozessoptimierung ein-

gesetzt (Abbildung 3). Mit RAMOSwerden die Vorteile von geschüttel-ten Bioreaktoren (Parallelansätze;kostengünstig, einfache Handhab-barkeit) mit denen von gerührten

90 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

EXTREMOPHILE

Das thermoalkaliphile BakteriumAnaerobranca gottschalkii als Quellestabiler Enzyme zur Herstellunghochwertiger Kohlenhydrate� Volker Thiemann1, Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian1, Dr. Hans-Peter Klenk2, Angela Vollstedt3, Prof. Dr. Roland Freudl3, Catharina Jürgens4, Prof. Dr.Reinhard Sterner4, Prof. Dr. Wolfgang Liebl51 TU-Hamburg-Harburg, 2 e.gene Biotechnologie GmbH, 3 Forschungszentrum Jülich GmbH, 4 Universität zu Köln, 5 Universität Göttingen

Ziel des DBU-Projekts „Hochwertige Kohlenhydrate“ ist die Identifizierung der für die Kohlenhydrat-prozessierenden Enzyme kodierenden Gene desthermoalkaliphilen Bakteriums Anaerobranca gottschalkii, ihre rekombinante Expression und der Einsatz der rekombinanten Enzyme zur Herstellunghochwertiger Kohlenhydrate. Hierzu wurde das Genom von A. gottschalkii mit der Shotgun-Technik partiell sequenziert, wobei ca. 95 % der Sequenzin-formation des Genoms erfasst werden konnten. Zur rekombinanten Herstellung der Enzyme wurden die Wirtsorganismen Staphylococcus carnosus undEscherichia coli verwendet. Die Enzyme Cyclodextrin-Glycosyltransferase, Pullulanase, Verzweigungsenzym sowie zwei ααααα-Amylasen wurden gereinigt,charakterisiert und werden zurzeit auf ihre biotechnologische Anwendbarkeit getestet. Die Eigenschaften ausgewählter Enzyme sollen gegebenenfallsüber gerichtete Evolution oder rationales Proteindesign optimiert und zur Herstellung hochwertiger Kohlenhydrate eingesetzt werden.

Keywords: thermoalkaliphile Bakterien, sekretorische Expression, Enzymoptimierung.

gende Rolle. Unter dem Sammelbegriff„Modifizierte Stärke“ findet sich die-se hochwertige Kohlenhydratquelle invielen Lebensmitteln wieder. Zur Mo-difikation von Stärke werden z.B.Amylasen und Verzweigungsenzymeeingesetzt. Mit Hilfe thermostabiler,Stärke-modifizierender Enzyme kanndie Stärkeveredelung gezielter undeffizienter durchgeführt werden, dabeispielsweise die Raum-Zeit-Ausbeu-te bei hohen Temperaturen aufgrundder höheren Löslichkeit der Stärkewesentlich besser ist. Darüber hinausist Stärke das Substrat für die Herstel-lung der aus 6, 7 bzw. 8 Glucoseein-heiten bestehenden α-, β und γ-Cy-clodextrine. Diese finden, vorwiegendaufgrund ihrer Fähigkeit, verschiede-ne hydrophobe Moleküle zu komple-xieren, in einer großen und noch stetswachsenden Anzahl an industriellenProzessen und Produkten Anwen-dung. In der Pharmaindustrie bei-spielsweise werden Cyclodextrine zurEinkapselung von Wirkstoffen verwen-det, in der Lebensmittelindustrie wer-den sie zur Aromastabilisierung ge-nutzt. Wie kürzlich nachgewiesen wur-de, bilden einige CGTasen [4] sowieAmylomaltasen [5] und Verzwei-gungsenzyme [6,7,8] mit Stärke alsSubstrat cyclische Ringe, die aus mehr

als 8 Glucoseeinheiten bestehen. Vondiesen konnte gezeigt werden, dass siein der Lage sind, die Ausfällung (Re-trogradation) von Stärke zu minimie-ren und Proteinlösungen zu stabilisie-ren [9].

Ziel des Verbundprojekts „Hoch-wertige Kohlenhydrate“ ist die Identi-fizierung der Gene von Anaerobran-ca gottschalkii, welche die Kohlen-hydrat-prozessierenden Enzyme ko-dieren und deren rekombinante Ex-pression. Nach Aufreinigung der En-zyme sollen diese charakterisiert undauf ihre biotechnologische Anwend-barkeit hin untersucht werden. Viel-versprechende Kandidaten sollen imAnschluss gegebenenfalls über gerich-tete Evolution und rationales Protein-design optimiert werden.

Partielle Genomanalyse zurIdentifizierungbiotechnologischinteressanter Enzyme

Für die schnelle Identifizierung vonGenen, die für potenziell biotechno-logisch interessante Enzyme kodieren,empfiehlt sich die Partialsequenzie-rung des Genoms mit der nun etablier-ten Shotgun-Technik. Mit einer gu-ten, d. h. statistisch gleichmäßig ver-

teilten, Plasmidbibliothek kann manz. B. bei dreifacher Sequenzabdek-kung ca. 95% der Sequenz eines mi-krobiellen Genoms erfassen. Für eineeffiziente und kostengünstige Sequenz-ermittlung sind zudem lange Lesewei-ten (>600 nt) und qualitativ hochwer-tige Sequenzen (< 1 Fehler pro 1000nt Rohsequenz) erforderlich. Durchden Einsatz von automatischen Anno-tationssystemen (z. B. PEDANT oderMAGPIE) lässt sich auf den Sequenz-bruchstücken (Contigs) eines Genomszwar nicht der komplette Satz allerGene identifizieren, aber doch ein sehrhoher Anteil daran. Einige Gene wer-den in den verbleibenden Lücken ver-steckt liegen, andere sind nur zu sehrkleinen Teilen sequenziert und kön-nen daher nicht durch Sequenzver-gleiche mit Datenbanken identifiziertwerden. Für das Verständnis des Me-tabolismus eines Organismus aus des-sen Genomsequenz heraus ist es über-aus hilfreich, auch die in Spezialda-tenbanken zusammengetragene Infor-mation über Stoffwechselwege einzu-beziehen (Kyoto Encyclopedia of Ge-nes and Genomes, KEGG, www.tokyo-center.genome.ad.jp/kegg/).

Bei einem gezielten Genomanalyse-ansatz zur Suche nach biotechnolo-gisch wertvollen neuen Enzymen ist es

Einleitung

Extremophile Mikroorganismenwachsen optimal bei extremen Tem-peraturen, pH- Werten, Salzgehaltenoder Drücken. Viele Enzyme dieserMikroorganismen weisen Eigenschaf-ten auf, die neue, vielversprechendePotenziale für die biotechnologischeAnwendung bergen. Beispielsweiseweisen die Enzyme extrem thermophi-ler (60-70°C) und hyperthermophi-ler (80-110°C) Mikroorganismenneben einer hohen Thermostabilitätim Allgemeinen eine relativ hohe Be-ständigkeit gegenüber denaturieren-den Chemikalien, wie Detergenzien,chaotropen Reagenzien, organischenLösungsmitteln, sowie gegenüber ex-tremen pH-Werten auf [1,2] .

Das aus dem heißem Sodasee „LakeBogoria“ isolierte Bakterium Anaero-branca gottschalkii vereint zwei Ex-treme miteinander. Es wächst optimalbei pH 9,5 und 55°C [3]. Zusammenmit der Tatsache, dass A. gottschalkiiverschiedene Kohlenhydrate als Sub-strate nutzen kann, nimmt das Bakte-rium aus diesem Grund unter den ex-tremophilen Mikroorganismen eineSonderstellung ein.

Stärke beispielsweise spielt in derLebensmittelindustrie eine herausra-

Sonderband | 2003 | 91BIOKATALYSEBIOKATALYSE

nicht von Interesse, die Sequenz je-des Gens im Genom zu vervollständi-gen. Nur die für weitere funktionelleAnalysen ausgewählten Gene müssenvollständig aufgeklärt werden. DieKomplettierung dieser Gene aus Se-quenzfragmenten ist meist einfach, daaus der Shotgun-Sequenzierungspha-se zahlreiche Plasmide vorliegen, wel-che die Sequenzlücken abdecken.Durch Sequenzierung mit spezifi-schen, aus den bekannten Sequenz-bruchstücken abgeleiteten Primernlassen sich die potenziell wertvollenGene rasch und preiswert vervollstän-digen. Die Konstruktion einer Biblio-thek mit großen DNA-Inserts (Cosmi-de oder BACs) – für die Vollsequen-zierung von Genomen meist unver-zichtbar – ist hier nicht erforderlich.Zwar kann man die Anordnung derGene im partialsequenzierten Genomüber Contigreihen nur bedingt undmeist in über hundert Fragmentenbestimmen, doch ist die Informationüber großräumige Zusammenhängeder Genanordnung nur bedingt vonInteresse, wenn ein Projekt primär diemöglichst kostengünstige und rascheIdentifizierung neuer enzymkodieren-der Gene zum Ziel hat.

Bei der Partialsequenzierung desGenoms von Anaerobranca gott-schalkii wurden in insgesamt ca.15.000 Sequenzierungsansätzenknapp 12.000 brauchbare Sequenzenmit einer Rohsequenz von ca. 12 Mbpgeneriert. Die Sequenz wies bei 3,65facher Sequenzabdeckung einen Feh-ler pro 6.800 bp auf. Nach dem Schlie-ßen einiger Sequenzlücken mittelsPCR konnte die Sequenz in 510 Con-tigs mit einer Gesamtbasenzahl von1,92 Mbp assembliert werden. Nachder automatisch vorgenommenen undmanuell überprüften Annotation wur-den 1.956 offene Leseraster (openreading frames, ORFs) identifiziert.Ein Vergleich dieser mit ca. zwei Dut-zend mikrobiellen Genomen ergabHomologien zu 78 % der ORFs. Unterdiesen konnten auch 93 putative Genedes Kohlenhydratmetabolismus iden-tifiziert werden

Staphylococcus carnosus:Ein mesophilesWirtssystem für diesekretorische Expressionvon Kohlehydrat-umwandelnden Enzymenaus Anaerobrancagottschalkii

Der Einsatz von Enzymen aus Anae-robranca gottschalkii in industriel-len Prozessen zur Herstellung hoch-

wertiger Kohlehydrate setzt voraus,dass die jeweils benötigten Biokataly-satoren in ausreichender Menge zurVerfügung stehen. Es ist daher von her-ausragendem Interesse, effiziente Ex-pressionssysteme für die Gewinnungder Anaerobranca-Enzyme zu eta-blieren, vorzugsweise auf der Basismesophiler Wirtsbakterien.

Prinzipiell sind zwei verschiedeneMöglichkeiten zur heterologen Ex-pression der Anaerobranca-Enzymeim gewählten Wirtssystem denkbar:Intrazelluläre Expression sowie dieSekretion der Enzyme in den Kultur-überstand. Die weit verbreitete Ex-pression von heterologen Proteinenim Cytosol eines Wirtsorganismusführt in vielen Fällen zu sehr großenProteinmengen, was jedoch sehr häu-fig die Bildung von Aggregaten, densog. „Inclusion bodies“, zur Folge hat.Aggregierte Proteine sind oft enzyma-tisch inaktiv. Die Inclusion bodiesmüssen in aufwändigen Verfahrenrenaturiert werden, was oft nicht odernur teilweise gelingt. Ein weitererNachteil der intrazellulären Expressi-on ist die Notwendigkeit eines Zellauf-schlusses, was eine Verunreinigung

des gewünschten Proteins mit wirts-zelleigenen Proteinen nach sich zieht.Die Sekretion der Anaerobranca-En-zyme in den Kulturüberstand des ge-wählten Wirtsorganismus stellt dahereine attraktive Alternative zur intrazel-lulären Expressionsvariante dar. DieVorteile einer sekretorischen Expres-sion bestehen vor allem im Wegfall derNotwendigkeit eines Zellaufschlusses,der Reduzierung der Gefahr der Bil-dung von Inclusion bodies sowie derbiologischen Abtrennung des Zielpro-teins vom zelleigenen Protein, waseine signifikante Produktanreiche-rung zur Folge hat.

Für die sekretorische Gewinnungvon Anaerobranca-Enzymen bietensich Gram-positive Bakterien als viel-versprechende Wirtsorganismen an,da sie, aufgrund des Fehlens eineräußeren Membran, die gewünschtenProteine direkt in den Kulturüberstandfreisetzen können [10]. Die FähigkeitGram-positiver Bakterien zur effizien-ten Sekretion von Proteinen wirdschon seit langem in der Waschmit-tel- und Lebensmittelindustrie für dieGewinnung einer Vielzahl von zumeistwirtseigenen, hydrolytischen Enzymen

(Proteasen, Lipasen, Amylasen) aus-genutzt. Bei den hierbei eingesetztenBakterien handelt es sich zumeist umBacillus Arten, die jedoch aufgrundihrer hohen intrinsischen Protease-aussscheidung als Wirtsorganismenfür die sekretorische Gewinnung he-terologer Protein nicht in Frage kom-men. Für die sekretorische Produkti-on von proteaselabilen heterologenProteinen bieten sich daher vor allemGram-positive Bakterien an, die kei-ne Proteaseaktivität im Kulturüber-stand aufweisen. Einer der Organis-men der diese Voraussetzung erfüllt,ist das bei der Wurst- und Fleischrei-fung als Starterkultur eingesetzteGram-positive Bakterium Staphylo-coccus carnosus. An verschiedenenBeispielen konnte bereits gezeigt wer-den, dass dieses Wirtssystem sich be-sonders für die sekretorische Gewin-nung heterologer Proteine eignet unddass sich, nach Optimierung der Kul-tivierungsbedingungen, Ausbeutenvon bis zu 2 g Protein/Liter Kulturüber-stand erzielen lassen [11].

Sekretorische Proteine werden alshöhermolekulare Vorläuferproteinemit einem aminoterminalen Signal-peptid synthetisiert. Das Signalpeptidsorgt für die Einschleusung des ent-sprechenden Proteins in den Export-weg und wird im Anschluss an denMembrantransport durch spezifischeProteasen, die so genannten Signal-peptidasen, vom reifen Teil des sekre-torischen Proteins wieder abgespal-ten. Der eigentliche Membrantrans-port wird durch membranständigeMultiproteinkomplexe („Translok-asen“) katalysiert. Die überwiegendeMehrzahl der zellulären Exportprotei-ne wird über den generellen Protein-exportweg, den „Sec“-Weg, durch dieCytoplasmamembran transportiert[12]. Neuere Arbeiten zeigten jedoch,dass es neben dem Sec-Weg noch ei-nen weiteren Exportweg gibt, nämlichden „Tat“-Weg, der vor allem von Co-faktor-haltigen Redoxenzymen für dieMembrantranslokation benutzt wird[13]. Signalpeptide des Tat-Wegs be-sitzen im Gegensatz zu Sec-Signalpep-tiden ein charakteristisches Sequenz-motif, dessen herausragendes Merk-mal zwei aufeinanderfolgende Argi-nin-Reste sind, welche dem Weg sei-nen Namen (Twin-Arginine Transloca-tion) gaben. Sec-abhängige Proteinewerden in entfalteter Form über dieMembran transportiert und nehmenihre native Konformation erst nacherfolgter Membranpassage ein. ImGegensatz dazu besitzt der Tat-Weg dieEigenschaft, bereits fertig gefaltete(und sogar multimere) Proteine ex-

Abb. 1: Sec- und Tat-Weg: Zwei alternative Möglichkeiten zur Ausschleu-sung von Proteinen in den Kulturüberstand Gram-positiver Bakterien.Sec-abhängige Proteine werden in entfalteter Form über die Membrantransportiert und nehmen anschließend ihre gefaltete Konformation ein.Im Gegensatz dazu werden Tat-abhängige Proteine in vollständig gefalte-ter Form über die Membran transportiert, was eine Unterstützung der Fal-tungsvorgangs durch cytosolische Chaperone möglich macht. Rot:Signalpeptide; blau: reifer Teil der Exportproteine; RR: Zwillingsarginin-Motif im Tat-Signalpeptid.

92 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

portieren zu können (Abb. 1). Da dieFaltung von Proteinen außerhalb desCytosols aufgrund des Fehlens vongenerellen Chaperonen einen schwer-wiegenden Engpass bei der heterolo-gen Proteinsekretion über den Sec-Weg darstellt, bietet der Tat-Weg einevielversprechende alternative Mög-lichkeit zur sekretorischen Produk-tion heterologer Proteine. Die Tat-ab-hängige Sekretion erlaubt eine Unter-stützung der Faltung der heterologenProteine durch die generellen Chape-rone im Cytosol und den Transportder Proteine im Anschluss an die er-folgte Faltung, wobei der oben er-wähnte Engpass bei der Sec-abhän-gigen Proteinsekretion umgangenwerden kann [14].

Im Rahmen des Teilprojekts„Hochwertige Kohlehydrate“ desDBU-Verbundvorhabens „Biokataly-se“ wurde die Eignung des mesophi-len Gram-positiven Bakteriums S.carnosus für die sekretorische Ge-winnung ausgewählter Enzyme aus A.gottschalkii untersucht. Die Anaero-branca-Enzyme wurden an Signal-peptide angehängt, die entweder eineEinschleusung in den Sec-Weg oderin den Tat-Weg vermitteln. Die ent-sprechenden Fusionsgene wurden inS. carnosus eingebracht und die soerhaltenen rekombinanten Stämmeanschließend auf Expression und Lo-kalisierung der gebildeten Genpro-dukte durch eine Vielzahl von Metho-den (Zellfraktionierung, Proteasever-dau von Protoplasten, Aufnahme vonExportkinetiken durch Pulse-Chase-Experimente, Aktivitätsbestimmun-gen) vergleichend untersucht. Eszeigte sich, dass in allen untersuch-ten Fällen sowohl mit Hilfe eines Sec-

Signalpeptids wie auch mit Hilfe ei-nes Tat-Signalpeptids eine Freisetzungder Enzyme in den Kulturüberstandder jeweiligen S. carnosus Stämmeerreicht werden konnte. Interessan-terweise zeigte sich, dass die Verwen-dung eines Tat-Signalpeptids im Ver-gleich zur Sec-abhängigen Membran-translokation zu signifikant höherenAusbeuten führte. Dies lässt daraufschließen, dass es für die Anaero-branca-Enzyme besonders vorteilhaftist, die faltungsunterstützende Funk-tion der cytosolischen Chaperoneauszunutzen und das native Enzymerst im Anschluss an die Faltung überden Tat-Weg aus der Zelle auszu-schleusen. Dennoch war zu beobach-ten, dass trotz erfolgreicher Sekreti-on der Anaerobranca-Enzyme in denKulturüberstand noch signifikanteMengen aktiven Enzyms in der Zell-fraktion verblieben. Dies deutet dar-auf hin, das die bisher erzielten Aus-beuten aufgrund von Engpässen in-nerhalb der Sekretionswege nochunterhalb der theoretisch erreichba-ren Ausbeuten liegen. Die Identifizie-rung dieser Engpässe und deren Um-gehung ist das Ziel momentan laufen-der und zukünftiger Arbeiten.

Heterologe Expression,Reinigung undCharakterisierung derrekombinanten Enzyme

Fünf Stärke-umsetzende Enzyme ausAnaerobranca gottschalkii wurdenbislang erfolgreich rekombinant pro-duziert (Abb. 2). Das Verzweigungs-enzym wurde in Staphylococcus car-nosus exprimiert, während für dieProduktion der zwei α-Amylasen und

der Pullulanase E. coli als Wirt ver-wendet wurde. Die CGTase konnte inbeiden Wirtsorganismen in aktiverForm exprimiert werden. Zurzeit wer-den die Enzyme hinsichtlich ihrer bio-technologischen Anwendbarkeit un-tersucht.

Die Temperaturoptima der extra-zellulären Enzyme CGTase, Pullulana-se und α-Amylase lagen mit 65°C bzw.70°C ca. 10°C über der optimalenWachstumstemperatur von Anaero-branca gottschalkii. Die pH-Optimader Amylase und der Pullulanase la-gen mit pH 8,0 bzw. pH 8,5-9 eben-falls in der Nähe des pH-Optimumsvon A. gottschalkii. Die CGTase wiesin einem weiten pH-Bereich (pH 4-10) nahezu gleich hohe Aktivität auf.Weniger temperatur- und pH-stabilwaren hingegen das intrazelluläreVerzweigungsenzym und die intrazel-luläre α-Amylase, die Temperatur-und pH-Optima von 50°C und pH 7bzw. 55°C und pH 6 aufwiesen.

Die thermische Stabilität der CGTasewurde neben der Messung der Rest-aktivität nach Inkubation des Enzymsbei unterschiedlichen Temperaturenüber Differential Scanning Calorime-trie (DSC) analysiert. Die DSC-Mes-sungen zeigen eine mehrphasige Auf-faltung, wobei die Schmelztempera-tur (Tm) des Hauptpeaks bei 66°Clag und unabhängig von der Scanrate(zwischen 0,1 und 1°C/min) und dempH-Wert (zwischen pH 8 und pH 10)war. In Anwesenheit von 5mM CaCl

2erhöhte sich der Tm-Wert jedoch auf69°C. Das Substrat Stärke zeigte eben-falls eine stabilisierende Wirkung, dadie Halbwertszeit der irreversiblenthermischen Inaktivierung bei 70°Cin Abwesenheit von Stärke nur ca. 1

min betrug, jedoch bei derselbenTemperatur in Anwesenheit von 20 %Stärke auch nach 240 min noch sig-nifikante Aktivität nachweisbar war(Abb. 3). In der Anfangsphase derReaktion wurde bei allen untersuch-ten Temperaturen und pH-Wertenrelativ am meisten α-CD gebildet. ImVerlauf der Reaktion stieg der relati-ve Anteil an gebildetem β-CD deut-lich und der des γ-CD geringfügig an.Beide α-Amylasen waren calciumun-abhängig und zeigten die höchsteHydrolyseaktivität mit Amylose alsSubstrat. Mit Maltooligosaccharidenzeigte die extrazelluläre α-Amylasebemerkenswert hohe Transferaseak-tivität. Die Pullulanase gehört zu denTyp I-Pullanasen. Die Typ I-Pullula-nasen spalten spezifisch die α-1,6Bindungen in den Polymeren Pullu-lanan, Amylopektin und Glykogen. InAnwesenheit von 0,5 % SDS, 20 %Tween und 50 % Triton X-100 war diePullulanase völlig beständig.

Die Umwandlung von Amylose zuverzweigten Produkten durch das Ver-zweigungsenzym wurde mit Größen-ausschlusschromatographie analy-siert. Dabei zeigte sich, dass das Ver-zweigungsenzym bevorzugt Ketten miteiner Länge von 6- 60 Glucoseeinhei-ten transferiert.

Veränderung der Funktionund Stabilität vonEnzymen durch rationalesDesign und gerichteteEvolution

Seit einiger Zeit ist es möglich, die Ei-genschaften von Enzymen gezielt zuverändern. Dies hat zum einen zu ei-nem besseren Verständnis der natür-lichen Evolutionsprozesse von Enzy-men geführt [15]. Zum anderen istes möglich geworden, biotechnolo-gisch relevante Enzymen zu erzeugen,die in industriellen Verfahren einge-setzt werden können [16]. Es gibtzwei prinzipiell unterschiedliche An-sätze zur Veränderung von Enzymen,rationales Design und gerichteteEvolution [17]. Rationales Designsetzt die genaue Kenntnis der Struk-tur und Funktion eines Enzyms vor-aus. Aufbauend auf diesem Wissen,werden Aminosäuren an sorgfältigausgewählten Positionen durch ge-richtete Mutagenese gezielt ausge-tauscht. Mit dieser Strategie ist esunter anderem gelungen, die Sub-stratspezifitäten von Enzymen zu ver-ändern bzw. ihre Thermostabilitätenzu erhöhen [17,18]. In vielen ande-ren Fällen ist rationales Design jedochgescheitert. Dies liegt vor allem dar-

Abb. 2: Bereits rekombinant produzierte Stärke-umsetzende Enzyme aus Anaerobranca gottschalkii und die vonihnen katalysierten Reaktionen. In Klammern angegeben die jeweiligen Wirtsorganismen.

Sonderband | 2003 | 93BIOKATALYSEBIOKATALYSE

an, dass wegen der Komplexität vonEnzymen auch bei genauer Kenntnisder Struktur die Auswirkung einesAminosäureaustauschs auf seineFunktion nicht exakt vorhergesagtwerden kann. Diesem Problem trägtder Ansatz der gerichteten EvolutionRechnung, der sich am Prozess dernatürlichen Evolution orientiert. Da-bei ist eine genaue Kenntnis derStruktur-Funktionsbeziehung prinzi-piell nicht erforderlich. Bei der ge-richteten Evolution wird durch denzufälligen Einbau von Mutationen indas Wildtyp-Gen zunächst ein großesRepertoire an Genvarianten herge-stellt. Anschließend werden die Gen-varianten in einem passenden Wirts-organismus nach den neuen Eigen-schaften selektiert oder gescreent.Der Prozess von Mutation und Selek-tion/Screening kann über mehrereRunden durchgeführt und so langewiederholt werden, bis weitere Ver-besserungen nicht mehr möglich sindbzw. nicht mehr detektiert werdenkönnen. So können durch schrittwei-se Erzeugung kleiner Verbesserungenüber viele Generationen hinweg er-hebliche Änderungen in Funktion undStabilität von Enzymen erreicht wer-den. Durch gerichtete Evolution wur-den in jüngster Zeit die Löslichkeitenvon Enzymen verbessert, Enantiose-lektivitäten gesteigert und erhöhteStabilitäten gegenüber thermischerInaktivierung erzielt [16,18,19]. Alsbesonders erfolgreich bei der gerich-teten Evolution neuer enzymatischerEigenschaften hat sich der Einsatzkombinatorischer Methoden erwie-sen, wie z.B. das „DNA-Shuffling“[20]. Hierbei wird die DNA aller her-

gestellten Genvarianten einem parti-ellen Verdau unterzogen. Anschlie-ßend werden die Fragmente durcheine PCR ohne externe Primer suk-zessive wieder zu vollständiger Längeamplifiziert. Dieses Vorgehen kann zueiner sehr schnellen und drastischenVerbesserung der Eigenschaften dergewünschten enzymatischen Eigen-schaften führen [21].

Über DNA-shuffling konnte einethermostabilere Mutante der CGTasehergestellt werden, die zur Zeit cha-rakterisiert wird.

Literatur

[1] Ladenstein, R., Antranikian, G., AdvBiochem Eng Biotechnol 61 (1998),37-85.

[2] Niehaus, F., Bertoldo, C., Kahler, M.,Antranikian, G., Appl Microbiol Bio-

technol 51 (1999), 711-729.[3] Prowe, S.G., Antranikian, G., Int J

Syst Evol Microbiol 51 (2001), 457-465.

[4] Terada, Y., Sanbe, H., Takaha, T., Kita-hata, S., Koizumi, K., Okada, S., ApplEnviron Microbiol 67 (2001), 1453-1460.

[5] Takaha, T., Smith, S.M., BiotechnolGenet Eng Rev 16 (1999), 257-280.

[6] Takata, H., Takaha, T., Okada, S., Taka-gi, M., Imanaka, T., J Bacteriol 178(1996), 1600-1606.

[7] Takata, H., Takaha, T., Okada, S., Hizu-kuri, S., Takagi, M., Imanaka, T., Car-bohydr Res 295 (1996), 91-101.

[8] Takata, H., Ohdan, K., Takaha, T.,Kuriki, T., Okada, S., J Appl Glycosci50 (2003), 15-20.

[9] Machida, S., Ogawa, S., Xiaohua, S.,Takaha, T., Fujii, K., Hayashi, K., FEBSLett 486 (2000), 131-135.

Abb. 3: Cyclodextrinbildung der rekombinanten CGTase mit 20 % Paselli-Stärke als Substrat bei 70°C und pH 8,5 in Anwesenheit von 5 mM Ca2+.

[10] van Wely, K.H., Swaving, J., Freudl,R., Driessen, A.J., FEMS MicrobiolRev 25 (2001), 437-454.

[11] Dilsen, S., Paul, W., Sandgathe, A.,Tippe, D., Freudl, R., Thommes, J.,Kula, M.R., Takors, R., Wandrey, C.,Weuster-Botz, D., Appl MicrobiolBiotechnol 54 (2000), 361-369.

[12] Manting, E.H., Driessen, A.J., MolMicrobiol 37 (2000), 226-238.

[13] Palmer, T., Berks, B.C., Microbiology149 (2003), 547-556.

[14] Thomas, J.D., Daniel, R.A., Errington,J. and Robinson, C., Mol Microbiol 39,1 (2001), 47-53

[15] Babbitt, P.C. and Gerlt, J.A., Adv Pro-tein Chem 55, (2000), 1-28

[16] Petrounia, I.P. and Arnold, F.H., CurrOpin Biotechnol 11, 4 (2000), 325-330

[17] Chen, R., Trends Biotechnol 19, 1(2001), 13-14

[18] Sterner, R. and Liebl, W., Crit RevBiochem Mol Biol 36, 1 (2001), 39-106

[19] Bornscheuer, U.T., Pohl, M., Curr OpinChem Biol 5 (2001), 137-143.

[20] Stemmer, W.P., Nature 370 (1994),389-391.

[21] Ness, J.E., Del Cardayre, S.B., Mins-hull, J., Stemmer, W.P., Adv ProteinChem 55 (2000), 261-292.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed AntranikianTU Hamburg-HarburgTechnische MikrobiologieKasernenstraße 12D-21073 HamburgTel.: 040-42878 3117Fax: 040-42878 2582eMail: antranikian@tuhh.de

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94 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

LIPASEN

Einsatz effizienterExpressionssysteme undMembranverfahren: Produktionvon Biokatalysatoren ausextremophilen Mikroorganismen� Dr. Karen Sonnenberger1, Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed Antranikian1, Prof. Dr. Roland Freudl2, Prof. Dr. Horst Chmiel3, Dr. Ralph Nonninger4, Dr. ThomasSchäfer5

1 Technische Mikrobiologie, Technische Universität Hamburg-Harburg, 2 Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich GmbH, 3 Gesellschaft fürumweltkompatible Prozesstechnik mbH, Saarbrücken, 4 ItN-Nanovation GmbH, Saarbrücken, 5 Department Bacterial Discovery Unit, Novozymes A/S,Dänemark

Die Natur hat eine große Diversität an Syntheseprozessen entwickelt, die an Spezifität und Effizienz nicht zu übertreffen sind. Dieses Potenzial wird bisheute kaum genutzt. Der Grund dafür ist meist die mangelnde Übertragung der Erkenntnisse vom Labor- auf den Industriemaßstab. Am Beispiel von Li-pasen soll modellhaft die Überproduktion von Enzymen aus extremophilen Mikroorganismen in mikrobiellen Produktionsstämmen demonstriert werden.Durch die Verwendung neuartiger Keramikmembranen und innovativer Fermentationstechniken sollen sowohl kälteaktive als auch hitzestabile Lipasenmit besonderen Eigenschaften, z. B. Enantioselektivität, bis zur Produktreife für den industriellen Einsatz gebracht werden.

Keywords: Biokatalysatoren, extremophil, Expression, Sekretion, Lipasen, Fermentation.

mit Hilfe rekombinanter Organismennotwendig und kann so der steigen-den Marktnachfrage in Zukunft ge-recht werden. Ausschlaggebend beider Produktion rekombinanter Enzy-me ist die Entwicklung effizienter Ex-pressionssysteme, mit denen Bioka-talysatoren aus Mikroorganismen inmesophilen Wirtsorganismen in gro-ßem Maßstab hergestellt werden kön-nen.

Das Projektziel ist es, am Beispielvon Lipasen aus extremophilen Mi-

kroorganismen modellhaft die re-kombinante Expression in mesophi-len mikrobiellen Produktionsstäm-men (z.B. Staphylococcus carnosus,Bacillus subtilis, Pichia pastoris)bei gleichzeitig verbesserter Sekre-tion der Enzyme sowie einer opti-mierten Fermentation zu demonstrie-ren. Das Projekt wird in Koopera-tion mit dem ForschungszentrumJülich, das sich seit vielen Jahren mitder Optimierung der Enzymsekretie-rung beschäftigt und mit den Firmen

Novozymes A/S, Gesellschaft für um-weltkompatible Prozesstechnik mbHund ItN-Nanovation GmbH durchge-führt. Die beiden letztgenannten Fir-men arbeiten an der Entwicklungneuartiger Keramikmembranen, dieim Fermentationsprozess zu einerProduktionsoptimierung beitragenwerden.

Lipasen – Bedeutung undAnwendung

Fette machen einen großen Teil derBiomasse aus. Der Abbau von Fettenerfolgt durch fettspaltende Enzyme,die Lipasen (Triacylglycerol-Acylhy-drolasen), welche die Hydrolyse vonTriacylglyceriden zu Glycerol undfreien Fettsäuren katalysieren (Abbil-dung 1). Die Lipasen gehören zu ei-ner großen Familie phylogenetischverwandter Proteine. Sie sind weitverbreitet in Tieren, Pflanzen und Mi-kroorganismen. Zurzeit sind ca. 400Proteinsequenzen von Lipasen be-kannt [2]. Die größte Quelle vonneuen Biokatalysatoren sind die mi-krobiellen Lipasen. Darunter befin-

Anlass und Zielsetzung

Biokatalysatoren werden von der In-dustrie zunehmend eingesetzt, umchemische Herstellungsprozesse zuersetzten, da hieraus sowohl ökolo-gische wie auch ökonomische Vortei-le erwachsen. Für viele Prozesse ste-hen aber noch keine geeigneten En-zyme zur Verfügung. ExtremophileMikroorganismen besitzen aufgrundIhrer Anpassung an ungewöhnlicheLebensräume besonders viele Enzy-me mit industriell interessanten Ei-genschaften, wie z. B. Thermostabili-tät oder Aktivität bei sehr hohen oderniedrigen pH-Werten [1]. Die vonIhnen katalysierten Reaktionen lau-fen oft sehr enantioselektiv ab, waszu hochreinen Produkten führt. Diesist z. B. besonders für die pharmazeu-tische Industrie von Interesse, da beimanchen Wirkstoffen nur ein Enan-tiomer therapeutisch wirksam ist. Dasich die biotechnologisch relevantenBiokatalysatoren oftmals nicht in aus-reichenden Mengen aus den Ur-sprungsorganismen gewinnen lassen,ist eine effektive Enzymproduktion Abb. 1: Triglyceridspaltung durch Lipase.

Sonderband | 2003 | 95BIOKATALYSEBIOKATALYSE

den sich auch eine Reihe von Lipa-sen aus extremophilen Mikroorga-nismen mit für die Industrie beson-ders interessanten Eigenschaften, wiez. B. hohe Thermostabilität oderEnantioselektivität (Abb. 2).

Die größte kommerzielle Anwen-dung finden hydrolytische Lipasen alsZusatzstoffe in Detergenzien fürHaushalt und Industrie. In der Le-bensmittelindustrie werden z. B. Li-pasen für die Anreicherung vonmehrfach ungesättigten Fettsäurenaus tierischen und pflanzlichen Lipi-den eingesetzt. Auch Phospholipasensind von großem Interesse, da siehervorragende Emulgatoren sind, diein der Lebensmittel- und Pharmain-dustrie benötigt werden. Anwen-dungsbeispiele im großen techni-

schen Maßstab gibt es allerdings bis-her nur wenige. Es steht also ein um-fangreiches, ungenutztes Potenzial zuVerfügung.

HoheBiokatalysatorenausbeutedurch optimierte Sekretion

Um eine optimale Sekretion der re-kombinant exprimierten Enzyme zuerreichen, sollen die Gram-positivenBakterien Bacillus subtilis und Sta-phylococcus carnosus eingesetzt wer-den, da aufgrund einer fehlenden äu-ßeren Membran Proteine direkt inden Kulturüberstand freigesetzt wer-den können. Für die Sekretion vonProteinen sind zwei bakterielle Pro-teinexportwege (Sec- und Tat-Weg)

Abb. 2: Lichtmikroskopische Aufnahme einer Lipase-produzierenden psy-chrophilen Hefe.

bekannt. Dabei handelt es sich umMultiproteinkomplexe, deren Aufga-be bei der Sekretion der Transportüber die Zellmembran ist [3]. Der Tat-Weg unterscheidet sich vom Sec-Weghauptsächlich dadurch, dass hier be-reits fertig gefaltete Proteine durch dieMembran geschleust werden. Unter-sucht werden soll für beide Wege derEinfluss verschiedener Signalpeptideauf die Sekretion heterologer Protei-ne. Weiterhin ist geplant, durch einelokalisierte Mutagenese des entspre-chenden Genbereichs der Signalpep-tide eine erhöhte Sekretion zu erzie-len.

Abb. 3: 300 l-Fermentationsreaktor für die Überproduktion rekombinanterEnzyme durch Mikroorganismen.

NeuartigeKeramikmembranen imFermentationsprozess

Durch eine optimierte Prozessfüh-rung lassen sich die Enzymausbeu-ten in rekombinanten Produktions-stämmen signifikant erhöhen. DieÜbertragung biotechnologischerProduktionsverfahren vom Labor-maßstab in den industriellen Maß-stab scheitert oft an der kontinu-ierlichen Entfernung des Produktsaus dem Bioreaktor. Durch die In-tegration neuartiger Module mitkeramischen Mehrkanal-Flach-membranen in den Fermenter be-steht die Möglichkeit, schon wäh-rend der Fermentation Kulturme-dium mit dem rekombinanten En-zym zu entnehmen und gleichzei-tig die produzierenden Mikroorga-nismen (Abb.3) im Fermenter zu-

rückzuhalten. Hierfür werden dieMembranen hinsichtlich Trennei-genschaften (Porendurchmesser)und geringer Wechselwirkung mitdem Kulturmedium (Fouling) op-timiert sowie geeignete sterilisier-bare Module entwickelt (Abb.4)[4]. Da diese direkt in den Fer-menter getaucht werden, könnendie Nachteile eines externen Mem-brankreislaufs (Scherkräfte, Stoff-gradienten) eliminiert werden. Au-ßerdem kann jeweils ein Teil derMembranmodule genutzt werden,um dem Fermenter wieder frischesMedium zuzuführen.

Abb. 4: Anordnung keramischer Vielkanal-Flachmembranen in einem La-bormodul.

Literatur

[1] Bertoldo, C., Antranikian, G., Enzymecatalysis in organic synthesis, Drauzund Waldmann 1 (2002), 313-334.

[2] Fischer, M., Pleiss, J., Nucl. Acid. Res.31 (2003), 319-321.

[3] van Wely, K.H., Swaving, J., Freudl,R., Driessen, A.J., FEMS MicrobiolRev. 25 (2001), 437-54.

[4] Weber, R., Chmiel, H., Mavrov, V., AnnN Y Acad Sci. 984 (2003), 178-93.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Dr. h.c. Garabed AntranikianTU Hamburg-HarburgTechnische MikrobiologieKasernenstr. 12D-21073 HamburgTel./Fax: 040-42878 3117 / 2582eMail: antranikian@tuhh.deWeb: www.icbio.de

96 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

stellt [2]. Daneben wurde auch eineReihe von anderen chemischen Ver-fahren beschrieben, die wie der klas-sische Prozess sehr energieaufwändigund/oder umweltunverträglich sind.Als Alternative wurden daher biotech-nologische Verfahren zur Pyruvat-Herstellung entwickelt, insbesondereaus Lactat [3] und Glucose. Die aufGlucose basierenden mikrobiellenVerfahren verwenden intakte Zellen,die Pyruvat primär durch die Reak-tionen der Glykolyse bilden. Ein gutuntersuchter Prozess verwendetStämme der Hefe Torulopsis glabra-ta, die eine multiple Vitamin-Auxotro-phie für Thiamin, Nicotinsäure, Bio-tin und Pyridoxin besitzen [4,5]. BeiFed-batch-Fermentation konnte mitdiesem Organismus ein maximalerPyruvat-Titer von 69 g/l (0,78 M) er-reicht werden bei einer Ausbeute von1,3 Mol/Mol (0,64 g/g) und einerRaum-Zeit-Ausbeute von 29,8 g/l/h.Aufgrund der multiplen Auxotrophi-en erwies sich eine ausgewogene Be-reitstellung der essentiellen Vitamineals sehr wichtig [4]. Ein vergleichba-res Verfahren zur Pyruvat-Herstellungaus Glucose wurde auch für Lipon-säure-auxotrophe Stämme von Esche-richia coli beschrieben [6]. Unteroptimierten Bedingungen konntenmit diesen Stämmen maximal 30 gPyruvat pro 50 g Glucose gebildet wer-den (1,2 Mol/Mol).

In den folgenden Kapiteln wird einneues Verfahren zur Herstellung von

Pyruvat aus Glucose mit Hilfe Acetat-auxotropher E. coli-Stämme be-schrieben. Es werden verschiedeneFermentationsprozessführungen vor-gestellt sowie der Einsatz der Elektro-dialyse zur Online-Abtrennung desPyruvats aus der Fermentationslö-sung.

Stammentwicklung und -charakterisierung

Alle bisher beschriebenen mikrobi-ellen Verfahren zur Herstellung vonPyruvat aus Glucose basieren auf Vit-amin-auxotrophen Stämmen, bei de-nen die Umsetzung von Pyruvat zuAcetyl-CoA und anderen Produktenbei entsprechender Vitamin-Limitie-rung partiell gehemmt ist und das an-gestaute Pyruvat daher ausgeschiedenwird. Probleme bei der technischenUmsetzung dieser Verfahren liegenunter anderem in der schwierigenKontrolle der Vitamin-Konzentration,insbesondere bei Verwendung vonStämmen mit multiplen Vitamin-Au-xotrophien. Das hier beschriebeneneue Verfahren basiert auf dem re-kombinanten E. coli-Stamm YYC202,der prototroph für Vitamine ist, aberzum Wachstum in Glucose-Minimal-medium Acetat benötigt [7]. DieseAcetat-Auxotrophie ist eine Folge dervollständigen Blockade der Pyruvat-Umsetzung zu Acetyl-CoA oder Ace-tat, die durch eine Deletion deraceEF-Gene sowie Mutationen in den

Abb. 1: Glukose-Stoffwechsel von E. coli YYC202ldhA. Dieser Stamm be-sitzt eine Deletion der aceEF-Gene, die für zwei Untereinheiten des Pyru-vat-Dehydrogenase-Komplexes kodieren, sowie Mutationen in den GenenpoxB (Pyruvat-“Oxidase”), pflB (Pyruvat-Formiat-Lyase), pps (PEP-Synthe-tase) und ldhA (NAD+-abhängige D-Lactat-Dehydrogenase). Er ist dahernicht in der Lage, Pyruvat zu Acetyl-CoA, Acetat, PEP und Lactat umzu-setzen und benötigt zum Wachstum in Glucose-Minimalmedium Acetat.

Einleitung

Pyruvat ist ein zentrales Zwischenpro-dukt des Stoffwechsels aller Zellenund an einer Vielzahl von enzymati-schen Reaktionen involviert. Danebenbesitzt Pyruvat auch eine wirtschaftli-che Bedeutung bei chemischen Syn-thesen, beispielsweise als Ausgangs-

substrat bei der industriellen Herstel-lung der Aminosäuren L-Tryptophan,L-Tyrosin oder L-Dihydroxyphenylala-nin (L-Dopa) [1].

Klassisch wird Brenztraubensäuredurch Dehydrierung und Decarboxy-lierung von Weinsäure in Gegenwarteines hohen Überschusses an Natri-umhydrogensulfat bei 220°C herge-

PYRUVAT

Pyruvat-Produktion aus Glucosemit rekombinanten Escherichiacoli-Stämmen� Dr. Ralf Takors2, Dipl.-Ing. Bruno Zelic 2, Dr. Tanja Gerharz1, Prof. Dr. Michael Bott 1

1Institut für Biotechnologie 1, Forschungszentrum Jülich, 52425 Jülich; 2Institut für Biotechnologie 2, Forschungszentrum Jülich, 52425 Jülich

Um ein effizientes mikrobielles Verfahren zur Produktion von Pyruvat aus Glucose zu etablieren, wurde ein rekombinanter Escherichia coli-Stamm konstruiert, der vollständig in seiner Fähigkeit blockiert ist, Pyruvat in Acetyl-CoA, Acetat oder Lactat umzuwandeln. Im Schüttelkolbensetzte dieser Acetat-auxotrophe E. coli-Stamm YYC202ldhA Glucose praktisch vollständig (>1,9 Mol/Mol) in Pyruvat um und schied das Pro-dukt ins Medium aus. Bei Fed-batch-Kultivierung im Fermenter mit Glucose- und Acetat-Regelung konnten maximal 62 g/l Pyruvat bei einerRaum-Zeit-Ausbeute von 42 g/l/d und einer integralen Pyruvat/Glukose-Ausbeute von 1,1 Mol/Mol erreicht werden. Aufgrund einer Hemmungder Produktbildung bei hohen Pyruvat-Konzentrationen (> ca. 350 mM) sowie zur Steigerung der molaren Ausbeute wurde eine repetitive Fed-batch-Prozessführung realisiert, bei der molare Ausbeuten bis zu 1,78 Mol Pyruvat/Mol Glucose bei einer Raum-Zeit-Ausbeute von 145 g/l/derreicht wurden. Diese Werte liegen deutlich über denen von alternativen mikrobiellen Pyruvat-Produktionsverfahren, wie z. B. mit Torulopsisglabrata, und machen in Kombination mit einer Reihe weiterer Vorteile eine technische Umsetzung des Verfahrens attraktiv.

Sonderband | 2003 | 97BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Genen pflB und poxB erreicht wurde(Abb. 1). Die aceEF-Gene kodierenfür die Pyruvat-Dehydrogenase- bzw.die Dihydrolipoyl-Transacetylase-Un-tereinheit des Pyruvat-Dehydrogena-se-Komplexes (PDH). Unter aerobenBedingungen wird der überwiegen-de Teil des Pyruvats durch diesenKomplex zu Acetyl-CoA umgesetzt.Die Mutationen in poxB und pflB füh-ren zur Inaktivierung der Pyruvat-„Oxidase“ (Pyruvat-Chinon-Oxidore-duktase) und der Pyruvat-Formiat-Lyase. Während die Funktion der Py-ruvat-„Oxidase“ unklar ist, ersetzt diePyruvat-Formiat-Lyase bei anaero-bem Wachstum den PDH-Komplex.Neben den genannten Mutationenbesitzt E. coli YYC202 eine weitereim pps-Gen für die PEP-Synthetase,die zur Inaktivierung dieses Enzymsführt.

Unter aeroben, nicht-wachsendenBedingungen setzte E. coli YYC202Glucose nahezu vollständig (>1,9Mol/Mol) in Pyruvat um und sekre-tierte es ins Medium (Abb. 2) [8].Diese Umsetzung kann durch folgen-de Reaktionsgleichung beschriebenwerden: Glucose + O

2 2 ➝ Pyruvat- +

2 H+ + 2 H2O. Auch wachsende Zel-

len von E. coli YYC202 produziertenin Schüttelkolben in Abhängigkeit vonder eingesetzten Acetat-Konzentrationbis zu 1,7 Mol Pyruvat/Mol Glucose.Leider wurden die genannten Wertenur bei geringen Zelldichten erreicht,bei höheren sank die molare Ausbeu-te stark ab, bedingt durch die Bildungdes Nebenprodukts Lactat (Abb. 3).Für eine spätere technische Umset-zung ist die Lactat-Bildung sehr un-günstig, da sie nicht nur die Ausbeutereduziert, sondern auch die Aufarbei-tung des Pyruvats aufwändiger macht.Um die Lactat-Bildung zu unterdrük-ken, wurde das ldhA-Gen, das für dieNAD+-abhängige D-Lactat-Dehydroge-nase kodiert, in E. coli YYC202 durchInsertion eines Kanamycin-Resistenz-gens inaktiviert. Der resultierendeStamm E. coli YYC202ldhA bildetesowohl im Schüttelkolben (Abb. 3) alsauch im Fermenter kein Lactat mehr,wodurch gezeigt wurde, dass aus-schließlich das ldhA-Genprodukt fürdie Lactat-Bildung verantwortlich war[8].

Fermentationsentwicklung

Für die Fermentationsentwicklung[9] wurde ein 7,5-Liter Bioreaktor(Infors, Schweiz) mit 2,5 Liter Start-volumen sowie ein Glucose-Acetat-Minimalmedium eingesetzt. Die pH-Regelung auf pH 7,0 erfolgte durch

Titration mit 25 %iger Ammonium-lauge. In allen Experimenten wurdeeine Temperatur von 37°C und einepO

2-Konzentration >40 % bei einem

Reaktorüberdruck von 0,2 - 0,8 bareingestellt. Die O

2- und CO

2-Konzen-

trationen im Abgas wurden über ei-nen Gasanalysator (Binos 102 M, Ro-semount, Deutschland) bestimmt.Die Glukose-Konzentration wurdeonline mittels Kamanfilter und Mini-malvarianzregler zusammen mit ei-nem Online-Glukose-Messgerät(OLGA, IBA GmbH, Göttingen) auf 5g/l eingeregelt.

1. Geregelte Fed-batch-Fermentationen

Die Fed-batch-Prozessführung (Abb.4) erfolgte durch Regelung von Glu-kose (auf 5 g/l) und Acetat [10]. AlsErgebnis einer ersten Versuchsseriekonnte ein einfacher, äquimolarerZusammenhang zwischen der Acetat-Verbrauchsrate (ACR) und der CO

2-

Produktionsrate (CTR) gefundenwerden. Darauf aufbauend wurdeeine indirekte Acetat-Regelung durchOnline-Bestimmung der CO

2-Emissi-

onsrate und Einstellung der Acetat-Feedrate nach folgender Gleichungetabliert, bei der VR das Reaktions-volumen des Bioreaktors darstellt:

ACR (g/h) = [927 (g/mmol) x CTR(mmol/l/h) x VR (l)] / F

Mit Hilfe des einführten Faktors F(dimensionslos) kann bestimmt wer-den, ob die Acetat-Versorgung limi-tierend ist (F>1) oder ob Acetat imÜberschuss zugegeben wird und da-her akkumuliert (F<1). Der Acetat-Feed wurde gestoppt, nachdem dieBiomassebildung über ein Zeitinter-vall von 3 h konstant blieb.

Abbildung 5 gibt einen Überblicküber die erreichten Pyruvat-Titer un-ter Verwendung des Stamms E. coliYYC202ldhA bei verschiedenen Ace-tat-Feed-Strategien. Es ist zu erken-nen, dass bei Acetat-Limitierung derPyruvat-Titer unter 500 mM lag, wäh-rend bei Acetat-Sättigung und Acetat-Überschuss Titer zwischen 630 – 700mM Pyruvat erzielt wurden. Unterdiesen Prozessbedingungen lag dieintegrale Pyruvat/Glukose-Ausbeutebei 1,11 Mol/Mol und die Raum-Zeit-Ausbeute bei 42 g/l/d. Allerdings wur-de festgestellt, dass die spezifischePyruvat-Produktionsrate bei Konzen-trationen >350 mM Pyruvat drastischabnahm und bei ca. 700 mM Pyruvatvollständig zum Erliegen kam. Diemolekulare Ursache für diese Pro-dukt-Inhibierung konnte noch nichtgeklärt werden.

2. Repetitive Fed-batch-Prozessführung

Um die Produkt-Inhibierung zu ver-mindern und die Produkt/Substrat-Ausbeute zu steigern, wurden Expe-rimente zur kontinuierlichen Fer-mentation von E. coli YYC202ldhAmit Zellrückhaltung durchgeführt, diejedoch nicht den gewünschten Erfolgzeigten. Als Alternative wurde dahereine repetitive Fed-batch-Prozessfüh-rung etabliert [11], wozu im Bypassdes 7,5-Liter-Bioreaktors eine Ultra-filtrationseinheit (0,98 m2 Membran-fläche, 500 kDa Cut-off, Schleicherund Schüll, Deutschland) installiertund vor Beginn der Experimente 3 hmit 1 M Natronlauge gereinigt wur-

de. Die repetitive Fed-batch-Pro-zessführung startete, nachdem in Pha-se I die Biomassebildung analog zurbisherigen Vorgehensweise erfolgtwar und konstant blieb. Die Suspen-sion wurde dann durch den Bypassgepumpt, bis ca. 60 % des Fermenta-tionsmediums zellfrei aus dem Systementnommen worden waren. Anschlie-ßend wurde das gleiche Volumen anfrischem Medium über die Ultrafiltra-tionseinheit in den Fermenter ge-pumpt. Dieser Zyklus wurde wieder-holt, nachdem die Glucose-Feedrateauf <10 g/h gesunken war.

Wie in Abbildung 6 dargestellt,konnten vier Produktionszyklen (II-V) durchgeführt werden, bevor diePyruvat-Produktionsrate stark ab-

Abb. 2: Umsetzung von Glucose zu Pyruvat durch eine Zellsuspension vonE. coli YYC202 mit einer OD600 von 0,8. Die Zellen wurden in Glucose-Ace-tat-Minimalmedium vorkultiviert, anschließend in einem Puffer pH 7,0 mit8 mM Glucose resuspendiert und bei 37°C und 160 Upm inkubiert.

Abb. 3: Vergleich der Glucose-Umsetzung durch Zellsuspensionen (OD600

= 4,5) von E. coli YYC202 (A) und E. coli YYC202ldhA (B). Die Zellen wur-den in Glucose-Acetat-Minimalmedium vorkultiviert und anschließend in500 mM MOPS-Puffer pH 7 mit ca. 100 mM Glucose bei 37°C und 160 Upminkubiert. In (A) wurden 1,3 Mol Pyruvat/Mol Glucose und 0,5 Mol Lactat/Mol Glucose gebildet, in (B) 1.7 Mol Pyruvat/Mol Glucose und kein Lactat.

98 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

sank. Die höchste Raum-Zeit-Ausbeu-te von 145 g/l/d konnte in Phase IIerreicht werden und bedeutete einebeträchtliche Steigerung der maxima-len Raum-Zeit-Ausbeute von 42 g/l/daus dem nicht-repetitiven Fed-batch-Ansatz [10]. Die molaren Pyruvat-/Glukose-Ausbeuten, die in den Pro-duktionsphasen II-IV erreicht wur-den, betrugen über 1,7 Mol/Mol, wasebenfalls eine drastische Verbesse-rung gegenüber dem Fed-batch-Pro-zess (1,1 Mol/Mol) darstellt. Wie ausAbbildung 6 nochmals deutlich wird,konnte die maximale spezifische Py-ruvatproduktionsrate von ca. 7-9mmol/g

BTM/h nur bei Pyruvatkonzen-

Abbildung 8 zeigt beispielhaft denVerlauf eines ISPR-Experimentes, dasprinzipiell in drei Phasen eingeteiltwerden kann, nämlich die Fed-batch-Phase zur Biomasseproduktion (Pha-se I), die kontinuierliche Produktions-phase, bei der ein konstanter Feed vonMedium (ca. 60 – 80 g Glucose/h) inden Reaktor gepumpt und die gleicheMenge über die Diafiltrationseinheitaus dem Reaktor entnommen wurde(Verdünnungsrate 0,1/h) (Phase II)und die ISPR-Phase mit vollständig in-tegrierter Elektrodialyse (III). Wie bei

Abb. 4: Experimenteller Aufbau zur Fed-batch-Fermentation (mit Zellrück-haltung) von E. coli YYC202ldhA im 7.5-L-Bioreaktor. Wie im Text be-schrieben, wurde die Glucose-Zugabe direkt, die Acetat-Zugabe indirektgeregelt. Zellfreies Permeat konnte über die Ultrafiltrationseinheit abgezo-gen werden.

Abb. 6. Ergebnis der repetitiven Fed-batch-Fermentation mit E. coliYYC202ldhA. Im oberen Teil der Abbildung ist der Verlauf der Zelldichtegezeigt (OD600), im mittleren Teil der Verlauf der Pyruvat-Konzentration undim unteren Teil die spezifische Pyruvat-Produktionsrate. Details sieheText.

trationen <500 mM erreicht wurde.Höhere Produkttiter führten zu dra-stisch abfallenden Pyruvat-Bildungs-raten am Ende jeder Produktionspha-se.

3. Vollständig integrierteElektrodialyse

Nachdem Voruntersuchungen zur Py-ruvatabtrennung aus wässrigen Mo-delllösungen und aus Fermentations-überstand mittels Elektrodialyse er-folgreich verliefen, erfolgte die voll-ständige Integration der Elektrodialy-se-Einheit in den Fed-batch-Prozess,resultierend in einem „in situ productrecovery“-Verfahren (ISPR-Verfah-ren) [11]. Wie in Abbildung 7 darge-stellt, besteht der Prozess aus einerFermentationseinheit mit integrierterUltrafiltration, einem nachfolgendenUltrafiltrationsschritt zur Proteinab-trennung, einer Pyruvatabtrennungmittels Elektrodialyse und einer nach-geschalteten Mikrofiltrationseinheitzur Rückführung des abgereichertenMediums in den Reaktor. Die Abtren-nung der Proteine im zweiten Ultrafil-trationsschritt erfolgte mit Ultrafiltrat-ions-Flachmembranen (Schleicherund Schüll) mit einem Cut-off von 10kDa. Die Mikrofiltrationseinheit miteiner Porengröße von 0,2 µm dientezur Aufrechterhaltung der Sterilitäts-grenze.

Abb. 5: Einfluss der Acetat-Feed-strategie auf den Pyruvat-Titer beiFed-bach-Fermentation von E. coliYYC202ldhA. Rauten, Acetat-Limi-titierung (F = 2.0); Quadrate, Ace-tat-Limitierung (F = 1.5); Kreise,Acetat-Sättigung (F = 1.0); Dreiek-ke, Acetat-Akkumulation (F = 0.8).

den vorangegangenen Experimentenwurde in Phase I eine Pyruvat-Akku-mulation bis ca. 600 mM erreicht. Inder kontinuierlichen Produktionspha-se II blieb diese Konzentration kon-stant, bis nach ca. 29 h in Phase III dieElektrodialyse zugeschaltet wurde. DieElektrodialyse konnte ca. 14 h paral-lel zum Produktionsprozess vollstän-dig integriert betrieben werden, waszu einer signifikanten Reduzierung derPyruvatkonzentration im Reaktor umca. 20 % führte. Entgegen der ur-sprünglichen Erwartung, dass die Re-

Sonderband | 2003 | 99BIOKATALYSEBIOKATALYSE

duktion der Pyruvatkonzentration ei-nen positiven Effekt auf die Pyruvat-Produktionsrate hat, fiel diese Rate vonursprünglich 60 mM/h auf ca. 25 mM/h nach Beginn der Elektrodialyse ab.Als Ursache wird eine Limitierung desStoffwechsels durch Co-Abtrennungvon z.B. Salzen oder anderen gelade-nen Komponenten aus der Fermenta-tionslösung vermutet. Als Folge dieserreduzierten Produktionsrate lag dieRaum-Zeit-Ausbeute mit 68 g/l/d unddie Produkt/Substrat-Ausbeute mit 1,2Mol/Mol deutlich unter den im repeti-tiven Fed-batch-Verfahren erzieltenWerten. Wird die gesamte Menge desproduzierten Pyruvats auf das Arbeits-volumen des Reaktors bezogen, sowurde rein rechnerisch in dem Expe-riment ein Titer von >900 mM Pyru-vat erreicht.

Ausblick

Die dargestellten Resultate zeigen einneues Konzept zur mikrobiellen Her-stellung von Pyruvat aus Glucose auf,das nicht mehr auf Vitamin-auxotro-phen Stämmen basiert, sondern aufAcetat-auxotrophen E. coli-Stämmen,bei denen die Umsetzung von Pyruvatzu Acetyl-CoA, Acetat und Lactat voll-ständig blockiert ist. Wachstum undProduktbildung dieser Stämme könnendurch eine Online-Regelung des Ace-tat-Feeds beeinflusst werden, die aufder beobachteten Äquivalenz von CO

2-

Bildungsrate und Acetat-Verbrauchsra-te basiert. Bei repetitiver Fed-batch-Prozessführung konnten Pyruvat-Kon-zentrationen bis zu 700 mM, Produkt/Substrat-Ausbeuten bis zu 1,8 Mol/Molund Raum-Zeit-Ausbeuten bis zu 145g/l/d erreicht werden. Die Elektrodia-lyse konnte als Aufarbeitungsmethodeetabliert werden, die sich für den Off-line-Betrieb eignen würde. Aufgrundder positiven Ergebnisse aus dem re-petitiven Fed-batch-Ansatz bietet es sichan, in einem nächsten Schritt den Py-

Abb. 8: Pyruvat-Konzentration cP (Kreise) und volumetrische Pyruvat-Pro-duktionssrate (PPR, Dreiecke) im Verlaufe des ISPR-Prozesses mit voll-ständig integrierter Elektrodialyse zur Pyruvat-Abtrennung. Phase I, Bio-massebildung, Phase II, kontinuierliche Prozessführung mit Zellrückhal-tung, Phase III, integrierte Pyruvatabtrennung. Die Konzentrationen des‚integrierten Prozesses’ (offene Kreise) sind rechnerisch und beziehensich auf das tatsächliche Arbeitsvolumen im Reaktor.

ruvat-Produktionsprozess mit immobi-lisierten Zellen von E. coli YYC202ldhAweiter zu optimieren und in den tech-nischen Maßstab zu übertragen. Dar-überhinaus können die dargestelltenStrategien auch für die mikrobielleProduktion anderer organischer Säu-ren von großem Interesse sein.

Referenzen

[1] Li, Y., Chen, J., Lun S.-Y., Appl. Micro-biol. Biotechnol. 57 (2001a), 451-459.

[2] Howard, J.W.,Fraser, W.A., Org. Synth.Coll. 1 (1932), 475-476.

[3] Eisenberg, A., Seip, J.E., Gavagan,J.E., Payne, M.S., Anton, D.L., DiCosi-mo, R. J., Mol. Catal. B. Enzymatic 2(1997), 223-232.

[4] Li ,Y., Chen, J., Lun, S.Y., Rui, X.S.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 55(2001b), 680-685.

[5] Li, Y., Hugenholtz, J., Chen, J., Lun,S.-Y., Appl. Microbiol. Biotechnol. 60(2002),101-107.

[6] Yokota, A., Henmi, M., Takaoka, N.,Hayashi, C., Takezawa, Y., Fukumori,Y., Tomita, F., J. Ferm. Bioeng. 83(1997) 132-138.

[7] Georgiou, C.D., Fang, H., Gennis, R.B.,J. Bacteriol. 169 (1987), 2107-2112.

[8] Gerharz, T., Zelic, B., Takors, R., Bott,M., German Patent Application10129714.4 (2001).

[9] Gerharz, T., Zelic, B., Takors, R., Bott,M, German Patent Application10220234.6 (2002).

[10] Zelic, B., Gerharz, T., Bott, M., VasicRacki, D., Wandrey, C., Takors, R.,Chem. Eng. Technol. (2003), imDruck.

[11] Zelic, B., Gostovic, S., Vuoriletho, K.,Vasic-Racki, B., Takors, R., Biotech-nol. Bioeng. (2003), im Druck.

Danksagung

Die Autoren danken der DeutschenBundesstiftung Umwelt (DBU) für diefinanzielle Unterstützung dieses Pro-jekts im Rahmen des VerbundprojektsBiokatalyse (www.biokatalyse.de) so-wie der Amino GmbH (Frellstedt), dieals Industriepartner an der techni-schen Umsetzung des Verfahrens ar-beitet. Ein weiterer Dank gilt Prof. E.Heinzle und A. Biwer vom Institut fürTechnische Biochemie der Universi-tät des Saarlandes (Saarbrücken) fürdie ökologische und ökonomischeEvaluation des Projekts. Für die kon-tinuierliche und großzügige Unterstüt-zung der Forschungsarbeiten bedan-ken sich die Autoren bei Prof. H. Sahmund Prof. C. Wandrey.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Michael BottInstitut für Biotechnologie 1Forschungszentrum JülichD-52425 JülichTel.: 02461-6155 15Fax: 02461-6127 10eMail: m.bott@fz-juelich.de

Abb. 7: Experimenteller Aufbau des kompletten ISPR-Prozesses mit vollständig integrierter Elektrodialyse-Anla-ge. Zellfreies Permeat wurde dem Bioreaktor über die Ultrafiltrationseinheit entnommen, die darin enthaltenenProteine in einem zweiten Ultrafiltrationsschritt (10 kDa Cut-off) abgetrennt und das Permeat zur Pyruvat-Abrei-cherung in die Elektrodialyse-Einheit geleitet. Das abgereicherte Medium wurde in den Reaktor zurückgeführt.Die in der Elektrodialyse gebildete Natronlauge bzw. das Ammonium wurde zur Unterstützung der Titration imBioreaktor ebenfalls zurückgeführt.

100 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

BIOTRANSFORMATION

Entwicklung biotechnologischerVerfahren zur mikrobiellenReduktion von Ketoverbindungen� Andrea Weckbecker1, PD Dr. Werner Hummel1, Maya Amidjojo2, Prof. Dr. Dirk Weuster-Botz2, Michel Brik Ternbach3, Dr. Ralf Takors3, PD Dr. MichaelMüller3, Prof. Dr. Christian Wandrey3

1Institut für Molekulare Enzymtechnologie, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 2Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, Technische Universität München,3Institut für Biotechnologie 2, Forschungszentrum Jülich GmbH

Am Beispiel der Reduktion prochiraler Ketone wurden Verfahren entwickelt, um mit mikrobiellen Methoden – BIOHYDRIERUNGEN – die Darstellung en-antiomerenreiner Alkohole im technischen Maßstab zu erreichen.Konkretes Beispiel sind enantiomerenreine Hydroxyhexansäureester, die als Bausteine für Pharmaka (Arteriosklerose-Mittel) benötigt werden. Mit Hilfeeiner (R)-spezifischen, NADP-abhängigen Alkohol-Dehydrogenase (ADH) aus Lactobacillus kefir können diese Verbindungen hoch enantiomerenrein ausprochiralen Ketonen hergestellt werden. Für die Regenerierung des Cofaktors NADPH stehen verschiedene Enzymsysteme zur Auswahl, z. B. Glucose/Glucose-Dehydrogenase oder Glucose-6-Phosphat/Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase.Für die Hydrierreaktionen wurden die Mikroorganismen mit gentechnischen Methoden, durch Coexpression von Reduktase und einem Coenzym-regene-rienden Enzym, verbessert. Als Coenzym-regenerierendes Enzym wurde die Glucose-Dehydrogenase (GDH) aus Bacillus subtilis ausgewählt. Es wurdenzwei Plasmide konstruiert, welche sowohl ADH als auch GDH in unterschiedlicher Reihenfolge enthalten. Beide Coexpressions-Systeme zeigen sowohlADH- als auch GDH-Aktivität und können in Ganzzellbiotransformationen eingesetzt werden.Die Eduktbereitstellung erfolgt im Rührkesselreaktor mikrodispers durch in situ-Erzeugung von Edukttropfen in der wässrigen Phase (Durchmesser 30 –50 µm). Basierend auf reaktionstechnischen Untersuchungen und der Online-Kontrolle der aktuellen Tropfengröße und -verteilung mit Hilfe der 3-dimen-sionalen optischen Laser-Reflexionsmessung (3D-ORM) werden Zulaufverfahren entwickelt, um bei der Biohydrierung hohe Raum-Zeit-Ausbeuten beihohem Enantiomerenüberschuss im technischen Maßstab zu erreichen.

Keywords: Biotransformationen, Cofaktorregenerierung, Coexpression, mikrodisperse Eduktbereitstellung, 3-dimensionale optische Laser-Reflexions-messung, Hydroxyhexansäureester, Makrokinetik.

die Produktionsschritte den an Phar-mazeutika gestellten Anforderungenentsprechen: Hohe Enantiomeren-reinheit, keine Schwermetall- und or-ganische Lösungsmittelrückständesowie hohe Produktreinheit. Die tech-nische Durchführung erfolgt aber inder Regel unter extremen, energiein-tensiven Bedingungen, unter Verwen-dung giftiger und umweltbelastenderSchwermetallkatalysatoren sowie gro-ßer Mengen organischer Lösungsmit-tel.

Vergleichende Untersuchungen be-legen, dass die Biokatalyse unter öko-nomischen wie auch ökologischenGesichtspunkten mit der chemischenasymmetrischen Katalyse konkurrie-ren kann. Die vergleichende Untersu-chung chemischer und biochemi-scher Reduktionen zur Synthese von(R)-2-Hydroxy-4-phenylbuttersäurewurde von der Gruppe um Spindlerund Blaser et al. (Novartis AG, ehe-mals Ciba-Geigy AG) [3] publiziert.Diese kommen zu dem Ergebnis, dassdie Biokatalyse insbesondere dannkonkurrenzfähig ist, wenn das Ziel-

produkt möglichst enantiomerenreinvorliegen sollte. Dies ist der Fall beichiralen Pharmazwischenprodukten.

Stand der Forschung undTechnik

Mit Hilfe von Biokatalysatoren ist esprinzipiell möglich, enantioselektiveReduktionen zur Darstellung enantio-merenreiner sekundärer Alkoholedurch Ketonreduktion in einem Schrittdurchzuführen. Bei der Biotransfor-mation kommen weder Schwermetall-Katalysatoren noch umweltbelastendeChemikalien zum Einsatz. Eine exten-sive Nutzung organischer Lösungsmit-tel ist nicht notwendig.

Hydrolytische Enzyme, wie Lipasenoder Esterasen, sind prinzipiell für dieDarstellung enantiomerenreiner Al-kohole geeignet. Allerdings geht mandabei von dem jeweiligen Racemataus, sodass durch kinetische Race-matspaltung die Ausbeute auf maxi-mal 50 % beschränkt ist.

Das Potenzial der Bäckerhefe Sac-charomyces cerevisiae und anderer

Hefen zur stereoselektiven Redukti-on ist auch im präparativen Maßstabsehr gut untersucht und dokumentiert[4]. Die breite Anwendbarkeit derBäckerhefe basiert auf der günstigenVerfügbarkeit (600.000 jato), der ef-fizienten intrazellulären Regenerie-rung von Cofaktoren, der Permeabi-lität der Zellmembranen für verschie-denste organische Substanzen unddem Vorhandensein verschiedener(R)- und (S)-spezifischer Oxidore-duktasen, die ein breites Substrat-spektrum der Bäckerhefereduktionzur Folge haben. Dieser letzte Um-stand ist aber auch für die oftmalserniedrigten Enantiomerenüber-schüsse bei Ganzzellbiotransforma-tionen mit Hefen verantwortlich.

Dieses Problem kann durch denEinsatz isolierter Oxidoreduktasenumgangen werden, was allerdings fürpräparative Umsetzungen ein effizien-tes Cofaktorregenerierungssystemvoraussetzt.

Ein aktueller Ansatz der japani-schen Arbeitsgruppe um Soda [5]kombiniert die Vorteile der Ganzzell-

Einleitung

Obwohl bei der katalytischen, asym-metrischen Reduktion von C=C-,C=O- und C=N-Bindungen innerhalbder letzten 15 Jahre enorme Fort-schritte im Laboratoriumsmaßstaberzielt worden sind, konnten dieseErgebnisse nicht direkt in den tech-nischen Maßstab übertragen werden.Die Bedeutung der asymmetrischenSynthese wird aber durch folgendeZahlen belegt: Die Zunahme des Um-satzes enantiomerenreiner Pharma-zeutika betrug 1997 weltweit 21 % auf$ 90 Mrd [1]. Noch in 1994 betrugder Gesamtumsatz für chirale Wirk-stoffe nur $ 42,2 Mrd, was einer Ver-doppelung innerhalb von 3 Jahrenentspricht [2]. Eine weitere jährlicheSteigerungsrate im zweistelligen Be-reich wird für die kommenden Jahreerwartet [1].

Da katalytische asymmetrische Re-duktionen im technischen Maßstabinsbesondere zur Herstellung vonZwischenstufen in der Wirkstoffpro-duktion eingesetzt werden, müssen

Sonderband | 2003 | 101BIOKATALYSEBIOKATALYSE

biotransformation, die im Wesentli-chen in der Robustheit des Systemsund der Selbstvermehrung der Kata-lysatoren liegen, mit den Vorteilen derhohen Enantiomerenreinheit isolier-ter Enzyme, indem die erforderlichenSynthese-Enzyme in einem geeignetenWirtsstamm coexprimiert und ohneIsolierung in Form ganzer Zellen ein-gesetzt werden. Die grundsätzlicheRealisierbarkeit dieses Ansatzes wur-de in dieser Arbeit am Beispiel derCoexpression von L-Aminosäurede-hydrogenasen und Formiatdehydro-genase in E. coli demonstriert. Sodaund Mitarbeiter konnten zeigen, dassausgehend von α-Ketocarbonsäurendie entsprechenden L-Aminosäurenin hohen chemischen und optischenAusbeuten durch mikrobielle Ganz-zellbiotransformation gewonnen wer-den können. Allerdings ist dieser An-satz auf die Darstellung von Amino-säuren beschränkt.

Die reaktionstechnische Untersu-chung von Umsetzungen mit ganzenZellen hat bisher gezeigt, dass die ge-ringe Wasserlöslichkeit typischerEdukte und Produkte, sowie oftmalsauftretende Inhibierungen, wesentli-che Hindernisse bei der technischenRealisierung darstellen. Zur Überwin-dung einer geringen Wasserlöslich-keit des Edukts wird die mikrokristal-line Eduktzugabe oder die Zugabe vonLöslichkeitsvermittlern vorgeschla-gen. Meist wird versucht, das schlechtwasserlösliche Edukt über eine zwei-te, nicht mit Wasser mischbare Pha-se im Reaktor vorzulegen, um die Ver-fügbarkeit zu verbessern. Die Verwen-dung einer zweiten nicht mit Wassermischbaren Phase wird besondersdann favorisiert, wenn das gebildeteProdukt sich ebenfalls über diese zu-sätzliche Phase schnell aus dem Re-aktor entfernen lässt, um Produktin-hibierungen oder -instabilitäten zuvermeiden [6].

In Vorarbeiten sind mehrere neueCarbonyl-reduzierende Dehydrogena-sen isoliert und biochemisch charak-terisiert worden, z.B. (R)-spezifischeAlkohol-Dehydrogenasen (ADH) ausLactobacillus brevis und L. kefir,eine (S)-ADH aus Rhodococcus ery-thropolis und aus Candida parapsi-lopsis oder eine (R)-spezifische Dia-cetyl-Reduktase aus L. kefir (sieheTab. 1). Alle Enzyme sind bereits bio-chemisch charakterisiert worden. Siesetzen ein sehr breites Spektrum anSubstraten durch Hydrierung stereo-spezifisch zu chiralen Alkoholen um.

Besonders die ADH aus L. breviszeichnet sich durch eine breite Sub-stratspezifität, hohe Enantioselektivi-

tät und gute pH- und Temperatursta-bilität aus [7]. So konnten 3,5-Di-ketohexansäureester durch eine re-gioselektive Biohydrierung mit die-sem Enzym umgsetzt werden. Die re-sultierenden (5R)-5-Hydroxy-3-oxo-hexansäureester werden optisch rein(> 99.5 % ee) in hohen chemischenAusbeuten erhalten (siehe Abb. 1)[8].

Zur reaktionstechnischen Über-windung niedriger Produktivitätenaufgrund der schlechten Wasserlös-lichkeit von Edukten wurde in Vorar-beiten die Bereitstellung des Eduktsin mikrokristalliner Form als Alterna-tive zur üblichen Verwendung einesnicht mischbaren organischen Lö-sungsmittels als „Eduktdepot“ imRührreaktor untersucht. Es konntegezeigt werden, dass bei Produkten,die besser wasserlöslich sind als dasEdukt, eine selektive Rückhaltung des

am Beispiel der regioselektiven Oxi-dation von Terfenadin mit Cunning-hamella blakesleeana erstmalig de-monstriert [9].

Die zeitnahe praktische Umsetzungvon mikrobiellen Reaktionen machteine effektive Bioprozessentwicklungerforderlich. Hierzu wurden insbe-sondere neue Methoden zur Optimie-rung von Reaktionsbedingungen, zurparallelen Versuchsdurchführung,zur Identifizierung von kinetischenModellen und zur Prozesskontrolle inBioreaktoren entwickelt [10-12].

Projektinhalt

Ziel des Forschungsvorhabens „Bio-hydrierung“ ist die Entwicklung vonallgemein nutzbaren mikrobiellenVerfahren zur Biohydrierung, die imtechnisch-industriellen Maßstab ein-setzbar sind. An ausgewählten Bei-

binanten E. coli-Stämmen zur Durch-führung enantioselektiver Reduktio-nen mit ganzen Zellen. Dabei soll ne-ben der gewünschten Reduktase einSystem zur Coenzym-Regenerierungin E. coli coexprimiert werden (Abb.2).

Als Modellreaktion dient die regio-und enantioselektive Reduktion von6-Chlor-3,5-dioxohexansäure-tert-butylester zu 6-Chlor-5-hydroxy-3-oxo-hexansäure-tert-butylester mitHilfe einer NADP-abhängigen, (R)-spezifischen Alkohol-Dehydrogenase(ADH) aus Lactobacillus kefir. 5-Hydroxy-3-oxo-hexansäurederivatesind wichtige chirale Intermediate beider Produktion synthetischer HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren.

Zur NADPH-Regenerierung stehenverschiedene enzymatische Systemewie Formiat/Formiat-Dehydrogenase(NADP-abhängiges Mutein; Gen nichtverfügbar), Glucose/Glucose-Dehy-drogenase, Gluconat/Gluconat-Dehy-drogenase, Malat/Malat-Dehydroge-nase oder Glucose-6-Phosphat/Glu-cose-6-Phosphat-Dehydrogenase zurAuswahl. Das System Glucose/Gluco-se-Dehydrogenase (GDH) weist eini-ge Vorteile auf. So liegen die spezifi-schen Aktivitäten von ADH und GDHaus Bacillus subtilis in der gleichenGrößenordnung (ca. 400 U/mg fürdie homogenen Enzyme), die Gense-quenz der GDH ist literaturbekannt,das Enzym ist stabil und das SubstratGlucose ist preiswert und führt, eben-so wie das Oxidationsprodukt Gluco-nolacton, nicht zu störenden Neben-reaktionen bei Biotransformationen.

Die Gene der ADH aus L. kefir so-wie der GDH aus B. subtilis wurdenisoliert und in unterschiedlicher Rei-henfolge in einen Expressionsvektorkloniert. Das Konstrukt mit dem Plas-mid pAW-3 enthält hinter der riboso-malen Bindungsstelle die ADH als er-stes Gen und im Anschluss an eineweitere ribosomale Bindungsstelledie GDH, während bei Plasmid pAW-4 die Reihenfolge der beiden Geneumgekehrt wurde (Abb. 3).

Nach Transformation in verschie-dene E. coli-Wirtsstämme wurden dierekombinanten Stämme unter Ex-pressionsbedingungen (1 mM IPTG,Induktion: 3 h bei 30°C) angezogen,aufgeschlossen und die Aktivität derADH und GDH im Rohextrakt be-stimmt (Tab. 2). Im Konstrukt pAW-3, das die ADH als erstes Gen enthält,weist die ADH eine etwa dreimal sohohe Aktivität auf wie die GDH, wäh-rend die Verhältnisse im System pAW-4 mit der GDH als erstem Gen umge-kehrt sind [13].

Abb. 1: Enzymatische Reduktion von 3,5-Dioxohexansäure-tert-butylester(Ausbeute 80 %, > 99.5 % ee).

Abb. 2: Coexpression einer ADH zur Synthese eines chiralen Alkohols (A)gekoppelt mit einem NAD(P)H-Regenerierungsenzym (B-1 bis B-4).

mikrokristallinen Edukts (und desBiokatalysators) durch eine Quer-stromfiltration im Bypass des Biore-aktors erfolgen kann. Das in derwässrigen Phase gelöste Produkt wirddabei über die Filtrationseinheit kon-tinuierlich aus dem Reaktor entferntund kann somit die biologische Re-aktion nicht inhibieren. Die prinzipi-elle Anwendbarkeit dieses neuen re-aktionstechnischen Ansatzes wurde

spielen chiraler sekundärer Alkoho-le, die industriell im Tonnenmaßstabbenötigt werden, soll die enantiose-lektive Reduktion prochiraler Ketonemit ganzen Zellen untersucht werden.

Biologische Systeme zurBiohydrierung

Vorrangige Zielsetzung dieses Teilpro-jekts ist die Bereitstellung von rekom-

102 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

In weiterführenden Experimentensollen diese beiden Systeme umfas-send biochemisch charakterisiertund anschließend vergleichend be-wertet werden. Alternativ zur Gluco-se-DH soll ein weiteres Enzym für dieNADPH-Regenerierung geprüft wer-den.

Bioorganische Chemie

Zielsetzung der Arbeiten im Bereichder Bioorganischen Chemie ist dieEntwicklung von Synthesen und dieBereitstellung von prochiralen Keto-nen als Substrate für enantioselekti-

generierungssystemen deutlich er-höht werden kann und somit die Pro-duktivität einen auch produktions-technisch interessanten Wert erreicht.Durch die Verwendung von Bäcker-hefe (BY) konnte diese Synthesestra-tegie auf die Darstellung beider En-antiomeren von 5-Hydroxy-3-keto-hexansäureestern (C) ausgeweitetwerden [15]. Durch nachfolgendediastereoselektive Reduktion und Kri-stallisation können so alle vier dia-stereomere Diole (D-G) stereoiso-merenrein erhalten werden (Abb. 4).

Die zur Verfolgung des Reaktions-verlaufs und zur Charakterisierung

gänglich wird. Hierzu wird im Gegen-satz zu früheren Methoden nur einÄquivalent Butyllithium benötigt. ImLabormaßstab (2 L Reaktionsgefäß)konnten so pro Ansatz 150 g des Di-ketons (A) in 80%iger Reinheit dar-gestellt werden. Diese Synthese soll-te sich ohne weiteres auch auf dieDarstellung im kg-Maßstab übertra-gen lassen können [14].

Neben dieser als Zielsubstrat aus-gewählten Verbindung wurden in Zu-sammenarbeit mit den Projektpart-nern weitere schlecht wasserlöslicheKetone ausgewählt, welche ebenfallsin der biokatalytischen Hydrierungeingesetzt werden sollen. Hierbei ist

Die von uns eingeführte dynami-sche kinetische Racematspaltung(Abb. 5) durch regio- und stereose-lektive Reduktion von in 2-Positionsubstituierten acyclischen 1,3-Dike-tonen [16,17] am Beispiel eines al-kylierten 3,5-Dioxohexanoates wurdeinzwischen von anderen Arbeitskrei-sen auf die Chemokatalyse übertra-gen [18]. Dieses Beispiel belegt ein-drucksvoll, dass die Untersuchungbiokatalytischer Verfahren zu neuenEntwicklungen auch in der rein che-mischen Synthese Anstoß geben kann.

Der Einsatz der von uns generier-ten Bausteine in der Naturstoff- undWirkstoffsynthese wurde durch die in

Abb. 3: Struktur der Expressionsplasmide pAW-3 and pAW-4, die ADH undGDH in entgegengesetzer Reihenfolge enthalten.

Abb. 4: Biokatalytische Darstellung beider Enantiomere von 5-Hydroxy-3-keto-hexansäureestern (B, C) sowie der diastereomeren Diole (D-G).

ve Reduktionen mit Biokatalysatorensowie die Ausarbeitung und Bereit-stellung geeigneter analytischer Me-thoden.Die von uns entwickelte Methode [8]zur regio- und enantioselektiven Re-duktion von 3,5-Diketohexansäuree-stern (A) im Batch-Verfahren mittelsLactobacillus brevis Alkoholdehy-drogenase (LBADH) wurde bis in den75g-Maßstab übertragen (bis zu 80% Ausbeute an enantiomerenreinemB, R = tBu) [14]. Dabei konnten Um-satzzahlen (ttn) für NADP(H) von biszu 125 erreicht werden. Es wird er-wartet, dass dieser Wert durch dieVerwendung von Ganzzell-Cofaktorre-

der Produkte (Reinheit, Enantiome-renüberschuss) benötigten chroma-tographischen und spektroskopi-schen Methoden (GC-MS, HPLC,NMR) sowie mögliche Derivatisie-rungstechniken wurden von uns aus-gearbeitet und den Projektpartnernzur Verfügung gestellt [15].

Der aus wirtschaftlicher Sicht in-teressanteste Baustein (3R,5S)-3,5-Dihydroxyhexansäure-tert-butylester(D) ist über diese Route im präpara-tiven Maßstab zugänglich. Für dieweitere Maßstabsvergrößerung wur-de von uns eine einstufige Syntheseausgearbeitet, durch die das benötigteDiketon (A) in effizienter Weise zu-

4-Chloracetophenon als geeigneteVergleichsverbindung zu nennen, dahierzu sowohl für das Substrat alsauch für die Racematspaltung der re-sultierenden Alkohole ausgearbeite-te analytische Verfahren und Ver-gleichsverbindungen zur Verfügungstehen.

Zusammenarbeit mit der Arbeitsgrup-pe von Prof. Dieter Enders, RWTHAachen (Förderung durch die DFG,SFB 380), durchgeführten Synthesenzu S-(+)-Argentilactone, S-(-)-Go-niothalamin und zweier Callystatin-Stereoisomeren nachhaltig belegt[19,20,21]. Insbesondere die erste

Abb. 5: Dynamische kinetische Racematspaltung durch regio- und stereo-selektive Reduktion eines in 2-Position substituierten 1,3-Diketons [16,17].

Abb. 6: Gegenüberstellung von Simulation und experimentellen Ergebnis-sen von Batch-Experimenten im Labormaßstab mit L-Valin produzierendenC. glutamicum Stämmen. Die gemessen Konzentrationen an Biomasse(CX,[OD600]) als +, Glucose (CS1,[g/l]) als o und L-valine (CP , [mM]) als *sind angegeben. Die Linien entsprechen den jeweils simulierten Werten.

Sonderband | 2003 | 103BIOKATALYSEBIOKATALYSE

vollständig auf enantioselektiven Syn-theseschritten aufbauende Synthesedes Zytotoxikums Callystatin beleuch-tet die Vorteile kombinierter chemo-enzymatischer Synthesestrategien.

Makrokinetische Analyseder Biohydrierung mitganzen Zellen

Ein wichtiger Schritt der verfahrens-technischen Prozessentwicklung istdie quantitative Beschreibung der mi-krobiellen Reaktionskinetik, um dar-auf aufbauend, z. B. modellgestützt,eine Prozessoptimierung durchführenzu können. Hinsichtlich der Vielzahlmöglicher Produktionsstämme, soll-te die makrokinetische Analyse mög-lichst effizient erfolgen, was durch dieEntwicklung und den Einsatz einermodelldiskriminierenden und/oderoptimalen Versuchsplanung für Fed-batch Experimente realisiert werdensoll. Dabei können z. B. die Konzen-tration der Kohlenstoffquelle im Feed,die zeitlich variablen Feedraten, dieVorgabe von Probennahmezeitpunk-ten und vieles mehr als Parameter derVersuchsplanung dienen.

Ziel der Versuchsplanung ist dieIdentifizierung eines geeigneten ma-krokinetischen Modellierungsansat-

zes für ein biologisches System inner-halb weniger, sequentieller Experi-mente. Dabei wird insbesondere dieAusgangssituation berücksichtigt,dass vor Beginn der makrokineti-schen Versuchsreihe oftmals nur we-

ze’ zur Folge, die durch die modell-diskriminierende Versuchsplanungauf das ‚wahre’ Modell reduziert wer-den sollen.

Basierend auf einem modelldiskri-minierenden Versuchsplanungsansatz

dellsystem-Entropie in aufeinander-folgenden Experimenten verwendet.Diese Größe berücksichtigt die Cova-rianz der Parameterschätzung in derFisher-Informationsmatrix als Basis.

Nachdem erste Simulationsrech-nungen erfolgreich verliefen, wurdedie Versuchsplanungstechnik experi-mentell getestet. Da zum Zeitpunkt derexperimentellen Überprüfung das E.coli basierte Produktionsystem mitCofaktorregenerierung noch nichteinsatzbereit war, wurde alternativ einrekombinanter L-Valin produzieren-der C. glutatmicum Stamm als Test-system eingesetzt (aus dem Institut fürBiotechnologie 1, ForschungszentrumJülich GmbH). Dieser Stamm war Pan-tothensäure und L-Isoleucin-auxo-troph.

Ausgehend von dem biologischenVerständnis über die L-Valin-Produk-tion in C. glutamicum wurden vierkonkurriende Modellansätze formu-liert, die die Konzentrationen an Bio-masse (c

x), Glucose (c

S1), dem Co-

Substrat 2 (Isoleucin und Pantothen-säure) (c

S2) und dem Produkt L-Va-

lin (cP ) berücksichtigten. Im einzel-

nen unterschieden sich die Modellewie folgt:

Tab. 1: Neue verfügbare NADH- und NADPH-abhängige Dehydrogenasen (DH).

Enzym Stereo- Organismus Coenzym BearbeitungsstandSpezifität

Biochemische Sequenzierung/Daten Klonierung

Alkohol-DH R Lactobacillus brevis NADPH Proteinchemisch charakt. sequenziertSubstratspektrum kloniertKinetische Konstanten überexprimiert

Alkohol-DH R Lactobacillus kefir NADPH Proteinchemisch charakt. sequenziertSubstratspektrumKinetische Konstanten

Alkohol-DH R Lactobacillus brevis -Gen NADH Proteinchemisch charakt. sequenziert(Mutein) in E. coli Substratspektrum kloniert

Kinetische KonstantenAlkohol-DH S Candida parapsilosis NADH Proteinchemisch charakt. sequenziert

Substratspektrum kloniertKinetische Konstanten exprimiert

Alkohol-DH S Rhodococcus erythropolis NADH Proteinchemisch charakt.SubstratspektrumKinetische Konstanten partiell sequenziert

Diacetyl- R Lactobacillus kefir NADH Proteinchemisch partiellReduktase charakterisiert

Substratspektrum

nige Informationen – auch übergrundlegende Reaktionsmechanis-men – in dem ‚neuen’ Produktions-stamm vorhanden sind. Dies hat dieanfängliche Berücksichtigung einerVielzahl ‚konkurriender Modellansät-

von Box und Hill [22] wurde in derEntwicklungsumgebung von MATLAB/SIMULINK ein entsprechender Algo-rithmus implementiert, der als diskri-minierendes Kriterium die zu erwar-tende abnehmende Differenz der Mo-

– Modell 1: Wachstumslimitierungdurch eines der beiden Substrate,Maintenance-Bedarf basierend aufGlucose, Glucose-abhängige L-ValinSynthese (ohne Einfluss durch Sub-strat 2)– Modell 2: Analog zu Model 1, je-doch limitiert die Verfügbarkeit vonSubstrat 2 die Glucoseaufnahme.Hohe Konzentrationen an Substrat 2können die Produktsynthese inhibie-ren.– Modell 3: Inhibierung des Wachs-tums durch L-Valin, keine Wachtums-limitierung durch Substrat 2, Inhibie-

Abb. 7: Beispiel eines diskriminierend geplanten Fed-batch Experiments zur Unterscheidung der oben genanntenvier Modelle. Wie angegegen sind die geplanten Startkonzentrationen an Substrat eins 27 g/L und Substrat zwei 0mM. Links sind die Feedraten an Glucose (durchgezogen, 500 g/L) und Substrat 2 (gestrichelt, 2.9 g/L Isoleucin,4.7 mg/L Pantothensäure) dargestellt. Rechts sind die simulierten Konzentrationsverläufe an Biomasse (CX) alsdurchgezogene Linie, Glucose (CS1) als gestrichelte Linie und L-Valin (CP ) als gepunktete Linie dargestellt. ZurVereinfachung sind nur die Modellaussagen der Modelle 3 und 4 aufgeführt, die deutliche Prognoseunterschiedeaufweisen, was Ziel der diskrimierenden Versuchsplanung ist.

Tab. 2: Vergleich der Konstrukte pAW-3 und pAW-4; Aktivitäten und Enzymverhältnis.

pAW-3 (ADH-GDH) pAW-4 (GDH-ADH)Expressions- Spez. Akt. Spez. Akt. GDH ADH Spez. Akt. Spez. Akt. ADH GDHstamm ADH [U/mg] GDH [U/mg] [%] ADH [U/mg] GDH [U/mg] [%]Tuner(DE3) 40,6 11,2 27,5 9,1 32,9 27,7BL21(DE3) 41,6 12,9 31,1 13,8 58,0 23,7Origami(DE3) 37,7 12,4 32,9 5,3 17,3 30,6

104 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

rung der Produktbildung durch Sub-strat 2.– Modell 4: Wachstumsabhängigkeitvon beiden Substraten, L-Valin Synthe-se ist wachstumsgekoppelt, Produkt-inhibierung durch L-Valin.

Wie in Abbildung 6 dargestellt, er-lauben alle Modelle eine akzeptableWidergabe der experimentellen Da-ten, was durch realtiv geringe χ2 Wer-

derung entspricht. Alle 2 Stunden wareine Probennahme vorgesehen.

Ein entsprechendes Experimentwurde durchgeführt. Dabei konntendie zuvor berechneten Feedratenweitgehend eingehalten werden. Al-lerdings zeigte sich auch, dass einmanuelles Eingreifen im Versuchsab-lauf durch den Experimentator teil-weise notwendig war, um z. B. eine

durch die ursprünglichen Modellan-sätze nur teilweise widergegebenwerden können.

Verfahrenstechnik zurmikrokristallinenBiohydrierung

Zielsetzung ist die Entwicklung einerallgemein nutzbaren Verfahrenstech-nik zur Biohydrierung mit ganzenZellen.

Reaktionstechnische Problemeder Biohydrierung mit ganzen Zellensind die geringe Wasserlöslichkeit ty-pischer Edukte und Produkte, sowieoftmals auftretende Inhibierungender biokatalytischen Aktivität schonbei niedrigen Edukt- und Produkt-konzentrationen in der wässrigenPhase. Eine Alternative zur oftmals als„Eduktdepot“ im Bioreaktor einge-setzten, nicht mit Wasser mischbarenorganischen Phase mit gelöstemEdukt ist die Bereitstellung desEdukts in mikrodisperser Form imBioreaktor. Zur Erzeugung einer ho-hen Stoffaustauschfläche zwischenEduktphase und wässrigem Reakti-onsmedium wird das in einem gutwasserlöslichem Cosolvenz gelösteEdukt in den Bioreaktor injiziert. Auf-grund der sofortigen Vermischungdes Cosolvenz (Isopropanol) in derwässrigen Phase können sehr feineEdukt-Tropfen in situ erzeugt wer-den. Für die Kontrolle der mikrodi-spersiven Eduktbereitstellung wirddie 3-dimensionale optische Laser-Reflexionsmessung (3-D-ORM) ein-gesetzt. Damit stehen die aktuelleTropfengröße der dispersen Phaseund Tropfengößenverteilung onlinezur Verfügung (siehe Abb. 8).

Basierend auf reaktionstechni-schen Untersuchungen (siehe Abb.9) und den online Signalen der 3-D-ORM-Sonde werden (intermittieren-de) Dosierprofile für ausgewählteprochirale Ketone entwickelt, wiez.B. 4-Chloracetophenon und 6-Cl-3,5-Dioxohexansäure-tert-butylester,um hohe Raum-Zeit-Ausbeuten undEndproduktkonzentrationen bei ho-hem Enantiomerenüberschuss inFed-batch Prozessen erreichen zukönnen.

Literatur

[1] Stinson, S.C., Chem. Eng. News 75(1998), 83-104.

[2] Stinson, S. C., Chem. Eng. News 73(1995), 44-74.

[3] Schmidt, E., Blaser, H.U., Fauquex,P.F., Sedlmeier, G., Spindler, F., Micro-bial Reagents in Organic Synthesis,

Kluwer Academic (1992), 377-388.[4] Csuk, R., Glänzer, B.I., Chem Rev 91

(1991), 49-97.[5] Galkin, A., Kulakova, L., Yoshimura,

T., Soda, K., Esaki, N. Appl EnvironMicrobiol 63 (1997), 4651-4656.

[6] Cabral, J.M.S., Aires-Barros, M.R.,Pinheiro, H., Prazeres, D.M.F., J.Biotechnol. 59 (1997), 133-143.

[7] Hummel, W., Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 58 (1997), 146-184.

[8] Wolberg, M., Hummel, W., Wandrey,C., Müller, M., Angew. Chem. 112(2000), 4476-4478.

[9] Schmitz, G., Weuster-Botz, D., Ta-kors, R., Wandrey, C., DeutschePatentanmeldung, DE 199 13 862.1(1999).

[10] Weuster-Botz, D., Wandrey, C., ProcBiochem 30 (1995), 563-571.

[11] Altenbach-Rehm, J., Weuster-Botz,D., Deutsches Patent DE 195 29 099C2 (1997).

[12] Takors, R., Wiechert, W., Weuster-Botz, D., Biotechnol Bioeng 56(1997), 564-576.

[13] Weckbecker, A., Hummel, W., Me-thods in Biotechnology, HumanaPress (submitted).

[14] Wolberg, M., Bode, S., Feldmann, R.,Müller, M., Advan. Syn. Catal. (inVorbereitung).

[15] Wolberg, M., Hummel, W., Müller,M., Chem. Eur. J. 7 (2001), 4562-4571.

[16] Ji, A., Wolberg, M., Hummel, W.,Wandrey, C., Müller, M., Chem. Com-mun. (2001), 57-58.

[17] Wolberg, M., Ji, A., Hummel, W.,Müller, M., Synthesis (2001), 937-942.

[18] Eustache, F., Dalko, P.J., Cossy, J.,Org. Lett. 4 (2002), 1263-1265.

[19] Job, A., Wolberg, M., Müller, M.,Enders, D., Synlett (2001), 1796-1798.

[20] Vicario, J.L., Job, A., Wolberg, M.,Müller, M., Enders, D., Org. Lett. 4(2002), 1023-1026.

[21] Enders, D., Vicario, J.L., Job, A.,Wolberg, M., Müller, M., Chem. Eur.J. 8 (2002), 4272-4284.

[22] Box, G.E.P., Hill, W.J., Technometrics9 (1967), 57-71.

Korrespondenzadresse

PD Dr. Werner HummelInstitut für MolekulareEnzymtechnologieHeinrich Heine UniversitätDüsseldorfForschungszentrum JülichD-52426 JülichTel.: 02461-613 790Fax: 02461-612 490eMail: w.hummel@fz-juelich.de

Abb. 8: Prinzipskizze der mikrodispersiven Biohydrierung (Cosubstrat:Glucose; Cosolvenz: Isopropanol; 3-D-ORM: 3-dimensionale optische La-ser-Reflexionsmessung).

Abb. 9: Reaktionstechnische Untersuchungen zur Biohydrierung mit Lac-tobacillus kefir (Batch-Ansätze mit 50 g/L L. kefir, 30°C, pH 6,5, 125 mM 4-Cl-Acetophenon, 200 mM Glucose): ee > 99 %, ttn > 1100.

te von 1,1 (Modell 3) bis 2,1 (Mo-dell 1) belegt ist. Da eine eindeutigeModellidentifizierung jedoch nochnicht möglich war, wurde ein model-diskriminierendes Experiment ge-mäß der nachfolgenden Abbildung 7geplant. Der Versuchsplan berück-sichtigte die Startkonzentrationenbeider Substrate und deren zeitlichvariablen Feed (Obergrenze: 15 ml/h) wie angegeben. Um eine einfacheÜbersetzung der Feed-Trajektorienzu erreichen, wurde ein jeweils für 6Stunden konstanter Feed angenom-men. Die maximale Dauer des Expe-riments war auf 48 h begrenzt, waseiner 8-fachen potenziellen Feedän-

zu starke Limitierung des Zellwachs-tums zu vermeiden. Dieser Fall konn-te dann eintreten, wenn aufgrund ei-ner noch ungenauen Modellidentifi-zierung die Modellaussage für dieSubstrataufnahme zu geringe Werteprognostizierte. Das Problem er-scheint typisch für die sequentielleVersuchsplanung basierend aufnicht-linearen Modellen und wirddaher zur Zeit näher untersucht. Da-mit verbunden sind auch Untersu-chungen zur Modellerweiterung imRahmen der Versuchsplanung, da essich zeigte, dass durch die diskrimi-nierend geplanten Experimente neueSystemeigenschaften auftreten, die

Sonderband | 2003 | 105BIOKATALYSEBIOKATALYSE

LBADH NADPNADPH

H C CH

OH

H C CH

O

Ph CH

OH

Ph CH3

3 3

2

3 3

+

3

O

Cofaktor-regenerierung

GASPHASENKATALYSE

Enzymatische Gasphasenkatalysezur Produktion chiralerSubstanzen� Dipl.-Chem. Clara Ferloni1, Dipl.-Ing. Matthias Heinemann1, Dr. Thomas Daußmann2, Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs1*1 Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, RWTH Aachen, 2 JFC - Jülich Fine Chemicals GmbH, Jülich

Die enzymatische Gasphasenkatalyse bietet aufgrund einer Reihe an verfahrenstechnischen Vorteilen ein großes Potenzial zur Produktion leichtflüchti-ger, chiraler Feinchemikalien. Im Rahmen der laufenden Arbeiten soll dieses Potenzial erschlossen und ein Verfahrenskonzept der enzymatischen Gas-phasenkatalyse zur Synthese optisch aktiver Feinchemikalien im technisch-industriellen Maßstab entwickelt werden. Im Vordergrund der bereits durch-geführten Arbeiten stand zunächst die Verbesserung der Langzeitstabilität der eingesetzten Enzyme durch geeignete Immobilisierungsverfahren unddurch Zugabe von Saccharose. Darüber hinaus erfolgte die Entwicklung eines Gasphasen-Batchreaktors für das Screening nach geeigneten Enzymenund nach Reaktionsbedingungen sowie die eines kontinuierlichen Reaktors zur Produktion im Labormaßstab. In Batchexperimenten konnte gezeigt wer-den, dass die Enantioselektivität quasi-trockener Alkoholdehydrogenase (ADH) höher ist als in wässrigen Medien. Nach einer Optimierung der Reakti-onsbedingungen für die Reduktion von Acetophenon zu (R)-1-Phenylethanol konnte im kontinuierlich betriebenen Reaktor ein Umsatz von 87 % erreichtwerden, welcher die thermodynamische Grenze darstellt.

Keywords: Gasphase, Katalyse, Enzyme, Alkoholdehydrogenase, Lactobacillus brevis, sekundäre Alkohole, Cofaktorregenerierung.

setzung von gasförmigen Eduktenmöglich ist. Der Wasserbedarf derEnzyme beschränkt sich auf eine etwamonomolekulare Bedeckung des En-zyms. Die entstehenden Produkte wer-den gasförmig aus dem Reaktor ab-gezogen und können leicht durch bei-spielsweise fraktionierte Kondensati-on von eventuell nicht umgesetztenEdukten abgetrennt werden.

Überblick über dieenzymatischeGasphasenkatalyse

Die erste bekannt gewordene enzyma-tische Gasphasenreaktion erfolgte mitdem Enzym Hydrogenase (aus Desul-fovibrio desulfuricans) [1,2]. DasEdukt dieses Enzyms, Wasserstoff, istnatürlicherweise gasförmig. Yagi undKoautoren konnten zeigen, dass dasEnzym auch im trockenen Zustand inder Lage ist, nicht nur einfache Reak-tionen wie die Umwandlung von or-tho-H

2 in para-H

2 und den Austausch

zwischen H2 und D

2 zu katalysieren,

sondern auch den Elektrontransfer zunicht-gasförmigen Akzeptormolekü-len. Seit diesen ersten Arbeiten wur-den enzymatische Gasphasenreaktio-nen auch mit weiteren Enzymen un-tersucht, die normalerweise fluideEdukte umwandeln. Erfolgreiche Re-aktionen wurden mit Lipasen [3,4],mit Oxidasen [5,6,7] und etwas sel-

tener mit Dehydrogenasen [8,9]durchgeführt. Bei den letztgenanntenArbeiten wurden die verschiedenenAlkoholdehydrogenasen mit den erfor-derlichen Coenzymen (z. B. NAD+) zu-sammen getrocknet und eingesetzt. Eskonnte gezeigt werden, dass mit qua-si-trockenen Enzymen in der Gaspha-se sogar eine Regenerierung des Co-enzyms mit Hilfe eines Cosubstratsmöglich ist. Die Regenerierung desCoenzyms ist jedoch grundsätzlich nurmit dem gleichen Enzym möglich, mitdem auch die angestrebte Umsetzung

erfolgt. Offenbar wird beim gemein-samen Immobilisieren des Enzymsund des Coenzyms ein gewisser Anteildes letzteren im aktiven Zentrum desEnzyms fixiert und kann dort im qua-si-trockenen Zustand vom Substratund Cosubstrat abwechselnd oxidiertund reduziert werden. Die beiden Ar-beitsgruppen, die bisher Arbeiten mitAlkoholdehydrogenasen für Umset-zungen in der Gasphase publizierten,haben Oxidationsreaktionen durchge-führt. So wurden mit Pferdeleber-ADHund mit der ADH des thermophilen

Einleitung

Die meisten synthetischen Pharma-wirkstoffe und Pflanzenschutzmittel,die derzeit auf den Markt kommen,besitzen mindestens ein chirales Zen-trum. Da in der Regel nur ein Enan-tiomer biologisch aktiv ist, währenddie anderen Enantiomere uner-wünschte Nebenwirkungen zeigenkönnen, sind aufgrund aktueller Zu-lassungsbestimmungen Wirkstoffe inracemischen Mischungen kaum nochgenehmigungsfähig. Aufgrund deswachsenden Markts für Feinchemika-lien und chirale Zwischenproduktewerden Enzyme in der chemischenIndustrie zunehmend als Katalysato-ren, insbesondere für stereoselektiveSynthesen oder Racemattrennungenunter milden Bedingungen, etabliert.Dabei werden die Edukte oft in einemansatzweisen Prozess durch den Bio-katalysator umgesetzt. Mittels Lö-sungsmitteln werden die Produkte an-schließend aus der Produktlösungextrahiert.

Neben dem Einsatz von Enzymen inwässrigen oder organischen Medien,in überkritischem CO

2 oder in ioni-

schen Flüssigkeiten konnte gezeigtwerden, dass isolierte Enzyme ihre ka-talytische Wirkung auch dann entfal-ten können, wenn sie in der Gaspha-se im annähernd trockenen Zustandvorliegen, wodurch eine direkte Um-

Abb. 1: Schema der in der Gasphase durchgeführten Modellreaktion: Re-duktion von Acetophenon zu (R)-1-Phenylethanol unter Regeneration desCoenzyms durch Oxidation von Isopropanol zu Aceton. Enzym und Cofak-tor sind auf Glaskugeln immobilisiert.

106 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Mikroorganismus Sulfolobus solfa-ricus aus Butanol, Pentanol und He-xanol die entsprechenden Aldehydehergestellt [8]. Als Cosubstrat dientein diesem Fall Acetaldehyd. Von einerzweiten Arbeitsgruppe wurde mitHefe-ADH 3-Methyl-2-buten-1-ol zu3-Methyl-2-butenal umgesetzt [9]. AlsCosubstrat diente hier Aceton.

Die Abwesenheit jeglicher Art vonfluidem Lösungsmittel stellt einen er-heblichen Vorteil der enzymatischenGasphasenreaktionen gegenüber denkonventionellen Verfahren der En-zymkatalyse dar. Für den Einsatz der-artiger enzymkatalysierter Stoffum-wandlungsverfahren sprechen folgen-de Argumente:– Die Abwesenheit von jeglichen or-ganischen Lösungsmitteln in solchenVerfahren ist produktionsintegrierterUmweltschutz.– Es können Edukte eingesetzt wer-den, die in wässrigen Medien nur sehrschlecht löslich sind, ohne dass ein(z. B. organisches) Lösungsmittel be-nötigt wird.– Die Edukte werden ohne Lösungs-mittel zugeführt. Neben einer einfa-chen Produktgewinnung (z. B. durchfraktionierte Kondensation) bestehtsomit auch keine Gefahr von Neben-reaktionen mit den Lösungsmitteln.– Enzyme im quasi-trockenen Zu-stand weisen eine zum Teil stark er-höhte Stabilität im Vergleich zu wäss-rigen Milieus auf [5,9]. Dadurch sindbei der Gasphasenkatalyse höhere Re-aktionstemperaturen möglich, wo-durch in der Folge höhere Reaktions-geschwindigkeiten erreicht werdenkönnen.– Da Gasphasen-Reaktionssystemequasi-wasserfrei sind, lassen sich die

natürlichen Reaktionsrichtungen hy-drolytischer Reaktionen umkehrenund so z. B. auch Veresterungendurchführen.– Die Diffusionskoeffizienten in derGasphase sind um über drei Zehner-potenzen höher als in der Flüssigpha-se. Es wird in der Literatur angege-ben, dass daher bei enzymatischenReaktionen in der Gasphase Limita-tionen beim Stofftransfer zum Enzymoder innerhalb von porösen Enzy-mimmobilisaten kaum zu erwartensind [5,9,10].

den, da sie bereits partikulär (quasi-trocken) vorliegen und so leicht imReaktor zurückgehalten werden kön-nen.– Aufgrund der extrem wasserarmenUmgebung und den erhöhten Tempe-raturen besteht keinerlei Gefahr ei-ner mikrobiellen Kontamination derReaktorsysteme.

Dem großen, vorteilhaften Poten-zial der enzymatischen Gasphasenka-talyse stehen jedoch auch Nachteilegegenüber. Die größte Limitierung ist,dass nur Stoffe mit einer gewissen

Ziel des Projekts

Mit der enzymatischen Gasphasenka-talyse haben sich weltweit bisher erstfünf Gruppen beschäftigt. Neben derTatsache, dass bislang noch keine ste-reoselektive Stoffumwandlung mittelsenzymatischer Gasphasenkatalyse pu-bliziert wurde, sind darüber hinausnoch viele Fragen sowohl grundsätzlichmechanistischer als auch produktions-technischer Natur ungeklärt. Das ei-gentliche Potenzial der enzymatischenGasphasenkatalyse ist also noch inkeinster Weise erschlossen. Ziel desForschungsvorhabens ist daher dieEntwicklung eines Verfahrenskonzeptsder enzymatischen Gasphasenkatalysezur Synthese optisch aktiver Feinche-mikalien im technisch-industriellenMaßstab.

Die geplante Vorgehensweise siehtneben der Optimierung des Katalysa-tors (Immobilisierung des Enzyms) dieEntwicklung eines ansatzweise und ei-nes kontinuierlich betriebenen Reak-tors vor. Mittels eines Modellreaktions-systems wird der Einfluss diverser Re-aktionsbedingungen untersucht undeine Methodik entwickelt, anhand de-rer die Reaktionsbedingungen gezieltoptimiert werden können. Das zu-nächst betrachtete Modellreaktionssy-stem ist in Abbildung 1 dargestellt. Eshandelt sich dabei um die Reduktionvon Acetophenon zu (R)-1-Phenyletha-nol. Die Alkoholdehydrogenase ausLactobacillus brevis (LBADH), coim-mobilisiert mit dem Cofaktor NADP+,wird dabei als Katalysator eingesetzt.Die erforderliche Regenerierung desCofaktors erfolgt durch die Oxidationdes Cosubstrats Isopropanol zu Aceton.

Enzymimmobilisierung

Der wesentliche Nachteil von Bioka-talysatoren ist, dass diese sehr emp-findlich sind: Sie können leicht de-aktiviert werden und sie erfordern zurEntfaltung ihrer optimalen katalyti-schen Aktivität meist genau eingestell-te Reaktionsbedingungen (pH, Tem-peratur, Wasseraktivität, etc.). Die ka-talytische Aktivität und Stabilität vonEnzymen kann beispielsweise schondurch die Art der Immobilisierungdes Katalysators beeinflusst werden.Eine schonende, von uns gewählteImmobilisierungsmethode ist die phy-sikalische Adsorption auf Glaskugeln.Dafür werden einer EnzymlösungGlaskugeln (mit ca. 0,3 mm Durch-messer) zugegeben. Nach längeremRühren wird der Ansatz getrocknet.Durch diese Methode wird eine feineVerteilung des Enzyms auf der Ober-

Abb. 2: Schemazeichnung desBatch-Reaktors zur Durchführungvon enzymatischen Gasphasenre-aktionen. (A) Aufnahme für dasEnzym; (B) Enzympräparat; (C)Vorlage der Edukte; (D) Septen fürdie Probenahme; (E) Ventil.

Abb. 3: Verlauf des Anteils an nicht-umgesetztem Edukt während einerBatch-Gasphasenreaktion. 100 mg lyophilisiertes YADH-Präparat; Tempe-ratur: 30°C; Druck: 1 bar; relative Feuchte: 68 % (eingestellt mit KI); Sub-stratlösung: 100 µl Hexanal und 1 ml Ethanol in 25 ml Wasser.

Abb. 4: Einfluss des absoluten Drucks auf die Reaktionsgeschwindigkeitund die Dauer der Lag-Phase bei Batch-Gasphasenreaktionen. 100 mglyophilisiertes YADH-Präparat; Temperatur: 30°C; relative Feuchte: 68 %(eingestellt mit KI); Substratlösung: 100 µl Hexanal und 1 ml Ethanol in25 ml Wasser.

– Da die Konzentrationen in der Gas-phase niedrig sind, besteht nur einegeringe hemmende oder deaktivie-rende Wirkung der Edukte oder Pro-dukte auf das Enzym.– Die Enzyme müssen für den wie-derholten oder kontinuierlichen Ein-satz nicht speziell immobilisiert wer-

Mindestflüchtigkeit in der Gasphaseangewendet werden können. Die en-zymatische Gasphasenkatalyse scheintdaher insbesondere geeignet für dieProduktion niedermolekularer Fein-chemikalien und leichtflüchtiger Sub-stanzen, wie beispielsweise Riech-und Aromastoffe oder Pheromone.

Sonderband | 2003 | 107BIOKATALYSEBIOKATALYSE

fläche des Trägers erzielt. Dabei liegtdie adsorbierte Menge an Enzym beica. 5 mg pro Gramm Trägermaterial.

Durch die Zugabe von Saccharosezu der Enzymlösung vor der Immobi-lisierung konnte die Stabilität des En-zyms deutlich erhöht werden. So konn-te die Halbwertszeit des Enzyms, ermit-telt in einem bei 40°C kontinuierlichbetriebenen Reaktor, in etwa verfünf-zigfacht werden im Vergleich zu einemEnzym, das ohne die Verwendung vonSaccharose immobilisiert wurde.

Darstellung desentwickelten Batch-Reaktors

Der entwickelte Batch-Reaktor ist inAbbildung 2 dargestellt. Unterhalb desDeckels einer Schottflasche ist eineAufnahme platziert (A), in der das En-zympräparat (B) Platz findet. Die Eduk-te der Reaktion liegen zusammen miteiner gesättigten Salzlösung am Bodender Schottflasche vor (C). Zwei Septen(D) ermöglichen die Probenahme ausder Flüssig- sowie aus der Gasphase.Durch ein Ventil am Deckel (E) kannder Reaktor auch bei verschiedenenDrücken betrieben werden.

Im geschlossenen System stellt sichein Gleichgewicht zwischen Flüssig-und Gasphase ein: Nur die Moleküle,die sich in der Gasphase befinden, sindan der Reaktion beteiligt, während dieFlüssigphase als Speicher für Edukteund Produkte wirkt. Sobald die Reak-tion die Edukte in der Gasphase ver-braucht, werden aufgrund des Gleich-gewichts neue Eduktmoleküle aus derFlüssigphase nachgeliefert. Gleichzei-tig werden die Produktmoleküle, diein der Gasphase freigesetzt werden, inder Flüssigphase abgeschieden.

Die einfache Bauweise und die sim-ple Handhabung solcher Reaktorenerlaubt leicht parallelisierte Experi-mente und daher die Generierung gro-ßer Mengen an Daten in kurzer Zeit.

DurchführungenzymatischerGasphasenreaktionen imBatch-Reaktor

In den ersten Arbeiten mit dem Batch-Reaktor wurde die Alkoholdehydroge-nase aus Saccharomyces cerevisiae(YADH) eingesetzt. Grundlegende Ein-flussparameter wie Temperatur undDruck wurden untersucht. Darüberhinaus wurde die Kinetik der Reaktionbestimmt.

Die zeitliche Abnahme der gasför-migen Eduktkonzentration zeigt, wie inAbbildung 3 dargestellt, einen charak-

teristischen Verlauf: Am Anfang ist einekurze „Lag-Phase“ zu erkennen, wel-cher eine Phase mit exponentiellerAbnahme - entsprechend einer Kine-tik erster Ordnung - folgt. In Abhän-gigkeit der mit der Salzlösung einge-

ausreichende Beweglichkeit des En-zyms erlaubt, um die katalytischenSchritte durchzuführen. Die lange Dau-er der Lag-Phase von bis zu 10 % dergesamten Reaktionszeit ist auf den ge-ringen Stofftransport innerhalb des

so gering, dass die Hydratisierung den-noch relativ viel Zeit in Anspruchnimmt. Durch die Reduktion des ab-soluten Drucks in den Reaktoren wirddie Diffusionsgeschwindigkeit der Mo-leküle in der Gasphase erhöht, was zurFolge hat, dass die Lag-Phase verkürztund die beobachteten (scheinbaren)Reaktionsgeschwindigkeiten erhöhtwerden, wie Abbildung 4 zu entneh-men ist

In weiteren Batch-Versuchen wurdedie Alkoholdehydrogenase von Lacto-bacillus brevis (LBADH) eingesetzt. Ineinem durchgeführten Screeningkonnten für dieses Enzym geeigneteprochirale Ketone (Edukte), deren Al-kohole als Aromastoffe, Pheromoneoder als Bausteine für andere Feinche-mikalien Anwendung finden, identifi-ziert werden. Tabelle 1 zeigt einen Ver-gleich der katalytischen Aktivitäten vonLBADH in Flüssig- und Gasphase miteinigen dieser ausgewählten Edukte. Indieser Tabelle sind darüber hinaus diejeweils erzielten Enantiomerenüber-

Abb. 5: Foto und Schemazeichnung des Reaktors zur kontinuierlichenDurchführung von enzymatischen Gasphasenreaktionen. (A) Massen-durchflussregler; (B) Vorlagegefäße für Edukte und Wasser; (C) Mischka-nal; (D) Festbettreaktor; (E) Feuchtesensor; (F) Probenahme-Port; (G) Kühl-falle.

Abb. 6: Abhängigkeit des maximalen Umsatzes während einer kontinuierli-chen Gasphasenreaktion von der relativen Feuchte im System. Tempera-tur: 25°C; 0,5 g Enzympräparat (auf Glaskugeln adsorbierter LBADH-Roh-extrakt mit 4 mg Protein/g Träger); Fluss 12 ml/min; Aktivität Acetophenon0,2; molares Verhältnis zwischen Isopropanol und Acetophenon: 60.

Tab. 1: Vergleich der relativen Aktivitäten (jeweils bezogen auf Reaktion mit Acetophenon) und Enantioselektivitä-ten von LBADH in wässriger Phase und in der Gasphase, erzielt in ansatzweisen Versuchen. Absolute Aktivität beider Reaktion von Acetophenon in wässriger Lösung: 150 U/mg; in der Gasphase: 2,5 U/mg.

In wässriger Phase In GasphaseEdukt Relative EE (R) des Relative Aktivität EE (R) des

Aktivität [%] Produkts [%] [%] Produkts [%]Acetophenon 100 100 100 100Sulcaton 70 92 765 >993-Octanon 45 97 233 >992,4-Pentandion 156 n.b. 107 100Acetessigsäure Ethylester 201 100 185 100

stellten Feuchtigkeit im Reaktor wirddas trockene Enzym zunächst hydrati-siert [9,11]. Eine optimale Reaktions-geschwindigkeit wird erreicht, wenndie Hydrathülle um das Enzym eine

Reaktors zurückzuführen: Die Diffusi-onskoeffizienten in der Gasphasen sindzwar mehr als drei Zehnerpotenzen hö-her als in Flüssigphasen, die treiben-den Konzentrationsgefälle sind jedoch

schüsse angegeben. Aus den dargestell-ten Ergebnissen ist ersichtlich, dass diein den beiden Phasen (Gas- und Flüs-sigphase) erzielten relativen katalyti-schen Aktivitäten (jeweils bezogen aufdas Standardedukt Acetophenon) un-terschiedlich sind. Ferner kann festge-stellt werden, dass der Enantiomeren-überschuss bei der enzymatischen Um-setzung in der Gasphase grundsätzlichhöher ist als in der wässrigen Phase.Die geringere Beweglichkeit des En-zyms im quasi-trockenen Zustand istvermutlich verantwortlich für die Stei-gerung der Enantioselektivität [12].Dies kann als weiterer Vorteil der en-zymatischen Gasphasenkatalyse be-trachtet werden.

Darstellung desentwickeltenkontinuierlichen Reaktors

Für die Produktion in größeren Maß-stäben ist ein kontinuierlich betriebe-ner Reaktor erforderlich. Abbildung5 zeigt das entwickelte Reaktorsystem

108 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

als Schema und als Fotografie. Das Re-aktorkonzept stellt sich wie folgt dar:Das Trägergas (Stickstoff) wird fil-triert, getrocknet und in vier Teilströ-me aufgeteilt. Der Fluss jeden Teilst-roms wird jeweils mit Massendurch-flussreglern eingestellt (A). Drei Teil-ströme werden durch Vorlagegefäße(B) der flüssigen Reaktionsedukte(Keton zur Reduktion, Isopropanolzur Regenerierung des Cofaktors,Wasser zur Einstellung einer bestimm-ten Feuchtigkeit) geleitet. Die angerei-cherten Ströme werden danach zu-sammengeführt (C). Der Gesamtstromstellt den Zufluss zum Reaktor mitdefinierter Konzentration an Eduktendar. Die Konzentrationen der verschie-denen Komponenten in der Gasphasesind von der Temperatur und dem Sie-depunkt der Substanzen abhängig. An-hand einer entwickelten Excel-Tabel-le werden die notwendigen Einstellun-gen der Massendurchflussregler be-rechnet, sodass der gesamte Träger-gasstrom schließlich genau definier-te Substrat- und Wasserkonzentratio-nen enthält, bevor er durch den Fest-bettreaktor (D) geleitet wird, in demsich das immobilisierte Enzym befin-det. In der Abluft des Reaktors wirdzur Kontrolle die Feuchte (E) gemes-sen. Zur Analyse der Edukt- und Pro-duktkonzentrationen in der Reaktor-abluft werden Proben entnommen (F)und mittels Gaschromatographie ana-lysiert. Der gesamte Aufbau befindetsich in einem temperierten Schrank.Der Gasstrom, welcher den Reaktorverlässt, wird nach der Probenahmein einer Kühlfalle (G) auskondensiert.

Der kontinuierlichen Reaktor zeigtfolgende Vorteile gegenüber demBatch-Reaktor:– Der Gasstrom, der kontinuierlichdas Enzymbett durchströmt, sorgt füreinen schnellen Stofftransport. Damitkönnen effektive Reaktionsgeschwin-digkeiten beobachtet werden.– Die Zusammensetzung des Gas-stroms kann genau definiert werden.Die Interpretation der Ergebnisse istim Vergleich zum Batch-Reaktor starkvereinfacht.– Durch die Reaktionslimitierungkann die Stabilität des Enzyms direktbeobachtet werden.

DurchführungkontinuierlicherenzymatischerGasphasenreaktionen

Als Modellreaktion für den kontinuier-lichen Reaktor wurde das bereits ge-nannte Acetophenon-Isopropanol-LBADH-System eingesetzt. Aus der Li-

teratur ist bekannt, dass die kataly-tische Aktivität von quasi-trockenenEnzymen vom Wassergehalt im Reak-tionssystem abhängig ist [9]. Daherwurde in einer Versuchsreihe mit un-terschiedlichen, im Trägergas einge-stellten relativen Feuchten das Opti-mum für die LBADH bestimmt. WieAbbildung 6 zu entnehmen ist, ist dasEnzym bei niedrigen relativen Feuch-ten nur wenig aktiv. Ein sehr steilerAnstieg der Aktivität ist zwischen derrelativen Feuchte im Gasstrom von30 % auf 50 % zu erkennen, währenddas Optimum bei einem Wert von65 % auftritt. Der Grund für diese Be-obachtung liegt in der zunehmendenHydratisierung und damit steigendenBeweglichkeit des Proteins, welchefür eine optimale katalytische Aktivi-tät erforderlich ist.

Zusätzlich zur Optimierung der Re-aktionsgeschwindigkeit ist auch dermaximal erzielbare Umsatz von Be-deutung für einen Prozess. Dieser istabhängig von dem Verhältnis zwi-schen Substrat- und Co-Substratkon-zentration. Die Bestimmung geeigne-ter Verhältnisse kann unter Zuhilfe-nahme der Gleichgewichtskonstantender Reaktion berechnet werden. Wieaus Abbildung 7 zu erkennen ist, steigtdemnach der maximal mögliche Um-satz mit zunehmendem Verhältnis vonIsopropanol zu Acetophenon an. Daeine zu hohe Isopropanolmenge imTrägergasstrom das Enzym deaktivie-ren und die nachfolgende Produkt-aufarbeitung negativ beeinflussenwürde, wurde ein Verhältnis Isopro-

panol zu Acetophenon von 60 festge-legt, was bei 25°C einen maximalenUmsatz von 87 % ermöglicht. Wie Ab-bildung 7 ebenfalls zu entnehmen ist,konnten die berechneten Werte in Ex-perimenten sehr gut bestätigt werden.

Ausblick

Die bislang durchgeführten Arbeitendienten in erster Linie der Reaktor-entwicklung sowie der Generierunggrundlegenden Systemverständnisses.Diese Arbeiten sind nun weitestgehendabgeschlossen. Als nächster Schrittsteht daher die Weiterverbesserung derEnzymimmobilisierung an, wodurcheine bessere Zugänglichkeit für die gas-förmigen Edukte und weitere Stabili-sierung des bislang verwendeten En-zyms bei höheren Temperaturen undrelativen Feuchten erreicht werden soll.Alternativ wird auch der Einsatz ande-rer thermostabilerer Enzyme getestet.Parallel dazu werden Synthesen inter-essanterer Produkte etabliert. Fernerwird zur weiteren Produktivitätssteige-rung die Trägergaszubereitung so mo-difiziert, dass höhere Substratkonzen-trationen durch den Reaktor geleitetwerden können. Schließlich wird derkontinuierliche Reaktor in einen grö-ßeren Maßstab zur tatsächlichen Pro-duktion chiraler Alkoholen übertragen.

Referenzen

[1] Yagi, T., Tsuda, M., Mori, Y., Inokuchi,H., J. Am. Chem. Soc. 91 (1969),2801

[2] Kimura, K., Suzuki, A., Inokuchi, H.,Yagi, T., Biochim. Biophys. Acta 567(1979), 96-105

[3] Parvaresh, F., Robert, H., Thomas, D.,Legoy, M. D., Biotechnol. Bioeng. 39(1992), 467-473.

[4] Hwang, S.O., Park, Y.H., BioprocessEng. 17 (1997), 51-54.

[5] Barzana, E., Klibanov, A.M., Karel, M.,Appl. Biochem. Biotechnol. 15 (1987),25-34.

[6] Hwang, S.O., Trantolo, D.J., Wise,D.L., Biotechnol. Lett. 16 (1994),1135-1138.

[7] Hidaka, N., Matsumoto, T., Ind. Eng.Chem. Res. 39 (2000), 909-915.

[8] Pulvin, S., Parvaresh, F., Thomas, D.,Legoy, M.D., Ann. NY Acad. Sci. 542(1988), 434-439.

[9] Yang, F., Russell, A.J., Biotechnol.Bioeng. 49 (1996), 700-716.

[10] Kim C.H., Rhee S.K., Biotechnol. Lett.14 (1992), 1059-1064.

[11] Goubet, I., Maugard, T., Lamare, S.,Legoy, M.D., Enz. Micr. Technol. 31(2002), 425-430.

[12] Rariy, R.V., Klibanov, A.M., Biocatal.Biotrans. 18 (2000), 401-407.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr.-Ing. Jochen BüchsRWTH Aachen, Lehrstuhl fürBioverfahrenstechnikWorringer Weg 1D-52056 AachenTel.: 0241-80 255 46Fax: 0241-80 222 65eMail: buechs@biovt.rwth-aachen.de

Abb. 7: Berechneter und experimentell ermittelter Umsatz in Abhängigkeit vom molaren Verhältnis zwischen Ace-tophenon und Isopropanol. Temperatur: 25°C; 0,5 g Enzympräparat (auf Glaskugeln adsorbierter LBADH-Rohex-trakt mit 4 mg Protein/g Träger); Fluss: 15 ml/min; relative Feuchte: 65 %; Aktivität Acetophenon 0,2.

Sonderband | 2003 | 109BIOKATALYSEBIOKATALYSE

DOWNSTREAM-PROCESSING

ModularesmembranadsorbertechnologischesBaukastensystem zumintegrierten DownstreamProcessing von Pharmatargets� Dr. Sascha Beutel1, Dr. Alexander Loa2, Dr. Oskar-Werner Reif3, Priv.-Doz. Dr. Roland Ulber1, Prof. Dr. Thomas Scheper1

1 Institut für Technische Chemie, Universität Hannover, 2 Cell Culture Service GmbH, Hamburg, 3 Sartorius AG, Göttingen

Dieses Vorhaben zielt darauf, integrierte Aufarbeitungssysteme zu schaffen, die eine schnelle und gezielte Problemlösung vorliegender Trennaufgaben,eine Kopplung von Verfahrensschritten und eine einfache Handhabung ermöglichen sollen. Diese integrierten Systeme auf Basis von Membranadsorbernwerden modular als ein Baukastensystem aufgebaut, das eine flexible Anpassung an die jeweilige Problemstellung erlaubt und durch die Integration inmodulare Kartuschensysteme eine hohe Scale-up-Fähigkeit aufweist. Durch diese Prozessintegration werden Energie- und Abwasserkosten gemindertund so wertvolle Ressourcen geschont. Das Prinzip wird anhand des Modellproteins r-hGH, eines rekombinanten humanem Wachstumsfaktors, entwik-kelt und getestet.

Keywords: Downstream Processing, Membranadsorber, Baukastensystem, Integration, modular, Proteinaufreinigung, Scale-up.

Vorhaben

Isolierung und Aufreinigung vonwertschöpfenden Proteinkomponen-ten aus Rohprodukten, wie Fermen-tationsbrühen, Blutseren oder Reak-tionslösungen, stellen heute immernoch die großen Herausforderungenim Bereich des Downstream Proces-sings biotechnologischer Pharma-zeutika dar. Bis heute werden unter-schiedliche energie- und abwasser-intensive Verfahrensschritte getrenntvoneinander durchgeführt (s. Abb.1), so dass darüber hinaus ein er-heblicher apparativer Aufwand be-trieben werden muss. Die hiermitverbundenen ökonomischen Aufwen-dungen machen oft einen Großteilder Produktionskosten aus, so dasseine Reduzierung dieses Kostenfak-tors durch Integration der verschie-denen Verfahrensschritte als die lo-gische Konsequenz erscheint. Über-raschenderweise ist dieser Ansatzbisher nicht intensiv verfolgt worden.

Das von der Deutschen Bundesstif-tung Umwelt geförderte Vorhaben„Innovatives Baukastensystem zumintegrierten Downstream Processingvon Pharmatargets auf der Basis mo-

dularer Membranadsorbertechnolo-gie“ zielt darauf ab, derartige inte-grierte Systeme zu schaffen, die eineschnelle und gezielte Problemlösungvorliegender Trennaufgaben, eineKopplung der Verfahrensschritte undeine einfache Handhabung ermögli-chen sollen. Diese integrierten Syste-me auf Basis von Membranadsorbernwerden in einem Baukastensystemverwirklicht, das eine flexible Anpas-sung an die jeweilige Problemstel-lung erlaubt und durch die Integra-tion in modulare Kartuschensystemeeine hohe Scale-up-Fähigkeit auf-weist. Weiterhin sind derartige inte-

grierte Systeme auch ökonomischgeboten, da sie eine Minimierung desRessourcen- und Energieverbrauchsermöglichen. Das Projekt ist eine Ko-operation des Instituts für TechnischeChemie der Universität Hannover, derFa. Cell Culture Service, Hamburg,und der Fa. Sartorius, Göttingen. DieProjektpartner ergänzen sich durchihre Expertisen so gut, dass alleAspekte des Vorhabens erschöpfendbearbeitet werden können.

Die praktischen Arbeiten beginnenmit der Konzeption und Entwicklungder Basismembranen, wobei ver-schiedenste Derivatisierungstechni-

ken zur Funktionalisierung der Mem-branen eingesetzt werden. DieseFunktionalisierung gliedert sich indrei verschiedene Hauptbereiche,welche die Schaffung einer hohenSpezifität für jegliches Targetproteinermöglichen. Zuerst erfolgt eine Trä-gerfunktionalisierung in Bezug auf

Abb. 1: Beispiel für ein Produktionsschema; rt-PA-Aufreinigung bei Fa.Genentech.

die Membranbeschaffenheit und -po-rengröße, dann eine Basisfunktiona-lisierung mit terminalen Linkern wieEpoxid-, Aldehyd- oder Hydroxid-gruppen, und zum Schluss eine Li-gandenbindung von Lektinen, Anti-körpern o. ä. als Spezifitätsfunktio-nalisierung. Die Einbindung der

Abb. 2: Modulares Prinzip: BeispielSartobind-Ionentauschermoduleder Fa. Sartorius

110 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

funktionalisierten Membranen in einModulsystem (s. Abb. 2) und dessenTestung erfolgt anhand von Modell-proteinen wie r-hGH, einem rekom-binanten humanem Wachstumsfaktor(r-hGH, human growth hormone).Die Übertragung der Ergebnisse aufRealmedien am speziellen Beispieldes r-hGH führt dann zu einer allge-meinen Methodik, welche die Opti-mierung der Downstream-Bedingun-gen ermöglicht. Ein derartiges pro-zessintegriertes Downstream Proces-sing-System erlaubt eine schnelleund leicht zu handhabende Model-lierung jedes Trenn- oder Aufreini-gungsproblems und vereinfacht so-

mit das Up-scaling in den Produkti-onsbereich erheblich (s. Abb. 3),was anhand des Modellproteins r-hGH demonstriert werden soll.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Thomas ScheperUniversität HannoverInstitut für Technische ChemieCallinstrasse 330167 HannoverTel.: 0511-762 25 09Fax: 0511-762 30 04eMail: scheper@iftc.uni-hannover.de

.

via Einbau von Luftsauerstoff kataly-sieren und so enzymdestabilisierendePeroxide als Kosubstrate oder Koppel-produkte vermeiden. Viele enzymati-sche Oxygenierungen wurden be-schrieben, aber wenige davon sindkomerzialisiert. Dies liegt an der Kom-plexität solcher Biokatalysatoren undan der im Vergleich zu hydrolytischenBiotransformationen wesentlich an-spruchsvolleren Prozessführung. Oxy-genasen sind häufig relativ instabil,bestehen aus mehreren, teilweisemembrangebundenen Proteinkompo-nenten und benötigen teure Coenzy-me wie NAD(P)H. Deswegen wurdenOxygenasen bisher vor allem in gan-zen, lebenden Zellen, die kontinuier-liche Enzymproduktion und Coenzym-regenerierung gewährleisten, einge-setzt.

Das hier beschriebene Projekt be-fasst sich mit der Lösung verschie-

In der chemischen Industrie gibt esbisher, abgesehen von Fermentationenzur Alkohol- oder Aminosäurenpro-duktion, wenige Beispiele für groß-technische Anwendungen (über 1000Jahrestonnen) von Bioprozessen [1].Biotransformationen in diesem Maß-stab werden fast ausschließlich mit hy-drolytischen Enzymen durchgeführt,z. B. in der Antibiotikaproduktion.Oxidoreduktasen katalysieren unteranderem hoch spezifische Oxyfunktio-nalisierungen von Kohlenwasserstof-fen und erlauben so die Herstellungvon funktionalisierten hochwertigenGrundchemikalien (Synthons), wiez. B. chiralen Epoxiden, mit bis zu100% Ausbeute. Solche, für die che-mische Industrie relevanten Reaktio-nen sind mit organisch chemischenMethoden schwierig durchführbar.Traditionelle chemische, homogen-oder heterogenkatalytische Verfahren

OXYGENASEN

Prozessintegrierte rekombinanteBiokatalyse für hochselektiveOxyfunktionalisierung vonKohlenwasserstoffen� Dr. Andreas Schmid1, Dr. Bruno Bühler1, Dr. Bernd Bauer2, Prof. Dr. Horst Chmiel3, Dr. Bernhard Hauer4, Dr. Tilo Habicher4, Dr. Rudolf Krumbholz5

1 Institut für Biotechnologie, ETH Zürich, Schweiz, 2 FuMA-Tech GmbH, St. Ingbert, 3 Gesellschaft für umweltkompatible Prozesstechnik mbH, Saarbrük-ken, 4 BASF AG, Ludwigshafen, 5 K.D.-Pharma GmbH, Bexbach

für stereoselektive Epoxidierungenoder Hydroxylierungen basieren aufSchwermetallkatalysatoren. Ein bio-technologischer Ansatz stellt eine öko-

nomisch sowie ökologisch interessan-te Alternative dar. Oxygenasen sind be-sonders interessant, da sie solche Re-aktionen unter milden Bedingungen

Abb. 1: Schema der Biotransformation von Styrol zu (S)-Styrolepoxid.Wachsende rekombinante E. coli-Zellen exprimieren die Gene der Styrol-monooxygenase von Pseudomonas sp. VLB120 und gewährleisten dieRegeneration von NADH. Substrat und Produkt liegen vor allem in derorganischen Phase vor, wodurch deren Toxizität minimiert wird [2].

Abb. 3: SchematischerAufbau einer Membra-nadsorbereinheit imTechnikumsmaßstab.

Sonderband | 2003 | 111BIOKATALYSEBIOKATALYSE

dener Probleme der Oxygenase-ba-sierten Biokatalyse mit lebenden Zel-len und baut auf kürzlich entwickel-ten Prozessen zur spezifischen Oxy-genierung von Styrol zu (S)-Styrole-poxid und von Pseudocumol zu 3,4-Dimethylbenzaldehyd auf [2,3]. Die-se Prozesse basieren auf Fed-Batchkultivierten rekombinanten Escheri-chia coli-Zellen als Biokatalysatorenund auf einem Zweiphasensystembestehend aus wässrigem Mediumund einem organischen Lösungsmit-tel. Solche Emulsionsprozesse ermög-lichen die Zugabe und Produktionhoher Mengen an toxischen undschwer wasserlöslichen Substratenund Produkten. Für die Modellreak-tion von Styrol zu (S)-Styrolepoxid istdas Konzept in Abbildung 1 darge-stellt. In nicht kontinuierlichen Pilot-prozessen im 30 L Maßstab wurden,bezogen auf die wässrige Phase, Pro-duktivitäten bis zu 4 g L-1 h-1 erreicht,was die industrielle Eignung der bio-katalytischen Oxyfunktionalisierungveranschaulicht.

Aus ökonomischen sowie ökologi-schen Gründen ist eine kontinuierli-che oder halbkontinuierliche Pro-zessführung vorteilhaft für industrielleAnwendungen. Dies erfordert eineeffektive Rückextraktion der Produk-te aus der Emulsion sowie eine ge-wisse Langzeitstabilität des Biokata-lysators, was die Schwerpunkte deshier beschriebenen Projekts sind.

Um hohe Expression der Oxyge-nasegene und hohe NAD(P)H Rege-nerationsraten zu erreichen, wird ein

induzierbares effizientes Expressions-system (basierend auf dem alk Re-gulationssystem von Pseudomonasputida GPo1) in metabolisch hochaktiven wachsenden Zellen eingesetzt.Eine Verbesserung der Biokatalysator-stabilität wird durch eine grundlegen-de Untersuchung des Stoffwechsels(NADH und Kohlenstoff Metabolis-mus) unter Prozessbedingungen an-gestrebt. Die Produktivität solcherEmulsionsprozesse ist oft durch toxi-sche Stoffwechselprodukte limitiert,speziell bei der Verwendung hoherBiomassekonzentrationen. SolcheEinflüsse sollen in kontinuierlichenProzessen charakterisiert werden.

Effektiver Sauerstoffeintrag undMinimierung des Verlusts an leicht-flüchtigem Substrat werden durchblasenfreie Begasung über Membra-nen angestrebt. Hemmungen durchtoxische Biotransformations- sowieStoffwechselprodukte, wie sie bei derStyrolepoxidproduktion auftreten,sollen über kontinuierliche Pro-zessführung und selektiven Produkt-austrag aus der Emulsion mittels Per-traktion beseitigt werden. Dafür wer-den, wie in Abbildung 2 gezeigt, po-röse Membranen und Module sowienicht-poröse Lösungs-Diffusions-membranen und die entsprechendenProzessführungsstrategien entwickelt.Dieses Konzept erlaubt auch eine ein-fachere und kostengünstigere Pro-duktaufreinigung.

Die erfolgreiche Entwicklung kom-petitiver Prozesse mit hohen Produk-tivitäten wird durch enge Zusammen-

arbeit von Biotechnologen und Ver-fahrensingenieuren angestrebt. DieErgebnisse dieser Arbeit werden all-gemein die Entwicklung neuartigerBioprozesse ermöglichen, deren Pro-duktivität (und damit Wirtschaftlich-keit) hoch genug ist, um herkömmli-che Prozesse der Petrochemie für dieFunktionalisierung von Kohlenwas-serstoffen durch kostengünstige undumweltfreundliche biotechnologischeAlternativen zu ersetzen.

Literatur

[1] Schmid, A., Dordick, J.S., Hauer, B.,Kiener, A., Wubbolts, M., Witholt, B.,Nature 409 (2001), 258-268.

[2] Panke, S., Held, M., Wubbolts, M.G.,Witholt, B., Schmid, A., Biotechnol.Bioeng. 80 (2002), 33-41.

[3] Bühler, B., Bollhalder, I., Hauer, B.,Witholt, B., Schmid, A., Biotechnol.Bioeng. 82 (2003), 833-842.

Korrespondenzadresse

Dr. Andreas SchmidETH ZürichInstitut für BiotechnologieHönggerberg HPT D73CH-8093 Zürich, SchweizTel.: + 41 1 633 3691Fax: + 41 1 633 1051eMail: andreas.schmid@biotech.biol.ethz.ch

Abb. 2: Membranmodul für blasen-freie Begasung sowie Produktaus-trag unter Rückhalt des Biokataly-sators. Das abgebildete Membran-modul ist chemisch nicht stabil imPertraktionsmedium, soll jedochunter Verwendung mechanischstabiler Hohlfasermembranen ent-sprechend angepasst werden.

Sonderpublikation „Nachhaltige Bio-katalyse“ der Deutsche Bundesstif-tung Umwelt (DBU) in Kooperation mitdem BioTechnologie Nachrichten-Ma-gazin |transkript der BIOCOM AG

Herausgeber:Dr. Stefanie HeidenDeutsche Bundesstiftung UmweltAn der Bornau 2D-49090 OsnabrückTel.: (0541)-9633-321Fax: (0541)-9633-193eMail: s.heiden@dbu.de

Dr. Rainer ErbZentrum für Umweltkommunikationder Deutschen BundesstiftungUmwelt gGmbHAn der Bornau 2D-49090 OsnabrückTel.: (0541) 9633-950Fax: (0541) 9633-990eMail: r.erb@dbu.de

Verlag:BIOCOM AGStralsunder Str. 58 - 59D-13355 Berlin | GermanyTel.: 030/264921-0Fax: 030/264921-11eMail transkript@biocom.deInternet www.biocom.de

Redaktion:Dr. Rainer Erb

Vertrieb:Angelika WernerTel.: 030/264921-40

Sabine LohausTel.: 0541/9633-951

Druck:Mayer & Söhne GmbHObernbacher Weg 7D-86544 Aichach

9. Jahrgang 2003Hervorgegangen aus BioTechnologieDas Nachrichten-Magazin (1986-88)und BioEngineering (1988-94)

ISSN 1435-5272Postvertriebsstück A 49017

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112 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

BIOPRODUKTAUFREINIGUNG

Magnettechnologie in derBioproduktaufreinigung� Dr.-Ing. habil. Matthias Franzreb1, Dipl.-Ing. Niklas Ebner1, Dr. rer. nat. Martin Siemann-Herzberg2

1 Institut für Technische Chemie, Forschungszentrum Karlsruhe GmbH, 2 Institut für Bioverfahrenstechnik, Universität Stuttgart

Im Rahmen eines Projekts des durch die Deutsche Bundesstiftung Umwelt geförderten InnovationsCentrums Biokatalyse (ICBio) werden die Komponen-ten und die Verfahrensführung eines neuen, einfachen und robusten Verfahrens für die Bioproduktaufreinigung entwickelt. Das Verfahren vereint dieSchritte Feststoffabtrennung sowie primäre Produktreinigung und basiert auf dem Einsatz kompakter magnetischer Mikrosorbentien und von auf dieBiotechnologie adaptierter Magnettechnologie. Nach einer Einführung und kurzen Vorstellung der eingesetzten Partikel- und Separatortechnologie wer-den anhand der Aufreinigung eines 5xHis-getaggten Green Fluorescent Proteins (GFP) erste Daten für die bisher erreichten Prozessparameter des Ver-fahrens angeführt. Zu den wichtigsten Ergebnissen zählen: (i) Im Rahmen eines Partikelscreenings erwiesen sich maghemithaltige Polyvinylalkohol-Par-tikel mit “Immobilized metal affinity”-Liganden als geeignete Affinitätssorbentien. (ii) Die anschließende direkte Abtrennung der beladenen Mikropartikelnaus einem Escherichia coli-Rohaufschluss mittels Magnetseparation gelang mit Filtergeschwindigkeiten von 25 m/h. (iii) Nach erfolgter Waschung ver-mag eine einmalige Elution mit 0,1 mol/L Imidazol nahezu 95 % des gebundenen GFP in feststofffreier Form wieder zu desorbieren.

Keywords: Bioproduktaufreinigung, Hochgradienten-Magnetseparation, magnetische Mikrosorbentien, Immobilisierte Affinitätsliganden-Chromatogra-phie, Green Fluorescent Protein (GFP), integrierte Aufreinigungsverfahren.

Modellsystem dient dabei die Aufreini-gung eines rekombinant hergestellten5x His-getaggten Green Fluorescent Pro-teins (GFP) aus einem Escherichia coli-Rohhomogenisat [3]. Der Lösungsan-satz basiert auf dem Einsatz magneti-scher Mikrosorbentien zur temporärenBindung von Bioprodukten in Kombi-nation mit auf die Biotechnologie zuge-schnittener Magnettechnologie. DasGrundprinzip folgt dem aus der Bioana-lytik bekannten Schema und ist in Ab-bildung 1 dargestellt. Im Unterschiedzur Bioanalytik muss das Schema füreinen Einsatz in der Bioproduktaufrei-nigung aber in einem um mehrere Grö-ßenordnungen erhöhten Maßstab rea-lisiert und vollständig automatisiertwerden. Hierdurch ergeben sich multi-disziplinäre Herausforderungen, wiez. B. die gentechnologische Synthesevon für das Verfahren geeigneten Stäm-men, die kostengünstige Herstellungmagnetischer Mikrosorbentien sowiedie Entwicklung geeigneter Magnetse-parationstechnologie im technischenMaßstab, wobei im letzteren Fall auf dieErfahrungen aus dem industriellen Ein-

satz von Magnetseparatoren in der Erz-aufbereitung und der Wassertechnolo-gie aufgebaut werden kann [4,5].

Magnetische Sorbentien

Mit sehr wenigen Ausnahmen besitzenbiologische Substanzen diamagnetischeEigenschaften, d. h. sie werden von ei-nem Magneten sehr schwach abgesto-ßen, wodurch eine direkte Nutzung vonMagnetfeldern zu ihrer Handhabungpraktisch auszuschließen ist. Um den-noch ein breites Anwendungsfeld fürmagnetische Verfahren in der Biotech-nologie zu erschließen, ist es daher stetsnotwendig die biologischen Substanzenan magnetische Sorbenspartikel zu bin-den. Diese Bindung kann in gewissenFällen, wie z. B. bei der Immobilisie-rung von Enzymen, irreversibel erfol-gen. In der Regel wird aber eine rever-sible Bindung angestrebt, die zum ei-nen stark genug ist, um eine ausrei-chende Selektivität für die Zielsubstanzzu erreichen, und zum anderen jedochdurch eine Änderung der Milieubedin-gungen wieder vollständig gelöst wer-

den kann. Am Anfang der Entwicklungjedes auf Magnettechnologie basieren-den Aufreinigungsverfahrens steht da-her die Suche nach geeigneten Parti-keln.

Ausgangsbasis des Screenings nachgeeigneten magnetischen Grundparti-keln waren die Eckpunkte: (i) Kom-pakte, unporöse Partikelstruktur mitca. 1 µm Durchmesser, (ii) superpa-ramagnetische Eigenschaften ausrei-chender Stärke für eine rasche und ef-fiziente Magnetseparation, (iii) che-misch und mechanisch robust, (iv)Partikeloberfläche liegt in einer Formvor, die eine breite Palette weitergehen-der Funktionalisierungen erlaubt, und(v) die Oberfläche zeigt eine geringeunspezifische Bindungsaffinität. MitBezug auf das gewählte Modellsystemwurden folgende Grundpartikeltypenmit Iminodiacetatgruppen (IDA) funk-tionalisiert (siehe Kasten), um nachanschließender Kupferbeladung derChelatgruppen verschiedene, für His-getaggte Proteine selektive, Affinitätssor-bentien zu erhalten.– Polyglutaraldehyd gecoatete Ferrit-partikel (PGF) [6]– Maghemithaltige Polymethacrylat-partikel (mPMA)– Maghemithaltige Polyvinylalkoholp-artikel (M-PVA) [7], 2 Varianten

Verfahrensführung undPartikelseparation

Ein Ansatz zur Übertragung des in Ab-bildung 1 dargestellten Prinzips in den

Bei der Bioproduktaufreinigung imtechnischen Maßstab besteht insbeson-dere bei der schnellen und direktenAbtrennung von Bioprodukten aus Zel-laufschlüssen, Zellkulturen und Zellsus-pensionen Optimierungsbedarf. DerGrund hierfür ist, dass bei den gängi-gen Aufreinigungsschemata eine Ad-sorptionschromatographie im Festbetthäufig den ersten eigentlichen Reini-gungsschritt für das Zielmolekül dar-stellt. Voraussetzung ist jedoch eine voll-ständige Entfernung aller suspendiertenFeststoffe aus dem Zulaufmedium, so-dass der Chromatographie in der RegelFällungs-, Zentrifugations- und Mikro-filtrationsstufen vorausgehen [1]. Dieresultierenden mehrstufigen Aufarbei-tungsprozesse führen zu hohen Pro-duktverlusten, langen Prozesszeiten so-wie oftmals zu einem hohen Chemika-lien- und Energieaufwand [2]. Die Ent-wicklung neuer Verfahren zu einer di-rekten Gewinnung von Bioproduktenaus feststoffhaltigen Medien ist dahervon großem Interesse für eine kosten-günstige und nachhaltige Biotechnolo-gie. Die vielversprechendsten Ansätzehierzu basieren auf dem Grundgedan-ken mehrere der diskreten Aufreini-gungsschritte zu neuen und innovativenProzessen („integrierte Verfahren“) zu-sammenzufassen.

Vorgestellt wird im Folgenden eineinfaches und robustes „integriertesVerfahren“ für die Bioproduktaufreini-gung, das die Schritte Feststoffabtren-nung und primäre Produktreinigung ineinem Verfahrensschritt vereint. Als Abb. 1: Prinzip der Magnettrenntechnologie im Milliliter-Maßstab.

Sonderband | 2003 | 113BIOKATALYSEBIOKATALYSE

technischen Maßstab ist in Abbildung2 dargestellt. Die Abbildung zeigt dasFließbild der verwendeten Laborver-suchsanlage sowie eine Detailvergrös-serung des Magnetseparationsbereichs.Nach der Sorption der Biomoleküle anmagnetische Mikrosorbentien in einemexternen Rührreaktor wird die parti-kelhaltige Suspension durch die Ab-scheidekammer eines Magnetsepara-tors gepumpt. Hierbei werden die pro-duktbeladenen magnetischen Sorben-tien zurückgehalten, während z. B. un-magnetische Zellbruchstücke den Se-parator ungehindert passieren. ZumWaschen und zur Elution wird derKreislauf der Laboranlage zunächst beieingeschaltetem Magnetfeld mit einerentsprechenden Lösung gefüllt. An-schließend erfolgt bei ausgeschaltetemMagnetfeld ein ca. einminütiges Um-pumpen der Partikel in einem Loop,gefolgt von einem Ausschleusen derWasch- bzw. Elutionslösung, wobei diePartikel wiederum durch das Magnet-feld zurückgehalten werden. Abschlie-ßend werden die Partikel aus dem Sy-stem ausgespült und für den nächstenZyklus verwendet.

Aufgrund der geringen Größe derMikrosorbentien sowie der großen zuverarbeitenden Volumina lässt sich dienach den Sorptions-, Wasch- und Elu-tionsschritten notwendige Partikelab-trennung nicht mit Hilfe einfacherHandpermanentmagnete oder Trom-melmagnetseparatoren erreichen. Viel-mehr kommen so genannte Hochgra-dienten-Magnetseparatoren [4,9] zumEinsatz, welche die magnetischen Par-tikel in einem Filter aus magnetisier-barem Drahtgewebe zurückhalten (sie-he Ausschnittsvergrößerung Abbildung2). Die Maschenweite des Drahtgewe-bes liegt bei ca. 1 mm und der Filterhat durch die Verwendung von unma-gnetischen Abstandshaltern eine hohePorosität von ca. 95 %. Hierdurch kön-nen unmagnetische Zellen und Zell-trümmer den Filter ungehindert durch-dringen und es treten auch im Falle vonZellhomogenisaten hoher Viskositätnur geringe Druckverluste auf.

Aufreinigung eines5x His-getaggten GreenFluorescent Proteins (GFP)

SorptionZum Vergleich der Aufreinigungslei-stung der verschiedenen magnetischenTräger wurden Adsorptionsisothermenfür eine nach dem Zellaufschluss un-geklärte GFP-Lösung bestimmt. Je 2 mLverschieden konzentrierter GFP-Lö-sungen wurden mit 4 mg der kupfer-beladenen IDA-Partikeln 15 min lang

Diese lassen sich gut durch das Mo-dell von Langmuir beschreiben, demfolgende Gleichung zugrunde liegt:

q = (qmax

x c*)/(K

d + c*),

wobei q die Menge des gebundenenProteins, q

max die maximale Beladungs-

kapazität und Kd die Gleichgewichtskon-

stante beschreibt. c* gibt die Konzen-tration des Proteins im Überstand nachGleichgewichtseinstellung an. Tabelle 1führt die Adsorptionsparameter für dieverschiedenen Partikelvarianten auf.

Eine optimierte Variante der M-PVA-Partikel (M-PVA_I) zeigt hierbei mit276 mg GFP/g Trägermaterial die höch-ste Beladungskapazität der untersuch-ten Mikrosorbentien. Die anderen un-tersuchten Trägermaterialen zeigenniedrigere Sättigungskapazitäten, wasauf niedrigere Ligandendichten zurück-zuführen ist (Ergebnisse nicht darge-stellt). Die geringen K

d-Werte von un-

ter 1,8 µM deuten bei allen Partikels-orten auf eine hohe Selektivität der Mi-krosorbentien hinsichtlich des Zielpro-teins hin.

Elution

Das Desorptionsverhalten von GFP inAbhängigkeit von der Imidazolkon-zentration im Elutionsmitttel ist inAbbildung 4 dargestellt. Quantifiziertwurde die eluierte Menge an GFP beiVerwendung der Partikelsorten M-PVA_II und PGF. Die Imidazolmengeim Elutionspuffer (Imidazol, NaCl, pH7,1) wurde von 0,01 bis 1,0 mol/L va-riiert, die Gesamt-Ionenstärke wurdedurch eine angepasste NaCl-Konzen-tration bei 1,0 mol/L konstant gehal-ten, um deren Einfluss auf die Des-orption zu unterdrücken.

Wie die Abbildung zeigt, reicht beiden M-PVA_II-Partikeln eine Imida-

Herstellungmagnetischer Sorbentienmit Chelatliganden amBeispiel von M-PVA

Ausgangspunkt bilden mittels Sus-pensionspolymerisation hergestell-te maghemithaltige Polyvinylalkohol-partikel der Firma chemagen Biop-olymer-Technologie AG. Diese Par-tikel zeichnen sich durch eine starkhydrophile Oberfläche, geringe un-spezifische Sorption und eine hohechemische und mechanische Ro-bustheit aus. Ausgehend von die-sen Primärpartikeln erfolgt die Ein-führung chelatbildender Iminodia-cetatgruppen (IDA), wobei Allyl-Gly-

cidyl-Ether zur Aktivierung und zurEinführung eines Spacers eingesetztwird. Die endständige Doppelbin-dung der allylaktivierten Partikellässt sich mittels N-Bromsuccinimid(NBS) leicht bromieren [8]. Ab-schließend erfolgt die Bindung desIDAs im Alkalischen .

geschüttelt. Aufgrund von Kinetikver-suchen erwies sich diese Zeit für dasgewählte System als ausreichend. NachEinstellung der Gleichgewichtsbela-dung der Partikel mit dem ZielproteinGFP wurden die Partikel zweimal mitWaschpuffer (20 mM NaH

2PO

4, 0,2 M

NaCl, pH 6,8) gewaschen, um unselek-tiv gebundenes Protein weitgehend zu

entfernen. Anschließend wurde mitElutionspuffer (0,2 M Imidazol, 0,2 MNaCl, pH 7,1) zweimal je 10 min eluiertund somit die Protein-Beladung derPartikel bestimmt. Abbildung 3 zeigtdie bei 25°C gemessenen Beladungs-werte mit GFP unter Gleichgewichts-bedingungen sowie die dazugehörigenAdsorptionsisothermen.

Abb. 2: Schema der Versuchsanlage zur Bioproduktaufreinigung.

Abb. 3: Beladungskapazitäten für verschiedene magnetische Sorbentien.

114 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

zolkonzentration von ca. 0,1 mol/Laus, um nahezu 95 % des gebunde-nen GFP zu desorbieren. Dies ent-spricht praktisch der maximalen GFP-Menge, die von diesen Partikeln in ei-nem Elutionsschritt desorbiert werdenkann (96 % bei 1,0 mol/L Imidazol).Für die PGF-Partikel ist eine mehr alsdoppelt so hohe Imidazolkonzentra-tion von über 0,2 mol/L nötig, um dieGrößenordnung der in einem Eluti-onsschritt maximal desorbierbarenMenge zu erreichen. Diese beträgt al-lerdings nur ca. 90 % von der sorbier-ten Gesamtmenge an GFP, sodass einzweiter Elutionsschritt ratsam ist. Ne-

zyklus. Ein Aufreinigungszyklus be-steht aus der Sorption des Proteins,zweimaligem Waschung mit Wasch-puffer und einer anschließenden ein-oder zweimaligen Elution (Bedingun-gen und verwendete Puffer sieheoben). Anschließend stehen die Par-tikel nach Entfernung des Elutionsmit-tels durch zweimaliges Waschen mitPuffer (20 mM NaH

2PO

4, 0,2 M NaCl,

pH 6,8) für einen erneuten Zyklus zurVerfügung.

Die maximalen Beladungskapazitä-ten der Partikelsorte M-PVA_II in mgeluiertes GFP pro g Träger sind in Ab-bildung 5 über mehrere Aufreini-

lativ geringen Kapazitätsverlusten erstnach dem dritten oder vierten Zyklusnotwendig. Wird nach jedem Zyklusder Chelatbildner neu mit Cu2+-Ionenbeladen (schwarze Symbole) bleibtdie Kapazität der Partikeln hinsicht-lich des Modellproteins über vieleZyklen voll erhalten.

Demonstration im 200 mLMaßstab

Parallel zu den Detailstudien über dasSorption-, Elutions- und Wiederver-wendungsverhalten der magentischenMikrosorbentien wurde die Leistungs-fähigkeit des Verfahrensprinzips inVersuchen mit 200 mL Rohlysat de-monstriert. Abbildung 6a zeigt dieSDS-Gelanalyse der Fraktionen einesentsprechenden Versuchs zur GFP-Aufreinigung. Die verwendeten Pufferentsprachen dabei den im AbschnittSorption genannten. Die eingesetzteMenge von 1,5 g M-PVA_II Partikeln,entsprechend einer GFP-Aufnahmeka-pazität von ca. 150 mg, wurde im Hin-blick auf hohe Reinheiten des Eluatsgewählt und nicht unter dem Aspekteiner hohen Ausbeute. Wie aus demGel zu erkennen ist, bildet GFP die ein-zige Bande der beiden Elutionsfrak-tionen. Zur Verdeutlichung, dass sichdas Verfahren nicht auf das hier ein-gehend untersuchte ModellproteinGFP beschränkt, ist mit Abbildung 6bnoch eine Gelanalyse der Aufreini-gungsfraktionen eines His-getaggtentechnischen Enzyms beigefügt, wobeiDetails hierzu in einer späteren Ver-öffentlichung folgen.

Zusammenfassung undAusblick

Im bisherigen Projektverlauf ist es ge-lungen, die Proteinaufreinigung mittelsmagnetischer Mikrosorbentien vonursprünglich 1-2 mL auf einen Maßstab

von aktuell 0,2 L Bakteriensuspensio-nen (20 % v/v Zellmasse) pro Zykluszu übertragen. Hierzu waren die Ent-wicklung und Produktion neuer lei-stungsstarker magnetischer Mikrosor-bentien, ein Übergang von einfachenHandpermanentmagneten zu Hochgra-dienten-Magnetseparatoren sowie dieErarbeitung und Optimierung geeigne-ter Verfahrensprotokolle notwendig. ImFalle des Modellsystems eines GFP-hal-tigen Eschericha coli-Rohhomogeni-sats ergibt sich aus der 20 %-igen Zell-suspension eine Ausbeute von ca.0,15 g nahezu reinen GFPs. Im weite-ren Verlauf des Projekts wird eine wei-tere Maßstabsvergrößerung des Verfah-rens angestrebt. Hierzu ist derzeit einMagnetseparator mit größerer Filter-matrix in Konstruktion, der im Falle desModellsystems ca. 3-4 Liter ungeklärteBiorohsuspension - entsprechend ca.5 g gereinigtem Protein - pro Aufreini-gungszyklus durchsetzen kann. Paral-lel werden weitere Partikelsorten mitneuen Affinitätsliganden entwickelt, umdie Palette einsetzbarer Tags zu erwei-tern.

Eine sehr reizvolle längerfristige Auf-gabe wird schließlich die direkte Kopp-lung des Magnettrennverfahrens anRoutineverfahren zur Herstellung re-kombinanter Proteine darstellen. ImFalle der Kultivierung von rekombinan-ten Bakterien wie Escherichia colikönnen in so genannten Hochzelldich-teverfahren bis zu 100 g Biotrocken-masse/L Reaktorvolumen hergestelltwerden [10]. Dieses entspricht einerca. 30 %-igen (v/v) Zellsuspension, diesich anschließend mittels einer konti-nuierlicher Rührwerkskugelmühle imtechnischen Maßstab vollständig auf-schließen lässt. Das vorgestellte Ma-gnettrennverfahren ist in der Lage, die-ses Rohlysat direkt weiter zu verarbei-ten und dabei die Schritte Feststoffab-trennung und primäre Produktreini-gung zu vereinen.

Tab. 1: Angepasste Langmuir-Parameter für die GFP-Adsorption.

Partikelsorte qmax Kd (µM) qmax/Kd

(mg GFP/g Träger) (L/g Träger)M-PVA_I 275,9 0,68 15,08M-PVA_II 92,1 1,37 2,50PGF 63,9 0,18 13,20mPMA 179,8 1,75 3,82

ben der höheren Sorptionskapazitätsprechen daher auch die Ergebnisseder Elutionsuntersuchungen für eineVerwendung der M-PVA-Partikel.

Wiederverwendung

Wichtig für eine automatisierte Be-triebsweise im technischen Maßstabist eine häufige Wiederverwendungder Partikel. Hierbei ist der Verlust vonCu2+-Ionen bei der Elution mit Imida-zol dann kritisch, wenn die maximaleSättigung der Partikeln mit GPF nichtmehr gewährleistet ist (Ergebnissenicht gezeigt), wie z. B. im Falle eineszweiten Elutionsschritts oder bei zuniedriger Ausgangskonzentration derBiorohsuspension im Vergleich zurgewählten Partikelkonzentration. DerVerlust an Kupferionen bewirkt eineVerringerung der Sorptionskapazitätan Protein im nächsten Aufreinigungs-

Abb. 4: Elutionseffizienz in Abhängigkeit der Imidazolkonzentration.

gungszyklen aufgetragen, wobei imersten Versuch zweimal (rote Symbo-le), im zweiten Versuch nur einmaleluiert wurde (blaue Symbole). Bei-desmal fand zwischen den Aufreini-gungszyklen keine Wiederbeladungdes Metallchelatbildners mit Cu2+-Io-nen statt.

Deutlich zu sehen ist der sehrschnelle Abfall der maximalen Aufrei-nigungskapazität bei einer zweimali-gen Elution. Bereits bei der viertenAufreinigung ist die Kapazität der Par-tikel um 68 % von 96 mg GFP/g Trä-ger auf 31 mg GFP/g Träger gesunken.Bei einmaliger Elution ist ein Rück-gang der Beladungskapazität auf ca.31 mg GFP/g Träger erst im siebtenZyklus zu verzeichnen. Da bei den M-PVA-Partikeln auf eine zweite Elutionverzichtet werden kann (siehe oben),ist eine erneute Beladung des Chelat-bildners mit Cu2+-Ionen bei noch re- Abb. 5: Beladungskapazität über mehrere Beladungszyklen.

Sonderband | 2003 | 115BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Literatur

[1] Amersham Pharmacia Biotech: Ex-panded bed adsorption - Principlesand methods In: Amersham Phar-macia Biotech., 91-630-5519-8.

[2] Leuchtenberger, A.: Grundwissenzur mikrobiellen Biotechnologie,B.G. Teubner Stuttgart (1998).

[3] Oelschlaeger, P., Lange, S., Schmitt,J., Siemann, M., Reuss, M., Schmid,R.D., Appl. Microbiol. Biotechnol. 61(2003), 123-32.

[4] Svoboda, J., Magnetic methods forthe treatment of minerals, ElsevierSci. Publ. Co., Amsterdam (1987).

[5] Franzreb, M., FZK Nachrichten 1(2001), 51-58.

[6] Hubbuch, J.J., Thomas, O.R.T.,Biotechnol. Bioeng. 79 (2002), 301-313.

[7] Oster, J., Parker, J., à Brassard, L.,J. of Magnetism and Magnetic Mate-rials, 225 (2001), 145-150.

[8] Burton, S.C., Harding, D.R.K., J.Chromatogr. A 75 (1997), 39-50.

[9] Hoffmann, C., Franzreb, M., Höll,W.H., IEEE Transactions on Applied

Superconductivity 12 (2002), 963-966.

[10] Wilms, B., Hauck, A., Reuss, M.,Syldatk, C., Mattes, R., Siemann, M.,Altenbuchner, J., Biotechnol. Bio-eng. 73 (2001), 95-103.

Projektpartner

– Dr. habil. Matthias Franzreb, Dipl.-Ing. Niklas Ebner, Institut für Techni-sche Chemie, ForschungszentrumKarlsruhe GmbH

Abb. 6: SDS-Gelanalyse der Aufreinigungsprozedur des His-getaggtenModellproteins eGFP (a) sowie eines technischen Enzyms (b) mittels Ma-gnettrenntechnik am HGMS durch Verwendung von M-PVA_II Partikeln. M:Molekularer Proteinmarker; 1: Zellaufschluss; 2: Sorptionsüberstand; 3:vereinigte Waschfraktionen mit: 3.1, 3.2, 3.3 (1.-3. Durchgang); 4: 1. Eluti-onsfraktion; 5: 2. Elutionsfraktion. Färbung des 10 %-igen SDS-Gels mit-tels Coomassie

– Dr. Josef Altenbuchner, Dr. Zsuzsa-na Mayer, Institut für Industrielle Ge-netik, Universität Stuttgart– Prof. Dr. Christoph Syldatk, Dr. Ru-dolf Hausmann, Dr. Martin Siemann-Herzberg, Dipl.-Biol. Christina Fritz,Dipl.-Biol. t.o. Nikolaus Rahaus, Dipl.-Biol. t.o. Nadja Schultz, Institut für Bio-verfahrenstechnik, Universität Stuttgart– Dr. Lothar à Brassard, Dr. JürgenOster, Dr. Thomas Sommer, chemagenBiopolymer-Technologie Aktiengesell-schaft, Baesweiler– Dr. Uwe Habich, Steinert Elektroma-gnetbau GmbH, Köln

Korrespondenzadresse

Dr.-Ing. habil. M. FranzrebForschungszentrum Karlsruhe GmbHInstitut für Technische Chemie(ITC-WGT)Hermann-von-Helmholtz-Platz 176344 Eggenstein-LeopoldshafenTel./Fax: 07247-82-3595/6660eMail: matthias.franzreb@itc-wgt.fzk.de

TEXTIL

Oxidative Enzyme in derTextilindustrie� Dr. Eva Schuh1, Dr. Elisabeth Heine1, Dipl.-Chem. Nabil Daâloul1, Prof. Dr. Hartwig Höcker1, Dipl.-Ing. Rudi Breier2, Dr. Anke Mondschein3, Dr. AnkeApitz3, Prof. Dr. Karl-Heinz van Pée3, Dr. Katrin Scheibner4

1 Deutsches Wollforschungsinstitut an der RWTH Aachen e.V. (DWI), 2 Textilchemie Dr. Petry GmbH, Reutlingen (Dr. Petry), 3 Institut für Biochemie, TUDresden (TU-Dresden), 4 JenaBIOS GmbH, Jena (JenaBIOS)

kommen sowohl bei der Carbonisur alsauch bei der Baumwollbleiche Chemi-kalien zum Einsatz, die Abwasser undMaschinenteile belasten. Das Ziel desersten Teilbereichs ist es, mit Hilfe der

enzymkatalysierten Oxidation von Vege-tabilien in Wolle die bei der klassischenCarbonisur eingesetzten Chemikalien-mengen zu reduzieren bzw. zu ersetzenund die Schädigung der Wolle zu mi-

nimieren. Durch die Anwendung vonOxidoreduktasen soll ein in der Papier-herstellung erprobtes Verfahren in derWollveredlung nutzbar gemacht werden.Ziel des zweiten Teilbereichs ist es, mitHilfe von Oxidoreduktasen die farbigenBegleitstoffe der Baumwolle zu zerstö-ren. Durch die enzymatische Bleiche solldie Menge an Lauge, die bei der Per-oxid-Bleiche benötigt wird, und die Salz-fracht im Wasser reduziert sowie auf denZusatz von anorganischen Salzen als Sta-bilisatoren verzichtet werden.

Einleitung undFragestellung

Im Rahmen des Verbundvorhabenswerden alternative Verfahren zur Car-

Die Textilindustrie ist eine Branche mithohem Energie- und Stoffverbrauch, beider die Hauptfracht der Emissionenüber das Abwasser erfolgt. Der Einsatzvon biotechnischen Verfahren kann zueiner erheblichen Entlastung der Um-welt und gleichzeitig zu Wettbewerbs-vorteilen im umkämpften Markt führen.Die hier vorgestellten Arbeiten befassensich mit dem Einsatz von Enzymen inder Veredlung von Wolle und Baumwol-le. Ziel des Verbundvorhabens ist dieEntwicklung und industrielle Umsetzungalternativer Verfahren zur Carbonisurvon Wolle und zur Baumwollbleiche un-ter Verwendung oxidativer Enzyme, dieim Rahmen des Projekts für diese bei-den Anwendungsbereiche produziertund optimiert werden. Konventionell

Abb. 1: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Grassamen (a)und Ringelkletten(b), den Ausgangssubstraten für die Inkubation mit denOxidoreduktasen.

116 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

bonisur von Wolle und zur Bleiche vonBaumwolle unter Einsatz oxidativerEnzyme entwickelt und im Pilotmaß-stab etabliert. Obwohl diese beiden Ver-fahren gänzlich unterschiedliche texti-le Schwerpunkte darstellen, kommenin beiden Fällen die gleichen Enzymezum Einsatz. Die Kombination dieserunterschiedlichen Themenkomplexe ineinem Verbundprojekt bietet demnachden Vorteil, dass die notwendigen Ent-wicklungsarbeiten im Hinblick auf En-zymproduktion und -optimierung fürbeide Bereiche zum überwiegendenTeil durch den biotechnologisch ori-entierten Verbundpartner (JenaBIOS:Laccase, Mangan-Peroxidase) über-nommen werden; ein Teilbereich (Per-oxidase) wird durch das Institut fürBiochemie der TU Dresden abgedeckt.Die Realisierung der Verfahren im La-bormaßstab erfolgt durch die For-schungsinstitute (DWI: Wollveredlung;TU Dresden: Baumwollveredlung) unddie Umsetzung der Verfahren in den Pi-lotmaßstab im Hinblick auf den Trans-fer in die Textilveredlungsbetriebedurch den Hilfsmittelhersteller (Dr.Petry), der sowohl auf dem Sektor derWoll- als auch der BaumwollveredlungExpertise aufweist.

Carbonisur vegetabilerBestandteile in Wolle

Als Vegetabilien werden pflanzlicheÜberreste in Wolle bezeichnet. Die Kon-tamination von Wolle mit Vegetabilienist auf die Weidebedingungen und dieBedingungen, unter denen die Schafegehalten werden, zurückzuführen.Menge und Art der Vegetabilien sindFaktoren, die zu Preisminderungen derWare führen. Bei den Pflanzenrestenhandelt es sich um die klettenförmigenVerbreitungseinheiten bestimmter Fut-terpflanzen sowie Heu, Stroh und be-grannte Grassamen. Die verholzten spi-ralbandigen Kletten der PflanzengattungMedicago können bis zu 30 % des Ve-getabiliengehalts von Waschwolle aus-machen [1]. Im Allgemeinen sind Klet-ten, insbesondere Ringelkletten (Abb.1), vorzugsweise bei Australwollen zufinden, Steinkletten bei Capwollen, beibeiden Provenienzen aber auch be-stimmte Gräserarten (Ringelkletten:Xanthium spinosum, Medicago den-ticulata, laciniata, minima; Gräser:Barley grass [Hordeum lepinorum])[2]. Europäische Wollen sind wenigerdurch Kletten als durch Gräser undStroh verunreinigt. Einige Kletten wer-den durch Krempeln und Kämmen er-folgreich entfernt, andere können sofeinfaserig vorliegen, dass sie sich wiedie Wollfasern selbst verhalten und mit

gekämmt werden. Diese Vegetabilienkönnen bei der Verarbeitung und Ver-edlung der belasteten Wolle zu Proble-men führen, z. B. verursachen Kletten-fragmente beim Spinnen Fadenrisseoder unerwünschte Verdickungen imFaden. Bereits kleine Anteile an Vege-tabilien in Tuchen verändern den Griffbzw. das Aussehen, da sie zu Fehlfär-bungen führen. Krempel, Kämme undSpinnstrecken werden bei der Wollver-arbeitung durch Vegetabilien mecha-nisch belastet [3]. Die chemische Me-thode zur Entfernung der Vegetabilienist die Carbonisur. Hierbei wird diegewaschene Wolle in ein Bad mit 6-8 %Schwefelsäure gegeben, abgequetscht,vorgetrocknet und dann bei Tempera-turen von über 100°C “gebrannt”. Diedurch die Trocknung hervorgerufeneKonzentrierung der Säure bewirkt eineDehydratisierung (Verkohlung) derCellulose. Die Reste der carbonisiertenVegetabilien können durch Walzen zer-kleinert, der Klettenstaub anschließendausgeklopft und die Wolle neutralisiertund gespült werden. Von harten Scha-lenteilen wird die Säure jedoch nichtgut aufgenommen, daher sind dieseStücke auch nach der Carbonisur kaumzu zertrümmern. Die Carbonisur istnicht unproblematisch für die Wolleselbst. Neben den Vegetabilien kann

auch die Wolle durch die Säure geschä-digt werden. Die gesamten Wollverlu-ste können je nach vorliegender Roh-wolle 12 % und mehr betragen.

Bleichen von Baumwolle

Die Baumwollfaser ist ein einzelliges,bandartig flaches Gebilde mit meistkräftiger Zellwand. Sie besteht zu 90-95 % aus reiner Cellulose und erscheintunter dem Mikroskop als flaches Bandmit korkenzieherartigen Drehungen.Diese Windungen greifen beim Verspin-nen scharnierartig ineinander, sodassdie Fasern gut im Garn haften. Baum-wolle enthält außerdem Baumwollfet-te und -wachse, Ligninreste, Proteine,Pektine und Mineralstoffe [4]. Je nachHerkunftsland ist Rohbaumwolle weiß(Peru Pima), gelb oder braun (ägypti-sche Baumwolle) gefärbt.

Besonders die gelb- und braunge-färbte Baumwolle, deren Farbe in er-ster Linie durch die anhaftenden Lignin-reste verursacht wird, muss in der Vor-behandlung des Textilguts gebleichtwerden, um nachfolgend eine einheit-liche Färbung der Garne erreichen zukönnen. Lange Zeit wurde Hypochloritals bleichendes Agens eingesetzt. AusGründen der Umweltverträglichkeit istes heute in Deutschland überwiegend

durch Wasserstoffperoxid ersetzt [5].Wasserstoffperoxid ist eine schwacheSäure, die sich in wässriger Lösungleicht zersetzt. Wird dieser wässrigenLösung Alkali zugesetzt, entstehen Hy-droperoxidanionen, die als das wirk-same Agens bei der Bleiche mit Per-oxid angesehen werden. Die Zersetzungdes Wasserstoffperoxids steigt mit zu-nehmender Temperatur, zunehmen-dem pH-Wert und wird durch Schwer-metalle und leicht oxidierbare Substan-zen katalysiert. Schwermetalle müssendaher vor dem Bleichprozess maskiertund die Eigenzersetzung bei der Do-sierung des Wasserstoffperoxids unterProzessbedingungen berücksichtigtwerden. Einen optimalen Bleicheffekterzielt man bei pH 11, der mit einemMinimum an Faserschädigung zusam-menfällt und daher meist zur Anwen-dung kommt. Andere eingesetzteBleichmittel sind z. B. Peressigsäure alsmildes Agens und Natriumdithionit alsreduzierendes Bleichmittel. Es ist gün-stig, vor der Bleiche die Faser alkalischabzukochen. Dazu kommt gewöhnlichNatronlauge zum Einsatz [6]. Durchjedes Bleichverfahren wird die Cellu-lose mehr oder weniger abgebaut, wassich in einer Abnahme des Durch-schnittspolymerisationsgrads (DP) äu-ßert. Es ist daher nicht beliebig oft zuwiederholen.

Das Ziel einer guten Bleiche ist es,einen hohen Weißgrad, eine gute Halt-barkeit des Weiß und eine gute Saug-fähigkeit der Ware mit geringstmögli-cher Faserschädigung und einer hohenWirtschaftlichkeit zu erreichen.

Der mikrobielleLigninabbau

Der mikrobielle Ligninabbau ist eingenerell aerober, oxidativer Prozess.Eine Reihe von Mikroorganismen, so-wohl Pilze als auch Bakterien (Actino-myceten), besitzen die Fähigkeit, dieStruktur des Lignins chemisch zu mo-difizieren [7]; ein substanzieller Abbaudes Lignins verbunden mit seiner Mi-neralisierung ist allerdings auf eine ein-zige Gruppe von Mikroorganismen be-schränkt - die Basidiomyceten (Stän-derpilze). Innerhalb dieser artenrei-chen Pilzklasse haben sich im Laufe derEvolution zwei ökophysiologische Le-bensweisen entwickelt (Holzabbau undStreuzersetzung), die einen effektivenAngriff auf das Ligninpolymer außer-halb der Zelle (extrazellulär) gewähr-leisten [8]. Holzabbau und Streuzerset-zung können zur sogenannten Weiß-fäule von Lignozellulosen führen, d. h.zu einem selektiven Verlust des Lignins,unter Zurücklassung weißgefärbter

Abb. 2: Reaktionsmechanismus für den mikrobiellen Ligninabbau durchManganperoxidase aus Nematoloma frowardii.

Abb. 3: Benetzbarkeit von unbehandelter (a) und mit hydrolytischen Enzy-men behandelter Baumwollmaschenware (b) (TEGEWA-Tropfentest).

a) b)

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Zellulosefibrillen. Ander and Eriksson[9] wiesen nach, dass die Oxidationphenolischer Verbindungen durchholzabbauende Weißfäulepilze auf ex-trazelluläre Oxidoreduktasen (Lacca-sen, Peroxidasen) zurückzuführen ist.Aus Untersuchungen zur Spaltung vonModellverbindungen und zur Depoly-merisation von Ligninpräparaten wur-de deutlich, dass diese Enzyme ver-schiedene Bindungstypen im Ligninunspezifisch durch Radikalbildung(Ein-Elektron-Oxidationen) zu spaltenvermögen; sie wurden deshalb als li-gninolytische (oder Lignin-modifizie-rende Enzyme) bezeichnet (beispiel-haft in Abbildung 2 der Reaktionsme-chanismus für ManganperoxidaseMnP).

Enzymproduktion und -optimierung

Hauptziel des von der JenaBIOS GmbHdurchgeführten Teilvorhabens ist dieHerstellung bislang nicht kommerzi-ell erhältlicher Oxidoreduktasen ausspeziellen Pilzgruppen. Die Enzymewerden hinsichtlich wesentlicher Re-aktionsparameter charakterisiert undauf ihre Einsetzbarkeit bei Prozessender Carbonisur von Wolle und Baum-wollbleiche erprobt. Für diese Verfah-ren der Textilveredlung werden spe-zielle Biokatalysatoren benötigt, diesich durch hohe Spezifität, katalytischeAktivität und Stabilität auszeichnen;letztere bezieht sich vor allem auf denpH-Bereich, die Behandlungstempe-ratur und die Anwesenheit organi-scher Hilfsmittel. Bisher war die ein-geschränkte Verfügbarkeit derartigerEnzyme ein Hinderungsgrund für ih-ren breiten Einsatz. Da innovative En-zyme in der konventionellen Pro-zessführung zu einer effizienten Ko-stenreduktion durch Ressourcenscho-nung sowie entscheidend zur Umwelt-entlastung beitragen können, ist dieErprobung des biotechnologischenPotenzials ligninolytischer Oxidore-duktasen von großer Bedeutung.

Im Speziellen wurden neuartige Hy-brid- Peroxidasen (HybridP) undMangan-Peroxidasen (MnP) für dieUntersuchungen der Projektpartnerzur technischen Einsetzbarkeit produ-ziert. Die biotechnologische Herstel-lung erfolgt nach Aufnahme derstammspezifischen Bildungskinetikund Sekretionsoptimierung vornehm-lich in Flüssigfermentation (bis100 L). Enzymmuster, einschließlichihrer natürlichen Mediatoren und nie-dermolekularen Katalysekomponen-ten, werden im Festbettreaktor pro-duziert.

Die eingesetzten Organismen gehörenzu den ökophysiologischen Gruppender Streu und Holz besiedelnden Weiß-fäulepilze. Die Enzyme dieser Basidio-myceten lassen aufgrund der besonde-ren Habitate wesentliche katalytische Ei-genschaften in Bezug auf die Entfernungvon Vegetabilien und die Delignifizie-rung erwarten. Obwohl ihr biochemi-sches Potenzial erst seit wenigen Jah-ren Gegenstand des wissenschaftlichenInteresses ist, konnte bereits gezeigtwerden, dass diese Pilzgruppen überhochaktive Enzymsysteme zum Abbaupersistenter Verbindungen verfügen. Alszentrales Enzym des degradativen Sy-stems fungiert die MnP, die u. a. Lignineund Huminsäuren sowie PAK, Nitro- undChloraromaten anzugreifen vermag.

Um die Oxidoreduktasen in techni-sche Biokatalyseprozesse integrieren zukönnen, erfolgte zunächst die bioche-mische Charakterisierung, wie die Er-fassung von Katalyse- und Prozesspara-metern. Die Evaluierung des Lignin ab-bauenden und spaltenden Potenzialswurde in Absprache mit den Projekt-partnern durchgeführt.

Im Einzelnen wurden folgende Ar-beitsschritte durchgeführt:– Analyse des Aktivitätsprofils im Kul-turüberstand und im Kulturextrakt,– Erstellung von Enzymbildungskine-tiken in Abhängigkeit von Kultivierungs-parametern und Induktionsfaktoren,– Charakterisierung der Biokatalysato-ren,– Produktion und Isolierung vielver-sprechender Enzyme im Labormaßstabund– Upscaling des Herstellungsprozessesunter Einsatz spezieller Fermentations-techniken.

EnzymkatalysierteBaumwollbleiche

Ziel dieses Teilprojekts ist es, die Mög-lichkeiten für den Einsatz von Oxido-

reduktasen für die enzymatische Blei-che von Baumwolle zu bestimmen.Dabei sollen sowohl kommerziell er-hältliche, als auch bei JenaBIOS undan der TU Dresden neu isolierte En-zyme mit ungewöhnlichen Stabilitätenzum Einsatz kommen. Durch den Ein-satz von Enzymen sollen die zurzeit in-dustriell benötigten Bleichchemikali-en Natronlauge und Wasserstoffper-oxid drastisch reduziert und damiteine erhebliche Reduktion der Salz-fracht im Abwasser sowie eine Was-sereinsparung erreicht werden.

Einsatz hydrolytischerEnzyme

Enzymreaktionen an Baumwolle kön-nen durch eine Vielzahl von Faktorenbeeinflusst werden, hierzu zählt insbe-sondere die Zugänglichkeit des Sub-strats für das Enzym. Der enzymatischeAngriff kann negativ beeinflusst werdendurch– der Baumwolle anhaftende hydro-phobe Wachse und Fette und– für die raumbeanspruchenden En-zyme zu kleine interfibrilläre Zwischen-räume der Baumwollfaser.

Die Folge ist, dass die zu oxidieren-den Substanzen vom Enzym gar nichterreicht werden. Die Zugänglichkeitder Baumwolle für Enzyme kann ent-weder durch den Einsatz von Netzmit-teln oder durch Entfernung der hydro-phoben Substanzen verbessert werden.Die Benetzbarkeit wird mit einem stan-dardisierten Tropfentest überprüft. DieEinsinkzeit eines Tropfens muss fürtechnische Zwecke unter 7 s liegen.

Bei der Untersuchung verschiedenerEnzymkombinationen erwies sich dersimultane Einsatz von Pectinase, Hemi-cellulase und Xylanase bei pH 4,5 ameffektivsten. Es können Einsinkzeitenbeim Tropfentest von unter einer Se-kunde sogar ohne zusätzliches Netzmit-tel erreicht werden (Abb. 3), dabei gilt

es jedoch, Behandlungsdauer und -temperatur weiter zu optimieren (der-zeit 20 h, 40°C). Besonders hervorzu-heben ist, dass diese Enzymkombinati-on im pH-Wert mit den im Rahmen desProjekts untersuchten Peroxidasenkompatibel ist und demnach als ein ko-stengünstigeres einstufiges Verfahren inBetracht gezogen werden kann.

Einsatz oxidativer Enzyme

Versuche zum Einsatz verschiedeneroxidativer Enzyme auf Baumwollma-schenware und -kardenband habengezeigt, dass in diesen Behandlungenim Vergleich zu den entsprechendenBlindbehandlungen keine Erhöhungdes Weißgrads erzielt werden kann.Teilweise wurde sogar eine durch dieBehandlung hervorgerufene Farbvertie-fung des Substrats beobachtet, die imFalle von Mn-abhängigen Enzymenmöglicherweise auf die Bildung vonBraunstein auf der Ware zurückzufüh-ren ist. Dieses Ergebnis ist unabhängigvon der eingesetzten Enzymkombina-tion.

Um die Wirkung der zu untersuchen-den Peroxidasen an Lignin an einemvereinfachten System zu überprüfen,wurde daher mit löslichen Modellver-bindungen gearbeitet. Zum Einsatz ka-men Poly R-478, ein Polymer-gebun-dener Farbstoff, dessen Entfärbungphotometrisch verfolgt werden kannund der in der Literatur als Lig-nin-Mo-dell beschrieben wird, und löslichesLignin. Die Ergebnisse der Behandlun-gen von Poly R-478 sind in Abbildung4 gezeigt.

Während die Hybrid-Peroxidase ausB. adusta und Baylase Poly R-478 voll-ständig entfärben, wird bei Lignin eineFarbvertiefung beobachtet. Dies kannauf eine Reaktion zwischen Enzym undLignin zurückgeführt werden, die abernicht zu einer Entfärbung führt. DieserEffekt kann durch den Abbaumecha-nismus phenolischer Strukturen beider enzymatischen Delignifizierung er-klärt werden. In einem ersten Oxidati-onsschritt werden chinoide Systemegebildet, die häufig eine braune Farbebesitzen. Des Weiteren ist bekannt, dassdie genannten Enzyme auch in der Lagesind, Ligninbausteine zu polymerisie-ren und auf diese Weise zu einer Farb-vertiefung beitragen könnten.

Daraus kann gefolgert werden, dasseine Reaktion zwischen Enzym und Li-gnin auch an der Baumwolle denkbarist, was die dabei beobachtete Farbver-tiefung erklärt. Dies legte eine Erwei-terung der Untersuchungen auf denEinfluss von Cofaktoren mit dem Zieldes weiteren Ligninabbaus nahe.

Abb. 4: Abbau des Modellfarbstoffs Poly R-478 mit Hilfe verschiedenerPeroxidasen.

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Enzymkatalysierter Abbauvon Vegetabilien in Wolle

Ziel dieses Teilbereichs ist es, mit Hilfeder enzymkatalysierten Oxidation vonVegetabilien in Wolle, die bei der klas-sischen Carbonisur eingesetzten Che-mikalienmengen zu reduzieren bzw.vollständig zu ersetzen.

Durch die Anwendung von Oxido-reduktasen (vorwiegend MnP und Lac-casen) wird ein bereits in der Papier-herstellung erprobtes Verfahren für dieWollindustrie nutzbar gemacht. Unter-schiedliche, aus belasteten Wollen undvon einer Wollkämmstrecke stammen-de Vegetabilienarten (Grassamen undRingelkletten, Abb. 1) wurden isoliertund mit definierten Enzymen bzw. En-zymcocktails isoliert behandelt, um denAbbaugrad der einzelnen Vegetabilienunter festgelegten Reaktionsbedingun-gen genau zu bestimmen. Sowohl dieanteilmäßig am stärksten auftretendenGrassamen als auch die Ringelklettenwurden als homogenes Ausgangssub-strat eingesetzt.

Die Zellwände höherer Pflanzen sindaus Cellulose, Lignin und Polyosen auf-

gebaut. Um einen Abbau der Vegetabili-en erzielen zu können, muss einerseitsein Angriff der Polysaccharide über hy-drolytische Prozesse und andererseits andem für die Verholzung des pflanzlichenMaterials verantwortlichen Lignin aufoxidativem Wege erzielt werden. Letzte-re Komponente der Vegetabilien, die ins-besondere für die Festigkeit und Wider-standsfähigkeit von Ringelkletten verant-wortlich ist, liegt in vielen Pflanzenteileneng vergesellschaftet mit Xylan vor. Umdie Zugänglichkeit des Lignins für dieoxidativen Enzyme zu verbessern, wur-de daher ergänzend der Einsatz von Xyla-nasen in den Behandlungen untersucht.Zum Abbau der Vegetabilien kamen so-wohl oxidative Enzyme der Projektpart-ner JenaBIOS GmbH und TU Dresdenals auch kommerziell erhältliche hydro-lytische Enzyme (vorwiegend Xylanasen)zum Einsatz. Die unterschiedlichen En-zyme wurden sowohl separat als auchin Kombination eingesetzt.

Zur Beurteilung des enzymkataly-tisch bewirkten Modifizierungsgradsder Vegetabilien wurden verschiede-ne analytische Methoden angewandt.Nach Inkubation der Vegetabilien mit

hydrolytischen Enzymen wurde dieMenge der in die Flotte freigesetztenreduzierenden Zucker [10] sowie derGewichtsverlust der Vegetabilien undsomit deren Abbaugrad bestimmt.Durch die im Rahmen des Projekts er-probten Enzymbehandlungen erfolgtüberwiegend ein Angriff auf die Poly-saccharid-Komponente der pflanzli-chen Substrate, wohingegen die ver-holzten Bestandteile nahezu unverän-dert bleiben. Dies spiegelt sich in denunterschiedlichen Behandlungserfol-gen an Polysaccharid-reichen Grassa-men im Vergleich zu denen an Rin-gelkletten wider.

Literatur

[1] Milnthorpe, E.J., Aust. Cent. WoolCommittee Testing Ho. (1943).

[2] Nitschke, G., Textilpraxis 32 (1977),24-28.

[3] Schiecke, H.E., Wolle als textiler Roh-stoff, Schiele & Schön GMBH, Berlin(1979).

[4] Stöckigt, U., Döcke, W., Glass, H.,Heinze, W., Köhler, E., Kuhrt, M.,Schmerler, C.-J., Appretur (1989).

[5] Stöhr, R., Melliand Textilberichte 11(1995)1010.

[6] Ebner, G, Schelz, D., Textilfärberei undFarbstoff. Springer Verlag, Berlin(1989).

[7] Eriksson, K.-E. L., Enzyme applicationin fiber processing, ACS symposiumseries, ISSN 0097-6156; 687, SanFrancisco (1997), 2–14.

[8] Tanesaka, E., Masuda, H., Kinugawa,K., Mycologia 85 (1993), 347-354.

[9] Ander, P., Eriksson K.-E., Arch. Micro-biol. 109 (1976), 1-8.

[10] Analytische Bestimmungsmethode:Betriebsinterner Nachweis reduzieren-der Zucker der Firma Extrakt ChemieGmbH & Co, Stadthagen.

Korrespondenzadresse

Dr. Elisabeth HeineDeutsches Wollforschungsinstitut ander RWTH Aachen e.V.Veltmanplatz 8D-52062 AachenTel.: 0241-4469 129Fax: 0241-4469 100eMail: heine@dwi.rwth-aachen.deWeb: www.dwi.rwth-aachen.de

ÖKOEFFIZIENZ

Ökoeffizienz-Bewertungin der Prozessentwicklung� Arno Biwer1, Pascal Zuber2, Prof. Dr. Klaus Bellmann2, Dr. Dieter Sell3, Peter Gebhart3, Prof. Dr. Elmar Heinzle1

1 Technische Biochemie, Universität des Saarlandes, 2 Lehrstuhl für ABWL und Produktionswirtschaft, Universität Mainz, 3 AG Bioverfahrenstechnik,Dechema e.V., Frankfurt

Frühe Entwicklungsphasen neuer Verfahren sind entscheidend für die späteren Produktionskosten und die entstehenden Umweltbelastungen. Durch dieBerücksichtigung von Ökoeffizienz-Aspekten in der Prozessentwicklung können ökologisch und ökonomisch optimierte Verfahren erreicht werden, diesich durch gute Marktchancen und geringe Umweltbelastungen auszeichnen.

Keywords: Ökoeffizienz, Ökologische Bewertung, Ökonomische Bewertung, Nachhaltigkeit, Prozessentwicklung, Cyclodextrin, Oxidative Enzyme.

gelegt [1]. Es ist deshalb wichtig, dieProzesse bereits in diesen Phasen öko-logisch und ökonomisch, also hin-sichtlich ihrer Ökoeffizienz, zu evalu-ieren. Im Gegensatz zu den oft vorge-nommenen retrospektiven Bewertun-gen steht man bei der integrierten Pro-zessentwicklung vor zwei Problemen:Zum einen sind meist erst wenige derrelevanten Daten vorhanden, die oftnoch mit einer hohen Unsicherheitbehaftet sind. Zum anderen müssen dieErgebnisse in relativ kurzer Zeit gelie-

fert werden, um als Entscheidungshil-fe in der Prozessentwicklung dienenzu können. Die hier vorgestellte Me-thode erlaubt es, aufbauend auf denin frühen Entwicklungsphasen vorhan-denen Prozessdaten, eine schnelle undumfassende ökologische und ökono-mische Bewertung vorzunehmen.

Methodik

Die Bewertung erfolgt in zweiSchritten. Im ersten Schritt werden

die bereits vorhandenen Daten imEntwicklungsprojekt erfasst undfehlende Daten durch Modellbil-dung und Simulation ergänzt. Imzweiten Schritt werden die so ermit-telten Sachbilanzen nach ökologi-schen und ökonomischen Kriterienbewertet. Die Ergebnisse dienendann als Entscheidungshilfe im Ent-wicklungsprozess (siehe Abb. 1).Dieses Vorgehen wird im Verlauf derProzessentwicklung iterativ wieder-holt.

Einleitung

Vom Einsatz biotechnologischer Ver-fahren wird oft eine Verbesserung in-dustrieller Prozesse hin zu einer nach-haltigeren Entwicklung, d. h. zu ko-stengünstigeren, ökologisch optimier-ten und sozialverträglichen Prozessen,erwartet. In frühen Phasen der Pro-zessentwicklung wird bereits ein gro-ßer Teil der später bei der Produktionentstehenden Kosten und der späterentstehenden Umweltbelastungen fest-

Sonderband | 2003 | 119BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Abb. 1: Regelkreisder ökologisch-ökonomischenBewertung in derProzessentwick-lung.

Datenbeschaffung und-generierung

Je besser die Datengrundlage, umsoumfassender und präziser werden dieErgebnisse der Bewertung sein. Daherist es wichtig, eine breite Datengrund-lage zu schaffen. Hierzu werden zu-nächst alle im Entwicklungsprojekt vor-handenen relevanten Daten erfasst.Dies kann durch die Verwendung ei-nes Fragebogens unterstützt werden.Parallel erfolgt eine umfangreiche Li-teratur- und Patentrecherche.

Die so ermittelten Prozessdaten sindjedoch meist für eine Bewertung nichtausreichend, da in frühen Entwick-lungsphasen, insbesondere für nach-geordnete Schritte wie die Produktauf-reinigung, nur lückenhafte Informatio-nen vorliegen. Durch die Modellierungund Simulation des Verfahrens könnenfehlende Daten abgeschätzt und dieDatengrundlage entscheidend verbes-sert werden (siehe Abb. 2). Auf den vor-handenen Prozessdaten aufbauendwird dabei ein Modell des erwartetenProduktionsverfahrens erstellt. Dabeiwird zunächst das Verfahrensschemades erwarteten Produktionsprozessesermittelt. Dieses Verfahrenschema wirdim nächsten Schritt in einer Simulati-onssoftware abgebildet. Dort werdenfür jeden Prozessschritt die notwendi-gen Parameter definiert und Simulatio-nen des Modells durchgeführt. Auf-grund der beschränkten Datengrund-lage ist man bei der Definition der Pro-zessparameter teilweise auf Abschät-zungen angewiesen.

Aus den Simulationen erhält man dieQuantifizierung der wichtigsten Stoff-ströme und eine Sachbilanz, die sowohldie Input- und Outputstoffe als auchden Energiebedarf des Prozesses be-schreibt. Diese Sachbilanz bildet dieGrundlage für die ökologische undökonomische Bewertung.

Ökologische Bewertung

Die in der Sachbilanz ermittelten Men-gen der Input- und Outputstoffe werdenzunächst auf die funktionale Einheit desVerfahrens bezogen. Der so erhaltene„Mass Index“ sagt aus, wie viel einesInputstoffs pro funktioneller Einheit, z.B. 1 kg Endprodukt, verbraucht wirdbzw. wie viel eines Outputstoffs profunktioneller Einheit gebildet wird.

Für eine detaillierte ökologische Be-wertung müssen jedoch die Mengender einzelnen Stoffe und ihre Umwelt-relevanz zusammengeführt werden.Basierend auf den Stoffeigenschaftenwird hierzu ein „Environmental Factor“definiert, der als Wichtungsfaktor dient.

Er ist ein Maß für die potenzielle Um-weltgefährdung, die von dem betrach-teten Stoff ausgeht. Der EnvironmentalFactor wird für Input- und Outputstof-fe getrennt bestimmt (siehe Abb. 3).

Jeder Inputstoff wird nach vierSchwerpunkten bewertet: Die Ressour-cenverfügbarkeit, die mit seiner Bereit-stellung verbundenen Umweltbelastun-gen (Grey Inputs), die negative Wir-kung auf Organismen und das Stoffri-siko. Die negative Wirkung auf Orga-nismen und das Stoffrisiko werdenauch zur Bewertung der Outputstoffeverwendet. Das Stoffrisiko berücksich-tigt das Potenzial des Stoffs im ProzessStörungen zu verursachen, z. B. durchdie Bildung zündfähiger Gemische odereinen niedrigen Flammpunkt. Die Wir-kung auf Organismen betrachtet vor al-lem die akute und chronische Toxizitätdes Stoffs. Die Outputstoffe werden dar-über hinaus auch nach ihrer Wirkungauf die Umweltkompartimente Luft undWasser/Boden untersucht. Hier spielenAspekte wie Ozonabbau und Treibhaus-effekt (Luft) oder Eutrophierung (Was-ser/Boden) eine Rolle.

In jeder betrachteten Kategorie wirdmit einer einfachen dreistufigen ABC-Klassifizierung festgelegt, ob der Stoff

ein geringes, mittleres oder hohes Be-lastungspotenzial besitzt. Im nächstenSchritt werden den drei Klassen A, Bund C Zahlenwerte zugeordnet und dieZahlenwerte aller relevanten Kategori-en zum Environmental Factor des Stoffsaggregiert.

Die Massenanteile der Input- undOutputstoffe in der Sachbilanz (MassIndex) werden mit den ermitteltenWichtungsfaktoren (EnvironmentalFactor) multipliziert. Dadurch erhältman den so genannten „Environmen-tal Index“. Durch den Vergleich der En-vironmental Indices eines Verfahrenkönnen die Stoffe identifiziert werden,die aus Umweltsicht die größte Bedeu-tung haben. Folglich liegt in einer Re-duzierung dieser Stoffe auch das größ-te Potenzial für Prozessverbesserungen.

Addiert man die Environmental In-dices aller Input- oder Outputstoffe ei-nes Verfahrens, erhält man den Envi-ronmental Index des Prozesses. Erkann dazu verwendet werden, alterna-tive Prozesse oder Prozessschritte zuvergleichen. Parallel zur Stoffbewertungerfolgt auch die Abschätzung des Ener-gieverbrauchs des Verfahrens. Er wirdebenfalls in die Bewertung des Prozes-ses einbezogen.

Ökonomische Bewertung

Ausgangspunkt der ökonomischenBewertung ist ein Prozessmodell, indem Rohstoffe in einem oder mehre-ren Transformations- und Aufreini-gungsschritten (in Sinne einer Blackbox) in die gewünschten Endproduk-te umgewandelt werden. Insofern ba-siert die ökonomische Bewertung aufder qualitativen und quantitativenSachbilanz der beteiligten Stoffströme.

Da zu Beginn einer Entwicklung inder Regel nur wenige Informationenüber die konkrete Produktionsanla-ge vorliegen, ist es nicht möglich, diedazugehörigen Apparaturen und bau-lichen Elemente sowie die Kosten hier-für in der Frühphase der Entwicklunghinreichend genau abzuschätzen. Ausdiesem Grund stützt sich die Bewer-tung in dieser Situation zunächst aufleicht ermittelbare ökonomischeKennzahlen, wie z. B. verschiedene va-riable Kostenbestandteile.

Die Bewertungselemente lassensich zwei logischen Ebenen zuordnen.Zum einen kann eine quantitativeWirtschaftlichkeitsebene identifiziertwerden, zu der die monetär messba-ren Bereiche zählen. Zum anderendarf auch die qualitative Risikoebe-ne, zu der verschiedene ökonomischrelevante Risikoaspekte gerechnetwerden, nicht vernachlässigt werden.

Die für die ökologische Bewertunggebildeten Massenindizes auf der In-putseite der Sachbilanz werden mit je-weiligen Marktpreisen bewertet. DieSumme dieser Werte stellt als Be-standteil der variablen Stückkosteneinen ersten Anhaltspunkt für dieWirtschaftlichkeitsbewertung dar. DieStoffe auf der Outputseite (bis auf dasEndprodukt selbst) stellen zu entsor-gende Abfallstoffe dar, sofern sie nichtrecycelt und in diesem oder anderenHerstellungsprozessen verwendetwerden können. Die dazugehörigenMassenindizes müssen mit entspre-chenden Abfallkosten, je nach Art derEntsorgung (Abwasser über Kläran-lage, Sonderdeponie etc.), bewertetwerden. Weiter sind die für die ent-sprechenden Verfahrensschritte not-wendigen Energiebedarfe festzustel-len und ihrer Art nach (Strom,Dampf, etc.) mit Marktpreisen zu be-werten.

Diesen Kostenblöcken muss das Er-löspotenzial des Endprodukts gegen-übergestellt werden. Bei neuartigenProdukten stellt die Summe dieserKosten eine Untergrenze für möglicheVerkaufspreise dar. Sofern Marktin-formationen, insbesondere Preisin-formationen, vorliegen, kann der

Abb. 2: Verbesserung der Datengrundlage durch Modellbildung und Simu-lation in der Prozessentwicklung.

120 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

Abb. 3: Wirkungsklassen bei der Bestimmung des Environmental Factorsvon Input- und Outputstoffen.

Stückdeckungsbeitrag für dieses Ver-fahren ermittelt werden.

Auf der Risikoseite werden Beschaf-fungs-, Absatz- und Umfeldrisiko un-terschieden, die jeweils die Ausprägun-gen gering, mittel, hoch und sehr hochaufweisen können. Das Beschaffungs-risiko wirkt sich auf die Herstellkostenaus. Aus diesem Grund werden die va-riablen Stückkosten je nach Risikoaus-prägung mit unterschiedlichen Fakto-ren multipliziert, um die möglicheBandbreite dieser Kosten zu ermitteln.Das Absatzrisiko wiederum wirkt sichüber Schwankungsbreiten des Endpro-duktpreises auf die ökonomische Be-wertung aus. Das Umfeldrisiko spieltbei biotechnologischen Verfahren einegroße Rolle und kann Wirkungen so-wohl auf der Kosten- als auch auf derErlösseite entfalten. Ergebnis des öko-nomischen Bewertungsprozesses ist einWirtschaftlichkeits- und Risikoprofildes betrachteten Verfahrens, in dembeide Bewertungsebenen zusammen-gefasst sind.

Fallbeispiele

Die Anwendung der Methode wird an-hand zweier Fallbeispiele aus demDBU-Verbund „Biokatalyse“ gezeigt,die in dieser Ausgabe in eigenen Arti-keln näher beschrieben sind.

α-Cyclodextrin

Cyclodextrine (CD) sind zyklische Oli-gosaccharide bestehend aus Glucose-resten, die über α-1,4-glykosidischeBindungen verbunden sind. Nach derAnzahl von Glucoseresten pro Molekülunterscheidet man α-, β- und γ-CD mit6, 7 bzw. 8 Glucoseresten pro Mole-kül. Alle drei Typen werden heute in-dustriell hergestellt und in der Lebens-mittel-, Chemie-, Pharma- und Textil-industrie eingesetzt. Cyclodextrine ha-ben einen zylinderförmigen Aufbau miteiner hydrophoben Innen- und einerhydrophilen Außenseite. Dadurch kön-nen sie Einschlusskörper mit vielen hy-drophoben Verbindungen bilden undso deren physikalische und chemischeEigenschaften verändern [2].

Zur Herstellung von α-Cyclodextrinwird Stärke als Rohstoff verwendet.Zunächst wird die Stärke mit Hilfe vonα-Amylase zu Dextrin abgebaut. Nachder Stärkehydrolyse erfolgt die eigent-liche Cyclodextrinbildung, die durchdie Cyclodextringlycosyl-Transferase(CGTase) katalysiert wird. Innerhalbdes DBU-Verbunds „Biokatalyse“ wer-den im Projekt „Hochwertige Kohlen-hydrate“ neue Enzyme mit verändertenEigenschaften zur α-Cyclodextrinher-

stellung entwickelt. Um die Auswirkun-gen dieser neuen Enzyme auf den Pro-duktionsprozess abschätzen zu kön-nen, wurde das Verfahren modelliert,simuliert und bewertet. In der industri-ellen Produktion wird überwiegend dasso genannte Solventverfahren verwen-det. Hierbei lenkt ein organischer Kom-plexbildner die Enzymreaktion. DerKomplexbildner und das α-CD bildeneinen Komplex und fallen aus. Dadurchwird in der Gleichgewichtsreaktionkontinuierlich α-CD abgezogen. Einetypische Prozessabfolge ist in Abbildung4 gezeigt.

Das erstellte Modell geht von einemReaktorvolumen von 10 m3 und derProduktion von 1,5 t α-Cyclodextrinaus. Das Verfahren erreicht eine Aus-beute von 47%. Dabei werden etwa 2kg Rohstoffe/kg Produkt und 13 kgWasser/kg Produkt benötigt (Mass In-dex). Der allergrößte Teil der Abfälleliegt als Abwasser vor, das mit leichtabbaubaren organischen Verbindun-gen belastet ist. Der Energiebedarf be-trägt im Modell etwa 18 MJ/kg Produkt.Die Wasserdampfdestillation zur Ab-trennung des Decanols und die Kris-tallisation sind dabei die energieinten-sivsten Schritte.

Die Environmental Indices bewertendie Umweltrelevanz der Input- und Out-putstoffe. Auf der Inputseite dominiertdie Stärke aufgrund ihrer großen Mas-se und daneben das Decanol (Komplex-bildner). Auf der Outputseite haben dieleicht abbaubaren organischen Verbin-dungen (Glucose, Maltose, Dextrin,Produktverlust etc.) eine größere Be-deutung, aber auch das Decanol spielteine Rolle. Die Bedeutung des Decanolskann durch ein weitgehendes Recyclingdeutlich verringert werden. Eine Redu-zierung der organischen Abfallstoffe istletztlich nur durch eine höhere Ausbeu-te möglich. Grundsätzlich zeigt die öko-logische Bewertung eine relativ gerin-ge Umweltbelastung durch das Verfah-ren. Dabei wirkt sich das Verfahren vorallem auf die Umweltkompartimente

Wasser und Boden aus, während dieWirkung auf das UmweltkompartimentLuft, die direkte Beeinträchtigung vonOrganismen und Sicherheitsaspektekaum eine Rolle spielen.

Mit Hilfe von Sensitivitätsanalysenwurde die möglichen Auswirkungenneuer Enzyme untersucht. Die durch-geführten Analysen zeigen, dass derEinfluss der Reaktionsdauer gering istund die Startkonzentration der Stärkeüber 20% liegen muss. Die Verwen-dung von thermostabilen CGTasen unddie damit verbundenen Prozessmodi-fikationen bringen einige Vorteile fürdie Verfahren, vor allem wird der En-ergie- und Kühlbedarf des Reaktorsdeutlich reduziert. Das größte Poten-zial zur Prozessverbesserung liegt zumeinen in einer Erhöhung der Ausbeuteund der damit verbundenen Reduzie-rung des Rohstoffbedarfs und des An-falls organisch belasteter Abwässer und

zum anderen in einer Energieeinspa-rung durch die Erhöhung der Produkt-konzentration oder durch eine weni-ger energieintensive Abtrennung desWassers in der Aufreinigung.

Bei der ökonomischen Bewertungwerden sämtliche Inputstoffe mitMarktpreisen bewertet. Der Preis fürdie CGTase wird mit Hilfe eines Pro-zessmodells, in dem die Herstellungsimuliert wird, abgeschätzt. Die mitweniger als 10% an der Massenbilanz(inkl. Wasser) beteiligte Stärke machtmit weitem Abstand den größten Ko-stenfaktor auf der Rohstoffseite aus. Eindeutlich geringerer Anteil der gesam-ten Rohstoffkosten fällt auf die α-Amylase. Die Kosten für Decanol, CG-Tase und Wasser sind nahezu unerheb-lich. Die hauptsächlich flüssigen Abfall-stoffe können direkt über das Abwas-ser entsorgt werden, sodass deren Ko-stenanteil vernachlässigbar gering ist.Zwar werden signifikante Kosten fürStrom, Dampf und Kühlwasser ermit-telt, die jedoch im Vergleich zu denRohstoffkosten nicht ins Gewicht fallen.So betragen die Kosten für elektrischeEnergie lediglich ca. 0,03 C/kg. Ins-gesamt dominieren die Rohstoffkostenmit ca. 86% die variablen Kosten.

Der Cost Mass Index [3] gibt dasVerhältnis von Rohstoffkosten und(möglichem) Umsatz an und beträgtbei diesem Verfahren ca. 0,1. Um alsoα-CD im Wert von 100 C herzustellenist ein Rohstoffeinsatz im Wert von 10C notwendig.

Um eine vollständige Bewertung vordem Hintergrund der Nachhaltigkeitvorzunehmen, sind auch investitions-abhängige Kosten zu berücksichtigen.Abbildung 5 zeigt bei entsprechendenAnnahmen bzgl. Anlagenspezifikation,Abschreibungen, Zinsen etc. den Ver-lauf der Umsatzrendite (Gewinn/Um-satz) in Abhängigkeit des Marktpreisesfür α-CD.

Oxidative Enzyme in derTextilindustrie

Das Forschungsprojekt „Oxidative En-zyme in der Textilindustrie“ im Verbund„Biokatalyse“ beschäftigt sich mit demEinsatz oxidativer Enzyme in zwei Ver-fahrensschritten der Textilherstellungbzw. -veredlung, der Bleiche von Baum-wolle und der Carbonisur von Wolle.Diese zwei Verfahren werden in unter-schiedlichen Bereichen der textilenWertschöpfungskette genutzt. Sie sindjedoch beide sehr chemikalien- undenergieintensiv. Im Projekt sollen alter-native Verfahren für beide Prozesseentwickelt werden, die jeweils auf demEinsatz von oxidativen Enzymen anstatt

Abb. 4: Verfahrensschema einesSolventverfahrens zur Herstellungvon a-Cyclodextrin.

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der bisher eingesetzten verschiedenenChemikalien basieren [4].

Bleiche von Baumwolle

Insbesondere der Prozess der Bleichevon Baumwolle wurde schon früh alsein potenzielles Einsatzgebiet biotech-nologischer Erkenntnisse in der Tex-tilindustrie erkannt. Für Textilunterneh-men können biotechnische Anwendun-gen bei erfolgreicher Verfahrenssubsti-tution Minderungen des Ressourcen-einsatzes, Verringerung/Vermeidungvon Emissionen und somit Kostensen-kungen bedeuten [5].

Baumwolle besteht zu 90-95 % ausCellulose sowie aus Baumwollfettenund -wachsen, Ligninresten, Proteinen,Pektinen und Mineralstoffen. Je nachregionaler Herkunft kann Baumwolleweiß, gelb oder braun gefärbt sein. Ins-besondere gelb- und braungefärbteBaumwolle machte in der Vergangen-heit den Einsatz von Hypochlorit in dertextilen Vorbehandlung notwendig, umbei nachfolgenden Färbevorgängeneine einheitliche Färbung von Garnoder Flächentextil zu erreichen. Heutewird Wasserstoffperoxid eingesetzt, umdie textilen Eigenschaften Weißgrad,Saugfähigkeit, Netzbarkeit und geringeFaserschädigung in ausreichendemMaße zu gewährleisten.

Ein alternativer enzymatischer Pro-zess, der durch reduzierten Energie-und Chemikalieneinsatz charakterisiertsein sollte, muss sich an dem etablier-ten Prozess der Bleiche mittels Wasser-stoffperoxid messen lassen. Daher wur-de der etablierte Prozess der Peroxid-bleiche analysiert um eine Benchmarkfür den zu entwickelnden Alternativpro-zess zu setzen. In einen typischenBleichprozess gehen neben Energieund Wasser verschiedene Chemikalienein, die sich mit dem Wasser zu einerFlotte im Flotten-Verhältnis von ca. 1:20(Ware:Flotte) verbinden. Für diese Res-sourcen wurden die Kostensätze fürEnergie und Wasser ermittelt, da dieseunmittelbar über die betriebliche Ko-stenrechnung in die Plankosten undmögliche Rechnungen der Kosten jeStunde Bleichprozess einfließen.

Die aggregierten Plan-Kosten derKostenstelle, in der dieser Prozessdurchgeführt wird, betragen 970.000C p.a. Bei einer Plan-Leistung von31.200 h ergeben sich Plankosten von31 C/h. Bezogen auf die reale Dauereines Bleichprozesses ergeben sichfolglich Prozesskosten in Höhe von 375C. In einem Bleichprozess werden imSchnitt 300 kg Textil mittels Peroxidgebleicht. Die Kosten pro kg Ware be-tragen somit ca. 1,25 C. Werden aus-

schließlich die Energie- und Stoffko-sten für den charakterisierten Bleich-prozess angesetzt, so ergeben sich Pro-zesskosten von 350 C bzw. 1,17 C/kggebleichte Ware.

Dies sind die Richtgrößen, an de-nen sich ein enzymatisches Bleichver-fahren auszurichten hat, wenn es ge-lingt Enzyme zu identifizieren und zuproduzieren, die alle qualitativen An-forderungen an eine Bleiche erfüllen.

Es ist anzumerken, dass für eine sol-che Substitution keine Investitionen inAnlagen notwendig sind. Eine enzyma-tische Bleiche wäre nach derzeitigenÜberlegungen in vorhandenen moder-nen Anlagen durchführbar.

Carbonisur von Wolle

Bei der Carbonisur werden pflanzlicheReste (Vegetabilien) aus der Wolle ent-fernt, da diese ansonsten bei der Wei-terverarbeitung der Wolle zu mechani-schen Problemen bei der Bearbeitungsowie zu qualitätsbeinflussenden Ver-änderungen im Griff und in der Optikentstehender Tuche führen würden.

Insofern ist die Carbonisur von Wolleein notwendiger Verfahrensschritt dertextilen Wertschöpfungskette, der der-zeit als chemisches Verfahren durchden Einsatz von Schwefelsäure ausge-führt wird. In diesem Verfahren wirddie Säure durch das Erhitzen der Wol-le auf über 100 °C aufkonzentriert, waseine Dehydratisierung (Verkohlung)der Cellulose bewirkt. Allerdings ist die-ses Verfahren sehr kritisch zu betrach-ten, da die Wolle durch den Säureein-satz signifikant geschädigt wird. Woll-verluste durch Säure und durch Vega-tabilien belaufen sich gemeinsam aufbis zu 23 % oder 0,50 C/kg Wolle.

Um die Potenziale einer „enzymati-schen Carbonisur“, zu denen auch dieVermeidung des genannten Wollver-

lusts zählt, zu ermitteln, wurde der kon-ventionelle Carbonisurprozess analy-siert.

Bei Wollpreisen von im Mittel 2,70C/laufender Meter ergibt sich für einrepräsentatives carbonisierendes Tex-tilunternehmen bei einem bearbeitetenWarenwert von 1.490.000 C/p.a. einWarenverlust durch die Carbonisur von185.000 C /p.a. Davon entfallen124.000 C/p.a. auf den reinen Faser-verlust, der durch ein enzymatischesVerfahren vermieden werden kann, fürdas außerdem gilt, dass es wenig kapi-talintensiv ist, da es in der Regel auf inwollverarbeitenden Textilunternehmenvorhandenen Anlagen ausgeführt wer-den könnte. Falls es gelingt, ein Enzym(oder einen Enzymcocktail) zu identi-fizieren, das den qualitativen Ansprü-chen an die Entfernung von Vegetabili-en aus der Wolle genügt, so kann einenzymatisches Verfahren dann effizientsein, wenn ein Preis für dieses Enzym(Enzymcocktail) unter 25 C/kg reali-siert wird (angenommene Enzymmen-ge für das repräsentative Textilunter-nehmen: 5.000 kg).

Dass die Substitution der chemi-schen Carbonisur wünschenswert ist,unterstreichen auch Überlegungen zuanderen substituierenden Technologi-en: „Die in Schafwolle auftretendenpflanzlichen Verunreinigungen bereitenim konventionellen Wollreinigungspro-zess Schwierigkeiten, da sie nur durchmechanische oder chemische Verfah-ren entfernt werden können. Durchbeide Methoden kann jedoch die Fa-ser geschädigt werden. Hinzu kommt,dass bei der mechanischen Reinigungnicht alle Vegetabilien entfernt werdenkönnen und ein unerwünschter Rest-gehalt im Wollvlies verbleibt. Das che-mische Verfahren ist sowohl umwelt-schädigend wie auch unwirtschaftlich.Daher soll nun mittels Laserstrahlung

Abb. 5: Abhängigkeit der erwarteten Umsatzrendite vom Marktpreis für α-Cyclodextrin.

eine selektive Zerstörung der Vegeta-bilien ohne Schädigung der Wolle er-möglicht werden. ...“ [6].

Perspektiven

Die Fallbeispiele verdeutlichen, dassbereits in frühen Phasen der biotech-nologischen Prozessentwicklung öko-logische und ökonomische Charakte-ristiken abgeschätzt werden können.Für eine weitergehende Implementie-rung in die industriellen Entwicklungs-prozesse müssen die erarbeiteten Me-thoden weiter verbessert und ihre An-wendung vereinfacht werden. Mit die-sen Methoden wird die Entwicklungökoeffizienter Prozesse unterstützt.Ökoeffizienz verbindet dabei wirtschaft-lichen Nutzen mit einer Reduzierungder Umweltbelastung. Eine Verbesse-rung der Ökoeffizienz bedeutet alsoauch immer eine Steigerung der Nach-haltigkeit und zwar letztlich aller dreiSäulen. Denn die Entwicklung wettbe-werbsfähiger Produkte ermöglicht einewirtschaftliche Nachhaltigkeit, die Re-duzierung der Umweltbelastung unddes Rohstoffverbrauchs verbessert dieökologische Nachhaltigkeit und die Be-friedigung menschlicher Bedürfnisse inEinklang mit der Umwelt stärkt die so-ziale Nachhaltigkeit.

Literatur

[1] Biwer, A. und Heinzle, E. In: Heiden, S.,Burschel, C., Erb, R. (Hrsg.) Biotechno-logie als interdisziplinäre Herausforde-rung. Spektrum Verlag: Heidelberg(2001), 191-208.

[2] Biwer, A., Antranikian, G. und Heinzle,E., Appl. Microbiol. Biotechnol. 59(2002), 609-617.

[3] Heinzle, E. et al., Ind. Eng. Chem. Res.37 (1998), 3395-3407.

[4] Heine, E. et al., In: Heiden, S., Erb, R.(Hrsg.) Biokatalyse - Verbundvorhabender Deutschen Bundesstiftung Umwelt.Sonderausgabe der DBU in Kooperati-on mit BIOspektrum, Spektrum Akade-mischer Verlag, Heidelberg (2001), 49-53.

[5] Gebhart, P., Ingenieur forum WESTFA-LEN-RUHR 2/99, 13.

[6] o.V., Selektive Lasereinigung von Wol-le, INFO-Börse Laser, 34/1999.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Elmar HeinzleTechnische Biochemie Universitätdes SaarlandesPF 15 11 450D-66041 SaarbrückenTel./Fax: 0681-302 2905/ 302 4572eMail: e.heinzle@mx.uni-saarland.de

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WIRTSCHAFTLICHKEITSANALYSE

Praxisnahe Implementierungbiotechnologischer Verfahren inmittelständischen Textilbetrieben� Peter Gebhart, Dr. Dieter SellDECHEMA e.V., Karl-Winnacker-Institut, AG Bioverfahrenstechnik

Biotechnologisch hergestellten Produkten und biotechnologischen Verfahren kann im Sektor der Textilindustrie, insbesondere im Bereich der Textilver-edlung, große Bedeutung für Prozessoptimierungen zukommen.Für die überwiegend klein- und mittelständisch geprägte Branche, für die weiterhin ein hoher Wettbewerbsdruck kennzeichnend ist, gilt, dass die Substi-tution oder Optimierung von einzelnen Prozessschritten und damit verbundene Kostensenkungen erkennbar zur Steigerung der Effizienz ganzer Produk-tionsabläufe beiträgt. Anders als in anderen Branchen ist es in der Textilveredlungsindustrie kaum möglich, konkurrenzlose Produkte und neue oderdeutlich erhöhte Produktqualitäten anzubieten. Somit kann eine Verfahrenssubstitution, die einen Kostenvorteil nach sich zieht, erheblich dazu beitra-gen, die Position eines Unternehmens im Wettbewerb zu sichern oder zu verbessern.Im Projekt sollte zum einen dieser Zusammenhang an einem konkreten Prozessschritt, der Zerstörung von Restperoxid im Anschluss an die oxidativeBleiche baumwollhaltiger Textilien, nachgewiesen werden. Zum anderen sollten weitere Prozesse innerhalb der Wertschöpfungskette der Textilveredlungidentifiziert werden, die sich für Substitutionen oder Optimierungen durch die Anwendung biotechnologischer Erkenntnisse eignen.

Keywords: Textilveredlung, Bleiche, Biotechnologie, Enzyme, Wissenstransfer, Prozessoptimierung, Kostensenkung.

Projektziele

Durch zunehmende Verknappung vonRohstoffen, steigende Umweltbelastun-gen durch Unternehmen, öffentlicheund private Haushalte, steigende Kostenfür die Beseitigung von Abfallproduk-ten industrieller Prozesse sowie sichverschärfender Umweltgesetzgebungkommt Prozessoptimierungen einewachsende Bedeutung zu. Innovativebiotechnologische Verfahren könnenmaßgebliche Beiträge zu derartigenProzessoptimierungen liefern. Die Tex-tilindustrie galt und gilt als ein Kernbe-reich möglichen Wandels von End-of-pipe-Technologien zu produktionsinte-griertem Umweltschutz durch die An-wendung der Biotechnologie.

Um Interessenvertretern der Textil-industrie den Gedanken des produkti-onsintegrierten Umweltschutzes durchBiotechnologie nahe zu bringen, wur-de durch die Deutsche BundesstiftungUmweltschutz, Osnabrück, das Projekt„Praxisnahe Implementierung biotech-nologischer Verfahren in mittelständi-schen Textilbetrieben“ gefördert. Zurinhaltlichen und organisatorischenBearbeitung arbeitete die antragstellen-de Arbeitsgruppe Bioverfahrenstechnikdes Karl-Winnacker-Instituts der DE-CHEMA e.V. mit den Kooperationspart-nern Windel Textil GmbH & Co. (neueFirmenbezeichnung: TVW - Textilvered-lungs- und Handelsgesellschaft Windel

mbH), Bielefeld, und Gesamtverbandder deutschen Textilveredlungsindu-strie e.V., Eschborn, sowie der auftrag-nehmenden Firma TVU-Beratungen,Schloß Holte-Stukenbrock, zusammen.

Ziele des Projekts waren, den Infor-mationsfluss und Wissenstransfer be-züglich des tatsächlichen bzw. des po-tentiellen Einsatzes biotechnologischerVerfahren und Produkte im Bereich derTextilveredlung zu verbessern. Weiter-hin sollten Ressentiments, die durchnegative Erfahrungen mit nicht ausge-reiften biotechnologischen Verfahrenentstanden sind, abgebaut werden.Schließlich sollten andere Hemmnissefür die bisher nicht erfolgte großflächi-ge Verbreitung biotechnologischer Ver-fahren in der Textilindustrie identifiziert

werden. Besonders jedoch solltendurch den angestrebten Wissenstrans-fer neue Entwicklungsprojekte ange-regt und hierzu potentielle Partner zu-sammengeführt werden.

Wirtschaftlichkeitsanalysevon Verfahren zurEntfernung von Restperoxidaus baumwollhaltigenTextilien nach deroxidativen Bleiche mitWasserstoffperoxid

Insbesondere um die Textilvered-lungsbranche für die Potentiale bio-technologischer Produkte und Prozes-se in der Wertschöpfungskette derTextilveredlung zu sensibilisieren wur-

den für einen konkreten Verfahrens-schritt, die Entfernung von Restper-oxid im Anschluss an die oxidativeBleiche baumwollhaltiger Textilien,das konventionelle Verfahren und dieneue biotechnologische Alternativeunter ökonomischen Gesichtspunktenanalysiert.

Der Prozess

Üblicherweise wird heutzutage nichtmehr Chlor sondern Wasserstoffper-oxid als Bleichmittel für Textilien ein-gesetzt. Um in den nachfolgenden Fär-beprozessen höchste Qualität zu erzie-len, ist es notwendig, Bleichmittelre-ste vollständig aus dem weiter zu ver-edelnden Textil zu entfernen.Im konventionellen Verfahren wurdedie Entfernung des Restperoxidsdurch wiederholtes (d.h. mindestenszweifaches) Spülen des Textils mitheißem Wasser angestrebt. Diese Ver-fahrensweise ist nicht nur sehr ener-gie- und wasserintensiv, sondern kannauch die erforderliche vollständigeEntfernung von Wasserstoffperoxidre-sten nicht garantieren.

Aus diesem Grund wurde ein neu-es enzymatisches Verfahren entwik-kelt, das mittlerweile als etabliert gel-ten darf und weitreichende, wennauch noch nicht vollständige Verbrei-tung in der Textilveredlungsindustriegefunden hat. Bei diesem neuen bio-Abb. 1: Temperatur-Zeit-Diagramm

Sonderband | 2003 | 123BIOKATALYSEBIOKATALYSE

technologischen Verfahren wird nachder oxidativen Bleiche der Textiliennur einmal bei hoher Temperatur ge-spült (je nach Materialart bedeutetdies Temperaturen zwischen 80-96°C). Anschließend wird einer neu-en Flotte das Enzym Katalase zudosiert,das bei Temperaturen zwischen 30°Cund 40°C ca. 15 Minuten einwirkt. Imanalysierten Prozess kam das Präpa-rat “KAPPAZYM AP Neu” der KappChemie GmbH, Miehlen, zum Einsatz.Das Enzym zerlegt überschüssiges Per-oxid in Wasser und Sauerstoff. An-schließend können sofort notwendi-ge Folgeprozesse gestartet werden,deren Ergebnisse übrigens ein signi-fikant höheres Qualitätsniveau gegen-über dem konventionellen Verfahrenaufweisen.

Da (mindestens) ein Spülgang ein-gespart wird, verringert sich sowohlder Einsatz der Ressourcen Wasserund Energie als auch die Prozessdau-er.

Alt vs. Neu –Prozessvergleich

Um den Rahmen für eine Betrachtungunter gleichen Bedingungen zu schaf-fen, müssen der neue biotechnologi-sche Prozess und seine verfahrens-technische konventionelle Alternativegenau abgegrenzt werden. Diese Gren-zen sind die Punkte, bis zu dem undab dem die betrieblichen Prozesseunabhängig von der Verfahrenssubsti-tution gleich sind.

Für beide Verfahrensweisen gilt,dass der Prozess nach dem Ablassender Bleichflotte aus der Anlage und mitdem Einlassen einer Spülflotte in denFärbeapparat beginnt. Er endet jeweilsmit dem Einleiten derjenigen Chemi-kalien, die eine reduktive Bleiche syn-thetischer Textilbestandteile in Gangsetzen. In Abbildung 1 ist der analy-sierte Schritt als „bleach cleanup“ be-zeichnet und reicht von 0 bis 180 Mi-nuten.

Um den angeführten Verfahrensver-gleich durchzuführen, mussten eini-ge grundlegende Annahmen getroffenwerden:

Zahl der Bleichprozesse pro JahrBedingt durch die technischen Spezi-fikationen beider Prozesse sind beider durchgeführten Verfahrenssubsti-tution keine Veränderungen an denAnlagen des Textilveredlungsbetriebsnotwendig, die Investitionen erfordernwürden. Lediglich die Programme fürdie Maschinensteuerung musstenmodifiziert werden. Ein Vergleich zwi-schen dem alten und neuen Verfah-

Baumfärbemaschinen in unterschied-lichen Größen gibt, war es wichtig,eine „durchschnittliche“ Apparaturzu identifizieren. Ca. 1/3 aller Bleich-prozesse auf Baumfärbemaschinenliefen auf dem Apparat HT 09, der miteiner Füllmenge von 5.800 LiternFlotte auch als durchschnittlich großangesehen werden kann. Da weitere50 % der Prozesse zu etwa gleichenTeilen auf den Apparaten HT 02 undHT 10 liefen, die von ihrer Füllmen-ge her ähnlich weit von den 5.800Litern des HT 09 entfernt sind (HT02: 2.600 l, HT 10: 8.500 l), wurdeApparatur HT 09 als die Apparaturidentifiziert, an der man die Analysefür den Bereich Baumfärben durch-führen kann.

Eine ähnliche Annahme musste fürden Bereich der Strangfärbeappara-te nicht getroffen werden, da die Ap-paraturen Soft 15 und Soft 16 gleicheGröße und Füllmenge besitzen. DieAnalyse für diese Bleichprozesse wirdam Beispiel von Soft 15 durchgeführt,da im Betrachtungszeitraum ca. 75 %aller Prozesse auf diesem Apparatdurchgeführt wurden.

Materialeinsatz proProzess

Es wurde die durchschnittlichen Men-ge an zu veredelndem Textil je Pro-zess ermittelt, da diese Menge denEinsatz an Prozesswasser determi-niert. Für den Prozess auf dem Baum-färbeapparat ergibt sich ein durch-schnittlicher Materialeinsatz von 226kg je Prozess, für den Strangfärbeap-parat 157 kg je Prozess. Selbstver-ständlich wurden alle getroffenen An-nahmen mit den ausführenden Prak-tikern im Unternehmen abgesprochenund von ihnen bestätigt.

Nachdem somit ein quasi idealerProzess identifiziert war, wurde er für

Abb.2: Baumfärbeapparat HT 09.

Abb. 3: Gelochte Stahlzylinder zur Aufnahme der Textilwickel, HT 09 imHintergrund.

Abb. 4: Strangfärbeapparat Soft 15.

ren zur Zerstörung des Restperoxidslässt sich daher sowohl für einen ein-zigen Bleichprozess als auch für dieGesamtheit der Prozesse eines Jahresdurchführen. Zur besseren Vergleich-barkeit von ökonomischen Ergebnis-sen über längere Zeitabschnitte hin-weg wurde in der Analyse der Zeit-raum eines Jahres zugrunde gelegt.Dazu wurden alle Produktionsaufträ-ge mehrerer Monate untersucht unddie Zahl von Bleichprozessen der in-teressierenden Art ermittelt. Die An-zahl der ermittelten Prozesse wurdedann auf ein volles Geschäftsjahr (12Monate) hochgerechnet. Den Ergeb-nissen liegt die Anzahl von insgesamt1420 Prozessen zur Entfernung vonRestperoxid, davon 1124 auf Baum-färbeapparaten und 296 auf Strang-färbeapparaten ausgeführt, zugrunde.

Auswahl der ProduktionsanlageBeim ausgewählten Textilveredlungs-betrieb werden zur Peroxidbleichezwei verschiedene Anlagentypen ge-nutzt. Zum einen sind das Baumfär-beapparate mit den firmeninternenBezeichnungen HT 01 bis HT 11 undzum anderen Strangfärbeapparate mit

den firmeninternen BezeichnungenSoft 15 und Soft 16 (siehe dazu dieAbbildungen 2 bis 4).

Im Betrachtungszeitraum wurden1420 Bleichprozessen mit Einsatz derKatalase Kappazym AP Neu durchge-führt. Ca. 80 % wurden auf den Baum-färbemaschinen abgearbeitet. Auf dieSoft-Färbeapparate entfielen die an-deren ca. 20 % der Gesamtmenge.Da es im analysierten Unternehmen

124 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

beide Verfahren betriebswirtschaft-lich untersucht. Dabei kamen Fix-und Proportionalkostensätze aus derBetriebskalkulation, die im Betrach-tungszeitraum aktuellen Einkaufs-preise für Chemikalien und Betriebs-stoffe sowie die im Betrachtungszeit-raum gültigen kommunalen Preise fürWasser und Energie zum Einsatz. Au-ßer dem Wasserstoffperoxid kommenbei der Bleiche von Mischgewebenoch eine ganze Reihe anderer Che-mikalien zum Einsatz, so z.B. Stabili-satoren, Kochsalz und Faserschutz-mittel. Dampf dient zum Aufheizender Bleichflotte, Kühlwasser zum Ab-kühlen derselben. Prozesswasser istdas Wasser, das als Bleichflotte direktmit den Textilien in Berührungkommt.

Ergebnis

Aus Gründen der Geheimhaltung wer-den hier keine absoluten Zahlen ge-nannt, sondern die Kosten des neuenVerfahrens in Relation zum her-kömmlichen Verfahren dargestellt(siehe Tabelle: Kostensenkung nachAnlagentyp).

Mit dem enzymatischen Verfahrensind sowohl auf dem Baum- als auchauf dem Strangfärbeapparat Einspa-rungen zu erzielen. Die Kosten fürChemikalien steigen zwar um 7% bzw.11% an, dies erklärt sich jedoch da-durch, dass hier die Kosten für dasEnzym einfließen. In allen anderenBereichen reduzieren sich die Kosten,zum Teil sogar bis zu 20%. Dabeimuss berücksichtigt werden, dass dieeinzelnen Kostenfaktoren in unter-schiedlich hohem Maß an den Ge-samtkosten beteiligt sind. Unter die-sen Voraussetzungen schneidet dasenzymatische Verfahren letztendlichrund 6% bzw. 8% billiger ab, als dasherkömmliche.

Die Substitution des herkömmli-chen mehrfachen Spülens zur Entfer-nung von Wasserstoffperoxid-Restenbei der Baumwollbleiche durch eineenzymatische Behandlung mit der Ka-talase KAPPAZYM AP Neu bewirktkonkret die folgenden Vorteile:– Der Ressoucenverbrauch sinktdurch die deutliche Einsparung vonWasser (sowohl beim Spülen als auchdurch den Einsatz als Kühlmittel fürden gesamten Prozess) sowie die Ein-sparung von Prozessenergie in Formvon Dampf.– Die Umweltbelastung verringertsich sowohl durch die genannte Sen-kung des Ressourcenverbrauchs alsauch durch geringere Einleitung vonindustriellem Abwasser.

– Die Kosten des Unternehmens fürdiesen Verfahrensschritt verringernsich signifikant; es konnten je nachverwendetem Maschinentyp und zubearbeitendem Material Kostensen-kungen zwischen 6 und 8 % per annorealisiert und nachgewiesen werden.

Die Ergebnisse dieser Wirtschaft-lichkeitsanlyse zeigen am konkretenBeispiel, dass schon eine geringfügi-ge produktionsintegrierte biotechno-logisch basierte Verfahrensänderungden Ressourcenverbrauch und dieUmweltbelastung deutlich gesenkthat, ohne dass dazu technisch und fi-nanziell aufwändige Investitionen not-wendig waren. Wesentlich ist gleich-zeitig, dass durch die gezeigte verfah-rensinduzierte Kostensenkung dieWettbewerbsfähigkeit des Unterneh-mens gesteigert wurde.

Identifikation weitererEinsatzgebietebiotechnologischerVerfahren in derTextilveredlung

Die am konkreten Beispiel aufgezeig-ten Potenziale des Einsatzes biotech-nologischen Know-hows in der Tex-tilveredlung regten die interdisziplinä-re Diskussion über mögliche weitereEinsatzgebiete für biotechnologischeVerfahren in der Wertschöpfungsket-te der Textilveredlung maßgeblich an.

Aus der Diskussion zwischen Ex-perten verschiedener Fakultäten unddem damit verbundenen fachüber-greifenden Wissenstransfer entstan-den während der Projektlaufzeit unddes Abschlussworkshops keine kon-kreten Verfahrensvorschläge. Jedochwurden in einer Prioritätenliste eineVielzahl von Handlungsfeldern für ver-schiedenste Prozessstufen der Textil-veredlung identifiziert, innerhalb de-rer der Einsatz biotechnologischerVerfahren wünschenswert und mög-lich erscheint.

Potenzielle Einsatzgebiete biotech-nologischer Verfahren in der Textil-veredlung:– Reinigen von Textilmaschinen:Ersatz des chemikalienintensiven Aus-kochens der Anlagen durch ein scho-nenderes enzymatisches Verfahren.– Enzymatischer Schnelltest beimWareneingang:Beantwortung der für die weitere Be-arbeitung der Textilien relevantenFragen, welche Chemikalien in wel-chen Mengen auf das Textil aufge-bracht sind und ob Enzyminhibitorenund/oder Komplexbildner vorhandensind.– Identifizierung und Einsatz einersauren Amylase:eine pH 2-taugliche Amylase könntedie Verbindung der Arbeitsgänge Ent-mineralisieren und Entschlichten er-möglichen.– Alternative Bleichmittel:Ersatz herkömmlicher Bleichmittelwie Wasserstoffperoxid durch Per-oxidasen.– Abbau von Silikonverbindungen:Enzymatischer Abbau von Silikonver-bindungen, die im Rahmen der Aus-rüstung auf das Textil aufgebrachtwurden.– Enzymatisches Abkochen:Ersatz des alkalischen Abkochensdurch einen „Enzymcocktail“ oderganze Mikroorganismen.– Biofinishing:Einsatz von Cellulasen und Co-Fakto-ren zum Ersatz chemischer Ausrü-stungsverfahren.– Alternative Schlichtemittel:Einsatz von Proteinhydrolysaten alsSchlichtemittel.

Resultate

Die Textilveredlungsindustrie istdurch hohen Energie- und Ressour-cenverbrauch und zeitintensive Pro-duktionsprozesse charakterisiert.Deshalb können produktionsinte-

grierte biotechnologische Verfahrenhier in besonderem Maße dazu bei-tragen, Energie und Wasser zu spa-ren, Emissionen zu vermindern sowiedie Prozesse und somit die Durchlauf-zeiten zu verkürzen. Der Nachweisökonomischer Vorteile ist maßgeb-lich für die Bereitschaft von Entschei-dungsträgern in Unternehmen, öko-logisch vorteilhafte innovative Verfah-ren zur Anwendung zu bringen.

Aus dem Projekt resultiert die amkonkreten Beispiel der Verfahrens-substitution der Zerstörung von Rest-peroxid in der textilen Bleiche gewon-nene Erkenntnis, dass Einsatzmög-lichkeiten biotechnologischer Pro-dukte und Prozesse in der textilenWertschöpfungskette für Unterneh-men genannte Minderungen des Res-sourceneinsatzes sowie Verringerung/Vermeidung von Emissionen und so-mit Kostensenkungen bedeuten kön-nen.

Das Projekt zeigte weiterhin, dassdie bisher als unzureichend anzuse-hende Anwendung biotechnologi-scher Verfahren in der textilen Wert-schöpfungskette nicht auf Ressenti-ments seitens der Textilveredlungsin-dustrie gegenüber dieser Art vonTechnologien zurückzuführen ist.Vielmehr besteht hier ein Technolo-giebedarf an anwendungsreifen, inihrer verfahrenstechnischen Sicher-heit über Erstanwendungen hinaus-gehenden Verfahren. Den vorwiegendklein- und mittelständisch geprägtenUnternehmen in der Textilveredlungfehlen i.d.R. die technischen und fi-nanziellen Mittel, um Ergebnisse derForschung in Verfahren zu überfüh-ren bzw. verfahrenstechnische Er-kenntnisse auf die unternehmensspe-zifischen Gegebenheiten zu adaptie-ren.

Der Technologiebedarf geht eben-falls über das Realisieren von „Insel-lösungen“ hinaus. Dies bedeutet füreine zukünftige Entwicklung, dass - bei

Tab. 1: Kostensenkung nach Anlagentyp

Sonderband | 2003 | 125BIOKATALYSEBIOKATALYSE

UMWELTBILANZIERUNG

Umweltorientierte Bewertung vonProduktionsprozessen am Beispielder Verbundinitiative BIOL� Dipl.-Ing. René Gildemeister, Dr. Cornelia Haase, Dr. Horst Moormann, Dr. Jens Wohlers, Prof. Dr. Norbert RäbigerInstitut für Umweltverfahrenstechnik, Universität Bremen

Als Teilprojekt innerhalb des Verbunds „Biotechnologie in der Lebensmittelwirtschaft“ - kurz: BIOL - wird das vom Institut für Umweltverfahrenstechnik(IUV) der Universität Bremen entwickelte Methodenkonzept der umweltrelevanten Bewertung als Maßnahme zur Unterstützung der Entwicklung neuerinnovativer Prozesse und Verfahren im Vergleich zu konkurrierenden Verfahren angewendet. Primäres Ziel ist es, die Entwicklung biotechnologischerInnovationen in der Lebensmittelindustrie sowohl als Einzelsystem wie auch als integrativer Bestandteil einer Produktionslinie hinsichtlich der Nachhal-tigkeitsanforderungen projektbegleitend zu unterstützen. Die Anwendung der Umweltbilanzierung in einem frühen Stadium der Produktentwicklung kannmögliche Umweltgefährdungspotenziale aufdecken und ermöglicht eine nachhaltige Ausrichtung der Innovation für die spätere Produktion. Erste Erfolgehinsichtlich eines besseren Ressourcenmanagements und einer optimierten Produktionsentwicklung konnten bereits in guter Zusammenarbeit mit deninvolvierten Arbeitsgruppen erzielt werden. Ein weiteres Ziel des Projekts ist die Erhöhung der Akzeptanz von Methoden der Umweltbilanzierung undderen Weiterentwicklung durch Zusammenarbeit und Erfahrungsaustausch mit Arbeitsgruppen, die auch an Methoden der Umweltbilanzierung arbeiten.

Keywords: Bewertung, Biotechnologie, Lebensmittelindustrie, Nachhaltigkeit, produktionsintegrierter Umweltschutz, Umweltbilanzierung.

Belange, der Forcierung des Kreislauf-gedankens und steigender Anforderun-gen an die Flexibilität von Produktions-systemen gewinnen zukunftsweisendeund umweltorientierte Analyse- und Be-wertungsmethoden für eine bessereIntegration ökonomischer sowie öko-logischer Aspekte bei der Entschei-dungsfindung im Unternehmen zuneh-mend an Bedeutung.

Im Institut für Umweltverfahrens-technik (IUV) wurde das „Methoden-konzept zur umweltrelevanten undökonomischen Bewertung von Produk-tionslinien“ entwickelt. Das Ziel die-ses Methodenkonzepts ist es, so-wohl die ökologischen als auch diehäufig damit in Verbindung stehendenökonomischen Schwachstellen undOptimierungspotenziale entlang vonbestehenden und/oder in der Ent-wicklung befindlichen Produktions-linien als solche zu identifizieren so-wie zu lokalisieren und somit Einspa-

rungs- und Entwicklungspotenzialetransparent und nachvollziehbar offenzu legen.

Im Rahmen der DBU-Verbundinitia-tive „Biotechnologie in der Lebensmit-

telwirtschaft“ - kurz: BIOL - soll dasMethodenkonzept und dessen metho-dische Weiterentwicklung auf die Pro-duktion angewendet werden. In derLebensmittelverarbeitung zeichnen

Einleitung

Das gestiegene Bewusstsein über dieBedeutung der Nachhaltigkeit, des Um-weltschutzes und möglicher Umweltein-wirkungen, die mit der Produktion undAnwendung von Produkten sowie mitDienstleistungen im Zusammenhangstehen, hat das Interesse an den vorge-schlagenen Maßnahmen der Integrier-ten Produktpolitik (IPP) erhöht. ZurVerringerung der negativen Umweltaus-wirkungen, zur Charakterisierung derNachhaltigkeit der Produktionslinienund zur Sicherung der Konkurrenzfä-higkeit von Industriestandorten wirdhierbei insbesondere auf die Integrati-on der umweltrelevanten Produktbe-wertung in den Verantwortungsbereichdes Managements hingewiesen, wo siedurch Anwendung von Bewertungsme-thoden umgesetzt werden muss.

Vor diesem Hintergrund der wach-senden Berücksichtigung ökologischer

Abb. 1: Methodenkonzept zur umweltrelevanten und ökonomischen Be-wertung von Produktionslinien.

aller Konzentration auf schnellstmög-liche Lösung drängender Problemeder Unternehmen - in Übereinstim-mung mit den Bedürfnissen der Bran-che noch eine Vielzahl von biotech-nologischen Verfahren entwickelt undangeboten werden kann, die je nachden unternehmensspezifischen Gege-benheiten (Produkte, Prozesse, anla-

gentechnische Ausstattung, Art undUmfang des Ressourcenverbrauchsbzw. der Emissionen) zum Einsatz inder textilen Wertschöpfungskettekommen können.

Abschließend ist anzumerken, dassfür einige der im Rahmen des Projektsidentifizierten Einsatzgebiete biotech-nologischer Produkte oder Prozesse

in derzeit laufenden Projekten ver-schiedener Förderschwerpunkte(„Biokatalyse“ der Deutschen Bun-destsiftung Umwelt, „Nachhaltige Bio-Produktion“ des Bundesministeriumsfür Bildung und Forschung) nach an-wendungsreifen Lösungen geforschtbzw. an konkreten Umsetzungen die-ser Lösungen gearbeitet wird.

Korrespondenzadresse

Peter GebhartDECHEMA e.V.Karl-Winnacker-InstitutAG BioverfahrenstechnikTel.: 069-7564 426Fax: 069-7564 388eMail: gebhart@dechema.de

126 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

sich viele Prozesse aufgrund der ho-hen hygienischen Anforderungen andas Produkt durch einen großen Was-ser- und Energieverbrauch aus. Auchwenn vor allem aufgrund bisherigerwirtschaftlicher Betrachtungen an vie-len Stellen der Ressourcenverbrauchreduziert wurde, ist immer noch eingroßes Einsparpotenzial vorhanden,welches sich allerdings häufig erstnach intensiver Analyse identifizierenlässt. Da sich der wirtschaftliche Auf-wand nur schwer abschätzen lässt,scheuen viele Unternehmen Mühenund Kosten einer solchen Analyse. AlsFolge hiervon bleibt das Potenzial zurRessourceneinsparung im Unterneh-men oft unerkannt, wobei dies imBesonderen für die Umsetzung vonInnovationen gilt. Innerhalb der F&E-Phase wurde den Auswirkungen vonInnovationen auf die Nachhaltigkeitim Zielprozess bisher nur wenig Auf-merksamkeit gewidmet.

Das Ziel des BIOL-Projekts ist eineprojektbegleitende umweltrelevanteBewertung von vier der im Rahmender DBU-Verbundinitiative geförder-ten innovativen biotechnologischenVerfahren als integrativer Bestandteileiner Produktionslinie sowie als Ein-zelsysteme, die über Synergien imBereich produktionsintegrierter Ein-satz, Ressourcenminimierung oderQualitätskontrolle verfügen.

Darstellung desMethodenkonzepts derumweltrelevantenBewertung

Zur Bewertung bestehender sowiegeplanter Verfahren und Prozessewurde ein Methodenkonzept entwik-kelt, das einen ökonomischen undökologischen Vergleich von Systemen,Prozessen und Prozesslinien ermög-licht [3]. Hervorzuheben ist die um-fassende Einbeziehung umweltrele-vanter Faktoren, die sowohl ökologi-sche als auch human- und ökotoxi-kologische Auswirkungen berück-sichtigen.Das entwickelte Methodenkonzeptorientiert sich in seiner Vorgehens-weise an der Erstellung von Ökobi-lanzen (DIN EN ISO 14040 ff.) undsetzt sich aus folgenden Modulen zu-sammen:– Zieldefinition,– Sachbilanz,– Bewertungsmethode,– Schwachstellendefinition und Op-timierungsanalyse,– ökonomische Betrachtung.Die einzelnen Module können in ei-nem iterativen Prozess jeweils ange-

passt werden und sind je nach dem Zielvariabel ausführbar (Abb. 1).

Zu Beginn der Anwendung des Me-thodenkonzepts werden in der Ziel-definition der Untersuchungsrahmenfestgelegt sowie die Forschungsinter-essen dargestellt. Nach einer detaillier-ten Systembeschreibung werden dieBilanzgrenzen und damit der Bilanz-raum festgelegt, der sich im vorliegen-den Methodenkonzept auf die Produk-tionslinien begrenzt.

In der Sachbilanz, welche die not-wendige Voraussetzung zur iterativenDurchführung des Methodenkonzeptsdarstellt, erfolgt die möglichst detail-lierte Erfassung der Stoff- und Ener-gieströme der zu vergleichenden rele-vanten Systeme und Prozesse. Mit denin der Sachbilanz erhobenen Datenwerden Kennzahlen zur Dokumentati-on und Beurteilung der Umweltleistungeines Unternehmens gebildet. Dadurchlassen sich Produktionsprozesse überdie gesamte Produktionslinie charak-terisieren und Zusammenhänge hin-sichtlich Nachhaltigkeit und Ressour-cenverbrauch aufzeigen. Das Stoff-strommanagement sämtlicher Input-und Outputströme ermöglicht bereitszu diesem Zeitpunkt eine zielgerichte-te Optimierung bzw. eine kontinuierli-che Verbesserung der Produktionsli-nie.

Das Ziel der Bewertungsmetho-de ist es, die innerhalb einer Produk-tion mit Produkten, Prozessen undDienstleistungen in Verbindung stehen-den Beeinflussungen der Umwelt zu er-fassen, nachvollziehbar aufzubereiten,die jeweils spezifischen Wirkungen ab-zuschätzen und zu bewerten. Die um-weltrelevante Bewertung basiert aufeiner Modifikation der Methode vonGebler [2]. Das Bewertungsergebnisbesteht aus einem Kennwert, dem

Funktionswert für umweltrelevanteWirkungen (F

ges), der in geeigneter

Weise die gesamtökologischen Um-weltauswirkungen eines Systems re-präsentiert. Zur Ermittlung des Funk-tionswerts für umweltrelevante Wir-kungen wird aufbauend auf der Sach-bilanz zunächst jeder im Produktions-prozess definierte Stoff sowie dessenAbbau- und Umwandlungsprodukteaufgrund seiner potenziellen Wirkun-gen in verschiedene Wirkungskatego-rien klassifiziert. Als Wirkungskatego-rien werden sowohl toxikologische alsauch ökotoxikologische Kriterien be-rücksichtigt (Abb. 2).

Innerhalb der Wirkungskategorienwird anschließend jeder klassifiziertenSubstanz ein repräsentativer Wirkungs-indikator zugeordnet. Die Indikatorenstellen stoffspezifische, naturwissen-schaftlich abgesicherte und das Scha-denspotenzial bewertende Größen dar.Die stoffspezifischen Werte für die Be-rechnung der Wirkungsindikatorender einzelnen Substanzen/Stoffe wer-den der UBA-Datenbank, den gängigenSicherheitsdatenblättern und Nach-schlagewerken sowie der institutseige-nen Datenbank entnommen. Liegendie benötigten Daten nicht vor, erfolgtüber die Analyse von Struktur-/Wir-kungsbeziehungen eine Abschätzunghinsichtlich der Substanzeigenschaften(z. B. QSAR).

Im nächsten Schritt werden die Wir-kungsindikatoren innerhalb jeder Ka-tegorie in eine gemeinsame Einheitumgerechnet, welche die Zusammen-fassung in ein Wirkungsindikatorer-gebnis erlaubt (Charakterisierung).Die so für jede Wirkungskategorie be-rechneten Wirkungsindikatorergeb-nisse, die weder qualitativ noch quan-titativ unmittelbar miteinander ver-gleichbar sind, stellen nach DIN EN ISO

14042 zusammen das Wirkungsab-schätzungsprofil für eine Substanz dar.

Zur Formulierung einer ganzheitli-chen Aussage über die gesamtökolo-gischen Umweltauswirkungen vonStoffen und Energien stellt die Reduk-tion der Komplexität in Form einesZahlenwerts eine wesentliche Voraus-setzung für die Auffindung von ökolo-gischen Schwachstellen in Produkti-onslinien dar, ohne den Einfluss derSubjektivität des Bewertenden berück-sichtigen zu müssen. Hierzu muss diein viele Wirkungskategorien aufgeteil-te Umweltrelevanz auf einen Funktions-wert zurückgeführt werden.

Zur Bildung eines einzigen wir-kungskategorieübergreifenden Kenn-werts, zur Verbesserung der Trenn-schärfe, zur Vermeidung von Schein-genauigkeiten und zur Senkung derFehlerquote werden im ersten Schrittden ermittelten Indikatorergebnissenabgestufte Größenordnungen zugewie-sen (Einordnung). Zur Erhöhung derÜbersichtlichkeit werden alle stoffspe-zifischen Toxizitätsfaktoren (Tx’, Tx’’,Tx’’’ und Tx’’’’) zu einem KennwertTx zusammengefasst und gleichrangiggewichtet. Der Minimalwert (pessimi-stische Annahme) wird aus allen vierDatentypen als Kennwert Tx gewählt.

Die ermittelten Indikatorergebnis-se der Wirkungskategorien der Bioak-kumulation (BCF’), der Biomagnifika-tion (AF’) und der Persistenz (PF) wer-den anschließend mit dem stöchiome-trischen Faktor λ multipliziert und alsBezugsgröße nach ihrem Gefähr-dungspotenzial (Tx

S) als Ökogefähr-

dungsfaktor Txök

gewertet:

(Bio = Biomasse; S = Substanz)Das pro kg Substanz vorhandene

Potenzial einer Schadwirkung wird mitHilfe des Ökogefährdungsfaktors aus-gedrückt.

Bei der Berechnung des Funktions-werts für umweltrelevante Wirkungeneines Schadstoffs (F-Wert) werden dieSchadstofffrachten (m

S) der entspre-

chenden Substanz und seiner Abbau-produkte mit den stoffspezifischenÖkogefährdungsfaktoren multipliziert.Eine Substanz kann auch durch ihreAbbauprodukte umweltgefährdendwirken, die dafür in die Berechnungdes F-Werts mit einbezogen werdenmüssen:

(PE = Produktionseinheit)Abschließend werden die Funkti-

onswerte für umweltrelevante Wirkun-

Abb. 2: Ausgewählte Wirkungskategorien und Einflussgrößen der Bewer-tungsmethode.

Sonderband | 2003 | 127BIOKATALYSEBIOKATALYSE

gen (FS) aller anfallenden Stoffe S zu

einem Gesamtfunktionswert umweltre-levanter Wirkungen (F

ges) zusammen-

gefasst, wobei hier das Gemischgefähr-dungspotenzial von Schadstoffen mitHilfe eines so genannten Gemischge-fährdungsfaktors (G

Si,Sj) berücksichtigt

wird:

Eine Übersicht über die einzelnenBerechnungsschritte zur Ermittlungdes Funktionswerts gibt Abbildung 3.

Zur Durchführung der Analysezur umweltrelevanten Schwach-stellendefinition wird der ermittel-te Kennwert (F

ges) über die einzelnen

Prozessschritte einer Produktionslinieaufgetragen. Durch Visualisierung derumweltrelevanten Bewertung in Dia-grammdarstellung und der Anwen-dung von mathematischen Kriterienauf den Kurvenverlauf können dieökologischen Schwachstellen einerProduktionslinie transparent undnachvollziehbar ermittelt werden.Nach erfolgter Schwachstellendefini-tion können mit Hilfe des Moduls zurumweltrelevanten Charakterisie-rung von Optimierungsansätzendurch Modellbildung auch möglicheintegrierte Umweltschutzmaßnahmenerarbeitet und deren Anwendung imProduktionsprozess bewertet werden.

Bei der ökonomischen Betrach-tung werden aufbauend auf der Sach-bilanz den einzelnen Stoff- und Ener-gieströmen Wertmaßstäbe zugeord-net. Aufgrund der erhöhten Transpa-renz der ökonomischen Aspekte kön-nen die Kosten den einzelnen Pro-zessschritten zugeordnet, Kostenpo-tenziale identifiziert und eine Entschei-dungsgrundlage für mittel- und lang-fristige Planungen geschaffen werden.

Die Anwendung derUmweltbilanzierung in derVerbundinitiative BIOL

Die nachhaltige Produktion im Be-reich der Life Sciences gilt als eine derSchlüsseltechnologien des 21. Jahr-hunderts und wird in Zukunft ein zen-traler strategischer Wettbewerbsfaktorder Wirtschaft sein. Aufgrund der ho-hen hygienischen Anforderungen andas Produkt zeichnen sich viele Pro-zesse der Lebensmittelverarbeitungdurch einen großen Wasser- und En-ergieverbrauch aus. Des Weiteren re-sultieren aus der biotechnologischenForschung erhöhte Ansprüche an dieProduktsicherheit, welche die Unter-nehmen der lebensmittelverarbeiten-den Industrie vor große Herausforde-

rungen stellen. Die effiziente Umstel-lung auf eine nachhaltige Produktionerfordert daher bereits im Vorfeld ei-ner Investition eine umweltrelevanteAnalyse der Produktionsprozesse, dasich die vorhandenen, aber nicht au-genfälligen, wertschöpfungssteigern-den Potenziale erst nach intensiverAnalyse identifizieren lassen.

Im Rahmen der DBU-Verbundin-itiative BIOL erfolgt bereits währendder Entwicklung von vier biotechno-logischen Innovationen die Anwen-dung und methodische Weiterent-wicklung der auf die Produktion aus-gerichteten Umweltbilanzierung, umals Projektziel bereits frühzeitig einenBeitrag zur nachhaltigen Entwicklungdieser ressourcenintensiven Produk-tion zu leisten. Aufgrund von Synergi-en im Bereich produktionsintegrier-ter Einsatz, Ressourcenminimierungund/oder Qualitätskontrolle wurdenfolgende vier geförderte biotechnolo-gische Verfahren ausgewählt:– Biotechnologische Veredelung vonterpenhaltigen Reststoff-Fraktionender citrusverarbeitenden Industrie zuhochwertigen natürlichen Duft- undAromastoffen– Ressourcen- und umweltschonen-de Behandlung von Lebensmittelndurch Hochdruck– Neues biotechnologisches Verfah-ren zur Brauchwassergewinnung mitTrinkwasserqualität aus Abwässernder Lebensmittelverarbeitung– Optimierung von DNA-Arrays zurAnalyse von Milch und Milchproduk-ten

Die Anwendung der Umweltbilan-zierung innerhalb der Entwicklungbiotechnologischer Innovationen fin-det in einem frühen Stadium der je-weiligen Projekte statt, um bereits beider Konzeptionierung der Innovatio-nen unterstützend mitwirken zu kön-nen. Als weiteres Teilziel dieses Vor-habens soll die Akzeptanz von Metho-den der Umweltbilanzierung erhöht

leisteten die Basis für die Bewertungder geplanten bzw. bestehenden Pro-zesse. Mit Hilfe dieser Unterstützungist eine hohe Datensicherheit im All-gemeinen erreicht worden. War dieDatenlage für die Bewertung lücken-haft oder erforderte präzisere Werte,konnten zusätzlich unter der Voraus-setzung eines vertretbaren Aufwandsgezielte Messungen zur Erweiterung

Abb. 3: Bewertungsschritte zur Ermittlung des Funktionswertes für umweltrelevante Wirkungen (F-Wert).

der Datenlage vor Ort durchgeführtwerden. Das gute Klima zwischen denProjektpartnern ermöglichte eine er-folgreiche Zusammenarbeit, im Rah-men derer Beiträge zur Optimierungder innovativen biotechnologischenProzesse bezüglich eines nachhalti-gen Ressourcenmanagements bereitsgeleistet werden konnten. Hinweiseüber die Auswirkung einer späterenIntegration der Innovation in die Ge-samtproduktion oder eine Neuaus-richtung der Produktionslinie konn-ten ebenfalls erbracht werden und

sowie deren Weiterentwicklung geför-dert werden. Hierzu erfolgt ein kon-tinuierlicher Erfahrungsaustausch mitanderen an den Methoden der Stoff-strombilanzierung beteiligten Arbeits-gruppen.

Bei der Durchführung der Projek-te erfolgte zunächst in enger Zusam-menarbeit mit den Projektpartnerndie Festlegung der Systemgrenzen unddie Aufnahme bzw. Überlassung vonDaten. Die Grundvoraussetzungen zurErfassung der Input- und Outputströ-me waren somit gegeben und gewähr-

Abb. 4: Bilanzierung und Modellierung von Stoffströmen.

128 | Sonderband | 2003BIOKATALYSEBIOKATALYSE

unterstützten die Arbeitsgruppen beider Fokussierung ihrer F&E-Aktivitä-ten.

Im Folgenden wird am Beispiel desProjektes: „Optimierung von DNA-Ar-rays zur Analyse von Milch und Milch-produkten“ die Vorgehensweise un-ter Anwendung des Methodenkon-zepts kurz beschrieben und darge-stellt.

Bei Fermentationsprozessen in derMilchindustrie bestehen durch vira-le oder bakterielle Kontaminationenerhebliche ökonomische und um-weltrelevante Risiken. Für eine Viel-zahl von Milchprodukten werdenspezifische bakterielle Starterkultu-ren eingesetzt, deren Qualität durchdie Kontamination mit kulturschädi-genden Bakterien und insbesonderedurch Bakteriophagen (Bakterien ly-sierende Viren) gefährdet ist. Deshalbist eine ständige Qualitätskontrolleder eingesetzten Starterkulturen undder Milchprodukte sowie der verwen-deten Roh- und Hilfsstoffe erforder-lich. Konventionelle mikrobiologi-sche Untersuchungsmethoden benö-tigen bis zum Ergebnis der Analyseneinen Zeitraum von bis zu drei Tagenund in Einzelfällen einen noch län-geren Zeitraum. Diese Zeiten entspre-chen den Quarantänezeiten der Pro-dukte. Im Fall von Fehlfermentatio-nen fallen damit neben dem wirt-schaftlichen Schaden Umweltbela-stungen aufgrund der dadurch not-wendigen Entsorgung der Produkteund der anschließenden Reinigungder Produktionsanlagen an. Durchden Einsatz eines DNA-Arrays könn-ten die genannten Risiken aufgrundder zeitnahen Detektion erheblichminimiert werden.

Die Untersuchungen erfolgen aneiner Sauermilchproduktionslinie.Zu Beginn erfolgt die Festlegung derSystemgrenzen und innerhalb des da-mit festgelegten Bilanzraumes dieAufnahme der Sachbilanzdaten (Abb.4).

Auf Basis dieser ermittelten Datenwerden dann in der sich anschließen-den Wirkungsanalyse wie beschrie-ben die Funktionswerte für umwelt-relevante Wirkungen ermittelt. Ausder Bilanzierung des Ist-Zustandssind die Entwicklungen verschiede-ner Szenarien möglich, die verschie-dene Richtungen der zukünftigenProduktion aufzeigen können. DieAuftragung der Funktionswerte überdie einzelnen Prozessschritte derProduktionslinie stellt die Grundla-ge zur Identifizierung von Schwach-stellen bzw. Optimierungspotenzialenim Produktionsprozess dar (Abb. 5).

Abb. 5: Auffinden von Optimierungspotenzialen im Produktionsprozess.

In den Prozessschritten Einwaage,Pasteurisierung und Fermentationsind relativ starke Steigungen (S1, S2und S3), insbesondere im Abwasser-bereich, erkennbar. Diese sind zumeinen auf den Wasserverbrauch zu-rückzuführen und zum anderen aufden damit verbundenen Einsatz vonReinigungsmitteln. Bei erfolgreicherNutzung eines DNA-Arrays könnte dieAnzahl der Fermentationen zwischenden Sicherheitsreinigungen erhöhtwerden, da die Detektion einer Fehl-fermentation sofort erfolgt. Die Pro-duktion wird erst nach der Eliminie-rung des Kontaminationsherds fortge-setzt und es lassen sich somit weitereFehlchargen vermeiden. Der Wasser-und Chemikalienverbrauch wirdebenfalls gesenkt und ist in der Sum-me kontrollierbarer einsetzbar. DieIdentifizierung der Optimierungspo-tenziale in der Produktionslinie führ-te in Rücksprache mit dem Betrieb zuÜberlegungen, ob die vorhandenenReinigungsmittel eingespart oder sub-stituiert werden können, was zu einerVerbesserung der umweltrelevantenAuswirkungen beitragen würde.

Am Beispiel dieses Projekts zeigensich Synergien im Bereich des pro-duktionsintegrierten Einsatzes, derQualitätskontrolle und der Ressour-cenminimierung zu den anderen Pro-jekten: So wäre die Integration einesDNA-Arrays zur Qualitätskontrolle inder Milchverarbeitung auch auf diedrei anderen, vom IUV bewertetenProjekte übertragbar. Durch ihrenEinsatz ließen sich Fehlchargen ver-meiden und somit Ressourcenver-bräuche minimieren.

Zusammenfassung undAusblick

Im Rahmen des DBU-Verbundpro-jekts BIOL werden die neuentwickel-ten innovativen biotechnologischenProzesse für die Lebensmittelindu-strie, inklusive der daraus resultie-renden Produktionsprozesse, mit Hil-fe des am IUV entwickelten Metho-denkonzepts der umweltrelevantenBewertung im Hinblick auf Nachhal-tigkeit und Ressourcenverbrauch un-tersucht. Am Beispiel der milchver-arbeitenden Industrie sind die Mög-lichkeiten des Methodenkonzeptsaufgezeigt worden. Nach dem Aufzei-gen vorhandener Optimierungspo-tenziale der einzelnen Produktions-linien oder Produktionsprozessedurch die Erhebung der Sachbilanz-daten und der sich anschließendenFunktionsanalysen können gegenwär-tige und zukünftige Umweltauswir-kungen mit Hilfe der Umweltbilanzie-rung wesentlich besser abgeschätztwerden. Die hierfür eingesetzten Wir-kungsanalysen in Kombination mitOptimierungsuntersuchungen habendie Modellierung von Szenarien, beider unterschiedliche Variationen derjeweiligen Prozessführungen be-trachtet werden, ermöglicht und eineAussage über die möglichen umwelt-relevanten Potenziale bewirkt.

Des Weiteren ist angedacht, denBetrieben das Methodenkonzept alsEntscheidungshilfe für eine nachhal-tige Betriebsführung bereitzustellenund aufbauend auf den Erfahrungendes IUV im Bereich der Umweltbilan-zierung bei Neuentwicklungen von

Produkten oder bei Optimierungenvon Produktions- und Prozesslinienunterstützend mitzuwirken.

Literatur

[1] Umweltbundesamt: Materialien zuÖkobilanzen und Lebensweganalysen,Texte 26/97, Erich-Schmidt-Verlag,Berlin (1997).

[2] Gebler, W.: Ökobilanzen in der Abfall-wirtschaft – Stuttgarter Berichte zurAbfallwirtschaft, Bericht 41 (1992).

[3] Haase, C.: Umweltrelevante und öko-nomische Bewertung von Produkti-onslinien, Dissertation UniversitätBremen, Shaker Verlag (2002).

Korrespondenzadresse

Prof. Dr.-Ing. Norbert RäbigerInstitut für UmweltverfahrenstechnikUniversität BremenPostfach 330 44028 334 BremenTel.: 0421-218 41 96Fax: 0421-218 49 47eMail: raebiger@iuv.uni-bremen.de

Zentrum für Umweltkommunikationder Deutschen Bundesstiftung Umwelt

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FaszinationBiotechnologie

Wanderausstellung

Besuchen Sie uns noch bis zum21. November

im Zentrum für Umweltkommunikationder Deutschen Bundesstiftung Umwelt in49090 Osnabrück - An der Bornau 2.

Die Ausstellung geht in den Jahren 2004 bis 2007 auf Wanderschaft. Hierfürkann sie ausgeliehen werden.

Näherer Informationen bekommen Sie unter Tel.: (0541) 9633-941.Internet: http://www.dbu.de/ausstellung

Bildnachweis:Karl Johaentges, HannoverArchimedes GbR, Berlin