VII. PEMBAHASANPada percobaan kali ini, telah dilakukan analisis kadar protein total pada fraksi protein sampel yang di telah dilakukan proses fraksinasi sebelumnya. Metode yang umum digunakan untuk menentukan kadar protein antara lain metode Biuret, Bradford, dan Lowry. Masing-masing metode memiliki kekurangan dan kelebihan. Pemilihan metode yang terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran tergantung pada beberapa faktor, yaitu jumlah material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan pengukuran, dan spektrofotometer yang tersedia yaitu sinar tampak atau UV. Reaksi biuret merupakan reaksi warna yang umum untuk gugus peptide dan protein. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu karena terbentuk senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptide. Banyaknya asam amino yang terikat pada ikatan peptide mempengaruhi warna reaksi ini. Senyawa dengan dipeptide memberikan warna merah. Beberapa protein yang mempunyai gugus CS NH-, CH-NH- dalam molekulnya juga member tes warna positif dari reaksi biuret ini membentuk suatu senyawa kompleks. Uji biuret ini dapat digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya ikatan peptide dalam suatu senyawa sehingga uji biuret dapat dipakai untuk menunjukan adanya senyawa protein. Langkah pengujian yang dapat dilakukan adalah larutan sampel yang diduga mengandung protein ditetesi dengan larutan NaOH kemudian diberi beberapa tetes larutan CuSO4 encer. Apabila larutan berubah menjadi arna unggu maka larutan tersebut mengandung protein. Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan Cupri Sulfat ( CuSO4) encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-senyawa yang mengandung gugus amida asam (-CONH2) yang berada bersama gugus amida asam yang lain atau gugus yang lain seperti CSNH2, C(NH)NH2, CH2NH2, CRHNH2, CHOHCH2NH2, CHOHCH2NH2, CHNH2CH2OH, CHNH2CHOH. Dengan demikian uji Biuret tidak hanya untuk protein tetapi zat lain seperti Biuret atau malonamida juga memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah-violet atau biru-violet. Intensitas warna tergantung pada konsentrasi protein yang ditera. Penentuan protein cara biuret adalah dengan mengukur optical density (OD) pada panjang gelombang 560580 nm. Agar dapat menghitung banyaknya protein maka perlu lebih dahuu dibuat kurva baku/standar yang melukiskan hubungan antara konsentrasi protein dengan OD pada panjang gelombang terpilih. Dibandingkan dengan cara Kjeldahl maka biuret lebih baik karena hanya protein atau senyawa peptida yabf bereaksi dengan biurety, kecuali urea. Reaksi yang terjadi dapat dituliskan sebagai berikut ;Percobaan ini dimulai dengan pembuatan pereaksi Biuret dimana 100 mL Na2CO3 2% dilarutkan dalam larutan NaOH 0,1 N ditambah 1 mL CuSO4 1% dan 1 mL K Na tartrat 2%. Seterusnya, dilakukan prosedur penentuan panjang gelombang maksimum pada kasein. Dimana, ditimbang 50 mg kasein, lalu dilarutkan dengan aquades dalam labu ukur 100 mL dan digenapkan hingga tanda batas dan mempunyai konsentrasi = 50 mg/100 mL = 500 g/mL. Selanjut dipipet 5 mL larutan kasein dan diencerkan dengan aquades dalam labu ukur 10 mL dengan konsentrasi 250 g/mL. Telah dipipet 1 mL larutan kasein 250 g/mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 9 mL pereaksi Biuret dan didiamkan selama 10 menit dengan konsentrasi 25 g/mL. Kemudiannya, diukur absorbansi larutan kasein pada panjang gelombang 400-800 nm dengan spektrofotometer dimana blangko berisi 1 mL aquades dan 9 mL pereaksi Biuret. Selanjutnya, digambarkan spektrum absorbansi terhadap panjang gelomban dan ditentukan panjang gelombang maksimum kasein yaitu 550nm. Selanjut itu, dilakukan pembuatan kurva baku larutan kasein dengan menyiapkan larutan kasein dalam 22 tabung reaksi sehingga diperoleh konsentrasi bertingkat dari 50-500 g /mL (duplo) berdasarkan Pengenceran larutan kasein untuk pembuatan kurva baku seperti digambarkan bawah:- Kemudianya, pada setiap tabung, ditambahkan 9 mL pereaksi Biuret, didiamkan selama 10 menit. Absorbansi setiap tabung diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang maksimum (550 nm) lalu dibuat kurva baku yang menunjukkan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi. Pada akhir ini, ditentukan persamaan garis kurva baku seperti berikut dengan Konsentrasi (0 = 0.016 ; 50 = 0.024; 100 = 0.353; 150 = 0.332; 200 = 0.682; 250 = 0.415; 300 = 0.68; 350 = 0.766; 400 = 1.107; 450 = 1.204; 500 = 1.18). Prosedural yang paling penting untuk percobaan ini dilakukan dengan pengukuran fraksi protein. Pertamanya, dipipet 1 mL fraksi protein protein, dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 9mL pereaksi Biuret lalu didiamkan selama 10 menit. Kemudian, diukur absorbansi fraksi, sehingga konsentrasi protein dalam fraksi protein perlu diperhitungkan dengan pengenceran (1 : 10) yang bertujuan adalah untuk mendapatkan kurva linear dan persamaan kurva linear tersebut dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel dari protein. Ternyata hasilnya seperti dibawah yaitu dari data analisisnya, ternyata bahwa campuran fraksi 2 & 3 (sampel A) mempunyai absorbansi paling tinggi yaitu 1.228 dan berikutan dengan fraksi 6 & 7 (sampel B) dengan nilai 0.648 dan terakhir sekali dengan fraksi 8 & 9 dengan nilai absorbansi 0.494. Sekian itu, dapat dibahaskan juga tentang kurva Kalibrasi Kasein terhadap Sampel Fraksinasi dimana Uji Biuret digunakan untuk menentukan konsentrasi protein secara umum. Persamaan yang didapat dari larutan standard adalah Y = 0,0025 x + 0,0068. Sampel A dengan nilai absorbansi mempunyai konsentrasi sebanyak 493.92 g/ml. Berikutan itu, dapat jelas dinyatakan bahwa konsentrasi tinggi memiliki absorbansi yang tinggi juga dan ini dapat dikatakan kurva yang didapat adalah linear.