PENETAPAN KADAR PHLOROTANNIN DALAM FRAKSI ETIL … fileii penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat sargassum cymosum c. agardh dengan metode kolorimetri folin

PENETAPAN KADAR PHLOROTANNIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT ALGA COKLAT Sargassum cymosum C. Agardh

DENGAN METODE KOLORIMETRI FOLIN CIOCALTEAU

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Diajukan oleh :

Andriani Noerlita Ningrum

NIM :048114063

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

PENETAPAN KADAR PHLOROTANNIN DALAM FRAKSI ETIL ASETAT ALGA COKLAT Sargassum cymosum C. Agardh

DENGAN METODE KOLORIMETRI FOLIN CIOCALTEAU

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Diajukan oleh :


NIM :048114063

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008


iii


iv


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Andriani Noerlita Ningrum Nomor Mahasiswa : 048114063

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : “Penetapan Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat Sargas-sum cymosum C. Agardh dengan Metode Kolorimetri Folin Ciocalteau” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 27 Juni 2008 Yang menyatakan



v

HALAMAN PERSEMBAHAN

Siapapun yang bermaksud menjadi seorang guru bagi manusia, biarlah dia

mengawali dengan mengajari dirinya sendiri sebelum mengajari orang lain, dan

mengajar dengan teladan sebelum mengajar dengan kata-kata. Selama dia

mengajar dirinya sendiri dan memperbaiki perilakunya sendiri, ia lebih patut

dihargai dan dihormati, daripada dia yang mengajari dan mencoba

memperbaiki perilaku orang lain (Kahlil Gibran).

Skripsi ini kupersembahkan untuk:

Keluarga, ayah, ibu, adik-adikku tercinta,

Teman-teman dan penyemangat hidupku,

Almamaterku.


vi

P R A K A T A

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas

terselesaikannya penelitian untuk skripsi yang berjudul ”Penetapan Kadar

Phlorotannin dalam Fraksi Etil Asetat Alga Coklat Sargassum cymosum C.

Agardh dengan Metode Kolorimetri Folin Ciocalteau”. Penelitian ini merupakan

bagian dari program hibah penelitian, dan menjadi tahap awal penelitian selanjutnya

yaitu aplikasi phlorotannin yang terkandung dalam alga di bidang kosmetik

khususnya sebagai sunscreen yang memiliki efek fotoprotektif.

Selama pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi, penulis

menerima banyak bantuan, dukungan dan kerjasama dari berbagai pihak. Oleh

karena itu, penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya, yang selalu

memberi petunjuk dalam setiap langkah.

2. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Ibu Dra. A. Nora Iska Harnita, M.Si., Apt., selaku Ketua peneliti dalam salah

satu penelitian program hibah. Terima kasih telah menjadikan penulis

sebagai bagian dari proyek ini, memberikan semangat dan kritik yang

membangun.


vii

4. Bapak Ign. Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku dosen pembimbing dan penguji

yang telah banyak meluangkan waktu, memberi saran, kritik, serta dorongan

sehingga proses penyusunan skripsi ini dapat berjalan lancar.

5. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah banyak

memberi masukan dan arahan untuk perbaikan skripsi ini.

6. Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah banyak

memberi masukan yang bermanfaat bagi skripsi ini.

7. Semua dosen yang telah menjadikan penulis ada dan berguna. Terima kasih

atas bimbingannya.

8. Semua laboran khususnya laboran lantai 4 (Mas Kunto, Mas Parlan, Mas

Wagiran, Pak Prapto) untuk kerja sama dan bantuannya selama penelitian.

9. Keluarga tercinta, Bapak, Ibu, Dek Ari, Dek Rio yang tak bosan-bosannya

memberikan kasih sayang dan semangat untuk terus melangkah.

10. Wisnu, yang mengajariku untuk terus berusaha dan bertahan sampai akhir.

Terima kasih untuk perhatian, support, dan harapan yang membuatku terus

terjaga. Terima kasih untuk tiap detik yang terasa semakin singkat.

11. Teman-teman satu proyek, Hendry, Angel, Dewi, Fani, Elsa, Dipta, teman-

teman proyek ”teh” (esp. Dona), terima kasih atas support dan bantuannya

selama penelitian sampai penyusunan skripsi.

12. The big family of ”kontrakan kartun”, felic, ndk, pakdhe, gogon, bela, tedy,

tembi, edo, anna, cicil, tery, ina, chacha, ririn. Thanks for the amazing life.


viii

13. Teman-teman Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan semua yang

berperan dalam penelitian sampai penyusunan skripsi, yang tidak dapat

penulis sebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyelesaian

skripsi ini, sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang dapat membantu

menyempurnakan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat berguna bagi banyak orang.

Terima kasih.

Yogyakarta, 19 April 2008

Penulis



ix

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak

memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam

kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 19 April 2008

Penulis



x

INTISARI

Alga coklat adalah alga laut yang terbesar ukurannya dan bentuknya sangat beragam. Salah satunya adalah Sargassum cymosum C. Agardh yang banyak tumbuh di perairan Indonesia. Tumbuhan alga, khususnya alga coklat mengandung phlorotannin yang memiliki beberapa aktivitas biologik. Namun pemanfaatan sumber bahan bioaktif dari alga di bidang industri farmasi, kosmetik, dan makanan belum banyak dilakukan.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan phlorotannin dan menetapkan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh menggunakan metode kolorimetri Folin Ciocalteau. Metode penelitiannya adalah non eksperimental. Ektraksi menggunakan metode soxhletasi dengan cairan penyari metanol. Ekstrak kental kemudian difraksinasi dengan kloroform, akuades, dan etil asetat untuk mendapatkan phlorotannin.

Kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat ditetapkan dengan metode kolorimetri Folin Ciocalteau. Menggunakan larutan standar phloroglucinol yang dibuat seri konsentrasi baku 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 ppm dengan pelarut aseton 75%. Konsentrasi phlorotannin dihitung equivalen dengan phloroglucinol (mg PGE/g fraksi). Kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh yang didapat adalah 6,36 ± 0,04 mg PGE/ g fraksi yang diukur menggunakan spektrofotometri, dibaca pada panjang gelombang 750,1 nm.

Kata kunci : phlorotannin, alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh, Folin

Ciocalteau.


xi

ABSTRACT

Brown alga is kind of seaweeds whose the biggest size and vary in its kind. One of them is Sargassum cymosum C. Agardh which grows in Indonesian sea. Algae, particularly brown algae contains of phlorotannin which has some biologic activity whereas, rarely pharmacy industries, cosmetics, and food used the algae’s bioactive source.

The goals of this study is for getting phlorotannin and determining phlorotannin concentration in ethyl acetate fractional of brown alga Sargassum cymosum C. Agardh by colorimetric Folin Ciocalteau method. The method of this study is non experimental. Extraction have been done by soxhletation method with methanol solvent. The viscous extract than was fractionated with methanol, chloroform, aquadest and ethyl acetate to gain phlorotannin.

Concentration of phlorotannin in ethyl acetate fractional was determined by colorimetric Folin Ciocalteau method. Using phloroglucinol standard that was made in calibration series 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ; 5,0 ; 6,0 ppm with acetone 75 % solvent. Phlorotannin concentration was equivalently calculated with phloroglucinol (mg PGE/g fractional). Concentration of phlorotannin in ethyl acetate fractional of brown alga Sargassum cymosum C. Agardh has been investigated was 6,36 ± 0,04 mg PGE /g fractional was scanned using spectrophotometric at 750,1 nm the maxima wavelength. Keyword : phlorotannin, polifenol, brown alga Sargassum cymosum C. Agardh, Folin Ciocalteau.


xii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL............................................................................................. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN............................................................................... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... v

PRAKATA............................................................................................................ vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................... ix

INTISARI.............................................................................................................. x

ABSTRACT............................................................................................................ xi

DAFTAR ISI.. ...................................................................................................... xii

DAFTAR GAMBAR............................................................................................. xvi

DAFTAR TABEL................................................................................................. xvii

DAFTAR LAMPIRAN......................................................................................... xviii

BAB I. PENGANTAR........................................................................................... 1

A. Latar Belakang ........................................................................................... 1

B. Perumusan Masalah ..................................................................................... 3

C. Keaslian Penelitian........................................................................................ 3

D. Manfaat ......................................................................................................... 3

1. Manfaat teoritis ........................................................................................ 3

2. Manfaat metodologis ............................................................................... 4


xiii

3. Manfaat praktis......................................................................................... 4

E. Tujuan .......................................................................................................... 4

1. Tujuan umum........................................................................................... 4

2. Tujuan khusus .......................................................................................... 4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA............................................................................ 5

A. Alga Coklat Sargassum C. Agardh............................................................... 5

B. Polifenol Alga (Phlorotannin)...................................................................... 6

C. Soxhletasi ..................................................................................................... 7

D. Spektrofotometri........................................................................................... 9

E. Kolorimetri.................................................................................................... 11

F. Metode Folin Ciocalteau................................................................................ 12

G. Keterangan Empiris....................................................................................... 14

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................... 16

A. Jenis Rancangan Penelitian .......................................................................... 16

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ............................................... 16

1. Variabel Penelitian .................................................................................. 16

2. Definisi Operasional ............................................................................... 16

C. Bahan dan Alat.............................................................................................. 17

1. Bahan ...................................................................................................... 17

2. Alat.......................................................................................................... 18

D. Tata Cara Penelitian ..................................................................................... 18

1. Preparasi sampel alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh................ 18


xiv

2. Uji kualitatif senyawa fenolik.................................................................. 19

a. Preparasi ekstrak ................................................................................ 19

b. Uji tannin dan polifenol .................................................................... 19

3. Isolasi crude phlorotannin....................................................................... 20

4. Optimasi metode kolorimetri dengan Folin Ciocalteau .......................... 21

a. Pembuatan larutan standar ................................................................. 21

b. Penentuan operating time (OT)......................................................... 21

c. Penentuan panjang gelombang maksimum (? maks)............................ 21

5. Penetapan kurva baku phloroglucinol ................................................... 22

6. Estimasi kadar polifenol total pada fraksi etil asetat alga coklat

Sargassum cymosum C. Agardh.............................................................. 22

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 24

A. Preparasi sampel alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh..................... 24

B. Uji kualitatif senyawa fenolik....................................................................... 28

C. Isolasi crude phlorotannin............................................................................ 29

D. Optimasi metode kolorimetri dengan reagen Folin Ciocalteau..................... 31

1. Pembuatan larutan standar phloroglucinol.............................................. 31

2. Penentuan operating time (OT)............................................................... 32

3. Penentuan panjang gelombang maksimum (? maks)................................. 33

E. Penetapan kurva baku phloroglucinol ........................................................ 35

F. Penetapan kadar phlorotannin fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum

C. Agardh..................................................................................................... 37


xv

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN................................................................. 43

A. Kesimpulan ................................................................................................... 43

B. Saran............................................................................................................. 43

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 44

LAMPIRAN............................................................................................................ 48

BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 61


xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur phloroglucinol......................................................................... 7

Gambar 2. Struktur fucofuroeckol .......................................................................... 8

Gambar 3. Diagram sederhana spektrofotometer.................................................... 9

Gambar 4. Proses oksidasi fenol oleh enzim PPO................................................... 26

Gambar 5. Reaksi penetapan kadar air dengan Karl Fischer.................................... 27

Gambar 6. Reaksi pembentukan kompleks gugus fenolik dan FeCl3................. .... 29

Gambar 7. Kurva baku vs serapan hasil penetapan operating time.......................... 33

Gambar 8. Hasil pembacaan ? maks phloroglucinol (0,1; 0,3; dan 0,6 ppm) setelah

direaksikan dengan Folin Ciocalteau....................................................... 34

Gambar 9. Kurva baku hubungan kadar dan absorbansi phloroglucinol................ 37

Gambar 10. Kesetimbangan reaksi phloroglucinol dalam suasana basa.................. 38

Gambar 11. Reaksi phloroglucinol dengan reagen Folin Ciocalteau....................... 39


xvii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Hasil uji kandungan senyawa polifenol serbuk alga.................................. 28

Tabel II. Data untuk persamaan kurva baku............................................................ 36

Tabel III. Hasil pembacaan absorbansi fraksi etil asetat alga coklat Sargassum

cymosum C. Agardh.................................................................................. 40

Tabel IV.Hasil penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat

Sargassum cymosum C. Agardh................................................................ 41


xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat keterangan hasil identifikasi spesies alga coklat............... ... 48

Lampiran 2. Data perhitungan kadar air dengan Karl Fischer............................. 50

Lampiran 3. Data penimbangan replikasi seri baku phloroglucinol..................... 51

Lampiran 4. Contoh perhitungan seri kadar baku phloroglucinol......................... 52

Lampiran 5. Hasil scanning operating time (OT).................................................. 52

Lampiran 6. Hasil scanning ? maks kadar phloroglucinol 1,0 ppm setelah

direaksikan dengan Folin Ciocalteau.............................................. 53





Lampiran 9. Hasil pembacaan absorbansi seri baku phloroglucinol pada

ketiga ? maks..................................................................................... 55

Lampiran 10. Kurva baku phloroglucinol............................................................ 56

Lampiran 11. Data penimbangan sampel.............................................................. 56

Lampiran 12. Data absorbansi sampel fraksi etil asetat Sargassum cymosum C.

Agardh............................................................................................. 57

Lampiran 13. Contoh perhitungan kadar sampel .................................................. 57

Lampiran 14. Foto hasil uji kualitatif alga coklat Sargassum cymosum C.

Agardh.............................................................................................. 58


xix

Lampiran 15. Foto instrumen spektrofotometer UV-VIS Perkin Elmer

Lambda-20....................................................................................... 59

Lampiran 16. Foto autoklaf................................................................................... 59

Lampiran 17. Foto vacuum rotary evaporator....................................................... 60


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Alga coklat adalah alga laut yang terbesar ukurannya, bentuknya sangat

beragam dan tersebar hampir di seluruh perairan pantai. Salah satu genus alga

coklat adalah Sargassum yang merupakan spesies yang kompleks baik morfologi

maupun susunan anatominya. Sargassum merupakan salah satu genus yang paling

menonjol dari kelas Phaeophyceae yang diperkirakan ada 400 spesies yang

tersebar di daerah tropis dan subtropis.

Salah satu kandungan dari tumbuhan alga adalah polifenol yang dikenal

sebagai phlorotannin dan merupakan senyawa polifenol yang hanya ditemukan

pada tumbuhan alga khususnya jenis-jenis alga coklat (Burtin, 2003). Beberapa

aktivitas biologik phlorotannin yang telah diteliti adalah antiproliferasi dan

antioksidan (Athukorala et al., 2006; Yuan dan Walsh, 2006; Kang et al., 2005a),

antiinflamasi (Shin et al., 2006), efek protektif terhadap ionizing radiation (Kang

et al., 2006), inhibitor matriks metalloroteinase (Kim et al., 2006), kemampuan

untuk mengabsorbsi sinar UV (Roleda et al., 2006; Swanson dan Druchl, 2002),

sitoprotektif terhadap stres oksidatif (Kang et al., 2005b), dan inhibitor HIV-1

reverse transcriptase dan protease (Ahn et al., 2004).

Eksplorasi senyawa polifenol terus dilakukan, akan tetapi eksplorasi

tersebut masih mengandalkan tumbuhan-tumbuhan terestrial. Tumbuhan alga

merupakan salah satu kekayaan laut Indonesia yang sangat potensial, namun


2

pemanfaatannya sebagai agen biomedis belum cukup maksimal. Fokus

pengembangan produk alam dari terestrial menjadi pengembangan berbasis

kelautan sangat diperlukan, mengingat wilayah laut Indonesia sebagai ”the largest

marine-mega biodiversity” (Dahuri, 2003).

Penelitian yang dilakukan terbatas pada phlorotannin dalam fraksi etil

asetat alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh. Phlorotannin dalam fraksi etil

asetat merupakan phlorotannin dengan polimer intermediet yang memiliki

aktifitas mengabsorbsi radiasi sinar ultraviolet secara maksimum sehingga dapat

dikembangkan menjadi produk sediaan sunscreen. Phlorotannin dengan polimer

intermediet akan memberikan serapan pada panjang gelombang UV A (400-320

nm) dan UV B (320 – 280 nm), sedangkan pada polimer panjang phlorotannin

akan memberikan serapan pada daerah visibel (400 – 800 nm) sehingga tidak

dapat dikembangkan menjadi sediaan sunscreen.

Zhang et al. (2006) telah melakukan penelitian tentang metode sederhana

untuk estimasi kandungan polifenol total pada rumput laut dan ekstraknya

berdasarkan reaksi kolorimetri Folin Ciocalteau. Metode Folin Ciocalteau

merupakan metode pilihan untuk mengestimasi kadar fenol total dalam tanaman

tanpa interferensi dari senyawa lain. Kelebihan metode Folin Ciocalteau

diantaranya adalah memiliki prosedur yang sederhana dan hanya membutuhkan

satu jenis reagen.

Penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat

Sargassum cymosum C. Agardh dihitung ekivalen dengan phloroglucinol.

Digunakan standar phloroglucinol karena merupakan salah satu monomer dari


3

phlorotannin, memiliki gugus pereduksi yang dapat dikembangkan sebagai

produk sediaan sunscreen, strukturnya mirip dengan polifenol alga, dan mudah

diperoleh dalam bentuk murni.

B. Perumusan Masalah

Permasalahan dalam penelitian ini difokuskan pada phlorotannin dalam

fraksi etil asetat yang diisolasi dari alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh

yang hidup tersebar di pantai selatan Yogyakarta. Rumusan masalah sebagai

berikut:

a. Apakah phlorotannin dapat diisolasi dari alga coklat Sargassum cymosum C.

Agardh?

b. Berapakah kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum

cymosum C. Agardh yang diukur dengan metode Folin Ciocalteau?

C. Keaslian Penelitian

Sepengetahuan peneliti belum pernah dilakukan penelitian tentang

penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum

cymosum C. Agardh dengan metode Folin Ciocalteau.

D. Manfaat

1. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi kandungan phlorotannin

hasil isolasi dari alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh.


4

2. Manfaat metodologis

Penelitian ini dapat menjadi acuan tentang penggunaan metode Folin

Ciocalteau dalam penetapan kadar phlorotannin.

3. Manfaat praktis

Memberi informasi kepada masyarakat kandungan polifenol alga coklat

Sargassum cymosum C. Agardh yang bermanfaat di bidang industri

farmasi,kosmetik, dan makanan.

E. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum :

Tujuan umum penelitian ini adalah menetapkan kadar phlorotannin alga

coklat Sargassum cymosum C. Agardh.

2. Tujuan khusus :

a. Melakukan isolasi phlorotannin berupa phlorotannin kasar pada fraksi

etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh.

b. Mengetahui kadar phlorotannin dalam alga coklat Sargassum cymosum

C. Agardh yang diukur dengan metode Folin Ciocalteau.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Alga coklat Sargassum C. Agardh

Alga coklat marga Sargassum termasuk dalam kelas Phaeophyceae

tumbuh subur di daerah tropis, pada kedalaman laut 0,5 – 10 m, suhu perairan

27,25 – 29,30ºC, salinitas 32 – 33,5%, dan intensitas cahaya matahari berkisar

6500-7500 lux (Kadi, 2007). Alga Sargassum tumbuh berumpun dengan untaian

bercabang-cabang dengan panjang thalli utama mencapai 1-3 m dan tiap

percabangan terdapat gelembung udara berbentuk bulat (Boney, 1965).

Tempat tumbuh alga Sargassum paling banyak di daerah perairan jernih

yang mempunyai substrat dasar batu karang, karang mati, batuan vulkanik dan

benda-benda yang bersifat massive yang berada di dasar perairan. Jenis alga

Sargassum yang banyak tersebar di pantai selatan Pulau Jawa di antaranya adalah

Sargassum binderi, Sargassum crassifolium, Sargassum duplicatum, Sargassum

hystrix, dan Sargassum sp. (Kadi, 2007)

Reproduksi marga Sargassum yang termasuk bangsa Fucales, marga

Sargassaceae dikenal dua cara yaitu; reproduksi asexual (vegetatif) dan sexual

(generatif). Reproduksi vegetatif dilakukan melalui fragmentasi yaitu potongan

thallus berkembang melakukan pertumbuhannya. Reproduksi generatif yaitu

perkembangan individu melalui organ jantan (antheridia) dan organ betina

(oogenia). Organ-organ tersebut terjadi dan berada dalam satu lubang yang

disebut koseptakel (Kadi, 2007).


6

Kandungan bahan kimia utama Sargassum sebagai sumber alginat yaitu

senyawa makronutrien heteropolisakarida. Kandungan makronutrien yang lain

berupa mineral yang tinggi (yodium dan kalsium), protein dan asam amino, lipid

dan asam lemak (asam linolenat, asam eikosapentoat dan asam arakidonat).

Selain itu juga terdapat kandungan mikronutrien antara lain vitamin C, vitamin E,

polifenol, dan karotenoid (Kadi, 2007).

B. Polifenol Alga (Phlorotannin)

Polifenol merupakan suatu senyawa aromatik yang mengandung

substituen gugus –OH. Diantara banyak polifenol tumbuhan, flavonoid seperti

kuersetin adalah bentuk yang paling banyak ditemukan. Akan tetapi, senyawa

fenolik seperti kuinon, lignan, xantin, kumarin, dan lain- lain masih ditemukan

dalam jumlah tertentu. Dengan penambahan struktur monomer dan dimer,

terdapat tiga bentuk penting polimer fenolik yaitu, lignin yang merupakan dinding

sel, melanin sebagai pigmen warna tanaman, dan tannin yang terdapat pada kulit

tanaman (Harborne, 1989).

Polifenol alga atau dikenal sebagai phlorotannin berasal dari unit

phloroglucinol (1,3,5-trihydroxybenzine)(Burtin, 2003). Phlorotannin terdiri dari

molekul dengan struktur dan tingkat polimerisasi yang heterogen yaitu

phloroglucinol (2%) dan oligomernya seperti eckol (trimer, 3%),

phlorofucofuroeckol A (pentamer, 28%), dieckol (hexamer, 7%), 8,8’-bieckol

(hexamer, 7%) dan lainnya (30%). Struktur dan tingkat polimerisasi yang

heterogen memungkinkan phlorotannin memiliki aktivitas biologik yang luas.


7

Kandungan phlorotannin yang paling tinggi ditemukan pada alga coklat, yaitu

antara 5-15% berat kering (Nagayama et al., 2002).

Menurut Glombitza dan Gerstberger (1985), Phlorotannin telah diisolasi

dari spesies pada beberapa genus alga coklat (Eisenia, Fucus, Cystophora,

Chorda, Cystoseria, Laminaria, Bifurcaria) dimana phlorotannin terdiri dari unit

phloroglucinol dengan berpasangan secara oksidatif C – C atau C – O (cit.,

Harborne, 1989). Grosse-Dambues et al. (1983) melaporkan adanya cincin

aromatik yang terhalogenasi dan molekul yang mengandung phloroglucinol

sampai 8 unit. Salah satu bentuk strukturnya adalah fucofuroeckol dari Eisenia

arborea (cit., Harborne, 1989). Dari alga coklat yang lain yaitu Bifurcaria

bifurcata, diisolasi sebuah difenil eter dan dikarakterisasikan sebagai paracetate.

Senyawa ini dinamakan bifuhalol yang diduga sebagai prekursor tannin

Phaeophyta.

OH

OH

HO

Gambar 1. Struktur Phloroglucinol


8

O

O

O

OH

O

HO OH

OH

Gambar 2. Struktur Fucofuroeckol

C. Soxhletasi

Soxhletasi merupakan salah satu metode ekstraksi kontinyu yang sering

digunakan jika perbandingan distribusi relatif kecil sehingga untuk pemisahan

yang kuantitatif diperlukan beberapa tahap ekstraksi. Efisiensi pada ekstraksi

jenis ini tergantung pada viskositas fase organik (Khopkar, 1990).

Penyarian berkesinambungan menggunakan alat soxhlet merupakan

penyarian yang menghasilkan ekstrak cair dan dilanjutkan dengan proses

penguapan. Cairan penyari dipanaskan hingga mendidih, kemudian uap penyari

akan naik ke atas kemudian akan mengembun karena didinginkan oleh pendingin

balik. Embun akan turun melalui serbuk simplisia sambil melarutkan kandungan

serbuk simplisia (Anonim, 1986). Pada soxhletasi larutan berkumpul di dalam

wadah gelas dan setelah mencapai tinggi maksimal secara otomatis ditarik ke

dalam labu, dengan demikian zat yang terekstraksi tertimbun melalui penguapan

kontinyu dari bahan pelarut murni (Voigt, 1994).

Metode soxhletasi lebih menguntungkan karena uap panas tidak melalui

serbuk simplisia tetapi melalui pipa samping, cairan penyari yang dibutuhkan


9

lebih sedikit, dan penyarian dapat langsung diteruskan tanpa menambah volume

cairan penyari (Anomim, 1986).

D. Spektrofotometri

Spektrofotometri adalah metode analisis yang mengamati interaksi radiasi

elektromagnetik dengan materi. Spektrofotometri memiliki ciri-ciri, yaitu dapat

digunakan pada sistem organik dan anorganik, memiliki selektivitas sedang

sampai tinggi, akurasinya baik, dan mudah dilakukan (Skoog et al., 1998).

Spektrofotometer adalah suatu instrumen yang digunakan untuk mengukur

transmitan atau serapan suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang,

pengukuran terhadap sederetan sampel pada suatu panjang gelombang tunggal

dapat pula dilakukan (Day dan Underwood, 2002). Sastrohamidjojo (1991)

menyatakan komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi: (1)

sumber tenaga radiasi yang stabil, (2) sistem yang terdiri atas lensa- lensa, cermin,

celah-celah, dan lain- lain, (3) monokromator untuk mengubah radiasi menjadi

komponen-komponen panjang gelombang tunggal, (4) tempat cuplikan yang

transparan, dan (5) detektor radiasi yang dihubungkan dengan sistem meter atau

pencatat.

Gambar 3. Diagram sederhana spektrofotometer (Sastrohamidjojo, 1991)

sumber monokro-mator

sel penyerap

detektor meter atau

pencatat


10

Spektrofotometri visibel adalah bagian dari analisis spektroskopik yang

menggunakan sumber radiasi elektromagnetik sinar tampak (380-780 nm) dengan

instrumen spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995).

Spektrofotometri dapat digunakan untuk analisis kuantitatif, oleh karena

banyaknya cahaya yang diserap di frekuensi atau panjang gelombang tertentu

sesuai transisi elektron yang terjadi, sehingga akan menentukan intensitas serapan

(Willard et al., 1988).

Absorbsi radiasi visibel oleh kompleks logam disebabkan satu atau lebih

transisi berikut, yaitu eksitasi ion logam, eksitasi ligan, atau transisi charge

transfer. Eksitasi ion logam dalam kompleks biasanya memiliki daya serap molar

yang kecil (e), 1-100 dan ini tidak berguna dalam analisis kuantitatif (Christian,

2004), akan tetapi transisi kompleks logam menunjukkan serapan yang sangat

intens (e = 103-105) dalam visibel (Ohannesian dan Streeter, 2002).

Kompleks charge transfer terdiri dari gugus elektron donor yang berikatan

dengan elektron aseptor. Ketika mengabsorpsi radiasi, elektron dari donor

berpindah ke orbital aseptor (Skoog et.al., 1993).

Pada absorbsi senyawa anorganik, terjadi transisi antara orbital d yang

terisi dengan tak terisi dengan energi yang bergantung dari ikatan ligan ke ion

pusat (Skoog et.al., 1993). Pada kompleks ion logam dan ligan terjadi transisi

orbital elektron d dari ion logam ke orbital p* dari ligan atau dari orbital elektron

p ligan ke orbital d dari ion logam (Ohannesian dan Streeter, 2002).


11

Intensitas suatu serapan dapat dinyatakan sebagai transmitans (T) yang

didefinisikan sebagai berikut :

....1

Rumusan yang lebih tepat untuk intensitas serapan diturunkan dari hukum

Lambert-Beer. Hukum ini menyatakan hubungan antara serapan dengan tebalnya

cuplikan dan konsentrasi bahan penyerap.

Hubungan tersebut dinyatakan sebagai berikut :

....2

Keterangan :

T = persen transmitan Io = intensitas radiasi yang datang I = intensitas radiasi yang diteruskan e = daya serap molar (L.mol-1.cm-1) c = konsentrasi larutan (mol.L-1) b = panjang sel (cm) A = serapan (Silverstein et al., 1991)

E. Kolorimetri

Kolorimetri adalah suatu teknik pengukuran cahaya yang diabsorbsi oleh

zat berwarna, baik yang terbentuk dari asalnya maupun yang bereaksi dengan zat

lain (Khopkar, 1990). Metode kolorimetri didasarkan pada gugus amin aromatik,

amin alifatik, atau gugus yang bereaksi membentuk kompleks serta memiliki

rantai panjang. Metode ini lebih banyak digunakan karena lebih sederhana dan

lebih sensitif. Yang ditentukan pada kolorimetri adalah serapan cahaya oleh

A = IIo

log = e b c

T = IoI


12

larutan yang berwarna. Kadar larutan dibuat dengan konsentrasi menaik dan

membandingkan dengan senyawa yang dianalisis. Kolorimetri juga mencakup

pengubahan senyawa tidak berwarna menjadi berwarna dan penentuan

fotometrinya dilakukan dalam daerah sinar tampak (Roth dan Blaschke, 1994).

Kriteria analisis kolorimetri yang baik adalah :

a. menghasilkan reaksi warna yang khusus dan intensif

Untuk mendapatkan hasil yang akurat maka warna yang dihasilkan harus sama

dan waktu untuk mencapai warna yang maksimal harus cukup lama.

b. keterulangan

Kolorimetri harus memberikan hasil reprodusibel pada kondisi spesifik.

c. kejernihan larutan

larutan harus bebas dari pengotor jika pembanding yang dibuat dengan

standar. Kekeruhan akan menyerap cahaya.

d. kepekaan yang tinggi

hal ini baik bila waktunya sudah ditentukan, maka reaksi warnanya memiliki

kepekaan yang tinggi. Hal ini juga akan menarik bila hasil reaksi menyerap

secara kuat dalam visibel daripada dalam UV (Vogel,1978)

F. Metode Folin Ciocalteau

Menurut Van Alstyne (1995), total senyawa fenolik dapat ditentukan

dengan metode Folin Ciocalteau yang dimodifikasi (cit., Hammerstrom, Dethier,

dan Duggins, 1998) dan diband ingkan dengan standar phloroglucinol. Metode

Folin Ciocalteau direkomendasikan karena lebih memberikan warna pada sampel


13

dan sedikit kecenderungan untuk berinterferensi dengan komponen non-fenolik

daripada metode yang lain (Waterman dan Mole, 1994).

Reagen Folin Ciocalteau merupakan larutan kompleks ion polimerik dari

asam fosfomolibdat dan asam heteropolifosfotungstat (Jansoon, 2005). Reagen

ini dibuat dengan mencampur sodium tungstat dan asam fosfomolibdat dalam

asam fosfat, dididihkan selama 2 jam, kemudian didinginkan, dipekatkan, dan

disaring. Modifikasi dari metode ini terdiri dari penambahan lithium sulfat dan

bromin ke dalam reagen fosfotungstat–fosfomolibdat pada akhir fase pendidihan,

dilanjutkan dengan pendinginan dan pemekatan. Penambahan lithium mencegah

pembentukan endapan yang dapat berinterferensi dengan pembentukan intensitas

warna (Folin dan Ciocalteau, 1944).

Reaksi ini berdasar pada reduksi campuran dari reagen fosfotungstat

(WO4-) – fosfomolibdat (MoO4

2-) oleh gugus hidroksil fenolik (Box, 1983).

Reagen Folin Ciocalteau merupakan rangkaian polimerik yang memiliki bentukan

umum dengan pusat unit tetrahedral fosfat (PO43-) yang dikelilingi beberapa unit

oktahedral asam-oksi molibdenum. Sehingga kompleks oktahedral yang

terbentuk merupakan kompleks MoO3-fosfat dengan fosfor (P) sebagai pusatnya.

Molibdat pada kompleks tersebut dapat disubstitusi oleh tungsten (W). Reaksi

tersebut menghasilkan warna biru ungu yang dapat diukur absorbansinya dengan

spektrofotometer (Jansoon, 2005).


14

G. Keterangan empiris

Tumbuhan alga mengandung phlorotannin yang merupakan senyawa

polifenol yang hanya ditemukan pada tumbuhan alga khususnya spesies alga

coklat.

Phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C.

Agardh merupakan phlorotannin dengan polimer intermediet yang memiliki

aktifitas mengabsorbsi radiasi sinar ultraviolet secara maksimum sehingga dapat

dikembangkan menjadi produk sediaan sunscreen.

Crude phlorotannin dapat diperoleh dengan mengekstraksi tanaman

menggunakan metode soxhletasi dengan penyari metanol. Dipilih metode

soxhletasi untuk efisiensi penyari dan phlorotannin masih dapat dipertahankan

hingga suhu 170°C dilihat dari sifat fisika-kimia monomernya yaitu

phloroglucinol. Ekstrak kental kemudian difraksinasi dengan kloroform, akuades,

dan etil asetat sehingga didapatkan fraksi etil asetat alga coklat. Digunakan

penyari metanol, dimana dari hasil orientasi diperoleh rendemen lebih banyak

dibandingkan dengan penyari etanol.

Dalam pengukuran kadar digunakan metode kolorimetri dengan pereaksi

Folin Ciocalteau sebagai senyawa pengkompleks membentuk senyawa berwarna

biru yang dapat diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer visibel.

Metode ini digunakan karena merupakan metode pilihan untuk mengestimasi

kandungan fenol total dalam tanaman. Metode Folin Ciocalteau berdasar atas

kemampuan mereduksi gugus hidroksil pada fenol sehingga tidak spesifik namun


15

sangat sensitif untuk mendeteksi semua kandungan senyawa polifenol dalam

fraksi etil asetat alga coklat. Keuntungan metode Folin Ciocalteau adalah

prosedurnya sederhana dan praktis karena hanya menggunakan satu jenis

pereaksi.

Kadar phlorotannin yang terukur adalah kadar phlorotannin ekivalen

dengan phloroglucinol (mg PGE/ g fraksi). Digunakan standar phloroglucinol

karena merupakan monomer dari phlorotannin. Phloroglucinol memiliki gugus

pereduksi yang dapat dikembangkan sebagai produk sediaan sunscreen,

strukturnya sederhana, mirip dengan struktur polifenol alga dan mudah diperoleh

dalam bentuk murni.


16

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk dalam penelitian non-eksperimental karena tidak

ada intervensi atau perlakuan terhadap fenomena yang diamati.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian

a. Variabel penelitian ini adalah kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat

alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh.

b. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah volume cairan

penyari untuk mengisolasi phlorotannin alga coklat Sargassum cymosum

C. Agardh, tempat panen alga coklat di pantai Drini, waktu panen pada

bulan Maret, komposisi reagen saat analisis.

c. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah umur alga

coklat yang dipanen, suhu dan kelembaban ruangan saat percobaan.

2. Definisi Operasional

a. Simplisia alga coklat merupakan alga coklat Sargassum cymosum C.

Agardh yang diambil dari Pantai Drini, Gunung Kidul, Yogyakarta dengan

ciri thallus alga pendek berwarna coklat, daun panjang, dan bentuk

kantung udara bergerigi .


17

b. Ekstrak metanol alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh adalah hasil

ekstraksi serbuk simplisia alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh

dengan metode soxhletasi menggunakan pelarut metanol sampai jernih

selama 56 jam.

c. Fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh adalah fraksi

yang diperoleh dengan cara fraksinasi dengan pelarut etil asetat dari

ekstrak metanol simplisia alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh.

d. Kadar phlorotannin adalah jumlah polifenol total yang terhitung ekivalen

dengan phloroglucinol dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum

cymosum C. Agardh (mg PGE/g fraksi) yang ditetapkan secara

spektrofotometri dengan metode kolorimetri Folin Ciocalteau.

C. Bahan atau Materi Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut:

1. simplisia alga coklat (Sargassum cymosum C. Agardh) dari pantai Drini,

Gunung Kidul, Yogyakarta

2. metanol p.a (pro analisis) (Merck, Germany)

3. kloroform p.a. (Merck, Germany)

4. etil asetat p.a. (Merck, Germany)

5. aseton (Merck, Germany)

6. phloroglucinol (Merck, Germany)

7. Na-Karbonat (Merck, Germany)

8. reagen Folin Ciocalteau ( Sigma Chem, Co., USA.)


18

9. akuades (Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma)

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut:

1. seperangkat spektrofotometer UV-VIS Perkin Elmer Lambda 20

2. timbangan elektrik BP 160 dan scaltec SBC 22 readability 0,01 mg

3. seperangkat alat titrasi Karl Fischer Mettler DL-18

3. vaccum rotary evaporator (Buchi)

4. waterbath (Abo-tech)

5. mikropipet 0,5-10 _l, 100-1000 _l. (Acura 825, Socorex)

6. tabung reaksi bertutup (Scott-Germany)

7. alat-alat untuk soxhletasi, yaitu soxhlet, kertas filter Schleicher & Schuell, labu

alas bulat (Schott Duran,

Germany), heating mantle

8. alat sentrifus, homogenizer (Vortex Genie)

9. corong pisah 500 mL

10. alat-alat gelas yang lazim digunakan untuk penelitian di laboratorium analisis

(PYREX-GERMANY)

E. Tata Cara Penelitian

1. Preparasi sampel alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh.

Simplisia alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh yang diperoleh dari

petani dikumpulkan dan dicuci dengan air mengalir, kemudian diuapi dengan air


19

mendidih. Selanjutnya dikeringkan dengan oven pada suhu 90º C dan diserbuk.

Penetapan kadar air serbuk alga dilakukan dengan menggunakan metode Karl

Fischer. Serbuk alga ditimbang 0,2 gram, kemudian tambahkan 10 mL metanol,

didiamkan selama 1 hari pada suhu kamar. Dilakukan pre-titrasi pada alat, lalu

dilakukan uji kebocoran alat, hingga didapat angka drift 10-50 pada alat.

Dilakukan standardisasi dengan cara menimbang spuit berisi air dan dimasukkan

1 tetes air ke dalam alat. Kemudian ditimbang kembali untuk menentukan berat

air yang dimasukkan. Dihitung kesetaraan air. Dimasukkan 1 mL metano l dan

dititrasi dengan alat (blanko). Kemudian 1 mL sampel dimasukkan, dititrasi

dengan alat, dihitung kadar air dalam sampel dengan menggunakan rumus :

Kadar Air =ditimbang yangberat

blanko(10)x −x 100%

x = angka yang muncul pada alat(%) x 10.000 mg atau berat konversi.

2. Uji kualitatif senyawa fenolik

a. Preparasi eksktrak

Tiga puluh mL metanol 80 % ditambahkan pada 10 g serbuk alga. Lalu

diletakkan ke dalam wadah dan dipanaskan pada waterbath selama ± 1 jam.

Dinginkan pada suhu ruang. Kemudian disaring menggunakan corong Buchner

yang sesuai. Ditambahkan 5 mL metanol 80 % lagi dan disaring.

b. Uji polifenol dan tannin

Sejumlah volume yang setara dengan 10 g ekstrak metanol 80 % yang

telah disiapkan sebelumnya pada langkah preparasi ekstrak, diuapkan


20

menggunakan waterbath. Ditambahkan 25 mL akuades panas, dicampur secara

merata. Dibiarkan hingga dingin pada suhu kamar. Ditambahkan 3-4 tetes larutan

NaCl 10 %. Kemudian ekstrak disaring dengan menggunakan vacuum. Filtrat

dibagi ke dalam 4 tabung masing-masing 3 mL. Pada tabung I ditambahkan 4-5

tetes larutan gelatin 1 %. Pada tabung II ditambahkan 4-5 tetes pereaksi garam

gelatin (gelatin 1% ditambahkan NaCl 10 %). Pada tabung III ditambahkan 3-4

tetes ferri klorida. Tabung IV dijadikan kontrol dan tidak ditambahkan pereaksi

apapun. Diamati warna yang terbentuk pada setiap tabung.

3. Isolasi crude phlorotannin

Serbuk alga ditimbang sebanyak 80 g. Kemudian serbuk dimasukkan ke

dalam kertas filter Schleicher & Schuell dan dimasukkan dalam labu soxhlet.

Setelah itu diberi pelarut metanol sebanyak 2 kali sirkulasi. Proses soxhletasi

dilakukan sampai tetesan pelarut jernih dengan suhu ± 120º C. Hasil soxhletasi

diuapkan pelarutnya dengan menggunakan vacuum rotary evaporator sampai

volume yang kecil (1/10 dari volume mula-mula). Selanjutnya ditambahkan 60

mL metanol, 120 mL kloroform, dan 45 mL air kemudian digojog dan didiamkan

hingga membentuk dua lapisan. Dipisahkan antara lapisan atas dan lapisan

bawah, selanjutnya lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat dua kali masing-

masing 75 mL. Fraksi etil asetat dikumpulkan, selanjutnya diuapkan, dan

diperoleh ekstrak yang merupakan crude phlorotannin.


21

4. Optimasi metode kolorimetri dengan Folin Ciocalteau

a. Pembuatan larutan standar

Standar (phloroglucinol) ditimbang seksama lebih kurang 0,05 g, kemudian

dilarutkan dalam aseton 75% sampai volume 50,0 mL. Seri konsentrasi larutan

intermediet dipipet dari larutan induk sebanyak 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4;0; 5,0; dan 6,0

mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL dilarutkan dengan aseton 75%,

sehingga konsentrasinya menjadi 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4;0; 5,0; dan 6,0 ppm.

b. Penentuan operating time (OT)

Larutan intermediet 4,0 ppm dipipet sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke

dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin

Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades (1:1). Campuran didiamkan

selama 2 menit lalu ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dan ditambah akuades

sampai volume 50,0 mL. Absorbansi diukur setiap 2 menit pada panjang

gelombang teoritis phloroglucinol (750 nm) selama 90 menit.

c. Penentuan panjang gelombang maksimum (? maks)

Larutan intermediet phloroglucinol dengan konsentrasi 1,0; 3,0; dan 6,0

ppm dipipet sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang

mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin Ciocalteau yang telah diencerkan

dengan akuades (1:1). Campuran didiamkan selama 2 menit, lalu ditambah 7,5

mL Na2CO3 1,9 M, dan akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran diinkubasi

pada suhu ruang selama OT. Pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua,


22

campuran divortex selama 30 detik, kemudian campuran hasil reaksi disentrifus

dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Supernatan diukur serapannya pada

operating time pada rentang panjang gelombang 400 – 900 nm. Panjang

gelombang maksimum ditentukan dari spektrogram yang didapatkan.

5. Penetapan kurva baku phloroglucinol

Larutan intermediet dipipet masing-masing sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan

ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi fenol Folin-

Ciocalteau yang diencerkan (1:1), biarkan selama 2 menit. Selanjutnya ditambahkan

7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan dicampur dengan akuades sampai 50,0 mL. Campuran

divortex setiap 15 menit, selama 30 detik, sebanyak 2 kali vortex. Kemudian

disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 4000 rpm dan diambil supernatannya.

Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum hasil scanning (750,1

nm). Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali. Dihitung data yang didapat dengan

program regresi linier sehingga didapatkan persamaan kurva baku.

6. Estimasi kadar polifenol total pada sampel fraksi etil asetat alga coklat

Sargassum cymosum C. Agardh

Lebih kurang 0,05 g fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C.

Agardh ditimbang dengan seksama, kemudian dilarutkan dalam aseton 75%

hingga volumenya 50,0 mL. Diambil 10,0 mL larutan sampel alga coklat dan

dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi

fenol Folin Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Campuran

didiamkan selama 2 menit kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan


23

akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran tersebut diinkubasi pada temperatur

ruang selama OT untuk menyempurnakan reaksi sampai terbentuk warna biru

(pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua, campuran tersebut divortex selama

30 detik). Kemudian, campuran reaksi disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm

selama 5 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum

menggunakan spektrofotometer visibel. Absorbansi dimasukkan ke persamaan

kurva baku. Konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen dengan phloroglucinol

(mg PGE / g fraksi).


24

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Preparasi Sampel Alga Coklat Sargassum cymosum C. Agardh

Pengambilan simplisia dilakukan di Pantai Drini, Gunung Kidul,

Yogyakarta. Simplisia alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh diperoleh dari

petani alga pada tanggal 23 Maret 2007 pada pukul 16.00 – 17.00 WIB. Menurut

petani, saat pengambilan simplisia temperatur air sekitar 27º-30º C, cuaca

mendung dan gerimis. Hal tersebut perlu diketahui sebab menurut Yates dan

Peckol (1993) parameter lingkungan seperti salinitas, ketersediaan nutrisi dan

cahaya, irradiasi UV, dan intensitas herbivora dapat mempengaruhi kadar

phlorotannin (cit., Koivikko, 2005).

Selanjutnya simplisia alga coklat yang didapat diidentifikasi dengan

bantuan dari Laboratorium Sistematika Tumbuhan (Fakultas Biologi UGM,

Yogyakarta). Dengan kesimpulan bahwa simplisia alga coklat termasuk dalam

ordo Fucales, familia Sargassaceae, genus Sargassum, spesies Sargassum

cymosum C. Agardh. (lihat lampiran 1).

Simplisia Alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh dicuci dengan air

mengalir untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang berupa epifit, pasir

(silikat), dan benda-benda asing yang ikut terbawa saat proses pengambilan

simplisia. Pengotor-pengotor harus dihilangkan sebab dapat mengganggu hasil

analisis. Senyawa silikat dapat membentuk kompleks molibdat yang berupa

H6[SiMo12O40].n H2O dari reagen Folin Ciocalteau dalam suasana asam sehingga


25

bila tidak dihilangkan akan mengganggu dalam analisis sampel (Auterhoff dan

Knabe, 1978).

Alga coklat Sargassum tumbuh dalam habitat laut yang terdiri dari

bermacam-macam species alga. Maka perlu dilakukan sortasi untuk memisahkan

spesies alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh dari species alga coklat

Sargassum yang lain. Pemisahan dilakukan dengan melihat ciri-ciri fisik dari alga

coklat Sargassum cymocum C. Agardh yaitu thallus pendek berwarna coklat, daun

panjang dan bentuk kantung udara yang bergerigi. Sortasi dilanjutkan dengan

membuang bagian akar dengan bantuan pisau atau gunting. Hal ini untuk

menghilangkan materi asing berupa karang yang masih melekat pada akar

tumbuhan alga. Saat sortasi juga ditemukan senyawa kalsium berupa butiran

kapur berwarna putih yang merupakan hasil kalsifikasi tumbuhan alga. Akan

tetapi Ca bukanlah reduktor sehingga tidak dapat mereduksi reagen Folin

Ciocalteau, dan kalsium disini tidak akan mengganggu proses analisis.

Setelah simplisia yang dikumpulkan benar-benar merupakan alga coklat

Sargassum cymosum C. Agardh, maka selanjutnya simplisia diproses dalam

autoklaf pada suhu 100º C selama 30 menit untuk menginaktivasi enzim

polimerase yaitu Polyphenol Oxydase (PPO). Menurut Mustapha dan Ghalem

(2007), enzim PPO dapat menjadi inaktif dengan direbus dalam air panas pada

100º C selama 1,5 menit.

Enzim PPO mengkatalisis hidroksilasi monofenol menjadi o-difenol, yang

selanjutnya dapat mengkatalisis oksidasi o-difenol menjadi o-kuinon. Polimerasi

o-kuinon menghasilkan pigmen berupa senyawa polifenol. Jika enzim PPO


26

inaktif maka proses polimerasi fenol akan terhenti dan tidak akan terbentuk

polimer polifenol yang lebih panjang. Proses oksidasi fenol oleh enzim PPO

dapat digambarkan sebagai berikut:

HOHO

O

O

o-quinone

HO

O O

Enzim PPO Enzim PPO

Gambar 4. Proses oksidasi fenol oleh enzim polifenol oksidase (PPO)

Setelah proses inaktivasi dengan menggunakan autoklaf, simplisia

kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 90º C agar benar-benar kering

sehingga mudah dihancurkan menjadi serbuk dengan menggunakan blender.

Tujuan penyerbukan disini adalah untuk memperluas bidang permukaan butiran

serbuk dan dengan demikian bidang kontak serbuk dengan cairan pengekstraksi

dapat ditingkatkan. Semakin kecil ukuran serbuk maka akan semakin optimal

proses ekstraksi karena banyak terjadi sel-sel yang rusak, yang kandungannya

dapat diambil langsung oleh cairan pengekstrak. Akan tetapi serbuk yang sangat

halus juga tidak menguntungkan, sebab cairan pengekstraksi akan sulit dipisahkan

dengan penyaringan dari sisa yang tertinggal setelah proses ekstraksi selesai.

Maka setelah diblender, serbuk diayak agar memiliki derajad halus 20/30. Proses

ini dilakukan supaya pembasahan serbuk dapat baik sehingga penyarian dapat

berjalan dengan optimal.

Selanjutnya serbuk di tetapkan kadar airnya dengan metode Karl Fischer.

Kadar air harus di kontrol di bawah 10% sebagaimana disebutkan dalam Materia


27

Medika Indonesia (MMI) untuk simplisia tanaman pada umumnya. Hal ini karena

kandungan air memungkinkan terjadinya kontaminasi mikrobial. Selain itu reaksi

hidrolitik oleh air dapat pula mengakibatkan cepatnya perusakan bahan aktif.

Prinsip penetapan kadar air dengan metode Karl Fischer adalah reaksi kuantitatif

antara larutan anhidrat belerang dioksida dengan iodium dengan adanya dapar

yang bereaksi dengan ion hidrogen. Reaksi ini merupakan reaksi redoks dimana

iod akan mereduksi garam dioksida dan iod sendiri mengalami oksidasi.

Kelebihan metode Karl Fischer adalah spesifik mengukur kadar air dalam sampel,

jumlah sampel yang digunakan untuk analisis relatif sedikit, dan hasilnya akurat.

H2O I2 SO22HI SO3+ + + (3)

SO2 I2

NO2S O

H2O

CH3OH

N NHI

N

H SO4CH3

NO2S O

+ + + 3 2 +

+

Gambar 5. Reaksi penetapan kadar air dengan Karl Fischer (Evans, 2002)

Kadar air yang terukur dari serbuk alga dengan 3 kali replikasi sebesar

3,7%; 3,5%; dan 2,7%. Sehingga hasil penetapan kadar airnya adalah 3,3 ± 0,5 %

dan memenuhi syarat untuk simplisia kering menurut MMI.


28

B. Uji Kualitatif Senyawa Fenolik

Salah satu kandungan mikronutrien dari tumbuhan alga coklat adalah

polifenol yang dikenal sebagai phlorotannin yang berbeda dari polifenol pada

tumbuhan terestrial (Burtin, 2003)

Tujuan dilakukannya uji polifenol adalah untuk memperkuat bukti adanya

kandungan polifenol dalam alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh. Adanya

polifenol ditunjukkan dengan warna hijau-biru yang terjadi pada filtrat alga

setelah ditetesi pereaksi FeCl3.

Hasil pengamatan sampel serbuk alga coklat Sargassum cymosum C.

Agardh menunjukkan hasil positif mengandung senyawa polifenol. Sebelum

penambahan FeCl3 filtrat ekstrak alga coklat berwarna kuning pucat. Warna biru

yang terjadi setelah penambahan FeCl3 dikarenakan terbentuknya kompleks ion

Fe3+ dengan gugus-gugus fenol. Hasil uji polifenol ditunjukkan pada tabel I

berikut:

Tabel I. Hasil uji kandungan senyawa polifenol serbuk alga Sargassum cymosum C.

Agardh

Warna sebelum reaksi Warna sesudah reaksi Kuning pucat biru gelap di bagian tengah (+)


29

HO OH

OH

FeCl3Fe3+

HO

OHO

O

OHO

OHHO

3 ++ 3HCl

OH

phloroglucinol kompleks berwarna biru-ungu

Gambar 6. Reaksi pembentukan kompleks gugus fenolik dan FeCl3

Adanya senyawa fenol berupa tannin juga ditunjukkan dengan

terbentuknya endapan setelah penambahan gelatin maupun setelah penambahan

gelatin dan NaCl. Penambahan NaCl dapat meningkatkan kepekaan reaksi

sehingga akan dihasilkan endapan dalam jumlah lebih banyak dibandingkan

dengan penambahan gelatin saja. Endapan terjadi karena kemampuan tannin

menyamak kulit. Selain itu tanin memiliki afinitas yang kuat terhadap gelatin

sehingga gelatin mengalami presipitasi. Ikatan yang terjadi antara tannin dan

gelatin merupakan ikatan hidrogen dan terdapat interaksi hidrofobik sehingga

endapan yang terbentuk bersifat reversible.

C. Isolasi Crude Phlorotannin

Serbuk alga ditimbang lebih kurang 80 g kemudian diekstraksi dengan

metode soxhletasi dengan cairan penyari metanol. Dipilih metode soxhletasi

untuk efisiensi penyari dan phlorotannin masih dapat dipertahankan hingga suhu

170°C dilihat dari sifat fisika-kimia monomernya yaitu phloroglucinol. Metanol


30

digunakan untuk menarik senyawa-senyawa yang bersifat polar. Metanol

memiliki gugus hidroksil sehingga mampu membentuk ikatan hidrogen

intramolekular dengan gugus hidroksil pada senyawa fenolik sehingga polifenol

cenderung larut dalam metanol. Ekstraksi dihentikan sampai cairan penyari

benar-benar jernih untuk memastikan semua senyawa polar telah larut dalam

metanol. Akan tetapi hal tersebut tidak menjamin bahwa seluruh kandungan

phlorotannin telah larut dalam metanol dengan sempurna. Untuk itu sebenarnya

perlu dilakukan optimasi terhadap lama waktu soxhletasi. Namun dalam

penelitian ini hal tersebut tidak dilakukan dan soxhletasi berlangsung selama 56

jam. Kemudian hasil soxhletasi diuapkan pelarutnya menggunakan vacuum

rotary evaporator agar diperoleh ekstrak kental.

Selanjutnya dilakukan fraksinasi terhadap ekstrak metanol kental dengan

menggunakan pelarut kloroform dan air sehingga terjadi pemisahan menjadi 2

lapisan. Hal ini dikarenakan adanya perbedaan berat molekul (BM) dimana fraksi

metanol-air lebih ringan daripada fraksi kloroform. Kloroform merupakan pelarut

yang cenderung non polar dibanding dengan metanol-air, sehingga memiliki

kecenderungan menarik kandungan non polar seperti lipid (Padda, 2006).

Sedangkan metanol-air cenderung menarik kandungan polar karena sifatnya yang

lebih polar dibandingkan kloroform.

Lapisan bawah (fraksi kloroform) dibuang dan lapisan atas (fraksi

metanol-air) difraksinasi kembali dengan etil asetat sebanyak 2 kali. Fraksinasi

dilakukan secara berulang dengan jumlah pelarut sedikit dimaksudkan untuk

mengefektifkan permurnian artinya senyawa yang diinginkan akan didapatkan


31

dalam jumlah yang lebih banyak. Fraksi etil asetat dikumpulkan dan diuapkan

pelarutnya untuk selanjutnya ditetapkan kadarnya secara kolorimetri dengan

reagen Folin Ciocalteau.

D. Optimasi Metode Kolorimetri dengan Reagen Folin Ciocalteau

1. Pembuatan larutan standar phloroglucinol

Standar yang digunakan adalah phloroglucinol yang merupakan

monomer dari phlorotannin. Standar phloroglucinol dilarutkan dalam aseton 75

%. Tidak digunakan pelarut metanol karena masih memiliki gugus hidroksil yang

dapat mereduksi kompleks asam dalam reagen Folin Ciocalteau sehingga

meningkatkan resiko kesalahan saat pembacaan absorbansi. Untuk itu diganti

menggunakan pelarut aseton 75% untuk menghilangkan intervensi absorbansi

warna dari pelarut metanol. Selanjutnya larutan direaksikan dengan reagen Folin

Ciocalteau, dibiarkan selama 2 menit, lalu ditambahkan Na2CO3 1,9 M untuk

memberikan suasana basa. Setelah penambahan basa larutan menjadi berwarna

biru. Kemudian campuran divortex agar homogen dan disentrifus dengan

kecepatan 4000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan senyawa-senyawa yang

tidak larut dalam aseton maupun air. Supernatan yang berupa larutan jernih hasil

sentrifugasi berwarna biru sedangkan endapan berwarna putih. Supernatan

tersebut yang kemudian dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer

visibel.


32

2. Penentuan operating time (OT)

Operating time merupakan tahap pertama yang harus dilakukan dalam

optimasi metode kolorimetri. Penentuan OT bertujuan untuk mengetahui waktu

pengukuran dimana pada rentang waktu tersebut senyawa memberikan serapan

yang stabil. Hal itu berarti semua senyawa fenolat telah mereduksi reagen Folin

Ciocalteau dengan sempurna.

Pada penelitian ini pengukuran OT dilakukan setelah penambahan Na2CO3

atau sejak terbentuknya warna. Pengukuran operating time kompleks

molybdenum blue dihasilkan dari larutan baku phloroglucinol dengan konsentrasi

4,0 ppm dilakukan pada panjang gelombang teoritis yaitu 750 nm. Hasil

penetapan operating time berupa kurva hubungan serapan vs waktu menunjukkan

serapan stabil pada menit ke 50 hingga menit ke 90 dengan absorbansi 0,454.

Pengukuran serapan untuk kurva baku dan sampel dilakukan menit ke-60 agar

semua pengukuran dilakukan pada rentang waktu operasi yang sama sehingga

semua mendapat perlakuan yang sama. Berikut ini adalah hasil pengukuran

operating time yang disajikan dalam bentuk kurva waktu vs serapan :


33

abso

rban

si

0,100

0,200

0,600

0,400

0,300

0,500

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00

Waktu (menit)

Gambar 7. Kurva waktu vs serapan hasil penetapan operating time

3. Penentuan panjang gelombang maksimum

Panjang gelombang maksimum adalah panjang gelombang saat suatu

senyawa memberikan serapan yang maksimum. Penentuan panjang gelombang

maksimum merupakan syarat dalam analisis kuantitatif secara spektrofotometri,

karena serapan senyawa yang diukur pada panjang gelombang maksimum akan

memberikan sensitifitas serapan yang maksimum dan kesalahan pembacaan

serapan yang minimum (Fatah, 1989). Pada panjang gelombang maksimum

perubahan serapan untuk setiap satuan konsentrasi paling besar sehingga

diperoleh kepekaan analisis maksimum, selain itu juga pita serapan di sekitar

panjang gelombang datar, sehingga kesalahan yang terjadi relatif kecil pada

pengulangan. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada tiga

kadar yang berbeda larutan baku phloroglucinol, yaitu 0,1; 0,3; dan 0,6 ppm. Hal

ini dilakukan agar didapat hasil yang meyakinkan bahwa pada panjang gelombang

tersebut memang terjadi serapan yang maksimum. Warna kompleks molybdenum


34

blue berada di daerah panjang gelombang cahaya tampak, sehingga pengukuran

panjang gelombang maksimum dilakukan dalam rentang 400 nm sampai 900 nm

karena daerah cahaya tampak terletak antara 380 nm sampai 780 nm. Berikut

hasil pengukuran panjang gelombang serapan maksimum:

λ (wavelength)

a b s o r b a n c e u n i t ( a u )

0,100 0,200

0,300

0,400 0,500

0,700

0,600

0,800

Gambar 8. Hasil pembacaan ?maks phloroglucinol 3 macam kadar phloroglucinol (A = 6,0 ppm; B = 3,0 ppm; C = 1,0 ppm setelah direaksikan dengan Folin

Ciocalteau

Hasil pengukuran ketiga konsentrasi baku, diperoleh spektrum serapan

yang menunjukkan panjang gelombang maksimum yang berbeda, yaitu pada

kadar 0,1; 0,3; dan 0,6 ppm berturut-turut diperoleh panjang gelombang

maksimum 758,7; 750,1; dan 743,4 nm. Panjang gelombang maksimum yang

diperoleh cenderung bergeser ke panjang gelombang yang lebih kecil setara

dengan semakin meningkatnya konsentrasi larutan baku phloroglucinol. Hal ini

mungkin dikarenakan adanya ionisasi fenolik menjadi ion fenolat yang dapat

mengabsorbsi cahaya pada tingkat energi lebih kecil sehingga panjang gelombang

menjadi lebih besar. Akan tetapi pada pembacaan absorbansi standar

A B C


35

phloroglucinol pada ketiga panjang gelombang tersebut diperoleh hasil

pembacaan absorbansi yang tidak berbeda jauh. Perbedaan panjang gelombang

maksimum ini dapat juga dikarenakan tidak terkontrolnya pH larutan sehingga

terjadi dua bentuk reduksi dari reagen Folin Ciocalteau. Senyawa kompleks

molybdenum blue yang terukur bukan merupakan satu bentuk senyawa namun

berupa campuran dari dua bentuk senyawa molydenum blue dengan rumus

struktur yang berbeda.

Menurut penelitian Zhang et al. (2006) tentang estimasi kandungan

polifenol total berdasarkan reaksi Folin Ciocalteau, panjang gelombang

maksimum untuk sampel A. nodosum dan standar phloroglucinol adalah 750 nm.

Sehingga dipilih panjang gelombang 750,1 nm untuk pengukuran sampel dan

baku karena mendekati panjang gelombang teoritis.

E. Penetapan Kurva Baku Phloroglucinol

Pembuatan kurva baku bertujuan mendapatkan persamaan garis regresi

linier yang digunakan menghitung kadar phlorotannin dalam sampel. Pembuatan

kurva baku digunakan 6 seri larutan phloroglucinol dengan konsentrasi yang

berbeda yakni 0,1024; 0,2048; 0,3071; 0,4095; 0,5119; dan 0,6143 mg/100mL.

Kemudian, seri kadar larutan baku phloroglucinol diukur serapannya pada

panjang gelombang maksimum 750,1 nm dan selanjutnya dibuat kurva hubungan

antara kadar dengan serapan. Replikasi kurva baku dilakukan tiga kali. Hasil

pengukuran serapan larutan phloroglucinol untuk pembuatan kurva baku disajikan

pada tabel di bawah ini.


36

Tabel II. Data untuk persamaan kurva baku

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Seri Baku

Kadar (mg/100mL) absorbansi



1 0,1024 0,138 0,1046 0,132 0,1008 0,134 2 0,2048 0,269 0,2091 0,257 0,2016 0,255 3 0,3071 0,405 0,3137 0,407 0,3025 0,41 4 0,4095 0,516 0,4182 0,514 0,4033 0,506 5 0,5119 0,648 0,5228 0,643 0,5041 0,636 6 0,6143 0,796 0,6274 0,712 0,6049 0,724 A 0,0082 A 0,0277 A 0,0253 B 1,2665 B 1,1381 B 1,1871 R 0,9994 R 0,9956 r 0,9972

Koefisien korelasi menunjukkan hubungan antara konsentrasi dengan

serapan. Nilai koefisien korelasi mendekati satu artinya hubungan antara kadar

dan serapan mendekati linier dan sesuai hukum Lambert-Beer. Berdasarkan nilai

r hitung yang diperoleh, ketiga kurva baku tersebut kemudian dibandingkan nilai r

tabel (pada taraf kepercayaan 95%, df 4) diperoleh nilai r hitung ketiga kurva

baku lebih besar dari r tabel yakni 0,811. Intersep dari persamaan garis regresi

linier hasil replikasi I kecil yakni 0,0082. Hal ini berarti ada korelasi yang baik

antara konsentrasi dengan serapan, dan korelasi terbaik dihasilkan oleh kurva

baku replikasi I yang dibuktikan dengan nilai r hitung kurva baku replikasi I > r

hitung kurva baku replikasi III > r hitung kurva baku replikasi II. Maka dari

ketiga persamaan kurva baku tersebut dipilih kurva baku I untuk menetapkan

kadar sampel. Persamaan kurva baku yang digunakan adalah Y = 1,2665 X +

0,0082.


37

Hubungan antara kadar phloroglucinol dan nilai absorbansi dari

persamaan baku yang dipilih (replikasi I) disajikan pada gambar 9 di bawah ini:

Gambar 9. Kurva baku hubungan kadar dan absorbansi phloroglucinol

F. Penetapan Kadar Phlorotannin Fraksi Etil Asetat Alga Coklat

Sargassum cymosum C. Agardh

Prosedur dimulai dengan melarutkan crude phlorotannin dari fraksi etil

asetat dengan aseton 75%. Phlorotannin merupakan suatu polifenol dan

komponen fenolik biasanya lebih larut dalam pelarut yang kurang polar dibanding

air. Biasanya digunakan campuran air dengan metanol, etanol, atau aseton

(Waterman dan Mole, 1994). Tidak digunakan pelarut metanol karena masih

memiliki gugus hidroksil yang dapat mereduksi kompleks asam dalam reagen

Folin Ciocalteau sehingga meningkatkan resiko kesalahan saat pembacaan

absorbansi. Untuk itu diganti menggunakan pelarut aseton 75% untuk

Kurva Baku

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000 0.7000

Konsentrasi (ppm)

Abso

rban

si

y = 1,2665 x + 0,0082


38

menghilangkan intervensi absorbansi warna dari pelarut metanol dan perlu dibuat

blanko sebagai faktor koreksi. Tujuan dari pembuatan blanko agar serapan yang

diinginkan saja yang terukur. Serapan yang ingin diukur yakni serapan kompleks

molybdenum blue. Fraksi etil asetat yang telah larut dalam aseton 75% kemudian

direaksikan seperti pada standar phloroglucinol dan diukur absorbansinya pada

panjang gelombang 750,1 nm.

Senyawa fenolik merupakan asam lemah yang dalam keadaan netral

mudah melepaskan ion H+ dan akan berada dalam kesetimbangan dengan ion

fenolat. Penambahan Na2CO3 akan memberikan suasana basa sehingga

kesetimbangan akan lebih bergeser ke arah terbentuknya ion fenolat. Kemudian

ion fenolat inilah yang akan mereduksi kompleks asam heteropoli dari

fosfotungstat dan fosfomolibdat membentuk senyawa molybdenum blue. Ketika

ion fenolat bereaksi dengan reagen Folin Ciocalteau, maka jumlah ion fenolat

akan berkurang dan kesetimbangan akan bergeser ke arah terbentuknya ion

fenolat sehingga akan lebih banyak lagi ion fenolat yang dihasilkan. Reaksi ini

akan berlangsung hingga semua fenol habis. Selama reaksi terjadi, reagen Folin

Ciocalteau harus tetap bertahan dalam kondisi basa. Digunakan Na2CO3 untuk

mempertahankan supaya kebasaan berada pada pH sedang (pH 9 – 10).

OH

OHHO

Na2CO3

O

OHHO

phloroglucinol 3,5-Dihydroxy-phenol anion

Gambar 10. Kesetimbangan reaksi phloroglucinol dalam suasana basa


39

Prinsip reaksi kolorimetri dengan reagen Folin Ciocalteau adalah reduksi

reagen Folin Ciocalteau oleh ion fenolat membentuk kompleks molybdenum blue

dan oksidasi ion fenolat menjadi senyawa kuinon oleh reagen Folin Ciocalteau.

Reaksi oksidasi senyawa fenol:

phloroglucinol

OH

OHHO

+ H2O

O

O

HO OH

+ 4H+ + 4e

2,6-Dihydroxy-[1,4]benzoquinone

Reaksi reduksi reagen Folin Ciocalteau:

H3PO4(MoO3)12 + 2e- + 2H+ H5(PMo12O40)

H3PO4(MoO3)12 + 2e- + 4H+ H7(PMo12O40)

Reaksi redoks:

OH

OHHO

phloroglucinol

+ H3PO4(MoO3)12 + H2O

O

O

OHHO

2,6-dihydroxy-[1,4]benzoquinone

+ H7(PMo12O40)

kompleks oktahedral molydenum blue

reagen Folin Cioalteau

Gambar 11. Reaksi phloroglucinol dengan reagen Folin Ciocalteau


40

Pada saat reaksi terjadi, reagen Folin Ciocalteau mengalami reduksi karena

mendapatkan proton (H+) dari gugus fenol sampel membentuk kompleks

oktahedral molybdenum blue. Sementara itu gugus fenol akan mendapatkan

tambahan oksigen dari air dan reagen (teroksidasi) sehingga membentuk senyawa

kuinon. Semakin banyak senyawa fenolik maka akan semakin banyak ion fenolat

yang terbentuk dan kompleks ion polimerik dari reagen Folin Ciocalteau akan

semakin tereduksi menghasilkan senyawa molybdenum blue yang semakin pekat.

Sehingga warna yang dihasilkan setara dengan konsentrasi ion fenolat dan

kandungan senyawa fenolik dalam sampel yang dapat diukur serapannya

menggunakan spektrofotometer.

Tabel III. Hasil pembacaan absorbansi fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C.

Agardh

Panjang Gelombang 750,1 nm Absorbansi

Replikasi I 1 0,172 2 0,173

Replikasi II 1 0,164 2 0,171

Replikasi III 1 0,171 2 0,175

Data serapan yang diperoleh kemudian diolah dengan menggunakan

persamaan kurva baku I, yaitu Y = 1,2665 X + 0,0082 sehingga diperoleh kadar

terukur phlorotannin. Pengukuran serapan dilakukan dengan 3 replikasi dan

masing-masing replikasi dianalisis dengan duplo seperti yang disajikan pada tabel

IV.


41

Tabel IV. Hasil penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh

Replikasi (duplo) Kadar

(mg PE/g fraksi) Rata-rata kadar

(mg PE/g fraksi) I.1 6,201 I.2 6,478

6,339

II.1 6,387 II.2 6,426

6,406

III.1 6,322 III.2 6,480

6,401

Kadar phlorotannin yang diperoleh diestimasikan sebagai kadar polifenol

total ekivalen dengan standar phloroglucinol. Hal ini dikarenakan sampel yang

diukur berupa crude phlorotannin yang mengandung banyak senyawa fenolik dan

tidak spesifik mengukur jenis polimer polifenol tertentu. Selain itu reagen Folin

Ciocalteau sensitif terhadap semua senyawa yang memiliki gugus fenolik. Pada

penelitian ini diperoleh kadar phlorotannin terukur 6,382 ± 0,037 mg PGE/g

fraksi.

Kelebihan metode kolorimetri dengan reagen Folin Ciocalteau ini adalah

sensitivitas dalam mengukur senyawa dengan gugus fenolik sampai tingkat part

per million (ppm), reprodusibilitas tinggi, linearitas baik, serta menghasilkan

reaksi warna yang cukup stabil dalam rentang waktu yang relatif panjang.

Kelemahan metode kolorimetri dengan reagen Folin Ciocalteau pada

penelitian ini adalah panjang gelombang maksimum yang selalu bergeser karena

kondisi pH yang tidak dikendalikan sehingga terjadi dua bentuk reduksi dari

reagen Folin Ciocalteau dan menghasilkan dua bentuk senyawa molybdenum blue

dengan rumus struktur yang berbeda. Metode ini juga tidak spesifik untuk jenis


42

polifenol tertentu namun sangat sensitif terhadap seluruh senyawa yang memiliki

gugus fenolik termasuk phlorotannin.


43

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN

1. Phlorotannin dapat diisolasi dari alga coklat Sargassum cymosum C.

Agardh.

2. Kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum

cymosum C. Agardh yang terukur dengan metode kolorimetri

menggunakan reagen Folin Ciocalteau adalah 6,38 ± 0,04 mg PGE/g

fraksi.

B. SARAN

1. Perlu dilakukan analisis terhadap struktur kimia phlorotannin untuk

mengetahui kandungan fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum

C. Agardh.

2. Perlu dilakukan validasi penuh untuk memastikan bahwa metode Folin

Ciocalteau valid digunakan untuk menetapkan kadar phlorotannin dalam

fraksi etil asetat alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh.

3. Perlu dilakukan optimasi kondisi prosedur dalam metode kolorimetri

dengan reagen Folin Ciocalteau terkait pH untuk memastikan bentuk

senyawa kompleks molybdenum blue yang terjadi.


44

DAFTAR PUSTAKA

Ahn, M. J., Yoon, K. D., Min, S.Y., Lee, J. K., Kim, J.H., Kim, T. G., Kim, S.H.,

Kim, N.G., Huh, H., and Kim, J., 2004, Inhibition of HIV-1 Reverse Transcriptase and Protease by Phlorotannins from the Brown Alga Ecklonia cava, Biol. Pharm. Bull., 27(4), 544-547

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, Edisi I, 2-4, 7, Depkes RI, Jakarta Anonim, 1995, United States Pharmacopoiea, 23rd Ed., 1982-1984, United States

Pharmaceutical, Convention, Inc., 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, United States of America.

Athukorala, Y., Kim, K.N., and Jeon,Y.J., 2006, Antiproliferative and Antioxidant

Properties of an Enzymatic Hydrolysate from Brown Alga, Ecklonia cava, Food Chem.Toxicol., 44(7), 1065-1074

Auterhoff, H. and Knabe, J., 1978, Lehrbuch der Pharmazeutischen Chemie, 103,

Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Mbh., Stuttgart. Boney, A.D., 1965, Aspect of the Biology of the Seaweeds of Economic

Importance, In : Basic in Mar. Bot., 3:205-253 Burtin, P., 2003, Nutrional Value of Algas , Electron. J. Environ. Agric. Food

Chem., France, 2 (4) , 498-500 Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, Sixth Edition, 65, 66, 483, 484, John

Wiley & Sons, Inc., United States of America. Dahuri, R., 2003, The role of Marine Biotechnology in the Development of

Marine Biomedical Product, Proceed.s Int. Symp. Biomed., 18-19 September, 2003, 1-5, IPB, Bogor.

Day, R. A. dan Underwood, A. L., 2002, Analisis Kimia Kuantitatif,

diterjemahkan oleh Iis Sopyan, Edisi VI, 396, 397, 402, 403, 407, Penerbit Erlangga, Jakarta.

Evans, W.C., 2002, Trease and Evans: Pharmacognosy, 15th Ed., 98, W.B.

Saunders, London. Fatah, A.M., 1989, Spektroskopi, 1, 45-46, Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta. Folin, O. and Ciocalteau, V., 1944, On Tyrosine and Tryptophane Determinations

in Proteins, J. Biol. Chem., 73, 627-650 1927, cit. Todd-Sanford, 10th ed., 412


45

Hammerstrom, K., Dethier, M.N., and Duggins, D.O., 1998, Rapid Phlorotannin

Induction and Relaxation in Five Washington Kelps, Mar. Ecol. Prog. Ser., 165, 293-305

Harborne, J.B. and Dey, P.M., 1989, Methods in Plant Biochemistry, Vol.I, 389,

Academic Press, New York. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,

Majalah Ilmu Kefarmasian, I (3), 117 – 135 Hsien, W., 1920, Contribution to The Chemistry of Phosphomolybdic Acids,

Phosphotungstic Acids, and Allied Substances, J. Biol. Chem., Harvard Medical School, Boston, 189-220

Jansoon, N., 2005, The Determination of Total Phenolic Compounds in Green

Tea, 209.85.165.104/search?q=cache:Nj311vjKCdcJ:chemw.sc.mahidol.ac.th/scess/scch108/2005_06_SCCH108Lab02.pdf+Folin-Ciocalteau+ method +colori metric&hl=en&ct=clnk&cd=9&gl=id, diakses tanggal 24 Oktober 2007

Kadi, A., 2007, Beberapa Catatan Kehadiran Marga Sargassum di Perairan

Indonesia, www.oseanografi.lipi.go.id/volxxxno.42.pdf, diakses tanggal 20 Februari 2007

Kang, K.A., Lee, K.H., Chae, S., Koh,Y.S., Yoo, B.S., Kim, J.H., Ham, Y.M.,

Baik, J.S., Lee, N.H., and Hyun, J.W., 2005a, Triphlorethol-A from Ecklonia cava Protects V-79-4 Lung Fibroblast Against Hydrogen Peroxide Induced Cell Damaged, Free Radic. Res., 39 (8), 883-892

Kang, K.A., Lee, K.H., Chae, S., Zhang, R., Jung, M.S., Ham, Y.M., Baik, J.S.,

and Hyun, J.W., 2005b, Cytoprotective Effect of Phloroglucinol on Oxidative Stress Induced Cell Damaged via Catalase Activation, J.Cell Biochem., 97(3), 609-620

Kang, K.A., Zhang, R., Lee, K.H., Chae, S., Kim, B.J., Kwak, Y.S., Park, J.W.,

Lee, N.H., and Hyun, J.W., 2006, Protective Effect of Triphlorethol-A from Ecklonia cava Against Ionizing Radiation in Vitro, J.Radiat Res., 47(1), 61-68

Khopkar, S.M., 1990, Basic Concepts of Analytical Chemistry, alih bahasa oleh

Saptoraharjo, A., 193, 204, Universitas Indonesia Press, Jakarta. Koivikko, R., Loponen, J., Honkanen, T., and Jormalainen, V., 2005, Content of

Soluble, Cell-Wall-Bound and Exuded Phlorotannins in the Brown Alga


46

Fucus Vesiculosus, with Implication on Their Ecological Functions, J. Chem. Ecol., 31(1), 196-197

Krumholz, L.R. and Bryant, M.P., 1988, Characterization of the Pyrogallol-

Phloroglucinol Isomerase of Eubacterium oxidoreducens, J. Bact., Illinois, 170(6), 2478

Mulja, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip Prinsip Cara Berlaboratorium yang

Baik, Majalah Farmasi Airlangga, 3(2), 72 Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 26-28, Airlangga

University Press, Surabaya. Mustapha, K. and Ghalem, S., 2007, Effect of Heat Treatment on Polyphenol

Oxidase and Peroxidase Activities in Algerian Stored Dates, Afric. J. Biotech., 6(6), 790-794

Nagayama, K., Iwamura, Y., Shibata, I., Hirayama, I., and Nakamura, T., 2002,

Bactericidal Activity of Phlorotannins from The Brown Alga Ecklonia kurome, JAC, 50, 889-893

Ohhannesian, L. and Streeter, A.J., 2002, Handbook of Pharmaceutical Analysis,

Vol. 117, 209, 210, Marcel Dekker, Inc, New York, U.States. Padda, M.S., 2006, Phenolic Composition and Antioxidant Activity of

Sweetpotatoes [Ipomoea batatas (L.) Lam], Disertasi, Punjab Agricultural University ,15

Roleda, M.Y., Clayton, M.N., and Wieneke, C., 2006, Screening Capacity of UV

Absorbing Compounds in Spore of Arctic Laminariales, J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 338, 123-133

Roth, H.J. and Blaschke G., 1994, Pharmazeutische Analytic, diterjemahkan oleh

S. Kisman, S. Ibrahim, 359-361, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Sastrohamidjojo, H., 1991, Spektroskopi, 1-15, Liberty, Yogyakarta Shin, H.C., Hwang, H.J., Kang, K.J., and Lee, B.H., 2006, An Oxidative and

Antiinflammatory Agent for Potential Treatment of Osteoarthritis from Ecklonia cava, Arch. Pharm. Res., 29(2), 165-171.

Silverstein, R.M., Bassler, G.C., and Morril, T.C., 1991, Spectrometric

Identification of Organic Compound, 5th Ed., 289-294, John Wiley & Sons. Inc., Singapura.


47

Singleton, V.L. and Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-Phosphotungstic Acid Reagent, Am. J. Enol. Vitic, 16, 147.

Skoog, D.A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, 3rd Ed., 22, 164-165,

Saunders College Publishing, Philadelphia. Skoog, D.A., West, D.M., and Holler, F.J., 1993, Analytical Chemistry an

Introduction, 6th Ed., 68, 237, 408, 417, 418, 430, 604, 605, Saunders College Publishing, United States of America.

Skoog, D.A., Holler, F.J., and Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental

Analysis, 5th Ed., 11-14, 140, H. Brace College, Philadelphia. Swanson, A.K. and Druchl, L.D., 2002, Induction, Exudation and the UV

Protective Role of Kelp Phlorotannins, Aquatic Bot., 73, 241-253 Vogel, A.I., 1978, A Text Book of Quantitative Inorganic Analysis, Fourth edition,

728, The English Languange Book Society, Richard Clay Ltd., Bungay. Voigt, R., 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, Edisi V, 572, Gadjah Mada

University Press, Yogyakarta. Waterman, P.G. and Mole, S., 1994, Analysis of Phenolic Plant Metabolites:

Extraction and Chemical Quantification, Black. Sci. Pub., 66-69. Willard, H.H., Merritt, J.R.L., Dean, J.A., and Settle J.F., 1988, Instrumental

Methods of Analysis, 7th Ed., 160, Wadsworth Publishing Company, California.

Yuan, Y.V., and Walsh, N. A., 2006, Antioxidant and Antiproliferative Activities

of Extract from a Variety of Edible Algas, J.Fd.Chem.Toxicol., 44, 1144-1150

Zhang, Q., Zhang, J., Shen, J., Silva, A., Dennis, D.A., and Barrow, C.J., 2006, A

Simple 96-well Microplate Method for Estimation of Total Polyphenol Content in Algas, J. App. Phycol., 18, 445-450.


48

LAMPIRAN Lampiran 1. Surat keterangan hasil identifikasi spesies alga coklat


49


50

Lampiran 2. Data perhitungan kadar air dengan Karl Fischer

Drift = 19

Blangko:

Berat air + spuit = 8,6898 g

Berat spuit + sisa air = 8,6694 g

Berat air yang dimasukkan = 0,0204 g

Konsentrasi = 25,253 mg/ 5 mL titran

Angka pada alat = 0,0349%

Kadar air blangko = 1000349,0

x 10000 mg

= 3,49 mg

Keterangan: 10000 adalah angka untuk konversi perhitungan blanko dan sampel

agar didapat angka yang mempermudah perhitungan.

Replikasi I:

Berat sampel = 2001,5 mg

Kadar air = 1001094,0

x 10000 mg = 10,94 mg

Persentase kadar air = 5,2001

10)49,394,10( x− x 100% = 3,72%

Replikasi II:


Kadar air = 1001051,0

x 10000 mg = 10,51 mg


51


10)49,351,10( x− x 100% = 3,51%

Replikasi III:


Kadar air = 1000894,0

x 10000 mg = 8,94 mg


10)49,394,8( x− x 100% = 2,73%

Lampiran 3. Data penimbangan replikasi seri baku phloroglucinol

Replikasi I:

Berat kertas + zat = 0,45148 g Berat kertas + sisa = 0,40029 g ( - ) Berat zat = 0,05119 g à ad 50,0 mL aseton 75 % Replikasi II:

Berat kertas + zat = 0,44613 g Berat kertas + sisa = 0,39553 g ( - ) Berat zat = 0,05060 g à ad 50,0 mL aseton 75 %

Replikasi III:

Berat kertas + zat = 0,49880 g Berat kertas + sisa = 0,39798 g ( - ) Berat zat = 0,10082 g à ad 100,0 mL aseton 75 %


52

abso

rban

si

0,100

0,200

0,600

0,400

0,300

0,500

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00

Waktu (menit)

Lampiran 4. Contoh perhitungan seri kadar baku phloroglucinol yang dibuat

Replikasi I:

Konsentrasi stok baku phloroglucinol = 51,19mg/50mL = 1,0238 mg/mL

C1 = 0,5 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,0512 mg/100mL

C2 = 1,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,1024 mg/100mL

C3 = 2,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,2048 mg/100mL

C4 = 3,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,3071 mg/100mL

C5 = 4,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,4095 mg/100mL

C6 = 5,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,5119 mg/100mL

C7 = 6,0 . 1,0238 . 1/10. 0,5/50 . 102 mg/100mL = 0,6143 mg/100mL

Lampiran 5. Hasil scanning Operating Time (OT)


53

Lampiran 6. Hasil scanning ?maks kadar phloroglucinol 1,0 ppm setelah

direaksikan

dengan Folin Ciocalteau


54


direaksikan dengan Folin Ciocalteau


55


direaksikan dengan Folin Ciocalteau

Lampiran 9. Hasil pembacaan absorbansi seri baku phloroglucinol pada ketiga

?maks

C phloroglucinol

(ppm) Absorbansi pada ? maks

758.7 nm 750.1 nm 743.4 nm 0,477 0,049 0,070 0,050 0,953 0,131 0,126 0,123 1,905 0,286 0,306 0,281 2,859 0,418 0,423 0,420 3,812 0,544 0,549 0,543 4,765 0,656 0,653 0,659 5,718 0,727 0,732 0,732

A 0,01598 0,02917 0,01084 B 0,131738 0,129576 0,133349 r 0,99425 0,99387 0,99477


56

Lampiran 10. Kurva baku phloroglucinol

Lampiran 11. Data penimbangan sampel

Replikasi I:

Berat kaca arloji + zat = 15,45098 g Berat kaca arloji + sisa = 15,40139 g ( - ) Berat zat = 0,04959 g à ad 50,0 mL aseton 75 %

Replikasi II:


Kurva Baku

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000 0.7000

Konsentrasi (ppm)

Abso

rban

si

y = 1,2665 x + 0,0082


57

Replikasi III:


Lampiran 12. Data absorbansi sampel fraksi etil asetat Sargassum cymosum C.

Agardh

759,6 750,1 745,9 730,9 Panjang gelombang

(nm) Absorbansi Replikasi I 1 0,161 0,164 0,166 0,165 2 0,171 0,171 0,171 0,170 Replikasi II 1 0,172 0,172 0,171 0,171 2 0,172 0,173 0,172 0,172 Replikasi III 1 0,170 0,171 0,170 0,169 2 0,174 0,175 0,173 0,173

Lampiran 13. Contoh perhitungan kadar sampel

Persamaan kurva baku: y = 1,2665 x + 0,0082

Replikasi I: Duplo 1 à y = 0,164 à x = 0,1230 mg/100mL

C1 = gg

mg/2016,mL50x01

50x

0,04959mg/mL.101230,0 2

=−


58

Duplo 2 à y = 0,171 à x = 0,1285 mg/100mL

C2 = gmg/ 6,478mL x501050

xg 0,04959

mg/mL 0,1285.10 2

=−

Kadar rata-rata sampel = sampel PE/g 6,339mg2

mg/g 6,478)(6,201=

+

Lampiran 14. Foto hasil uji kualitatif alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh

Keterangan:

1. ekstrak alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh + gelatin 1%

2. ekstrak alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh + gelatin 1% + NaCl

10%

3. ekstrak alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh + FeCl3 LP

4. ekstrak alga coklat Sargassum cymosum C. Agardh tanpa perlakuan

(kontrol)

1 2 3 4


59

Lampiran 15. Foto instrumen spektrofotometer UV - VIS Perkin Elmer Lambda-

20

Lampiran 16. Foto autoklaf


60

Lampiran 17. Foto Vacuum Rotary Evaporator


61

BIOGRAFI PENULIS

Andriani Noerlita Ningrum , penulis skripsi yang berjudul

Penetapan Kadar Phlorotannin dalam Fraksi Etil

Asetat Alga Coklat Sargassum cymosum C. Agardh

dengan Metode Kolorimetri Folin Ciocalteau , lahir di

kota Semarang, pada tanggal 24 Mei 1986 dari pasangan

Bapak Sri Wiyono dan Ibu Siti Nurkhayatun. Penulis

menyelesaikan pendidikan di TK Siwipeni III Boyolali,

pada tahun 1992, SD Negeri I Boyolali pada tahun 1993,

SD Negeri I Karanganyar pada tahun 1998, SLTP Negeri I Karanganyar pada

tahun 2001, dan SMU Negeri III Surakarta pada tahun 2004. Penulis melanjutkan

kuliah di Fakultas Farmasi Univesitas Sanata Dharma, Yogyakarta pada 2004

hingga 2008. Selama kuliah, penulis pernah menjadi asisten praktikum

Spektroskopi pada semester gasal tahun ajaran 2006/2007, asisten praktikum

Kimia Analisis pada semester gasal tahun ajaran 2006/2007 dan tahun ajaran

2007/2008. Selain itu, penulis juga pernah menjabat sebagai koordinator UKF

Tari pada Tahun 2006-2007 dan menjadi panitia dalam berbagai kegiatan yang

diadakan oleh Fakultas maupun Universitas.


Documents

PENETAPAN KADAR PHLOROTANNIN DALAM FRAKSI ETIL … fileii penetapan kadar phlorotannin dalam fraksi etil asetat alga coklat sargassum cymosum c. agardh dengan metode kolorimetri folin