LAPORAN PRAKTIKUM

BIOREGULATOR

Pengamatan Aktivitas Enzim Amilase pada Kecambah Kacang Hijau

Oleh :

Yuda Anggi Pradista(101810301025)

Heksa Desi Amalia(101810301026)

Yeni Patmawati(101810301029)

Wardatul Baedho(101810301045)

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Jember

2012

Tujuan

Mengetahui aktivitas kerja enzim amilase pada kecambah kacang hijau

Kerangka Berpikir

Amilase

Amilum

Kecambah Kacang Hijau

Absorbansi

Konsentrasi protein

Aktivitas Enzim

Tinjauan Pustaka

Enzim amilase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi pemecahan amilum yang meruapakan suatu polisakarida yang terdiri atas amilosa dan amilopektin menjadi gula disakarida. Enzim -amilase meruapakan enzim yang mengkatalisis pemutusan ikatan glikosida -1,4 molekul amilum secara acak.

Enzim -amilase memiliki nama lain -1,4-D-glucanglucanohydrolase, endoamylase, EC 3.2.1.1. Enzim ini dapat ditemukan pada mikroorganisme, tumbuhan, dan organism tingkat tinggi lainnya. -amilase dimiliki oleh family endo-amylase yang mengkatalis awal hidrolisis pati menjadi oligosakarida yang lebih pendek melalui pemecahan ikatan -D-(1-4) glikosidik. Enzim amylase tersusun dari 512 asam amino pada rantai tunggal oligosakarida dengan berat molekul 57,6 kDa (Biogen, 2008).

Sisi aktif alpha-amilase berisi tiga kelompok asam (berwarna putih dan merah) yang melakukan sebagian besar pekerjaan. Pada struktur yang ditampilkan di atas glutamat 233, aspartat 179 dan aspartat 289 bekerja sama untuk membelah hubungan antara dua gula dalam rantai pati. Struktur ini mengandung rantai pendek dari lima unit gula (berwarna kuning dan oranye) terikat di situs aktif.

Enzim -amilase banyak terdapat pada kecambah kacang-kacangan, seperti halnya kacang hijau. Enzim -amilase termasuk ekstraselular, sehingga mengekstraknya relatif mudah. Enzim ini dalam biji dibentuk pada waktu awal perkecambahan oleh asam giberilik. Asam giberilik adalah suatu senyawa organik yang sangat penting dalam proses perkecambahan suatu biji karena bersifat sebagai pengontrol perkecambahan tersebut (Winarno, 1983). Aktivitalisme dipengaruhi oleh garam-garam anorganik, pH, suhu dan cahaya. pH optimum dari amilase menurut Hopskin Cole dan Green adalah 4,5 4,7 (Whitackr, 1994).

Larutan buffer adalah larutan yang tahan terhadap perubahan pH dengan penambahan asam atau basa. Larutan seperti itu digunakan dalam berbagai percobaan biokimia dimana dibutuhkan pH yang terkontrol dan tepat ( Fardiaz, 1992 ). Larutan buffer bermanfaat untuk melarutkan kotoran yang masih terikut di dalam endapan enzim tersebut sekaligus bisa mencegah enzim dari denaturasi dan kehilangan fungsi biologisnya ( Fox, 1991 ). Buffer dapat mempertahankan kondisi enzim presipitat agar tidak terjadi perubahan pH dan mencegah agar enzim tidak mengalami inaktivasi (Winarno, 1995 ).

Metode percobaan

4.1 Alat dan Bahan

4.1.1 Alat

3 buah Gelas kimia 50 mL Labu ukur 25, 50 dan 100 mLBatang pengadukMortar dan pastel6 buah tabung sentrifiusKuvet ukuran 1 cmSpektrometer UV VISStopwatchPipet tetes 3 buahPipet mohr 10 mLStirrerPemanasPenjepitTermometerpH meterKertas saringBotol kaca 5 buahNampan plastik untuk perkecambahan

4.1.2 Bahan

Kecambah kacang hijauStarch/AmilumAquadesReagen Bradford dan Vortex.Larutan Standart BSA.Buffer Phospat pH 7Kristal amonium sulfatReagen arsenomolibdatReagen nelson somogy

Berikut ini tahapan praktikum yang akan di lakukan :

Persiapan bahanPersiapan dan perlakuan sampelEkstraksi sampelPemisahan enzimPengujian enzim

Persiapan bahan

Perkecambahan kacang hijauBahan yang digunakan pada praktikum ini adalah biji kacang hijau yang siap mengalami perkecambahan ( Dipilih biji dengan ukuran yang besar). Siapkan wadah untuk tempat perendaman kacang hijauKacang hijau yang telah disiapkan, kemudian direndam di dalam wadah tersebut selama tiga hari dalam air 25CSetelah mencapai waktu yang ditentukan, biji rendaman tersebut kemudian diangkat dan disebarkan diatas kertas koran basah dalam wadah. Biji kacang hijau kemudian diletakkan dalam ruang lembab dan tidak terkena cahaya matahari secara langsung selama tiga hari. Setiap hari semprot biji tersebut dengan dengan air (spray). Kecambah kacang hijau siap dipanen sesuai variasi umur perkecambahan. Pada praktikum kali ini diambil kecambah yang berumur 3 hari. Selanjutnya, kecambah di ekstraki dan diisolasi. Pembuatan Larutan Stok Amilum 0,5 gram amilum dilarutkan dalam 50 mL aquades, dipanaskan perlahan sambil diaduk dengan stirer sampai terbentuk larutan jernih. Larutan amilum dimasukkan dalam labu ukur 100 mL secara kuantitatif dan ditambah dengan aquades sampai tanda batas. Dari larutan stok ini dibuat larutan amilum standart dengan mengencerkan sampai konsentrasi 0.1%.Pembuatan buffer phosphateLarutan A : 0,2 M larutan Na-Phosphate monobasis (27,8 gr dalam 1000 ml)Larutan B : 0,2 M larutan Na-Phosphate dibasis ( 52,65 gr Na2HPO4.7H2O) atau 71,7 gr Na2HPO4.12H2O dalam 1000 ml. Larutan A 195 mL + 305 mL larutan B, encerkan sampai 1000 mLPembuatan reagen nelson somogyReagen Nelson A : Larutkan 12,5 gr Natrium Karbonat Anhidrat, 12,5 gr Rochelle, 10 gr Natrium Bikarbonat dan 100 gr Natrium sulfat anhidrat dalam 350 ml air suling. Encerkan sampai 500 ml Reagen Nelson B : Larutkan 7,5 gr CuSO4. 5 H2O dalam 50 ml air suling dan tambahkan 1 tetes asam sulfat pekat.Reagen Nelson dibuat dengan cara mencampur 25 bagian reagensia Nelson A dan 1 bagian Reagensia Nelson B. Campuran dikerjakan setiap akan digunakan.Pembuatan reagen arsenomolybdatLarutkan 25 gr amonium molybdat dalam 450 ml air suling Tambahkan 25 ml asam sulfat pekatLarutkan pada tempat yang lain 3 gr NaHAsO4.7H2O dalam 25 ml air sulingKemudian tuanglah larutan ini kedalam larutan yang pertamaSimpan dalam botol warna coklat dan diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jamReagensia ini baru bisa digunakan setelah masa inkubasi tersebut, reagensia ini berwarna kuning.Pengenceran larutan standart BSA :Sebanyak 0,25 : 0,5 ; 1 ; 2 ; 3 ; 4 l diencerkan pada erlenmeyer 10 ml. Sehingga diperoleh konsentrasi BSA 25;50;100;200;300 dan 400 ppm

Persiapan sampel dan perlakuan sampel

Disiapkan kecambah yang telah berumur 2 hariDiambil potongan kecambah sepanjang 1 cm dari titik tumbuhDihaluskan 20 gram kecambah dengan mortar, hingga didapatkan bubur kecambah.Ditambah 25 ml NaCl 5%, kemudian dihomogenkan dengan bubur kecambah

Pemisahan enzim

Pemisahan enzim didasarkan BM yang mengendap dalam medium tertentu, selanjutnya diuji aktivitasnya.Larutan bubur kecambah dimasukkan ke dalam kuvet dan disentrifius dengan kecepatan 4000 rpm 5 menitDipisahkan supernatan dan pellet sehingga didapatkan ekstrak enzim kasar (Supernatan).Supernatan yang didapatkan di tambahkan (NH4)2SO4 18,5%, dan disentrifius dengan kecepatan 4000 rpm, 5 menitDipisahkan supernatant dan pellet 1Supernatan dipindahkan kedalam tabung dan selanjutnya ditambahkan lagi (NH4)2SO4 menjadi 28%Dipisahkan supernatant dan pellet 2Supernatan (enzim kasar), pellet 1 dan pellet 2 ditempatkan dalam wadah tertutup untuk diukur dengan spectrometer.

Pengujian enzim

Dasar pengujianE + S ESNilai Km didasarkan perubahan konsentrasi enzim aktif terhadap cahaya UVAlat yang digunakan adalah spektrofotometer UV, pengujian menggunakan variasi larutan standard amilum yang telah disiapkan.Pengukuran Aktivitas EnzimVariasi suhuDisiapkan 3 tabung reaksiDiisi tiap tabung reaksi dengan 1 mL Ekstrak enzimTabung 1,2 dan 3 diinkubasi pada suhu berturut turut 30oC, 38 oC dan 45 oC selama 5 menitDiukur absorbansinya dari masing masing tabung reaksi dengan panjang gelombang 280 nm 290 nm menggunakan spektrometer UVDicatat nilai absorbansi dan waktu yang dibutuhkan hingga didapatkan perubahan nilai yang konstanVariasi pHDisiapkan 3 tabung reaksiDiisi tiap tabung reaksi dengan 1 mL Ekstrak enzimTabung 1,2 dan 3 diatur pH larutan berturut turut pada pH 3, 4 dan 5 Diukur absorbansinya dari masing masing tabung reaksi dengan panjang gelombang 280 nm 290 nm menggunakan spektrometer UVDicatat nilai absorbansi dan waktu yang dibutuhkan hingga didapatkan perubahan nilai yang konstanVariasi konsentrasi substratDisiapkan 3 tabung reaksiDiisi tiap tabung reaksi dengan 1 mL Ekstrak enzimTabung 1, 2 dan 3 ditambahkan 0,1 mL substrat dengan variasi konsentrasi substrat masing masing 0,1 %, 0,5 % dan 1 % Diukur absorbansinya dari masing masing tabung reaksi dengan panjang gelombang 280 nm 290 nm menggunakan spektrometer UVDicatat nilai absorbansi dan waktu yang dibutuhkan hingga didapatkan perubahan nilai yang konstan