i

PENGARUH PEMBERIAN KOMBINASI TOMAT

(Solanum lypopersicum l) DAN WHEY KEFIR

TERHADAP KADAR MDA DAN JUMLAH

EOSINOFIL PADA TIKUS (Rattus

novergicus) MODEL ASMA

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

Oleh:

David Prasetyo Jati

125130107111026

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2017

ii

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

PENGARUH PEMBERIAN KOMBINASI TOMAT (Solanum

lypopersicum l) DAN WHEY KEFIR TERHADAP KADAR

MDA DAN JUMLAH EOSINOFIL PADA TIKUS

(Rattus novergicus) MODEL ASMA

Oleh:

David Prasetyo Jati

125130107111026

Setelah dipertahankan di depan Majelis Penguji

pada tanggal 18 Agustus 2017

dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh

gelar Sarjana Kedokteran Hewan

Dosen Pembimbing I Dosen Pembimbing II

Dr. Djoko Winarso, drh ,MS drh.Dahliatul Qosimah, M.Kes

NIP. 19530605 198403 1 001 NIP. 19820127 201504 2 001

Mengetahui,

Dekan Fakultas Kedokteran Hewan

Universtas Brawijaya

Prof. Dr. Aulanni’am, drh, DES

NIP. 19600903 198802 2 00

iii

LEMBAR PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : David Prasetyo Jati

NIM :125130107111026

Program Studi : Pendidikan Dokter Hewan

Penulis Skripsi berjudul:

Pengaruh Pemberian Kombinasi Tomat (Solanum lypopersicum l) dan

Whey Kefir Terhadap Kadar MDA dan Jumlah Eosinofil pada Tikus

(Rattus Novergicus) Model Asma

Dengan ini menyatakan bahwa:

1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya sendiri dan tidak

menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang termaktub di isi dan

tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.

2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil jiplakan,

maka saya akan bersedia menanggung segala resiko yang akan saya terima.

Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.

Malang, 18 Agustus 2017

Yang menyatakan,

(David Prasetyo Jati)

NIM. 125130107111026

iv

PENGARUH PEMBERIAN KOMBINASI TOMAT (Solanum

lypopersicum l) DAN WHEY KEFIR TERHADAP KADAR

MDA DAN JUMLAH EOSINOFIL PADA TIKUS

(Rattus novergicus) MODEL ASMA

ABSTRAK

Asma merupakan penyakit kronik pada saluran pernafasan yang banyak

dijumpai pada hewan dan manusia. Asma dihubungkan dengan hiperresponsif

bronkus, hipersekresi mukus dan gejala pernapasan yang bersifat reversibel. Salah

satu sel yang diketahui berperan besar dalam patogenesis asma adalah eosinophil

yang berperan dalam merusak epitel saluran napas dan menyebabkan peradangan.

Gejala asma dapat dipicu oleh ovalbumin dan dapat diperparah oleh infeksi

rongga mulut akibat Lipopolisakarida (LPS) dari bakteri Gram negatif. Tomat

mengandung antioksidan yang berguna untuk menangkal radikal bebas. Whey

kefir merupakan produk susu fermentasi yang kaya akan senyawa antimikroba

diantaranya asam organik, peptida dan eksopolisakarida. Tujuan penelitian ini

untuk mengetahui potensi terapi kombinasi tomat (Solanum lypopersicum l) dan

whey kefir terhadap kadar Malondialdehida (MDA) dan jumlah eosinofil pada

hewan tikus model asma. Tikus model asma diinduksi ovalbumin diinjeksikan

secara intraperitoneal 10 μg dengan 1,5 mg AlOH3 dalam 200 μL PBS (phosphate

buffer saline) sebanyak 3 kali, induksi yang pertama dan kedua diinjeksi

intraperitoneal dan ketiga diinhalasi dengan nebulizer dan dipapar LPS dari

bakteri Phorphyromonas gingivalis secara intrasulkuler dengan dosis 1 μg.

Penelitian ini menggunakan lima kelompok perlakuan, yaitu kontrol negatif,

kontrol positif, perlakuan 1, 2 dan 3 diterapi kombinasi tomat (Solanum

lypopersicum l) dan whey kefir dengan dosis yang berbeda perlakuan

1ml/200kgBB, 1,5ml/200KgBB dan 2ml/200KgBB. Kadar MDA diukur

menggunakan metode Thiobarbaturic Acid (TBA) dan perhitungan jumlah

eosinophil dengan ABX Micros 60. Data yang diperoleh berapa data kuantitatif

uji MDA dan jumlah eosnofil selanjutnya data dianalisa menggunakan uji analisis

ragam ANOVA dan uji lanjutan Beda Nyata Jujur (BNJ) α = 5%. Hasil penelitian

didapatkan bahwa pemberian whey kefir dan tomat mampu menurunkan kadar

MDA dan menurunkan jumlah eosinofil. Dosis terapi terbaik yaitu 1.5 ml/200g

BB. Kesimpulan penelitian ini yaitu kombinasi whey kefir dan tomat dapat

digunakan sebagai terapi tikus model asma.

Kata Kunci: Tomat, Whey Kefir, Asma, MDA dan Eosinofil

v

GIVING EFFECT FROM COMBINATION OF TOMATO

(Solanum lypopersicum l) AND WHEY KEFIR MDA

CONCENTRATION AND NUMBER OF

EOSINOPHILS IN RAT (Rattus

novergicus) MODEL OF

ASTHMA

ABSTRACT

Asthma is a chronic disease of the respiratory tract that are often found

in animals and humans. Asthma is associated with bronchial

hyperresponsiveness, hypersecretion of mucus and respiratory symptoms are

reversible. One cell is known to play as a major role in the pathogenesis of

asthma is eosinophil that play a role in airway epithelial damage and cause

inflammation. Asthma symptoms can triggered by ovalbumin and can be

aggravated by oral infections due to lipopolysaccharide (LPS) from Gram-

negative bacterias. Tomatoes have antioxidants that are useful to prevent free

radicals. Whey kefir is a fermented milk product with a lot of antimicrobial

compounds include organic acids, peptides and exopolysaccharide. The purpose

this study to determine the potential of combination therapy tomato (Solanum

lypopersicum l) and whey kefir against Malondialdehida levels (MDA) and the

number of eosinophils in rat as an animal models of asthma. Rat model of

ovalbumin-induced asthma were injected intraperitoneally 10 mg to 1.5 mg

AlOH3 in 200 mL of PBS (phosphate buffer saline) 3 times, the induction of the

first and the second and third were injected intraperitoneally with a nebulizer

and is exposed to inhaled LPS from Phorphyromonas gingivalis bacteria in

intrasulkuler with a dose of 1 mg. This study uses five treatment groups, is the

negative control, positive control, treatment 1, 2 and 3 treated with a

combination of tomatoes (Solanum lypopersicum l) and kefir whey treatment

with different doses of 1ml / 200kgBB, 1,5ml / 200KgBB and 2ml / 200KgBB.

MDA levels were measured using the Thiobarbaturic Acid (TBA) method and

the calculating the number of eosinophil with ABX Micros 60. Data obtained

quantitative data turned away MDA test and subsequent eosnofil amount of data

analyzed using analysis of variance ANOVA test and advanced test Honestly

Significant Difference (HSD) α = 5 %. The results showed that whey kefir and

tomato were able to decrease MDA levels and decrease the amount of

eosinophils. The best therapy dose is 1.5 ml / 200 g BW. The conclusion of this

research is the combination of whey kefir and tomato can be used as therapy in

rats as animal model of asthma.

Keywords: Tomato, Whey Kefir, Asthma, MDA and Eosinophil

vi

KATA PENGANTAR

Ucapan Puji Syukur penulis haturkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa

karena atas limpahan rahmat, hidayah dan pertolongan-Nya lah sehingga penulis

mampu menyelesaikan serangkaian pelaksanaan penelitiaan skripsi yang berjudul

” Pengaruh Pemberian Kombinasi Tomat (Solanum lypopersicum l) dan

Whey Kefir Terhadap Kadar MDA dan Jumlah Eosinofil pada Tikus (Rattus

novergicus) Model Asma” dengan lancar.

Dalam penyusunan Skripsi ini penulis banyak mendapat bantuan dari

berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada

yang terhormat:

1. Dr. Djoko Winarso, drh ,MS selaku dosen pembimbing 1 atas bimbingan,

saran, kesabaran, fasilitas serta waktu yang telah diberikan selama ini.

2. drh.Dahliatul Qosimah, M.Kes selaku dosen pembimbing 2 atas

bimbingan, saran, kesabaran, fasilitas serta waktu yang telah diberikan

selama ini.

3. drh. Fajar Shodiq Permata, M.Biotech selaku dosen penguji 1 yang telah

memberikan saran dan kritik yang sangat membangun

4. Bu Agri Kaltaria dan Bu Dhita Evi Aryani selaku dosen penguji 2 yang

telah memberikan saran dan kritik yang sangat membangun.

5. Seluruh Jajaran Dekanat, Dosen dan Staff Fakultas Kedokteran

Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya atas dorongan semangat dan

fasilitas yang diberikan.

6. Ayahanda (Alm) Suhardi dan Ibunda Mariana serta saudara saya yang

tercinta Dian Ikawati & Andi Susanto dan Ira Puspitaningrum & Narendra

Wahyu Ardana untuk doa, kasih sayang, dukungan serta pengorbanan baik

moril maupun materi selama ini.

7. Untuk eyang nano, mbah ngori, tante endang, om dody, tante lip, om toni,

adek shinta, adek menco, adek diva, adek ila, iqbal, wak giok, ku ling ing,

pak man, pak bani, tante vero atas suport, doa dan wejangannya

8. Teman-Teman dari Blora yang tidak bisa saya sebutkan satu satu atas

dukungan dan motivasinya

vii

9. Teman-teman KMK (Keluarga Mahasiswa Katolik) Santo Fransiskus dari

Asisi FKH UB atas dukungan moral dan doa selama ini yang telah

diberikan.

10. Teman-teman dari IMPROVE KESPER (Kelompok Perunggasan) FKH

UB atas kekeluargaan yang tercipta selama ini

11. Teman-teman seperjuangan keluarga besar angkatan 2012 PKH UB

khususnya kelas C atas cinta, persahabatan, semangat, inspirasi, keceriaan

dan mimpi- mimpi yang luar biasa.

12. Teman-teman kelompok pkm dan skripsi W-Tom fera, lia, ridho, ovi, tia,

dan nindha yang berjuang agar penelitian ini bisa berhasil dan bermanfaat

bagi sesama.

13. Teman Teman satu atap kontrakan parlente selama di malang hio, ridho

dan nirwan atas cinta, persahabatan, semangat, inspirasi, keceriaan dan

mimpi- mimpi yang luar biasa.

14. Serta kepada semua pihak yang telah membantu dalam pelaksanaan dan

penyusunan laporan ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa laporan ini masih jauh dari kata sempurna, maka

saran dan kritik yang membangun dari semua pihak sangat diharapkan demi

penyempurnaan selanjutnya.

Akhir kata, penulis berharap semoga Tuhan membalas segala kebaikan

yang telah diberikan kepada penulis dan semoga Skripsi ini dapat memberikan

manfaat serta menambah pengetahuan tidak hanya bagi penulis tetapi juga bagi

pembaca. Amin

` Malang, 18 Agustus 2017

Penulis

viii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... i

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ............................................................................. iii

ABSTRAK ........................................................................................................... iv

ABSTRACT ......................................................................................................... v

KATA PENGANTAR ......................................................................................... vi

DAFTAR ISI ............................................................................................ viii DAFTAR TABEL ............................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xi

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xii

DAFTAR ISTILAH DAN LAMBANG ............................................................. xiii

BAB 1. PENDAHULUAN .................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 4

1.3 Batasan Masalah ............................................................................... 4

1.4 Tujuan ............................................................................................... 6

1.5 Manfaat ............................................................................................. 6

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 7

2.1 Asma ................................................................................................. 7

2.2 Patogenesa Asma .............................................................................. 8

2.3 Alergen .............................................................................................. 11

2.4 Lipopolisakarida LPS) ...................................................................... 11

2.5 Ovalbumin ........................................................................................ 13 2.6 MDA ................................................................................................ 13

2.7 Eosinofil ............................................................................................ 14

2.8 Tomat (Solanum lypopersicum L.) .................................................... 18

2.9 Whey Kefir ...................................................................................... 19

2.10 Hewan Coba Tikus Model Asma ................................................... 20 BAB 3. KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESA PENELITIAN ............... 23

3.1 Kerangka Konsep .............................................................................. 23

3.2 Hipotesis Penelitian .......................................................................... 26

BAB 4. METODOLOGI PENELITIAN ........................................................... 27

4.1 Waktu dan Tempat ........................................................................... 27

4.2 Bahan dan Alat Penelitian ................................................................ 27

4.2.1 Bahan Penelitian...................................................................... 27

4.2.2 Alat Penelitian ......................................................................... 27

4.3 Sampel Penelitian ............................................................................ 28

4.4 Rancangan Penelitian ....................................................................... 28

4.5 Variabel Penelitian ........................................................................... 29

4.6 Tahapan Penelitian ........................................................................... 30

4.6.1 Pembuatan Whey Kefir dan Tomat ........................................ 30

4.6.2 Preparasi Hewan Coba (Rattus novergicus) ............................ 30

4.6.3 Hewan Model Asma ................................................................ 31

4.6.4 Pemberian Terapi Kombinasi Whey Kefir dan Tomat ........... 32

ix

4.6.5 Pengujian Malondialdehida (MDA) ....................................... 32

4.6.6 Malondialdehida (MDA) ........................................................ 33

4.6.7 Pengukuran Kadar Malondialdehida ...................................... 33

4.6.8 Eosinofil ................................................................................. 34

4.6.9 Analisa Data ........................................................................... 35

BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 36

5.1 Pengaruh Kombinasi Whey Kefir dan Tomat Terhadap Aktivitas

Enzim Malondialdehida MDA pada darah Hewan Tikus (Rattus

novergicus) ....................................................................................... 36

5.2 Pengaruh Kombinasi Whey Kefir dan Tomat Terhadap Kadar Jumlah

Eosinofil pada darah Hewan Tikus (Rattus novergicus) ................. 43

BAB 6. PENUTUP ............................................................................................... 51

6.1 Kesimpulan ....................................................................................... 51

6.2 Saran ................................................................................................. 51

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 52

LAMPIRAN ......................................................................................................... 61

x

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

4.1 Rancangan Penelitian ................................................................................. 28

5.1 Rata-rata kadar malondialdehida pada darah tikus kontrol, tikus yang

diinduksi OVA dan LPS dan tikus yang diterapi dengan kombinasi whey

kefir dan tomat................................................................................................37

5.2 Rata-rata jumlah eosinfil pada darah tikus kontrol, tikus yang diinduksi

OVA dan LPS dan tikus yang diterapi dengan kombinasi whey kefir dan

tomat ............................................................................................................ 44

L 3.1 Perhitungan Pemberian Induksi Ovalbumin ............................................... 64

L 5.1 Komposisi larutan dalam pengukuran kadar MDA .......................... 66

L7.1 Absorbansi Larutan standart MDA 4 ppm pada berbagai panjang

gelombang.................................................................................................... 68

L8.1 Hasil Pengukuran Absorbansi Kurva Baku MDA dengan Panjang

Gelombang max 533 nm .............................................................................. 68

L 9.1 Data Absorbansi MDA ................................................................................ 69

L 9.2 Perhitungan Kadar MDA ............................................................................. 69

L10.1 Uji Normalitas Data MDA ........................................................................ 71

L10.2 Uji Homogenitas MDA............................................................................... 72

L10.3 Uji Statistik ANOVA MDA ....................................................................... 73

L 10.4 Uji Lanjutan Beda Nyata Jujur (BNJ) atau Tukey MDA .......................... 74

L 12.1 Perhitungan jumlah eosinofil ..................................................................... 76

L 12.2 Uji Normalitas Data Eosinofil ................................................................... 78

L 12.3 Uji Homogenitas Eosinofil ........................................................................ 79

L 12.4 Uji Statistik ANOVA Eosinofil ................................................................. 80

L 12.5 Uji Lanjutan Beda Nyata Jujur (BNJ) atau Tukey Eosinofil ..................... 81

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1. Patogenesa Asma ................................................................................................ 9

2.2. Reaksi ”early onset” pada Asma ......................................................................... 10

2.3 Reaksi lambat pada asma .................................................................................... 11

2.4 Gambar Struktur LPS dari Bakteri Gram Negatif............................................... 12

2.5 Gambaran fisiologi eosinofil .............................................................................. 15

2.6 Diffrensiasi eosinofil, menstimulasi pelepasan eosinofil dari sumsum

tulang ke dalam sirkulasi perifer ................................................................................ 17

2.7 Rattus norvegicus ................................................................................................ 21

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Sertifikat Laik Etik ........................................................................................... 61

2. Kerangka Operasional Rancangan Penelitian .................................................. 62

4. Perhitungan Dosis .............................................................................................. 64

4. Pembuatan Whey Kefir dan Tomat .................................................................... 65

5. Komposisi Larutan ............................................................................................. 66

6. Prosedur Pengukuran Kadar MDA ..................................................................... 66

7. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum MDA ........................................... 68

8. Kurva Baku MDA ............................................................................................. 68

9. Data Absorbansi dan Perhitungan Kadar MDA ................................................ 69

10. Hasil Uji Statistika MDA .............................................................................. 71

11. Prosedur pengukuran jumlah eosinofil ............................................................. 75

12. Hasil Uji Statistika Eosinofil ........................................................................ 76

13. Hasil Uji Vitamin C Titrasi (jacobs) ................................................................. 82

14. Dokumentasi Penelitian .................................................................................... 83

xiii

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG

Simbol/singkatan Keterangan

AlOH3 : Alumunium Hidroksida

AMDK :Air Minum Dalam Kemasan:

ANOVA :Analysis of Variance

APC :Antiigen Persenting Cell

BNJ :Beda Nyata Jujur

CD14 :Cluster of Diferentiation

FcɛR1 :Fc epsilon Receptor

GMCSF :Granulocytet Monocyte Colony Stimulating Factor

H2O2 :Hidrogen Peroksida

HCl :Hydrochloric Acid

HDM :House Dust Mite

HE :Hematoksilin-Eosin

IgE :Imunoglobulin E

IL :Interleukin

LBP :Lipopolischaride Binding Protein

LPS :Lipopolisakarida

MBP :Major Basic Protein

MDA :Malondialdehida

MHC :Mayor Histocompatibility

mL :Mililiter

NaCL :Natrium Chlorida

NO :Nitric Oxide

NO2- :Nitrit

NO3- :Nitrat

NOS :Nitric Oxide syntase

O2 :Oksigen

O2- :Superoksida

OH :Hydroxyl radical

ONOO- :Peroxynitrite

OVA :Ovalbumin

PBS :Phosphat Buffer saline

PFA :Paraformaldehid

PUFA :Polyunsaturated Fatty Acid

ppm :parts per million

RAL :Rancangan Acak Lengkap

ROS :Reactive Oxygen Species

rpm :Rotasi per menit

TBA :Thiobarbituric Acid

TCA :Tricarboxylic Acid

Th-2 :T helper-2

TLR-4 :Toll Like Receptor-4

1

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dewasa ini terjadi peningkatan prevalensi dan derajat asma pada anak, baik di

negara maju maupun negara berkembang. Di Indonesia berdasarkan Survei

Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) tahun 1992, asma, bronkhitis kronis dan

emfisiema merupakan penyebab kematian ke-4 di Indonesia atau sebesar 5.6%.

Pada tahun 1995, prevalensi asma diseluruh Indonesia sebesar 13 dari 1000

penderita (PDPI,2004). Prevalensi asma di beberapa daerah Indonesia berkisar

antara 3,7%-15,18%. Faktor gaya hidup dan lingkungan berpengaruh pada

timbulnya asma. Asma dapat terjadi pada segala usia dengan menifestasi yang

sangat bervariasi dan berbeda-beda antara satu individu dengan individu lainnya

(Barnes,1999). Asma dapat dicetuskan oleh beberapa hal seperti alergen, infeksi

saluran nafas, polusi udara, kelelahan, perubahan cuaca dan stress. Prevalensi

asma pada anak-anak bervariasi antara 0-30%, sedangkan pada dewasa secara

umum sekitar 6% pada beberapa negara yang berbeda (NIH,2002).

Pada ilmu kedokteran hewan, asma pada kucing telah dipelajari lebih dari

90 tahun. Asma juga seringkali menyerang hewan terutama pada kucing.

Prevalensi asma pada kucing sekitar 1-5% dari jumlah populasi seluruh dunia.

Prevalensi asma yang tinggi pada kucing terjadi karena adanya kombinasi

penyebab antara faktor genetik dan paparan alergen dari lingkungan (Reinero,

2013). Gejala asma pada kucing mirip dengan gejala asma pada manusia yang

ditandai dengan batuk, bersin, frekuensi nafas yang meningkat, dan hipersalivasi

(Pernans, 2010).

1

2

Asma pada hewan dipengaruhi oleh banyak faktor, salah satunya adalah

infeksi rongga mulut yang telah diketahui mampu menyebabkan keadaan asma

pada anjing dan polusi udara yang mampu menyebabkan gangguan pernafasan

pada kucing. Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Utomo

(2012) paparan lipopolisakrida (LPS) dari bakteri Gram negatif Phorphyromonas

gingivalis mampu meningkatkan tingkat keparahan asma. Bakteri ini banyak

dijumpai pada plak gigi kucing dan anjing. Dari hasil pemeriksaan plak pada gigi

anjing ditemukan bakteri Phorphyromonas gingivalis (68%), Prevotella

intermedia (44%) dan Actinomyces (12%) (Allaker et al., 1997; David et al.,

2005). Beberapa penelitian terbaru menyebutkan bahwa paparan lipopolisakarida

(LPS) merupakan faktor resiko yang memperparah keadaan asma. Sumber bakteri

gram negatif yang berpotensi memproduksi lipopolisakarida (LPS) adalah

Porphyromonas gingivalis. Bakteri Porphyromonas gingivalis merupakan bakteri

rongga mulut yang menyebabkan adanya plak gigi dan periodontitis. Penelitian

yang menjelaskan tentang patomekanisme keparahan asma akibat paparan

lipopolisakarida rongga mulut masih relatif sedikit diketahui (Schwartz, 2002;

Utomo, 2006).

Lipopolisakarida dari Porphyromonas gingivalis akan membentuk interaksi

LPS-LBP melalui Toll-like receptors-4 (TLR-4). Proses tersebut dapat

mengaktivasi sel Th2 dan sel-sel mediator inflamasi lainnya (Wang dan Ohura,

2002; Eisenbarth et al., 2002). Lipopolisakarida (LPS) akan menyebabkan

kerusakan organ paru dan menginduksi produksi dan pelepasan sel inflamatori

seperti eusinofil, neutrofil, monosit, makrofag dan sitokin. Sel-sel inflamasi yang

3

teraktivasi akibat inflamasi menghasilkan oksidan reaktif, seperti Reactive Oxygen

Species (ROS) yang mampu menghasilkan senyawa radikal bebas dan enzim

proteolitik. Radikal bebas mampu menyebabkan peroksidasi lipid pada sel

membran sehingga menyebabkan kerusakan sel membran. Peroksidasi lipid

merupakan proses oksidasi asam lipid tidak jenuh berantai panjang

(Polyunsaturated fatty acids atau PUFA) pada membran sel yang menghasilkan

produk aldehida seperti malondialdehida (MDA) (Sharma et al., 2003).

Peroksidasi lipid yang terjadi akan menyebabkan kerusakan sel epitel pada

bronkiolus (Beumer, 2003).

Saat ini pengobatan asma dapat dilakukan dengan menggunakan obat-obat

bronkodilator dan anti inflamasi yang memiliki efek samping yang beragam,

seperti mual, muntah, hingga hipertensi (Gunawan dkk., 2007). Oleh karena itu

perlu dicarikan alternatif pengobatan asma di antaranya menggunakan bahan

alam. salah satunya buah tomat. Menurut Canene., et al (2005) buah tomat

memiliki kandungan vitamin C, provitamin A, mineral, lycopene serta

bioflavonoid (termasuk likopen, α dan ß-karoten). Vitamin C dan alfa karoten

berperan sebagai antioksidan atau penangkal radikal bebas akibat adanya stressor

dari luar dan memiliki pengaruh paling signifikan untuk meningkatkan daya tahan

tubuh penderita asma dan sebagai anti inflamasi.

Kefir adalah pakan yang mengandung bakteri dan yeast sebagai probiotik

yang dapat berfungsi meningkatkan respon imun melalui mukosa tubuh dengan

menghasilkan antibodi (Suhartanti, 2014). Sari tomat kombinasi whey kefir

diharapkan dapat memperkecil partikel bahan aktif tomat sehingga dapat diserap

4

oleh tubuh secara optimal dan meningkatkan efisiensi vitamin C yang terkandung

dalam sari tomat sehingga dapat berperan sebagai antioksidan.

Penelitian ini dilakukan untuk mengkaji pengaruh pemberian kombinasi

whey kefir dan tomat (Solanum lypopersicum L.) terhadap kadar MDA dan jumlah

eosinofil pada tikus (Rattus norvegicus) model asma.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka dapat dirumuskan

beberapa permasalahan berikut:

1. Apakah terjadi penurunan aktivitas MDA pada tikus model asma yang diberi

kombinasi whey kefir dengan tomat (Solanum Lypopersicum L.)?

2. Apakah terjadi penurunan jumlah eosinofil pada tikus model asma yang diberi

kombinasi whey kefir dengan tomat (Solanum lypopersicum L.)?

1.3 Batasan Masalah

Berdasarkan rumusan masalah yang telah disebutkan, maka penelitian ini

dibatasi pada :

1. Hewan model yang digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus) betina dengan

strain wistar dengan umur 8-12 minggu dan berat badan berkiar antara 150-

250 gram yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP)

UGM Yogyakarta. Penggunaan hewan coba dalam penelitian ini

mendapatkan persetujuan laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas

Brawijaya, No; 605 KEP-UB.

2. Pembuatan tikus yang terkena penyakit asma dilakukan dengan diinduksi

ovalbumin sebanyak 3 kali, induksi yang pertama dan kedua diinjeksi

5

intraperitoneal dan ketiga diinhalasi dengan nebulizer dan lipopolisakarida

dari bakteri Phorphyromonas gingivalis (Utomo, 2006). Perlakuan pada tikus

dilakukan pada hari pertama setelah dilakukan aklimatisasi dengan injeksi

ovalbumin (OVA I) (Sigma-Aldrich) 10 μg/ml secara intraperitoneal dalam

AlOH3 (alumunium hydroxide ) dalam PBS (phosphate buffer saline) dan

injeksi ovalbumin (OVA II) dilakukan pada hari ke-14. Pemaparan ovalbumin

(OVA III) secara inhalasi dilakukan pada hari ke-21 menggunakan tabung

transparan yang dihubungkan dengan Omron CompAir Compressor

Nebulizer. Injeksi lipopolisakarida (LPS) intrasulkuler dilakukan dengan

dosis 1 μg/ml pada sulkus gingiva molar rahang atas kiri tikus (Stephanie et

al, 2002). Injeksi LPS intrasulkuler dilakukan berturut-turut pada hari ke 10

dan 11 (Utomo, 2006).

3. Kefir yang digunakan adalah lapisan paling bawah kefir berupa whey kefir

dengan karakteristik lebih encer dan lebih bening yang dicampurkan dengan

sari tomat (Solanum lypopersicum L.) yang kemudian dilakukan uji kadar

vitamin C di Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya.

4. Tomat yang digunakan adalah tomat yang berwarna merah yang diambil

sarinya dan disaring yang kemudian dilakukan uji kadar vitamin C dengan uji

titrasi (Jacobs) di Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya.

5. Terapi pemberian kombinasi whey kefir dengan tomat diberikan pada hewan

coba dimulai pada hari ke-22, tiap hewan coba diberikan terapi secara per oral

dengan dosis pemberian sebesar 1 ml/200g BB, 1,5 ml/200g BB dan 2

ml/200g BB.

6

6. Variabel yang diamati dalam penilitian ini adalah kadar MDA yang diukur

menggunakan spectrophotometer UV-1601 pada panjang gelombang 580 nm

dan uji jumlah eosinophil dengan menggunakan alat ABX micros 60 Switch.

1.4 Tujuan Penelitian

Berdasarkan rumusan masalah yang telah diuraikan, maka tujuan dari

penelitian ini adalah :

1. Mengetahui adanya penurunan kadar enzim MDA pada tikus model asma

setelah diberikan kombinasi whey kefir dengan tomat (Solanum lypopersicum

L.).

2. Mengetahui adanya penurunan jumlah eosinofil pada hewan tikus (Rattus

norvegicus) model asma yang diberikan kombinasi whey kefir dengan tomat

(Solanum lypopersicum L.).

1.5 Manfaat Penelitian

Penelitian ini bermanfaat memberikan informasi tentang pemanfaatan whey

kefir dan buah tomat (Solanum lypopersicum L.) sebagai bahan terapi penyakit

asma pada hewan lain (pet animal).

9

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

1.1 Asma

Menurut Nelson (2007), asma merupakan penyakit inflamasi kronis pada

saluran pernapasan yang menyebabkan penyempitan saluran nafas. Inflamasi

didefinisikan sebagai reaksi lokal jaringan terhadap infeksi atau cidera

(Baratawidjaja dan Rengganis, 2010). Patomekanisme asma pada dasarnya terbagi

kedalam dua tahapan yaitu tahapan sensitisasi dan tahapan pemaparan ulang

terhadap alergen. Tahapan sensitisasi dimulai ketika ada paparan alergen seperti

Ovalbumin (Ova), kemudian alergen ditangkap oleh makrofag atau sel dendrit

sebagai Antigen Presenting Cell (APC). Alergen yang telah tertangkap kemudian

dibawa masuk melalui sistem limfatik untuk dipresentasikan kepada sel T yang

akan memicu produksi sitokin pro inflamasi seperti IL 12. Sekresi sitokin pro

inflamasi akan menyetimulasi sel B akan diferensiasi menjadi sel B plasma dan

akan menghasilkan IgG (Antibodi protective yang normal dan tidak dihasilkan

pada reaksi alergi). Paparan antigen mengaktifkan sel Th-2 dan memproduksi

sitokin pro inflamasi seperti IL-4, IL-5 dan IL-13 yang merangsang sel B

berdiferensiasi menjadi sel plasma yang membentuk IgG menjadi IgE

(imunoglobulin yang bekerja spesifik terhadap reaksi alergi) yang dilepas dan

diikat oleh FcɛR1 pada sel mast dan basofil sehingga akan menimbulkan

pelepasan mediator amina (histamin, leukotrien dan sitokin) yang mengawali

reaksi awal asma yang dikarakterisasi dengan hipersekresi mukus, perubahan

struktur saluran dan merangsang kontraksi otot polos sehingga menimbulkan

penyempitan saluran nafas (Barnes et al., 1998).

7

10

Obstruksi saluran pernapasan dapat menyebabkan batuk, rasa berat di dada

dan sesak. Hiperesponsif saluran nafas akan menyebabkan terjadinya

bronkokonstriksi. Pada penderita asma terjadi penebalan lapisan otot polos yang

merupakan hasil peningkatan ukuran sel otot polos (hipertropi) sehingga

menyebabkan penyempitan saluran pernapasan ( Barnes et al., 1998;Busse and

Lemanske, 2001).

2.2 Patogenesa Asma

Asma merupakan suatu sindroma yang sangat kompleks melibatkan faktor

genetik, antigen, berbagai sel inflamasi, mediator dan sitokin yang akan

menyebabkan kontraksi otot jalan napas, hiperaktivitas bronkus dan inflamasi

jalan napas. Sistem imun dibagi menjadi dua yaitu spesifik dan non spesifik.

Spesifik ditandai oleh produksi dan sekresi antibodi spesifik sel limfosit B.

Sedangkan non spesifik diperankan oleh limfosit T. Sel limfosit T helper (CD4)

dibedakan menjadi Th1 dan Th2. Sel Th1 mensekresi interleukin-2 (IL-2), IL-3,

granulocytet monocyte colony stimulating factor (GMCSF), interferon y (IFN-y)

dan tumor necrosis factor-a (TNF-a). Sedangkan Th2 mensekresi IL-3, IL-4, IL-5,

IL-9, IL-13 dan GMCSF. (Gambar 2.1)

11

Gambar 2.1. Patogenesa asma

Respon imun dimulai dengan masuknya alergen kedalam seluran nafas

akan ditangkap oleh sel dendrit yang merupakan sel pengenal antigen (Antigen

Persenting Cell/APC). Antigen diproses di dalam APC dan dipresentasikan

kepada sel limfosit T dengan bantuan Mayor histocompatibility (MHC) kelas II,

limfosit T akan membawa ciri antigen spesifik, teraktivasi dan berdiffrensiasi ke

Th2.4,5 Subtipe Th2 ini merupakan subtipe utama yang terlibat pada asma,

mensekresi berbagai sitokine yang bertanggung jawab bagi berkembangnya reaksi

tipe lambat atau cell- mediated hypersensitivity reaction. (NIH,2002)

Rangsangan interleukin 4 dan interleukin 13 dari Th2, akan memacu sel

limfosit B untuk mensintesa IgE. IgE akan dilepas limfosit B dan melekat pada

high affiniting IgE reseptors (FceRI) pada permukaan sel mast. Bila alergen yang

sama masuk lagi maka akan diikat oleh IgE dipermukaan sel mast. Cross Linked

Reseptor IgE dengan alergen akan mengaktifkan sel mast yang menyebabkan

degranulasi sel mast sehingga terjadi pelepasan mediator inflamasi seperti

histamin serta newly generated modiator antara lain: prostaglandin, leukotrin yang

12

menyebabkan terjadinya kontraksi otot polos bronkus, sekresi mukus, vasodilitasi.

Mediator inflamasi menginduksi kebocoran mikrovaskuler yang melibatkan

eksudasi plasma kedalam saluran napas. Kebocoran plasma protein menginduksi

penebalan dan edema dinding saluran napas yang menyebabkan penyempitan

lumen saluran napas, sehingga menyebabkan kontraksi otot pernapasan dan reaksi

ini berlangsung selama 1-2 jam. Reaksi ini disebut ” early onset ” pada asma

(Gambar 2.2). Degranulasi sel mast juga menghasilkan sejumlah sitokin a.l. IL-

4,IL-5, IL-6,IL-13 dan TNF- a. (NIH,2002)

Gambar 2.2. Reaksi ”early onset” pada asma

Degranulasi sel mast beserta limfosit T subtipe Th2 akan menggerakkan

dan mengaktifkan sel-sel inflamasi eosinofil, basofil, neutrofil dan makrofag,

melalui aktivitas sel endotel yang akan menyebabkan pembentukan molekul

adhesi. Reaksi ini akan terjadi pada 4-8 jam setelah reaksi pertama dan

menyebabkan kedatangan sel-sel radang sehingga meningkatkan pelepasan

mediator. Reaksi ini disebut reaksi tipe lambat. (Gambar 2.3)

13

Gambar 2.3. Reaksi lambat pada asma

2.3 Alergen

Alergen yang umum digunakan dalam pembuatan hewan model asma untuk

menimbulkan peradangan pada paru adalah ovalbumin (Ova) (Kumar et al.,2008).

Ovalbumin merupakan 60-65% komponen dalam putih telur, dan terdiri atas 385

asam amino dengan massa molekul 45 kDa (Huntingeston dan Stein, 2001).

Alergen lain yang sering digunakan untuk menginduksi asma adalah house dust

mite (HDM) dan ekstrak kecoa (Johnson et al., 2004; Sarpong et al., 2003).

Paparan kronik ovalbumin sebagai alergen akan menimbulkan perubahan struktur

saluran nafas dan inflamasi (Barlianto dkk., 2009). Pemberian ovalbumin juga

memberikan gambaran peningkatan IgE dan terjadi inflamasi yang ditandai

dengan infiltrasi sel radang dan eosinofil pada histopatologi jaringan paru.

Sensitisasi menggunakan ovalbumin secara inhalasi pada hewan coba

menunjukkan airway remodeling seperti gambaran asma pada manusia (Tang et

al., 2006).

2.4 Lipopolisakarida (LPS)

Lipopolisakarida (LPS) merupakan dinding sel bakteri Gram negatif yang

mampu memperparah keadaan asma. Lipopolisakarida yang biasa digunakan

untuk memperparah kejadian asma berasal dari LPS bakteri Porphyromonas

14

gingivalis. Bakteri ini merupakan bakteri anaerob Gram negatif yang tidak

berspora dan tidak mempunyai alat gerak (non motile) (Iman dkk., 2011).

Lipopolisakarida bersifat sebagai imunostimulan yang potensial berasal dari

dinding sel bakteri Gram negatif (Friskawati, 2001).

Gambar 2.4. Gambar Struktur LPS dari Bakteri Gram Negatif (Iman,

dkk 2011)

Dinding bakteri Gram negatif tersusun dari Lipopolisakarida (LPS) (Gambar

2.4). Lipopolisakarida sendiri terdiri dari tiga bagian yaitu lipid A, polisakarida

inti, dan polisakarida O. Sifat antigenik bakteri Gram negatif ditentukan oleh

lipopolisakarida terutama polisakarida A. Lipid A menyebakan bakteri lebih tahan

terhadap fagositosis (Iman, dkk 2011). Penggunaan LPS dari bakteri

Porphyromonas gingivalis, dikarenakan bakteri ini banyak terdapat pada karang

gigi yang mampu menimbulkan radang kronis pada gusi dan jaringan sekitar akar

gusi (Allaker et al., 1997 ; David et al.,2005). Menurut Beumer et al (2003),

Lipopolisakarida dapat terikat dengan dinding sel saluran pernapasan melalui

bantuan senyawa Lipopolysacharide-binding protein (LBP) dan mengantarkan

LPS untuk dikenali CD14. Ikatan LPS dan CD14 akan melawati Toll Like

15

Receptor-4 (TLR-4) sehingga akan meningkatkan aktivasi sel dendrit dan Th-2

akan membuat sel B akan berdiferensiasi menjadi sel B plasma yang

memproduksi IgE dan menyebabkan inflamasi serta remodeling jaringan saluran

pernafasan.

Lipopolisakarida mampu menginduksi produksi dan pelepasan sel-sel

radang dan senyawa radikal bebas dalam jumlah besar yang sangat toksik

sehingga akan menimbulkan kerusakan oksidatif dari tingkat sel sampai organ

tubuh (Beume et al., 2003). Berdasarkan penelitian Utomo (2006), paparan LPS

pada tikus asma mampu memperparah kejadian asma yang mampu menimbulkan

terjadinya inflamasi pada saluran pernafasan

2.5 Ovalbumin

Ovalbumin adalah glikoprotein dengan berat 45.000 dalton. Ovalbumin

sering dipakai sebagai bahan sensitisasi imun mencit yang dapat diberikan secara

inhalasi, oral, maupun intraperitoneal. Sensitisasi ovalbumin melalui

intraperitoneal lebih menguntungkan dalam hal ketepatan dosis dan pemberian

tidak perlu setiap hari. Sensitisasi dengan ovalbumin tersebut telah dilaksanakan

pada beberapa penelitian (Kartikawati, 2003). Penelitian Kumar et al, (2008) telah

menggunakan tikus putih (Rattus norvegicus) sebagai hewan model asma

menggunakan albumin (OVA) dan Alumunium Hydroxide (AlOH3) sebagai

sensitisasi penginduksi asma.

2.6 Molondialdehida (MDA)

Malondialdehida (MDA) merupakan hasil pemecahan lipid peroksida dan

merupakan salah satu penanda adanya stres oksidatif. Lipid peroksida adalah hasil

16

reaksi oksidasi radikal bebas dengan lipid membran sel jaringan tubuh atau

dengan asam lemak tak jenuh (Suwandi, 2012). Hasil akhir dari reaksi ini akan

membentuk hidrogen peroksida, yang berefek pada kerusakan membran sel antara

lain dengan mengubah struktur dan fungsi membran, dalam kondisi yang lebih

ekstrim menimbulkan kematian sel (Halliwell and Gutteridge, 2007). Stres

oksidatif dalam tubuh disebabkan oleh adanya radikal bebas yang dihasilkan oleh

ROS (Widodo, 1995).

2.7 Eosinofil

Pada orang normal, kadar eosinofil hanya sebagian kecil dari lekosit darah

perifer dan keberadaannya di jaringan terbatas. Pada penyakit tertentu, eosinofil

dapat berakumulasi pada darah tepi atau jaringan tubuh. Gangguan yang

menyebabkan eosinofilia didefinisikan sebagai akumulasi abnormal eosinofil

dalam darah atau jaringan sehingga menimbulkan gejala klinis. (Rahmawati,2003)

Normalnya kadar eosinofil hanya 1-3 % dari lekosit darah tepi, dan batas

dari rentang nilai normal adalah 350 sel/mm3 darah. Eosinofil diklasifikasikan

ringan (351-1500 sel/mm3), sedang (>1500-5000 sel/mm3) atau berat (>5000

sel/mm3) (Rothenberg,1998).

Eosinofil memproduksi mediator inflamatori yang unik yang disimpan

dalam granul-granul dan disintetis setelah sel ini teraktivasi, granul tersebut

mengandung kristaloid yang terdiri dari Major Basic Protein (MBP) dan matrix

yang terdiri dari Eosinophil Cationic Protein (ECP), peroxidase eosinofil dan

Eosinophil Derived Neurotoxin (EDN) yang mengandung efek sitotoksin pada

epitelium repiratori. Eosinofil juga menghasilkan berbagai sitokin yang sebagian

17

disimpan didalam granul dan mediator lipid yang dihasikan setelah sel ini

teraktivasi, antara lain rantes, eotaxin dan platelet activating factor yang berperan

mempercepat migrasi eosinofil. (Rahmawati,2003) (Gambar 2.5)

Eosinofil terjadi melalui 4 proses:

− diffrensiasi sel-sel progenitor dan proliferasi eosinofil pada sumsum tulang

− intaraksi antara eosinofil dan sel endotel, termasuk migrasi eosinofil

− rangsangan kimia yang menarik eosinofil ke lokasi tertentu dan aktivasi

serta destruksi eosinofil

Gambar 2.5 Gambaran fisiologi eosinofil

Eosinofil diproduksi oleh sel progenitor dalam sumsum tulang. Tiga sitokin

yakni interleukin-3, IL-5 dan granulocyte macrophage colony stimulating faktor

(GHCSF) adalah bagian penting dalam mengatur perkembangan eosinofil. IL-5

adalah spesifik untuk “eosinofil Lineage” dan bertanggung jawab terhadap

18

diffrensiasi eosinofil, menstimulasi pelepasan eosinofil dari sumsum tulang ke

dalam sirkulasi perifer. (Rahmawati,2003)

Eosinofil di sirkulasi akan berputar pada endothelium yang diperantarai oleh

E- Selectin. Kemudian terjadi perlengketan (adhesion) antara eosinofil dan sel

endothelial yang diperantarai oleh perlengketan molekul-molekul pada sel

endothelial dan ”counter –ligand” pada eosinofil. Perlekatan ini melalui

perlengketan molekul-molekul dengan kelompok integrin dari eosinofil, yakni

kelompok CD-18 (B2 Integrin) dan molekul antigen 4 (VLA-9 atau B1 Integrin).

B2 Integrin berintereaksi dengan molekul 1 intercelular (I-CAM 1) yang melekat

pada sel-sel endothelial dan B1 Integrin berintereaksi dengan molekul yang

melekat pada sel vaskuler (VCAM–1). Jalur CD18-ICAM-1 digunakan untuk

semua lekosit sedangkan jalur VLA-9 – VCAM-1 digunakan oleh eosinofil dan

sel mononukler. ICAM-1 diinduksi oleh berbagai mediator inflamasi antara lain:

interleukin 1 dan TNF-a sedangkan VCAM-1 diinduksi oleh interleukeukin 4,

kemudian esinofil bermigrasi kedalam jaringan yang diperankan oleh molekul-

molekul chemoattractant local seperti leukotrin B4, mediator–mediator lipid,

interleukin, dan berbagai chemokines. Dari ke semua subtansi yang relatif spesifik

untuk eosinofil adalah eotaxin-1 dan eotaxin-2 dan efeknya dipertinggi oleh

interleukin -5. Eosinofil dapat hidup dan bertahan di jaringan dalam jangka waktu

lama (sampai berminggu-minggu) bergantung pada sitokin micro lingkungan

(micro enviroment). Sitokin IL-3, IL-5 dan GM-CSF menghambat apoptasi

eosinofil sekurang kurangnya 12 sampai 14 hari pada jaringan sebaliknya hanya

bertahan 48 jam pada keadaan tidak adanya sitokin, eosinofil jaringan juga dapat

19

meregulasi masa hidupnya sendiri melalui jalur autokrin. (Rahmawati,2003)

(Gambar 2.6)

Setelah di jaringan eosinofil melepaskan mediator LTC, PAF, radikal bekas

oksigen, MBP, ECP, EDN sehingga terjadi kerusakan epitel saluran nafas. Major

basic protein secara langsung meningkatkan reaktifasi otot polos dan merangsang

degranulasi sel mast dan basofil.(Rahmawati,2003)

Remodeling merupakan reaksi tubuh untuk memperbaiki jaringan yang rusak

akibat inflamasi dan diduga menyebabkan perubahan ireversibel pada asma.

Fibroblas berperan penting dalan remodeling dan proses inflamasi. Fibroblas

menghasilkan kalogen, serat elastik dan retikuler, proteoglikans dan glikoprotein

dari matriks ekstraselular (ECM). (Rahmawati,2003)

Gambar 2.6. Differensiasi eosinofil, menstimulasi pelepasan eosinofil dari

sumsum tulang ke dalam sirkulasi perifer

20

2.8 Tomat (Solanum Lypopersicum L.)

Tomat (Solanum lycopersicum syn. Lycopersicum esculentum) adalah

tumbuhan keluarga Solanaceae, berasal dari Amerika Tengah dan Selatan, dari

Meksiko sampai Peru. Kata tomat berasal dari bahasa Aztek, salah satu suku

Indian yaitu xitomate atau xitotomate. Tanaman tomat menyebar ke seluruh

Amerika, terutama ke wilayah yang beriklim tropik, sebagai gulma. Penyebaran

tanaman tomat ini dilakukan oleh burung yang makan buah tomat dan kotorannya

tersebar kemana-mana. Penyebaran tomat ke Eropa dan Asia dilakukan oleh orang

Spanyol. Tomat ditanam di Indonesia sesudah kedatangan orang Belanda. Dengan

demikian, tanaman tomat sudah tersebar ke seluruh dunia, baik di daerah tropis

maupun subtropis (Pracaya, 2012).

Dalam sistem klasifikasi menurut Huffman (2006), tomat diklasifikasikan

sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Kelas : Dicotyledonae

Ordo : Solanales

Famili : Solanaceae

Genus : Solanum

Spesies : Solanum lycopersicum L.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Agarwal and Rao (2000), buah

tomat adalah salah satu jenis buah yang banyak mengandung antioksidan yang

sangat berguna untuk menangkal radikal bebas. Senyawa antioksidan membantu

21

mengikat radikal bebas yang berlebihan sehingga mencegah perubahan oksidatif

yang abnormal.

Setiap jenis tomat mengandung unsur gizi yang hampir sama, yakni kaya

akan vitamin A dan C, mineral, serat, zat besi, senyawa fenolik dan karotenoid.

Kandungan senyawa lain di antaranya solanin (0,007 %), saponin, asam folat,

asam malat, asam sitrat, bioflavonoid (termasuk likopen, α dan ß-karoten),

protein, lemak, vitamin, mineral dan histamin (Canene-Adam et al., 2005).

Kandungannya lycopene di dalam sebutir tomat mencapai sekitar 50%, yaitu

dalam 100 gram tomat mencapai sekitar 3-5 mg. Lycopene merupakan senyawa

antioksidan kuat golongan karetenoid dan mempunyai potensi yang tinggi dalam

menghambat radikal bebas, yang dapat merusak sel dan radiasi sinar UV. Selain

itu likopen juga mampu meningkatkan hidrogen peroksida dan nitrogen peroksida

(Teti, 2009).

2.9 Whey Kefir

Kefir adalah minuman fermentasi yang memiliki kemampuan probiotik.

Asam laktat sebagai penghambat bakteri pathogen yang dihasilkan oleh kefir pada

saat proses fermentasi berasal dari laktosa yang terkandung dalam susu sebagai

medium kefir juga mengandung CO2, diasetil, asetaldehida dan hidrogen

peroksida dan bakteriosin suatu senyawa protein yang menunjukkan aktivitas

antibakteri terhadap bakteri sejenis (Surono, 2004).

Pada pembuatan kefir secara tradisional, kefir dibuat dengan menambahkan

starter kefir pada susu segar. Starter kefir memiliki komposisi protein,

polisakarida dan campuran beberapa jenis mikroba. Bakteri asam laktat dan

22

kapang yang terdapat pada starter kefir hidup bersimbiosis dan berfungsi pada

proses fermentasi asam laktat dan alkohol. Starter kefir dapat memecah laktosa

sehingga Starter kefir tersebut dapat digunakan untuk fermentasi whey kefir (Ozer

dan Kirmaci, 2010).

Whey kefir merupakan produk susu fermentasi yang kaya akan senyawa

antimikroba diantaranya asam organik, peptida dan eksopolisakarida. Komponen

ini merupakan hasil metabolisme Bakteri Asam Laktat (BAL) (Suhartanti, 2014)

2.10 Hewan Coba Tikus Model Asma

Hewan percobaan yang umum digunakan dalam penelitian ilmiah adalah

tikus putih. Tikus putih (Rattus norvegicus) telah diketahui sifat-sifatnya secara

baik, mudah dipelihara, dan merupakan hewan yang adaptif serta cocok untuk

berbagai penelitian. Ciri-ciri morfologi Rattus norvegicus antara lain memiliki

hidung tumpul, panjang badan 18-25 cm, kepala dan badan lebih pendek dari

ekornya, serta telinga relatif kecil dan tidak lebih dari 20-23 mm. Rattus

norvegicus memiliki waktu hidup 2,5 tahun sampai 3,5 tahun, denyut jantung 330-

480 kali permenit, frekuensi respirasi 85 kali permenit dan memasuki masa

dewasa pada usia 40-60 hari (Armitage, 2004). Pengembangan hewan model

untuk penyakit alergi seperti asma, rinitis, alergi makanan telah banyak dilakukan

pada tikus (Nials et al., 2008). Penggunaan tikus sebagai hewan model asma

dikarenakan tikus memilki beberapa keunggulan yaitu produksi IgE yang

merupakan antibodi anafilaksis (hipersensitivitas terhadap antigen) terbesar.

Selain itu tikus memiliki kemampuan untuk mengalami airway hipereaktivitas

23

yang lebih lama (Zosky & Sly, 2007). Penelitian Kumar et al., (2008) telah

menggunakan Ovalbumin

(OVA) dan Alumunium Hydroxide (AlOH3) pada hewan coba sebagai

sensitisasi alergi akut penginduksi asma, yang diketahui dapat membantu

pembentukan T helper 2 (Th-2) oleh sistem imun ketika terpapar antigen.

Tikus Rattus norvegicus merupakan hewan yang umum digunakan dalam

penelitian, karena mudah dipelihara, secara garis besar fungsi dan bentuk organ

serta proses biokimianya antara tikus dan manusia memiliki banyak kesamaan

(Suckow, 2006). Rattus norvegicus telah digunakan sebagai hewan model asma

oleh Epstein (2004), hewan ini memiliki waktu hidup 2,5 tahun sampai 3,5 tahun,

berat badan jantan 300-500 g dan betina 250-300 g, denyut jantung 330-480 kali

permenit, frekuensi respirasi 85 kali permenit dan memasuki masa dewasa pada

usia 40-60 hari. (Gambar 2.1)

Gambar 2.7 Rattus norvegicus (Johson, 2010)

Menurut Rukmanasari (2010) tikus yang digunakan sebagai hewan coba

dalam penelitian adalah Rattus norvegicus strain Wistar yang memiliki klasifikasi

sebagai berikut:

Kingdom : Animalia

Kelas : Mammalia

24

Ordo : Rodentia

Famili : Muridae

Genus : Rattus

Spesies : Rattus norvegicus

Penelitian dengan hewan coba yang sama telah dilakukan oleh Utomo

(2012) yang menggunakan tikus putih (Rattus norvegicus), induksi OVA dan LPS

dapat memicu respon imun. Paparan LPS pada hewan model asma akan

meningkatkan reaksi alergi dan inflamasi. Hewan model asma juga telah dimuat

dalam penelitian Kumar et al., (2008) sebagai hewan model asma yang diinduksi

oleh ovalbumin (OVA) dan Alumunium Hydroxide (AlOH3) sebagai sensitisasi

penginduksi asma. Induksi sensitisasi dilakukan secara intra peritoneal dan secara

inhalasi menggunakan ovalbumin akan menginduksi pembentukan T helper 2

(Th2). Tikus putih juga memiliki IgE sebagai antibodi pertama untuk merespon

alergi. Tikus putih memiliki kemampuan hipersensitivitas yang lama dan memiliki

sel-sel antibodi yang lengkap seperti sitokin, growth factor, dan cell surface

marker membuat spesies ini sesuai untuk penelitian tentang respon imun pada

saluran pernapasan (Shin et al., 2009).

23

BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESA PENELITIAN

3.1 Kerangka Konsep

Gambar 3.1 Kerangka Konsep Penelitian

Keterangan :

: Patomekanisme : Pengaruh induksi alergen : Variabel Bebass

: Terapi : Pengaruh pemberian terapi

: Variabel tergantung

Tikus

Sistem Imun

Non Spesifik

Ovalbumin 1

Th2

Sel B

Ig E

Sel Mast

Pelepasan mediator inflamasi

Inflamasi

Eosinofil

Radikal Bebas

H2O

2 OH, O

2

Stress Oksidatif

Peroksidasi Lipid

(Poliunsaturated Fatty

Acid PUFA)

MDA

Sel Fagosit

Sitokin Histamin

Mediator inflamasi

Ovalbumin II

Ovalbumin III

(Inhalasi)

Sistem Imun

Spesifik

Sel T

LPS

Kombinasi

Whey

Kefir dan

Tomat

23

24

Asma adalah gangguan inflamasi yang bersifat kronik pada saluran

pernafasan. Penelitian ini menggunakan 3 tahap pemberian ovalbumin dimana

pemberian pertama berfungsi sebagai sensitivasi untuk mengaktifkan innate

immunity respon. Pemberian Ovalbumin kedua diberikan sebagai aktivator dan

akan menginduksi kerja sel adaptif. Pemberian ovalbumin ketiga secara inhalasi

berfungsi sebagai efektor (Suliani, 2003).

Induksi OVA 1 berfungsi sebagai sensitisasi untuk mengaktifkan innate

immunity yang kemudian akan merangsang pengaktifkan sel fagositosis berupa

neutrofil dan makrofag untuk melawan radikal bebas. Proses fagositosis akan

menghasilkan radikal bebas lebih banyak yang akan memicu proses inflamasi.

Induksi OVA 2 berpengaruh dengan respon imun dimulai dengan masuknya

alergen kedalam seluran nafas akan ditangkap oleh sel dendrit yang merupakan sel

pengenal antigen (Antigen Persenting Cell/APC). Antigen diproses di dalam APC

dan dipresentasikan kepada sel limfosit T dengan bantuan Mayor

histocompatibility (MHC) kelas II, limfosit T akan membawa ciri antigen spesifik,

teraktivasi dan berdiffrensiasi ke Th2. Subtipe Th2 ini merupakan subtipe utama

yang terlibat pada asma, mensekresi berbagai sitokin yang bertanggung jawab

bagi berkembangnya reaksi tipe lambat atau cell- mediated hypersensitivity

reaction (NIH,2002).

Induksi OVA 3 secara inhalasi berfungsi sebagai efektor untuk

mengaktifkan sel Th2. Sel Th2 yang akan berdiferensiasi menjadi sel B

berdiferensiasi sel plasma yang kemudian akan menghasilkan IgE. Stimulasi IgE

akan berikatan dengan reseptor Fc dapat menyebabkan degranulasi sel mast

25

(Suliani, 2003). Degranulasi sel mast akan mengakibatkan pelepasan mediator

inflamasi seperti histamin serta newly generated modiator antara lain:

prostaglandin, leukotrin yang menyebabkan terjadinya kontraksi otot polos

bronkus, sekresi mucus dan vasokontriksi. Mediator inflamasi menginduksi

kebocoran mikrovaskuler yang melibatkan eksudasi plasma kedalam saluran

napas dan dapat mengeluarkan sitokin antara lain IL-4,IL-5, IL-6,IL-13 dan TNF-

a. Asam Arakidonat (AA) mengikat COX-1 dan COX-2 yang menghasilkan

inflamasi melalui (prostaglandin E 2 ) PGE2 (NIH,2002).

LPS digunakan untuk menginduksi asma sebagai antigen yang akan

ditangkap oleh Lipopolysacharide Binding Protein (LBP). Ikatan LPS-LBP

dikenali oleh toll like receptor-4 (TLR-4) yang nantinya akan berikatan dengan sel

mast. Degranulasi sel mast beserta limfosit T subtipe Th2 akan menggerakan dan

mengaktifkan sel-sel inflamasi eosinofil (NIH,2002).

Oksigen reaktif yang terlepas menyebabkan ketidakseimbangan antara

radikal bebas dan antioksidan sehingga menimbulkan stres oksidatif.

Malondialdehida mengkatalis dismutasi radikal bebas superoksida O2-

menjadi oksigen dan hidrogen peroksida (H2O2), selanjutnya Glutation

Peroksidase membuang hidrogen peroksidase (H2O2) menjadi H2O dan O2,

sehingga MDA ini penting sebagai enzim antioksidan endogen pada sel yang

terkena oksigen (Granot dan Kohen, 2004).Radikal bebas akan bereaksi dengan

asam lemak tidak jenuh (PUFA) penyusun membran sel untuk mencapai

keseimbangan atau disebut sebagai proses peroksidasi lipid yang menghasilkan

26

produk aldehida berupa MDA. Penurunan MDA juga menggambarkan stress

oksidatif yang sedang berlangsung (Comhair et al, 2005).

Pemberian kombinasi whey dan tomat (Solanum lypopersicum L.) yang

memiliki kandungan vitamin C yang berfungsi sebagai antioksidan di dalam

tubuh (Sofia, 2013). Kandungan flavonoid sebagai antioksidan didalam tubuh

akan berikatan dengan radikal bebas menjadi radikal fenoksil flavonoid sehingga

kondisi radikal bebas tidak reaktif. Kondisi ini akan menurunkan kondisi stress

oksidatif dalam tubuh berkurang, sehingga aktivitas enzim MDA menurun.

Flavonoid dan biopeptida dari whey kefir dapat berfungsi untuk menurunkan

jumlah eosinofil dan mengurangi pelepasan sel-sel inflamasi. Berkurangnya sel-

sel inflamasi di dalam tubuh mengakibatkan berkurangnya mediator inflamasi

sehingga kerusakan jaringan akan berkurang (Laksana,2014).

3.2 Hipotesis Penelitian

Dari rumusan masalah yang telah ada, maka hipotesis yang dapat diajukan

adalah sebagai berikut ini: Kombinasi pemberian whey kefir dan Tomat (Solanum

Lypopersicum L.) mampu menurunkan aktivitas malondialdehide (MDA) pada

hewan tikus (Rattus norvegicus) model asma yang telah di papar dengan

Lipopolisakarida dan ovalbumin serta dapat menurunkan jumlah eosinofil.

28

BAB 4 METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei– Juni 2016 di Laboratorium Hewan

Coba, Jurusan Biologi, Fakultas Science dan Teknologi, Universitas Islam Negeri

Malang.

4.2 Bahan dan Alat Penelitian

4.2.1 Bahan Penelitian

Tikus putih (Rattus norvegicus) Strain Wistar jantan, ovalbumin (Sigma-

Aldrich), LPS1435/1449 dari bakteri Porphyromonas gingivalis, NaCl fisiologis,

AlOH3, PBS, akuades, tirosin, Tris-HCL (Biomedical), whey kefir dan tomat

(Solanum lycopersicum L.), serum darah, plasma darah, 550 µL aquades, 100 µL

TCA 100%, 250 µL HCl 1N, 100 µL Na-Thio 1%

4.2.2 Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bak pemeliharaan hewan

coba, alat bedah, cawan petri, gelas objek, labu ukur (10 ml dan 1000 ml),

pengaduk kaca, mikro pipet (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL), microtube, mortar,

lemari pendingin, autoklaf, Omron CompAir Compressor Nebulizer, tisu, sarung

tangan, glove, masker, yellow tip, blue tip, white tip, vortex, disposable syringe

32 G 1 mL, spuit, sentrifugator, sonikator, timer, tabung EDTA, Tabung ependorf,

spektrofotometer UV-VIS, spuit 3 ml, vortex, penangas air suhu 100OC,

spektrofotometer (Shimadzu UV-visible spectrophotometer UV-1601), tabung

reaksi, plastik wrap, pendingin suhu 4oC, ABX micros 60 Switch,

27

29

4.3 Sampel Penelitian

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini yaitu hewan coba berupa tikus

putih (Rattus norvegicus) strain Wistar jantan dengan berat badan 150-250 g

berumur 8 – 12 minggu yang didapatkan dari Unit Pengembangan Hewan

Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta.

4.4 Rancangan Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratorik dengan

menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Rancangan eksperimental yang

digunakan adalah rancangan eksperimen sederhana dimana subyek dibagi menjadi

5 kelompok secara random. Tiap kelompok terdiri dari 4 tikus. Kelompok 1

adalah tikus sehat (kontrol negatif), kelompok 2 adalah tikus diberi OVA + LPS

(kontrol positif), sedangkan kelompok A, B dan C diberi OVA+LPS+ kombinasi

whey kefir dan tomat dengan dosis 200 mg/Kg BB

Tabel 4.1 Rancangan Penelitian

Kelompok

Keterangan

Variabel yang diamati

Kadar

MDA

Jumlah

Eosinofil

(Kontrol

negatif)

Tanpa perlakuan

(Kontrol

positif)

Pemberian

ovalbumin dan

LPS

Perlakuan A Pemberian

ovalbumin dan

LPS serta diberi

whey kefir dan

tomat dosis

whey kefir dan

tomat1 mL/200g

BB

Perlakuan B Pemberian

ovalbumin dan

LPS serta diberi

30

whey kefir dan

tomat dosis

whey kefir dan

tomat1,5

mL/200g BB

Perlakuan C Pemberian

ovalbumin dan

LPS serta diberi

whey kefir dan

tomat dosis

whey kefir dan

tomat2 mL/200g

BB

Rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan desain

Post Test Control Only. Menggunakan besaran sampel dengan rumus :

t (n-1) ≥ 15

5 (n-1) ≥ 15 Keterangan :

5n-5 ≥ 15 t = Jumlah kelompok perlakuan

5n ≥ 20 n = Jumlah ulangan yang diperlukan

n ≥ 20/5

n ≥ 4

Berdasarkan perhitungan di atas, maka untuk 5 macam kelompok perlakuan

diperlukan jumlah ulangan minimal 4 kali dalam setiap kelompok sehingga total

hewan coba yang dibutuhkan adalah 20 ekor.

4.5 Variabel Penelitian

Adapun variabel yang diamati dalam penelitian ini yaitu :

Variabel bebas : Dosis pemberian Whey Kefir dan Tomat , Induksi OVA

dan LPS

Variabel tergantung : Kadar MDA dan Jumlah Eosinofil

31

Variabel kontrol : Tikus (Rattus norvegicus) strain Wistar (jenis kelamin,

umur, berat badan) lingkungan, suhu, pakan.

4.6 Tahapan Penelitian

4.6.1 Pembuatan Whey Kefir dan Tomat

Cara pembuatan kefir yaitu susu sapi murni 1 liter diberi 50 gr bibit kefir

diinkubasi selama 1-2 hari sampai terjadi gumpalan kefir. Lapisan yang terbentuk

yaitu lapisan grain kefir di bagian paling atas, kefir prima yang terletak di bagian

tengah dengan ciri khas cairan berwarna putih dan kental, serta lapisan paling

bawah yaitu kefir bening (whey kefir) dengan karakteristik lebih encer dan lebih

bening. Whey kefir yang dihasilkan kemudian disaring menggunakan kain sampai

didapatkan cairan berwarna bening. Whey kefir yang dihasilkan sebanyak 600 ml

(Suriasih, 2005).

Pembuatan ekstrak tomat yaitu 600 gram tomat dicuci bersih lalu diblender

sampai halus lalu disaring larutannya dan ampasnya dibuang. Selanjutnya whey

kefir 300 ml dicampurkan dengan sari tomat 300 ml diinkubasi selama 3 hari di

suhu ruang sampai keluar cairan bening (Mudjiwijono, 2010).

4.6.2 Preparasi Hewan Coba (Rattus norvegicus)

Persiapan hewan coba dimulai dengan diaklimatisasi hewan coba selama

tujuh hari di laboratorium. Tikus dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan dan setiap

kelompok perlakuan terdiri dari 4 ekor tikus. Tikus diberikan pakan yang

disesuaikan dengan standar penyusunan ransum untuk hewan coba Association of

Analytical Communities (AOAC, 2005) yaitu mengandung karbohidrat, protein

10%, lemak 3%, mineral, vitamin, dan air 12%.

32

Tikus dipelihara di dalam kandang yang terbuat dari bak plastik yang

dilengkapi penutup kawat dengan ukuran 17,5 x 23,75 x 17,5 cm. Lokasi

pemeliharaan berada pada tempat tenang dan bebas dari polusi kendaraan maupun

industri. Suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22-24oC dan kelembaban

udara 50-60% dengan ventilasi yang cukup.

4.6.3 Hewan Model Asma

Induksi OVA dan LPS dapat memicu respon imun. Ovalbumin (OVA I)

(Sigma-Aldrich) diinjeksikan secara intraperitoneal 10 μg dengan 1,5 mg AlOH3

dalam 200 μL PBS (phosphate buffer saline) pada hari ke 0 setelah dilakukan

aklimatisasi dan ovalbumin (OVA II) diinjeksikan lagi hari ke-14. Injeksi

lipopolisakarida (LPS) intrasulkuler dilakukan sebesar 1μg pada sulkus gingiva

molar rahang atas kiri tikus pada hari ke 10 dan 11. Injeksi LPS ini berfungsi

sebagai agen infeksi rongga mulut dan memodulasi respon imun sehingga

memperparah gejala asma. LPS yang digunakan adalah LPS1435/1450 dari

Porphyromonas gingivalis (Astarte Biologics). Pemaparan ovalbumin (OVA III)

secara inhalasi dilakukan pada hari ke-21 menggunakan tabung transparan yang

dihubungkan dengan Omron CompAir Compressor Nebulizer. Perlakuan pemicu

asma dilakukan dengan nebulasi OVA dalam NaCl steril dengan dosis dari 1

mg/mL selama 20 menit. Tikus yang dipaparkan OVA akan menunjukkan adanya

gejala hiperresponsif pada saluran pernafasannya, peningkatana sel-sel radang

pada mukosa saluran nafas mencit, serta meningkatnya remodeling jalan nafas

yang diakibatkan penurunan kadar sel T. Ketiga gejala inilah yang merupakan

patofisiologi terjadinya asma pada hewan (Utomo, 2012).

33

4.6.4 Pemberian Terapi Kombinasi Whey Kefir dan Tomat

Terapi pemberian kombinasi Whey Kefir dan Tomat diberikan pada hewan

coba pada hari ke-22, tiap hewan coba diberikan terapi secara per oral

menggunakan sonde. Dosis pemberian terapi pada kelompok C sebesar 1 ml/200g

BB tikus, kelompok D sebesar 1,5 ml/200g BB tikus dan kelompok E sebesar 2

ml/200g BB tikus. Pemberian kombinasi Whey Kefir dan Tomat ini diberikan

secara per oral menggunakan sonde selama 14 hari secara berturut-turut

(Utomo,2006)

4.6.5 Pengujian Malondialdehida (MDA)

Pengambilan serum pada hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus)

dilakukan pada hari ke-21 pada kontrol positif dan hari ke-35 pada tikus terapi

setelah seluruh perlakuan dilakukan. Langkah awal yang dilakukan adalah

dislokasi hewan coba pada bagian leher kemudian dilakukan pembedahan. Tikus

diletakkan secara rebah dorsal pada papan pembedahan. Pembedahan dilakukan

dari daerah abdomen sampai ke bagian thorax. Setelah itu darah diambil dengan

menggunakan spuit 3 ml pada bagian jantung. Kemudian darah di masukan ke

dalam tabung ependorf dengan cara jarum spuit diambil terlebih dahulu lalu darah

dimasukan lewat penggir tabung ependorf. Darah didiamkan selama 5 menit di

suhu ruang, setelah 5 menit tabung ependorf yang telah terisi darah dimasukan ke

dalam sentrifugasi. Di sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3 rpm.

Setelah 10 menit darah dan serum terpisah ,serum berada di atas dan darah terletak

di bawah. Serum diambil dengan menggunakan mikropipet yang sudah dipasang

yellow tip,serum yang berada pada tabung ependorf yang telah disentrifus

34

dimasukan ke dalam tabung ependorf kosong sebanyak 0,5 ml yang telah diberi

label (Suwandi, 2012)

4.6.6 Malondialdehida (MDA)

Standar MDA dengan konsentrasi 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dan 8 mg/ml masing-

masing diambil 100 μl, kemudian dimasukkan dalam tabung reaksi yang berbeda,

setelah itu ditambahkan 550 μl aquades. Setiap tabung tersebut ditambahkan 100

μl TCA 100%, 250 μl HCl 1N dan 100 μl Na-Thio 1%, dan campuran yang

terbentuk dihomogenkan dengan vortex. Tabung ditutup dengan plastik dan diberi

lubang. Tabung diinkubasi dalam penangas air dengan suhu 1000C selama 30

menit. Setelah itu, didinginkan pada suhu ruangan. Larutan standar kemudian

dibaca pada panjang gelombang maksimum (533 nm) menggunakan

spektrofotometer (Shimadzu UV-visible spectrophotometer UV-1601). Kurva

standar MDA dihasilkan dari persamaan regresi antara absorbansi (y) dan

konsentrasi MDA (x) (Amin, 2009).

4.6.7 Pengukuran Kadar Malondialdehida

Isolasi serum diawali dengan pengambillan darah pada jantung sebanyak 1,5

ml ,selanjutnya di masukan dalam tabung ependorf lalu dibiarkan 5 menit,

selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 500 rpm selama 10 menit. Supernatan

yang terbentuk diambil 100 μl dimasukkan kedalam ependorf, ditambah 550 μl

akuades, 100 μl TCA kemudian dihomogenkan dengan vortex, ditambahkan 250

μl HCL 1N lalu lalu dihomogenkan dengan vortek. Kemudian ditambahkan

dengan 100 μl Na-Thio 1% dan dihomogenkan kembali dengan vortex. Setelah

itu, mulut tabung ditutup menggunakan plastix wrap dan dipanaskan dalam water

35

bath 100oC selama 30 menit. Setelah dipanaskan, dilakukan sentrifugasi dengan

kecepatan 500 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dipindah kedalam

tabung reaksi baru. Sampel kemudian diukur absorbansinya dengan

spektofotometer Shimadzu UV-visible spectophotometer UV-1601 pada panjang

gelombang maksimum ( 533 nm) (Amin, 2009)

4.6.8 Eosinofil

Isolasi darah yang pertama dilakukan adalah pengambilan sampel darah di

jantung sebanyak 2 ml dan di masukan ke dalam tabung EDTA (jangan sampai

ada lisis) dan dimasukan dalam suhu 40

C untuk mendapatkan plasma darah.

Setelah itu dipersiapkan alat ABX micros 60 Switch utama dinyalakan, terletak di

belakang instrument. Setelah lampu indikator menyala, ditekan tombol start up,

maka secara otomatis alat akan melakukan pembilasan dan melakukan

pemeriksaan reagen. Jika lolos maka alat akan menampilkan nilai nol untuk setiap

parameter pemeriksaan dan jika tidak, maka secara otomatis alat akan melakukan

pembilasan ulang dan pemeriksaan reagen sampai tiga kali sehingga didapatkan

angka nol untuk setiap parameter pemeriksaannya. Ditekan tombol start.

Disiapkan bahan pemeriksaan plasma darah. Ditekan tombol ID dan dimasukkan

nomor pasien, ditekan tombol enter tunggu sampai jarum penghisap darah keluar.

Ditempelkan alat penghisap sampai dasar tabung kemudian ditekan sampel

bar sampai jarum masuk kembali dan melakukan pemeriksaan. Alat akan

memproses sample selama satu menit dan hasil pemeriksaan akan tampak pada

layar. Untuk mematikan alat, ditekan stand by maka alat akan mencuci selama

36

satu menit, setelah layar padam dimatikan alat dengan menekan switch utama

yang terletak di bagian belakang alat (Rothenberg,1998).

4.6.9 Analisis Data

Data yang diperoleh berupa data kadar enzim malondialdehid (MDA) dan

jumlah eosinofil. Data pengamatan hasil perubahan aktivitas MDA diamati secara

kuantitatif absorbansinya dengan spektofotometer Shimadzu UV- visible

spectrophotometer UV-1601 pada panjang gelombang (533 nm) sedangkan untuk

jumlah eosinofil diamati secara kuantitatif dengan alat ABX micros 60 Switch .

Data yang diperoleh dari hasil perlakukan dimasukkan kedalam Microsoft Office Exel

dan dianalisa menggunakan SPSS 16.0 untuk Windows dengan analisis ragam One

Way ANOVA untuk melihat pengaruh pemberian terapi dan uji lanjutan Beda

Nyata Jujur (BNJ) α = 5% untuk melihat perbedaan perlakuan terapi.

36

BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Pengaruh Kombinasi Whey Kefir dan Tomat Terhadap Aktivitas Enzim

Malondialdehida MDA pada darah Hewan Tikus (Rattus norvegicus)

Hasil penelitian menunjukkan bahwa terapi kombinasi whey kefir dan

tomat yang digunakan pada tikus model asma mampu menurunkan kadar

Malondialdehida (MDA). Malondialdehida (MDA) merupakan hasil samping

dari peroksidasi lipid akibat rusaknya membran sel oleh radikal bebas (Asni,

2009). Malondialdehida (MDA) juga merupakan suatu penanda timbulnya

stres oksidatif dalam tubuh. Sejumlah penelitian menunjukkan bahwa stres

oksidatif merupakan akibat dari respon inflamasi pada asma (Nadeem et al.,

2005 ; Wood et al., 2003). Gejala asma pada tikus pada penelitian ini

menunjukan gejala bersin-bersin, terlihat tikus menggaruk-garukan hidung dan

tikus kesulitan bernafas. Gejala asma pada tikus mirip dengan gejala asma pada

manusia yang ditandai dengan batuk, bersin, dan hipersalivasi (Pernans, 2010).

Hasil pengukuran kadar MDA tikus putih (Rattus norvegicus) model asma

yang telah diterapi dengan kombinasi whey kefir dan tomat volume 1 mL, 1,5

mL dan 2 mL per ekor per hari didapatkan data sebagai berikut: pada kelompok

kontrol negatif rata-rata kadar MDA sebesar 0.344 ±0.012, kelompok kontrol

positif rata-rata kadar MDA sebesar 0.455 ±0.019 dengan presentase

peningkatan kadar MDA sebesar 24,39% dibandingkan kontrol negatif,

kelompok A rata-rata kadar MDA sebesar 0.421 ±0.005 dengan presentase

penurunan kadar sebesar 7,47% dibandingkan dengan kontrol positif, pada

kelompok B rata-rata kadar MDA 0.349 ±0.024 dengan presentase penurunan

36

37

kadar MDA sebesar 23,30% dibandingkan kontrol positif dan pada kelompok C

rata-rata kadar MDA 0.400 ±0.015 dengan presentase penurunan kadar MDA

sebesar 12,09% dibandingkan kontrol positif (Tabel 5.1).

Tabel 5.1. Rata-rata kadar malondialdehida pada darah tikus kontrol, tikus yang

diinduksi OVA dan LPS dan tikus yang diterapi dengan kombinasi whey kefir dan

tomat.

Kelompok Rata-rata kadar

Malondialdehida

(MDA) mg/ mL

Presentase Aktivitas

Enzim MDA(%)

Protease (%)

Penurunan

(%)

Peningkatan

(%)

Kontrol negatif 0.344 ±0.012a

- -

Kontrol positif

(asma)

0.455 ±0.019c

- 24,39 %

Terapi dosis 1

mL/200 g BB (A)

0.421 ±0.005bc

7,47 % -

Terapi dosis 1,5

mL/200g BB (B)

0.349 ±0.024a

23,30% -

Terapi dosis 2

mL/200 g BB (C)

0.400 ±0.015b

12,09% -

Keterangan : Perbedaan notasi a, b, c, menunjukkan adanya perbedaan yang nyata

antar kelompok perlakuan dengan nilai p < 0,05.

Hasil analisa statistik menggunakan SPSS. 21 menunjukkan bahwa

pemberian terapi dengan kombinasi whey kefir dan tomat pada hewan model

asma, memberikan pengaruh yang berbeda nyata (P

38

dan ovalbumin (OVA) memicu terjadinya reaksi fagositosis oleh makrofag

dan neutrofil. Proses fagositosis ini menghasilkan radikal bebas Reactive Oksigen

Species (ROS). Reactive Oxygen Species (ROS) dapat menyebabkan reaksi

berantai dan menghasilkan senyawa radikal bebas seperti O2-, H2O2, OH- dan

NO. Nitric oxide disintesis dengan bantuan NO synthase (NOS). Peningkatan

aktivitas enzim NOS mengakibatkan jumlah anion superoksida (O2-) sebagai

produk samping reaksi pembentukan NO bertambah. Peningkatan NO yang

lebih tinggi dikaitkan dengan resiko asma yang lebih besar dan menambah

keparahan asma. Radikal bebas dalam jumlah rendah mampu dinetralisir oleh

antioksidan endogen (SOD, catalase dan glutathione) dalam tubuh tetapi bila

jumlah senyawa radikal bebas melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh maka

radikal bebas akan merusak komponen lipid sehingga mengakibatkan ROS dan

mengakibatkan stres oksidatif (Winarsi,2007)

Hasil pengukuran kadar MDA tikus putih (Rattus norvegicus) model asma

yang telah diterapi dengan kombinasi whey kefir dan tomat volume 1 mL, 1,5

mL dan 2 mL per ekor per hari didapatkan data sebagai berikut: pada kelompok

kontrol negatif rata-rata kadar MDA sebesar 0.344 ±0.012, kelompok kontrol

positif rata-rata kadar MDA sebesar 0.455 ±0.019 dengan presentase peningkatan

kadar MDA sebesar 24,39% dibandingkan kontrol negatif, kelompok A rata-rata

kadar MDA sebesar 0.421 ±0.005 dengan presentase penurunan kadar sebesar

7,47% dibandingkan dengan kontrol positif, pada kelompok B rata-rata kadar

MDA 0.349 ±0.024 dengan presentase penurunan kadar MDA sebesar 23,30%

dibandingkan kontrol positif dan pada kelompok C rata-rata kadar MDA 0.400

39

±0.015 dengan presentase penurunan kadar MDA sebesar 12,09% dibandingkan

kontrol positif.

Pada kelompok perlakuan kontrol positif memiliki kadar MDA yang

paling tinggi, serta memiliki kadar MDA yang berbeda nyata (p < 0,05) dengan

kontrol negatif, sedangkan pada kelompok A (terapi 1 ml/200g), Kelompok B

(terapi 1,5 ml/200g) dan Kelompok C (terapi 2 ml/200g) berbeda nyata terhadap

kelompok positif. Hal ini ditunjang dengan data kuantitatif berupa tingkat

kenaikan kadar MDA hingga 24,39 % yaitu sebesar 0.455 ±0.019 µg/mL.

Peningkatan kadar MDA terjadi karena terdapat stres oksidatif. Pemberian

ovalbumin dan LPS mengakibatkan terjadinya inflamasi pada tikus, metabolisme

asam arakidonat menyebabkan terjadinya inflamasi.

Mekanisme kerjanya dengan menghambat aktivitas enzim siklooksigenase

1 (COX-1) dan enzim sikloogsigenase 2 (COX-2). Penghambatan pada COX-2

akan berfungsi terhadap pengurangan nyeri, namun penghambatan terhadap COX-

1 akan menghambat sintesis prostaglandin E2 (PGE2) yng berfungsi pada sekresi

mukus untuk melindungi mukosa usus sehingga menyebabkan melemahnya

sistem pertahanan tubuh pada daerah mukosa dan bakteri lebih mudah

menginfeksi (Tanaka et al.,2002).

Enzim Cyclooxygenase (COX) mengkatalisis sintesis prostaglandin.

Prostaglandin mempunyai peran yang penting dalam beberapa proses fisiologis

seperti pemeliharaan integritas gastrointestinal dan proses patologis seperti

inflamasi dan neoplasia (Zang et al, 2002; Guilemany et al, 2008; Pane et al,

2008)

40

Adanya antigen inilah yang menyebabkan aktivasi makrofag , proses non

oksidatif berlangsung dengan bantuan berbagai protein, pembentukan Reactive

Oxygen Species (ROS). Produksi ROS yang tinggi menyebabkan antioksidan

tidak berfungsi dengan maksimal sehingga terjadi stres oksidatif. Stres oksidatif

dapat memicu terjadinya peroksidasi lipid.

Peroksidasi lipid merupakan proses yang bersifat kompleks akibat reaksi

asam lemak tak jenuh ganda (Poly Unsaturrated Fatty Acid atau PUFA) penyusun

fosfolipid membran sel dengan radikal bebas. Ada dua konsekuensi dari

peroksidasi lipid: kerusakan struktural membran dan adanya produk sekunder.

Kerusakan membran berasal dari produksi rantai asam lemak tak jenuh ganda

(Poly Unsaturrated Fatty Acid atau PUFA) yang rusak (Catala, 2006). Efek ini

berat bagi sistem biologi, menghasilkan kerusakan fungsi membran, inaktivasi

enzim dan efek toksik pada bagian dan fungsi seluler. Proses peroksidasi lipid ini

menghasilkan produk sekunder berupa senyawa yang disebut Malondialdehida

(MDA). Pada jaringan yang rusak terjadi peningkatan kadar Malondialdehida. Hal

ini sesuai dengan hasil penelitian yang menunjukkan bahwa terjadi peningkatan

pada kadar MDA sebesar 24,39 % pada kelompok kontrol positif.

Peroksidasi lipid dinilai secara tidak langsung dengan pengukuran produk

sekunder, seperti sebagai Malondialdehida (MDA). Malondiladehida (MDA)

adalah tiga-karbon dengan berat molekul aldehida rendah dan merupakan produk

kerusakan spontan peroksida yang dapat dihasilkan dari adanya radikal bebas.

Kelompok A kadar MDA sebesar 0.421 ±0.005 dengan presentase

penurunan kadar sebesar 7,47 % dibandingkan dengan kontrol positif, pada

41

kelompok B rata-rata kadar MDA 0.349 ±0.024 dengan presentase penurunan

kadar MDA sebesar 23,30 % dibandingkan kontrol positif dan pada kelompok C

rata-rata kadar MDA 0.400 ±0.015 dengan presentase penurunan kadar MDA

sebesar 12,09 % dibandingkan kontrol positif (Tabel 5.1). Terapi kombinasi whey

kefir dan tomat pada serum darah tikus putih (Rattus norvegicus) mampu

menurunkan kadar MDA secara nyata (p < 0,05). Kelompok tikus yang diterapi

dengan kombinasi whey kefir dan tomat dosis 1 mL/ekor yang diberikan 1 kali

sehari (0.421 ±0.005), kelompok tikus yang diberikan terapi kombinasi whey kefir

dan tomat dosis 1,5 mL/ekor yang diberikan 1 kali sehari (0.349 ±0.024) dan

kelompok tikus yang diberikan kombinasi whey kefir dan tomat dosis 2 mL/ekor

yang diberikan 1 kali sehari (0.400 ±0.015) memiliki perbedaan yang nyata dengan

kelompok tikus kontrol negatif dan kontrol positif. Hal ini didukung dengan

presentase penurunan kadar Malondialdehida (MDA) jika dibandingkan dengan

kontrol positif (Tabel 5.1)

Penurunan kadar MDA pada kelompok terapi disebabkan oleh kandungan

yang terdapat pada kombinasi whey kefir dan tomat yaitu berupa vitamin C,

likopen dan produk bakteri asam laktat (BAL). Vitamin C atau L-asam askorbat

merupakan antioksidan yang larut dalam air. Vitamin C adalah salah satu

antioksidan sekunder yang memiliki kemampuan menangkap radikal bebas dan

42

mencegah terjadinya reaksi berantai. Mekanisme kerja antoksidan sekunder

adalah dengan cara memotong reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas atau

dengan cara menangkap radikal bebas (free radical scavenger). Akibatnya radikal

bebas tidak akan bereaksi dengan komponen seluler. Asam askorbat menangkap

secara efektif sekaligus O2*

(anion superoksida)