18

18

3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan pada bulan September 2011 sampai Desember 2011

bertempat di Laboratorium Atsiri, Pusat Penelitian Kimia, Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia (LIPI), Kawasan PUSPIPTEK, Serpong, Propinsi Banten;

Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan,

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium Kimia Pangan, Departemen

Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian; dan Laboratorium

Terpadu, Institut Pertanian Bogor.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan utama yang digunakan adalah minyak ikan hasil samping dari

pengalengan lemuru yang berasal dari perusahaan pengalengan ikan PT. X, di

Banyuwangi-Jawa Timur yang diambil pada bulan Oktober. Bahan-bahan dalam

ekstraksi meliputi pelarut gas CO2 teknis dengan kemurnian 90%. Bahan untuk

penyaringan minyak ikan, yaitu kertas Whatman 40. Bahan-bahan untuk analisis

asam lemak, yang meliputi 1 ml larutan standar, 1 ml 0,5 N NaOH dalam

methanol, 2 ml BF3 20%, 2 ml NaCl, 1 ml isooctane, dan 0,1 g Na2SO4 anhidrat.

Bahan-bahan untuk analisis bilangan asam dan kadar asam lemak bebas meliputi

KOH 0,1 N, 25 ml alkohol netral 96%, indikator fenolftalein. Bahan-bahan untuk

analisis bilangan penyabunan adalah 50 ml KOH, indikator fenolftalein, aquades,

HCl 0,1 N. Bahan-bahan untuk analisis bilangan peroksida adalah 30 ml pelarut

(60% asam asetat dan 40% pelarut), 30 ml aquades, Natriumthiosulfat 0,02 N,

1 gram KI.

Alat utama dalam proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan

adalah satu unit Supercritical Fluid Extraction (SFE) Model 46-19360 dari

Superspressure-hydrodynamics, Newport Scientific Inc.AMINCO, USA dengan

kapasitas ekstraktor 0,845 liter dan separator 0,3 liter, serta tekanan maksimum

9200 psi yang berada di Pusat Penelitian Kimia, LIPI, Serpong (spesifikasi

lengkap pada Lampiran 1). Alat untuk analisis lemak berupa Gas

Chromatography (GC) Shimadzu Model GC 2010 plus dengan kolom

19

19

cyanopropil methyl sil (capillary column), dimensi kolom p = 60 m, Ø dalam =

0,25 mm, 0,25 µm film thickness, laju alir N2 20 mL/menit, dan laju alir H2 30

mL/menit. Alat untuk penyaringan minyak ikan sebelum dilakukan ekstraksi

berupa vakum Buchner. Peralatan untuk analisis lainnya antara lain neraca

analitik, erlenmeyer, tabung reaksi, hot plate, buret, pipet gondok, pipet tetes,

bulb.

3.3 Metode Penelitian

Tahapan pelaksanaan penelitian dilakukan meliputi, (1) preparasi sampel

minyak ikan hasil samping pengalengan lemuru mengacu pada penelitian Setha

(1996) dan Boran et al. (2006), (2) analisis mutu minyak ikan sebelum ekstraksi

dengan fluida CO2 superkritik, dengan parameter uji yang mengacu pada Celik

(2002) tentang minyak ikan komersial, IFOMA (International Fishmeal and Oil

Manufacturers Association) tentang standar minyak ikan untuk konsumsi, serta

penelitian Dewi (1996) dan Estiasih et al. (2005) untuk perbandingan hasil

ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan, (3) proses ekstraksi asam lemak

omega-3 minyak ikan dengan fluida CO2 superkritik mengacu pada penelitian

Lopes et al. (2011) dengan modifikasi, (4) analisis konsentrat asam lemak

omega-3 beserta kandungan asam lemak omega-3, dengan parameter uji mengacu

pada IFOMA.

3.3.1 Preparasi sampel minyak ikan hasil samping pengalengan lemuru

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini merupakan minyak ikan hasil

samping pengalengan ikan lemuru yang baru diambil dari proses pengalengan

tahapan pre-cooking pada bulan Oktober. Minyak ikan dimasukkan dalam wadah

(jerigent) yang tidak tembus cahaya dan tertutup rapat, lalu dimasukkan dalam

boks sterofoam. Minyak ikan sebelum digunakan disaring menggunakan kertas

Whatman 40 dengan vakum Buchner. Hasil saringan, kemudian ditaruh pada

wadah yang tidak tembus cahaya. Ketentuan preparasi sampel mengacu pada

penelitian Setha (1996). Sedangkan pencegahan terhadap oksidasi dilakukan

penyimpanan sampel minyak ikan dengan cara menyimpan sampel di freezer

(atau suhu di bawah 0 oC) (Boran et al. 2006).

20

20

3.3.2 Analisis mutu minyak ikan sebelum ekstraksi dengan fluida CO2

superkritik

Analisis mutu minyak ikan dilakukan untuk mengetahui kondisi awal

bahan baku minyak ikan hasil samping pengalengan ikan lemuru yang akan

digunakan dalam proses ekstraksi dengan teknologi fluida CO2 superkritik.

Analisis yang dilakukan meliputi bilangan asam dan asam lemak bebas (AOAC

1995), bilangan penyabunan (AOCS Cd 3-25 1997), dan bilangan peroksida

(AOAC 1995). Parameter yang dianalisis ini mengacu pada Celik (2000), yaitu

bilangan asam (10,15 mg KOH/gr), asam lemak bebas (4,6%), bilangan

penyabunan (187,4 mg KOH/gr), serta mengacu pada IFOMA (International

Fishmeal and Oil Manufacturers Association), yaitu asam lemak bebas (1-7%),

dan bilangan peroksida (3-20 meq/kg).

Kandungan asam lemak omega-3 yang terdapat dalam minyak ikan

sebelum diekstraksi dilakukan analisis asam lemak omega-3 menggunakan Gas

Chromatography (GC) (AOAC 1984 butir 28.060/GC). Hasil analisis asam lemak

yang diperoleh dibandingkan dengan penelitian Dewi (1996), yaitu kandungan

omega-3 (29,68%) dengan EPA (15,15%) dan DHA (11,36%), serta penelitian

Estiasih et al. (2005) dengan EPA (11,71%) dan DHA (9,11%).

3.3.3 Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan dengan fluida CO2

superkritik

Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan dengan fluida CO2

superkritik dilakukan dengan tahapan sebagai berikut :

1. Kondisi sampel sebelum ekstraksi

Sampel yang akan digunakan untuk proses ekstraksi, yaitu minyak ikan

yang sudah disaring dengan kertas Whatman 40 (Setha 1996), dan disimpan pada

wadah yang tidak tembus cahaya dengan suhu di bawah 0 oC (Boran et al. 2006).

2. Penentuan tekanan dan suhu ekstraksi

Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan lemuru dengan fluida

CO2 superkritik terdiri dari tiga tahap, yaitu tahap persiapan, tahap proses dan

tahap flushing. Skema unit alat ekstraksi fluida CO2 superkritik terdapat pada

Lampiran 2. Prosedur operasional standar ekstraksi dengan fluida CO2 superkritik

dapat dilihat pada Lampiran 3. Jumlah bahan baku minyak ikan yang dimasukkan

21

21

setiap ekstraksi sebanyak 200 gram. Kondisi proses ekstraksi dijaga kestabilannya

dan dicatat setiap 15 menit.

Proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan dengan fluida CO2

superkritik dilakukan dengan 2 variasi tekanan dan suhu ekstraksi, yaitu tekanan

3500 psi dan 4000 psi serta suhu 40 oC dan 50

oC yang mengacu pada penelitian

Lopes et al. (2011) dengan modifikasi. Tekanan dan suhu pemisahan atau separasi

setelah proses ekstraksi adalah tekanan 500 psi dan suhu 30 oC. Lama proses

berlangsung 4 jam, pada laju alir 5,5 liter/menit yang mengacu pada penelitian

Rizvi (1999) dan Utami (2004). Kondisi proses ekstraksi asam lemak omega-3

minyak ikan lemuru dengan fluida CO2 superkritik dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7 Kondisi proses ekstraksi asam lemak omega-3 minyak ikan lemuru

dengan fluida CO2 superkritik

PE

(psi)

TE (oC) PS

(psi)

TS

(oC)

Laju alir CO2 Waktu

Proses 40 50

3500 U 1 U 2 U 1 U 2 500 30 5,5 liter/menit 4 jam

4000 U 1 U 2 U 1 U 2

Keterangan PE : Tekanan Ekstraktor TE : Suhu Ekstraktor

PS : Tekanan Separator TS : Suhu Separator

U : Ulangan

Konsentrat asam lemak omega-3 minyak ikan lemuru hasil ekstraksi

dimasukkan dalam wadah botol gelap yang tidak tembus cahaya dan tertutup

rapat. Kemudian disimpan pada suhu di bawah 0 oC sampai dilakukannya analisis.

3.3.4 Analisis konsentrat asam lemak omega-3 beserta kandungan asam

lemak omega-3

Analisis konsentrat asam lemak omega-3 meliputi analisis asam lemak

dengan Gas Chromatography (GC) (AOAC 1984 butir 28.060/GC) untuk

mengetahui kandungan asam lemak omega-3, analisis asam lemak bebas (AOAC

1995), dan bilangan peroksida (AOAC 1995). Parameter yang dianalisis mengacu

pada IFOMA (International Fishmeal and Oil Manufacturers Association)

tentang standar minyak ikan konsumsi.

22

22

3.4 Prosedur Pengujian

Pengujian yang dilakukan pada penelitian ini untuk menguji mutu minyak

ikan sebelum ekstraksi dengan fluida CO2 superkritik dan analisis konsentrat asam

lemak omega-3 minyak ikan hasil ekstraksi dengan fluida CO2 superkritik.

Analisis mutu minyak ikan hasil samping pengalengan lemuru meliputi analisis

asam lemak, analisis bilangan asam dan asam lemak bebas, analisis penyabunan,

dan analisis bilangan peroksida. Analisis konsentrat asam lemak omega-3 minyak

ikan hasil ekstraksi meliputi analisis asam lemak, analisis asam lemak bebas dan

analisis bilangan peroksida. Selain itu juga dilakukan perhitungan rendemen dan

solubilitas konsentrat asam lemak omega-3 minyak ikan hasil ekstraksi.

3.4.1 Rendemen (Sahena et al. 2010)

Rendemen konsentrat asam lemak omega-3 ditentukan dengan

membandingkan bobot (g) hasil ekstraksi yang diperoleh terhadap bobot (g)

minyak ikan yang digunakan dikalikan 100%.

Rendemen (%) =

3.4.2 Solubilitas (Sahena et al. 2010)

Solubilitas konsentrat asam lemak omega-3 dalam CO2 ditentukan dengan

rumus sebagai berikut :

Solubilitas (g/kg CO2) =

3.4.3 Analisis total asam lemak omega-3 (AOAC 1984 butir 28.060/GC)

Sebanyak 20-30 mg contoh minyak ditimbang dalam tabung bertutup

teflon. Lalu ditambahkan 1 ml NaOH 0,5 N dalam metanol dan dipanaskan dalam

penangas air selama 20 menit. Selanjutnya ditambahkan 2 ml BF3 20%,

dipanaskan lagi selama 20 menit. Setelah dingin, kemudian ditambahkan 2 ml

NaCl jenuh dan 1 ml isooctane dikocok dengan baik. Lapisan isooctane

dipindahkan dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung yang berisi sekitar 0,1 g

Na2SO4 anhidrat, dibiarkan 15 menit. Fase cair dipisahkan dan selanjutnya

diinjeksikan ke kromatografi gas.

23

23

Kandungan komponen asam lemak (%) =

3.4.4 Bilangan asam dan kadar asam lemak bebas (AOAC 1995)

Prinsip bilangan asam dan asam lemak bebas adalah pelarutan contoh

lemak atau minyak dalam pelarut organik tertentu (alkohol netral 96%)

dilanjutkan dengan penitaran dengan basa (NaOH atau KOH). Contoh yang akan

diuji, ditimbang sebanyak 5-10 gram di dalam erlenmeyer 250 ml, lalu ke dalam

contoh ditambahkan alkohol netral 96% sebanyak 25 ml dan dipanaskan sampai

mendidih. Larutan ditambahkan 2 tetes indikator PP, kemudian dititrasi dengan

larutan KOH 0,1 N hingga berwarna merah muda (konstan selama 15 detik).

Bilangan asam (mg KOH/gram sampel) =

Kadar asam lemak bebas (%) =

Keterangan :

V = Volume KOH untuk titrasi contoh (ml)

T = Normalitas larutan KOH

M = Bobot molekul asam dominan (asam oleat 282)

m = Bobot contoh (gram)

56,1 = Bobot molekul KOH

3.4.5 Bilangan penyabunan (AOCS Cd 3-25 1997)

Prinsip bilangan penyabunan adalah asam lemak terikat (trigliserida) dan

asam lemak bebas (FFA) bereaksi dengan basa (KOH/NaOH) membentuk sabun,

gliserol dan air.

a. Timbang sampel minyak sebanyak 1-2 g. Tambahkan 50 ml KOH

beralkohol dengan menggunakan pipet kering

b. Siapkan blanko dengan cara yang sama, tetapi tidak menggunakan lemak

atau minyak

Ax x Cstandar x Vcontoh x 100 %

As 100

gram contoh

24

24

c. Sambungkan ke kondensator dan didihkan dengan perlahan hingga seluruh

sampel tersaponifikasi. Untuk sampel yang bersifat formal biasanya proses

ini membutuhkan waktu selama 1 jam.

d. Setelah labu dan kondensor mendingin, tetapi belum berubah bentuk

menjadi gel, cuci bagian dalam kondensor dengan menggunakan akuades.

Lepaskan kondensor, tambahkan 1 ml indikator fenolftalein dan titrasi

dengan menggunakan HCL 0,5 N sampai warna merah muda menghilang.

Tulis volume HCL 0,5 N yang dibutuhkan untuk titrasi.

Bilangan penyabunan (mg KOH/g sampel) =

Keterangan :

B = Volume HCL 0,5 N untuk titrasi blanko (ml)

S = Volume HCL 0,5 N untuk titrasi contoh (ml)

N = Normalitas larutan HCL

W = Bobot sampel

3.4.6 Bilangan peroksida (AOAC 1995)

Analisis bilangan peroksida dilakukan dengan menimbang 5 gram contoh

dalam Erlenmeyer 250 ml kemudian ditambahkan 30 ml pelarut (60% asam asetat

dan 40% kloroform) dan dikocok sampai sampel larut. Selanjutnya ditambahkan

0,5 ml KI jenuh kemudian didiamkan selama 2 menit di ruang gelap sambil

sekali-kali dikocok. Tambahkan 30 ml aquades, kemudian titrasi dengan

Natriumthiosulfat 0,01 N. Perhitungkan sebagai berikut :

Bilangan peroksida (meq/kg) =

Analisis terhadap blanko dilakukan dengan cara yang sama. Sampel diganti

dengan akuades sebagai blanko.

3.5 Rancangan Percobaan

Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap

Faktorial, yakni menunjukkan pengaruh perlakuan tekanan dan suhu ekstraksi,

25

25

serta interaksi keterkaitan antara tekanan dan suhu ekstraksi . Setiap interaksi

perlakuan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 2 kali ulangan. Model

Rancangan Acak Lengkap Faktorial adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie

1991) :

Yijk =µ + αi + βj + (αβ)ij + ɛijk

Keterangan :

Yij = Pengamatan pada satuan percobaan ke k yang memperoleh kombinasi

perlakuan taraf ke i dari faktor α dan taraf ke j dari faktor ß.

µ = Mean populasi

αi = Pengaruh taraf ke i dari faktor α

βj = Pengaruh taraf ke j dari faktor ß

(αβ)ij = Pengaruh taraf ke i dari faktor α dan taraf ke j dari faktor ß

Ɛijk = Pengaruh acak satuan ke k yang memperoleh kombinasi perlakuan

Data dianalisis dengan menggunakan analisis ragam oneway ANOVA

untuk melihat pengaruh terhadap paramater yang diuji. Apabila hasil analisis

ragam memberikan pengaruh yang nyata (tolak Ho), maka dilakukan dengan uji

lanjut Beda Nyata Terkecil (BNT), untuk melihat adanya perbedaan dari masing-

masing perlakuan yang diberikan. Rumus pengujian dengan Uji BNT adalah

sebagai berikut (Steel dan Torrie 1991):

BNT = t α (dbs)

Keterangan :

n = Ulangan

dbs = Derajat bebas sisa

α = 0,05

kts = Kuadrat tengah sisa

Data hasil rendemen dan solubilitas konsentrat asam lemak omega-3

minyak ikan, kandungan asam lemak omega-3 (EPA dan DHA), kadar asam

lemak bebas, dan bilangan peroksida dianalisis menggunakan program Microsoft

Excel 2007 dan SPSS versi 13.0.