Upload
others
View
29
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
PENGENALAN DASAR
TEKNIK
BIO-MOLEKULER
UU No 28 tahun 2014 tentang Hak Cipta Fungsi dan sifat hak cipta Pasal 4 Hak Cipta sebagaimana dimaksud dalam Pasal 3 huruf a merupakan hak eksklusif yang terdiri atas hak moral dan hak ekonomi. Pembatasan Pelindungan Pasal 26 Ketentuan sebagaimana dimaksud dalam Pasal 23, Pasal 24, dan Pasal 25 tidak berlaku terhadap: i. Penggunaan kutipan singkat Ciptaan dan/atau produk Hak Terkait untuk pelaporan
peristiwa aktual yang ditujukan hanya untuk keperluan penyediaan informasi aktual; ii. Penggandaan Ciptaan dan/atau produk Hak Terkait hanya untuk kepentingan penelitian
ilmu pengetahuan; iii. Penggandaan Ciptaan dan/atau produk Hak Terkait hanya untuk keperluan pengajaran,
kecuali pertunjukan dan Fonogram yang telah dilakukan Pengumuman sebagai bahan ajar; dan
iv. Penggunaan untuk kepentingan pendidikan dan pengembangan ilmu pengetahuan yang memungkinkan suatu Ciptaan dan/atau produk Hak Terkait dapat digunakan tanpa izin Pelaku Pertunjukan, Produser Fonogram, atau Lembaga Penyiaran.
Sanksi Pelanggaran Pasal 113 1. Setiap Orang yang dengan tanpa hak melakukan pelanggaran hak ekonomi sebagaimana
dimaksud dalam Pasal 9 ayat (1) huruf i untuk Penggunaan Secara Komersial dipidana dengan pidana penjara paling lama 1 (satu) tahun dan/atau pidana denda paling banyak Rp100.000.000 (seratus juta rupiah).
2. Setiap Orang yang dengan tanpa hak dan/atau tanpa izin Pencipta atau pemegang Hak Cipta melakukan pelanggaran hak ekonomi Pencipta sebagaimana dimaksud dalam Pasal 9 ayat (1) huruf c, huruf d, huruf f, dan/atau huruf h untuk Penggunaan Secara Komersial dipidana dengan pidana penjara paling lama 3 (tiga) tahun dan/atau pidana denda paling banyak Rp500.000.000,00 (lima ratus juta rupiah).
PENGENALAN DASAR
TEKNIK
BIO-MOLEKULER
Chris Adhiyanto
Laifa Hendarmin
Rini Puspitaningrum
PENGENALAN DASAR TEKNIK BIO-MOLEKULER
Chris Adhiyanto
Laifa Hendarmin Rini Puspitaningrum
Editor:
dr. Hari Hendarto, SpPD-KEMD, Ph.D.
Desain cover Zahra Muthmainnah
Solihin, S.Pd.
Sumber freepik.com
Tata letak :
Amira Dzatin Nabila
Proofreader : Avinda Yuda Wati
Ukuran :
vi, 82 hlm, Uk: 15.5x23 cm
ISBN :
Cetakan Pertama:
Bulan 2020
Hak Cipta 2020, Pada Penulis
Isi diluar tanggung jawab percetakan
Copyright © 2020 by Deepublish Publisher
All Right Reserved
Hak cipta dilindungi undang-undang Dilarang keras menerjemahkan, memfotokopi, atau
memperbanyak sebagian atau seluruh isi buku ini tanpa izin tertulis dari Penerbit.
PENERBIT DEEPUBLISH
(Grup Penerbitan CV BUDI UTAMA) Anggota IKAPI (076/DIY/2012)
Jl.Rajawali, G. Elang 6, No 3, Drono, Sardonoharjo, Ngaglik, Sleman
Jl.Kaliurang Km.9,3 – Yogyakarta 55581 Telp/Faks: (0274) 4533427
Website: www.deepublish.co.id www.penerbitdeepublish.com
E-mail: [email protected]
v Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Kata Pengantar
Buku Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler ini merupakan
pengembangan dan perbaikan dari buku sebelumnya yang berjudul
Genetika Molekuler dan Aplikasinya. Dalam buku ini, kami
menambahkan beberapa metode teknik pembelajaran dalam
melakukan penelitian bio-molekuler khususnya yang berkaitan
dengan DNA, RNA dan Protein.
Buku ini kami tulis berdasarkan hasil pengalaman kerja dalam
membimbing mahasiswa S-1, S-2 dan S-3 dari Program Studi Ilmu
Kedokteran, Farmasi, Gizi dan Biologi, yang telah dilakukan di
Laboratorium Riset Fakultas Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta sejak 2013 hingga sekarang. Selain itu, isi buku ini juga
merupakan hasil pengalaman yang kami peroleh saat melakukan
penelitian kolaborasi dengan universitas di luar Indonesia.
Kami harapkan, buku ini dapat membantu dan menjadi dasar
pengetahuan melakukan penelitian bio-molekuler mahasiswa S-1, S-2
maupun S-3 dalam melakukan penelitian bio-molekuler.
Kami sebagai penulis merasa masih banyak kekurangan yang
ada dalam buku ini, karenanya kami akan berupaya menambah
informasi dan pengetahuan yang kami miliki agar ke depannya dapat
kami tambahkan teknik maupun informasi tambahan lainnya dalam
buku yang sama.
Semoga buku ini dapat membantu bagi para peneliti pemula
dalam bidang bio-molekuler.
Jakarta, Februari 2020
Tim Penulis
vi Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Daftar Isi
Kata Pengantar .................................................................................................................... v
Daftar Isi ................................................................................................................................ vi
BAB I. ISOLASI GENOM ......................................................................... 1
1.1. Pendahuluan ..................................................................................... 1
1.1.1. Persiapan Genom Manusia .......................................... 2
1.1.2. Menghancurkan Sel ......................................................... 2
1.1.3. Membuang Protein ........................................................... 3
1.1.4. Membuang RNA ................................................................. 4
1.1.5. Pemekatan DNA ................................................................. 4
BAB II. ELEKTROFORESIS DAN IDENTIFIKASI GENOM
DNA ............................................................................................ 13
BAB III. ISOLASI RNA ............................................................................ 16
BAB IV. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) .............................. 23
BAB V. REAL-TIME PCR/KUALITATIF PCR (RT-PCR/
QPCR) ........................................................................................ 34
BAB VI. MERANCANG PRIMER ........................................................... 60
BAB VII. ISOLASI PROTEIN ................................................................... 67
7.1. Pemurnian Protein ..................................................................... 69
7.2. SDS-Page .......................................................................................... 70
Daftar Pustaka .................................................................................................................. 78
Tentang Penulis ............................................................................................................... 81
1 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
BAB I. ISOLASI GENOM
1.1. Pendahuluan
Mendapatkan DNA berkualitas tinggi dan utuh seringkali
merupakan langkah pertama dan paling penting dalam banyak
aplikasi biologi molekuler, seperti kloning DNA, sekuensing, PCR, dan
elektroforesis. Mengisolasi keseluruhan DNA utuh dari berbagai
macam sampel jaringan memiliki kesulitan yang berbeda karena
tergantung dari sifat fisik dan biokimia jaringan yang dituju. Sebagai
contoh, banyak metode ekstraksi DNA akan bekerja dengan baik untuk
jaringan seperti hati, namun pada jaringan lain seperti jantung, lemak,
otak, dan limpa, isolasi DNA hingga saat ini masih merupakan hal yang
sulit untuk dilakukan. Isolasi yang paling umum dan mudah,
khususnya isolasi genom pada hewan adalah dengan menggunakan
sampel darah atau cairan tubuh dari organisme tersebut.
Beberapa metode telah banyak dikembangkan dengan tingkat
kesukaran, kemurnian hasil dan konsentrasi hasil yang berbeda-beda.
Namun demikian, teknik konvensional masih merupakan teknik yang
terbaik. Permasalahannya adalah teknik konvensional ini
menghasilkan produk buangan atau limbah yang berbahaya. Teknik
konvensional biasa menggunakan fenol-kloroform sebagai proses
menghilangkan materi lain selain nukleotida, misal protein.
Sebagaimana diketahui fenol merupakan bahan yang sangat korosif
sehingga pembuangan limbah yang tidak tepat, akan mencemari
lingkungan sekitarnya.
Pada teknik dasar bio-molekuler, kami akan memaparkan
beberapa teknik yang dapat digunakan untuk isolasi genom dari
bahan cairan tubuh. Pemilihan sumber cairan tubuh, bukan jaringan
hanya pada kemudahan dalam pengerjaan isolasi. Perbedaan isolasi
dari jaringan adalah pada langkah bagaimana teknik menghancurkan
2 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
jaringan tersebut. Dengan menguasai teknik dasar isolasi genom dari
bahan cairan tubuh, akan memudahkan kita dalam mempelajari teknik
isolasi genom dari sumber jaringan.
1.1.1. Persiapan Genom Manusia
Tujuan dari percobaan ini adalah mengisolasi dan
mempurifikasikan dalam jumlah banyak genom manusia. Sumber
yang paling mudah dan tidak korosif adalah saliva ataupun usapan
lapisan mukosa mulut pipi bagian dalam.
Telah kita ketahui bahwa konsentrasi jumlah DNA dalam sel
hanya sedikit, ditemukan sebagian besar di inti sel (90%). Karena
jumlah yang sangat sedikit, maka diperlukan keterampilan dalam
memisahkan DNA dengan komponen sel lainnya. Ada banyak metode
memurnikan atau purifikasi DNA dengan komponen lain, terutama
protein. Namun semua proses memiliki prinsip dasar yang sama,
yaitu:
1. Menghancurkan sel.
2. Membuang protein.
3. Membuang RNA.
4. Memekatkan DNA.
1.1.2. Menghancurkan Sel
Menghancurkan sel merupakan salah satu langkah penting
dalam pemurnian DNA. Sel dapat dihancurkan atau dipecah
menggunakan teknik sonikasi, grinding/giling, cacah atau dengan
tekanan tinggi agar sel hancur. Namun, langkah ini sering
mengakibatkan DNA terpotong-potong jika metode yang digunakan
kurang baik, sehingga kemurnian DNA akan turun.
Langkah yang terbaik adalah menggunakan bahan kimia
seperti pemberian detergen/sabun atau menggunakan teknik
enzimatik. Sabun akan melarutkan lipid membran sel. Sabun juga akan
memiliki peran sebagai inhibitor DNAse dan dapat mendenaturasi
protein, sehingga membantu dalam membuang protein dari larutan
uji. Detergen yang biasanya digunakan sebagai pelarut lisis sel hewan
3 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
adalah detergen yang bersifat anionic seperti SDS (sodium deodesil
sulfat) atau Sarkosil (sodium deodesil sarkosinat).
1.1.3. Membuang Protein
Langkah selanjutnya dalam proses isolasi dan pemurnian
genom adalah membuang semua materi atau komponen protein,
dikenal sebagai deproteinasi. Prinsip dasar pada proses ini adalah
membuang kemampuan kelarutan protein, sehingga protein akan
menjadi tidak larut (mengendap) sedangkan asam nukleat tetap larut.
Banyak pelarut organik yang dapat digunakan untuk
mengendapkan protein. Metode fenol dan kloroform, umumnya
digunakan dalam mengendapkan protein. Metode fenol mempunyai
prinsip sebagai berikut: Fenol adalah kristal pada suhu kamar, namun
dengan adanya 20 persen air, ia membentuk suspensi berair yang
mengandung misel fenol yang dikelilingi oleh molekul air. Molekul
protein banyak mengandung residu asam amino hidrofobik yang
terpusat di pusat molekul. Ketika larutan yang mengandung protein
terlarut dicampurkan dengan fenol yang bersifat lebih hidrofobik akan
menyebabkan fenol akan berdifusi ke dalam inti protein, sehingga
protein membengkak dan protein menjadi terbuka (unfold) dan ter-
denaturasi. Protein yang terdenaturasi dengan kelompok hidrofobik
yang terpapar dan dikelilingi oleh misel fenol, jauh lebih mudah larut
dalam fase fenol daripada fasa berair. Akibatnya, protein dipartisi ke
fasa fenol yang meninggalkan asam nukleat dalam fasa berair. Asam
nukleat tidak memiliki gugus hidrofobik sama sekali dan tidak dapat
larut dalam fase fenol. Selain itu, fenol juga berperan dalam
membuang fraksi lipid dalam larutan sampel DNA tersebut.
Metode kloroform digunakan karena kloroform tidak larut
dalam air sehingga mencegah hilangnya DNA ke fase organik.
Deproteinisasi oleh kloroform didasarkan atas ter-denaturasi rantai
polipeptida pada interfase air-kloroform. Konsentrasi protein yang
tinggi pada interfase akan menyebabkan protein mengendap. Namun
deproteinisasi ini sangat tergantung pada pembentukan daerah
interfase yang besar, sehingga bantuan mekanik yang besar yaitu
4 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
pengocokan/penggoyangan yang kuat. Selain itu, metode ini hanya
cocok untuk mendapatkan DNA dengan total ukuran 20 ribu-50 ribu
pasang basa (umumnya DNA virus). Metode fenol dan kloroform
memiliki keburukan dalam hal limbah. Sifat toksin yang tinggi,
memerlukan penangan limbah yang khusus.
Metode lain adalah menggunakan enzim. Protein dapat
dibuang dalam larutan sampel genom menggunakan enzim protease.
Enzim ini akan memecah atau mencerna semua protein. Ada dua
macam enzim yang sering digunakan yaitu proteinase K dan pronase.
Kedua enzim ini sangat stabil dan diperoleh dari jamur. Enzim ini akan
bekerja aktif pada larutan yang rendah seperti detergen anionik, tinggi
konsentrasi garam EDTA, pH 6-10 dan suhu antara 500-600C.
Perbedaan antar kedua enzim ini adalah pronase bersifat self-
digesting, sehingga harus selalu ditambahkan pada saat proses
berlangsung. Metode lain adalah dengan penggunaan asam. Prinsip
dasarnya adalah penambahan larutan asam seperti asam cuka akan
menyebabkan koagulasi protein, sehingga protein akan mudah
diendapkan. Proses ini terjadi akibat asam akan mengacaukan
jembatan garam dengan adanya muatan ionik.
1.1.4. Membuang RNA
Untuk membuang RNA saat isolasi DNA, maka digunakan
metode enzimatik. Namun, tidak semua RNA akan hilang, sejumlah
kecil RNA akan tetap ditemukan pada proses pemurnian DNA. Ada dua
enzim yang digunakan, yaitu RNase A dan RNase T1. Mekanisme
keduanya didasarkan pada posisi pemotongan basa nuklotida urasil,
sitosin dan guanine.
1.1.5. Pemekatan DNA
Pengendapan dan pemekatan DNA telah dimulai pada tahap
deproteinisasi menggunakan campuran fenol-kloroform-alkohol.
Prinsip pengendapan pada alkohol didasarkan pada kemampuan
penurunan kelarutan asam nukleat dalam air. Molekul air yang polar
yang mengelilingi molekul DNA akan mempengaruhi kelarutan DNA.
5 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Etanol akan mengubah potensial ionik dari DNA sehingga akan
membuang molekul air yang berinteraksi dengan DNA, akibatnya DNA
akan mengendap. Penambahan etanol 95% dalam larutan sampel DNA
akan menarik molekul air-DNA sehingga DNA akan mengendap.
Penggunaan etanol 95% atau 100% murni, akan mempengaruhi
dalam hal pembiayaan. Untuk itu, digunakan etanol dengan
konsentrasi lebih rendah. Namun, proses ini memerlukan
penambahan larutan senyawa garam dalam larutan DNA agar
menetralkan muatan fosfat-DNA sehingga mengeliminasi interaksi air-
DNA. Senyawa larutan garam yang sering digunakan adalah natrium
atau amonium. Namun harap diingat, pengeliminasi materi garam dari
larutan DNA yang tidak sempurna akan mempengaruhi proses PCR
karena senyawa garam ini akan mengganggu proses enzimatik pada
proses PCR.
Penggunaan amonium asetat yang memiliki kelarutan tinggi
dalam etanol, sangat dianjurkan dalam memperoleh DNA yang murni.
Setelah larutan DNA diendapkan, garam amonium akan mudah
dilarutkan dengan penambahan etanol 70%. Sedangkan untuk
menghilangkan fraksi etanol pada DNA, dapat digunakan pemanasan.
Dalam temperatur 600C, etanol akan mudah dan cepat menguap.
Prinsip protokol isolasi genom ini dapat diterapkan baik
menggunakan darah, sel maupun jaringan. Perbedaan pada jaringan,
seperti jaringan tumbuhan, organ dan sebagainya hanya bagaimana
cara kita untuk memecah jaringan tersebut, seperti untuk isolasi
genom DNA dari jaringan hati, maka kita harus menggerus jaringan
tersebut menggunakan teknik penggerusan dengan lumping. Ekstrak
gerusan tersebut akan digunakan pada metode isolasi seperti di atas.
Saat ini, telah banyak dikembangkan teknik isolasi genom DNA
menggunakan KIT dari berbagai manufaktori. Masing-masing KIT
memiliki kelebihan dan kekurangan, sebagai contoh KIT isolasi DNA
genom menggunakan miniprep column memiliki kelebihan dalam
memangkas waktu kerja, tidak menggunakan bahan fenol yang
berbahaya dan mudah dalam pengerjaannya, namun kekurangannya
adalah dalam harga yang lebih mahal. Umumnya KIT isolasi genom
6 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
yang diproduksi di Eropa maupun Amerika, dijual lebih mahal
dibandingkan produk dari di luar negara tersebut.
Hal yang perlu diperhatikan dalam isolasi genom
Penanganan material sampel
Untuk isolasi DNA genom dari sel dan jaringan, sebaiknya
gunakan sampel baru fresh sample. Jika kita tidak dapat langsung
mengisolasi, sampel tersebut wajib dibekukan dalam cairan nitrogen
atau lemari beku -70C. Hal ini bertujuan mencegah degradasi DNA
akibat aktivitas enzim pendegradasi. Jika sampel yang kita koleksi
adalah darah atau cairan tubuh, penyimpanan pada suhu ruang hanya
bertahan selama 1-2 hari. Penyimpanan pada lemari beku suhu 4C,
hanya bertahan hingga 7 hari. Penyimpanan untuk 1 bulan, sampel
dapat dibekukan pada suhu -20C. Penyimpanan terbaik adalah pada
suhu -80C, sampel dapat bertahan lebih dari 5 tahun. Umumnya,
penyimpanan lama, akan menurunkan kemurnian dari DNA genom.
Perlu diingat, untuk sampel darah, antikoagulan yang diperbolehkan
adalah selain heparin. Pemakaian heparin sebagai antikoagulan, akan
mengganggu proses tahap PCR. Bahan sampel terutama dalam bentuk
cairan, harap disimpan dalam bentuk alikuot atau ditaruh di lebih dari
1 tabung. Hal ini bertujuan mencegah kerusakan bahan sampel akibat
proses cair-beku-cair (“thawing”) saat melakukan isolasi genom DNA.
Genom DNA hasil isolasi, sebaiknya disimpan pada suhu 2-8C.
Penyimpanan pada suhu beku akan merusak genom DNA atau genom
DNA akan terpotong-potong. Untuk genom DNA plasmid, dapat disim-
pan pada suhu -20C. Hindari pengeringan yang berlebih (pemanasan
yang lama) saat menguapkan etanol ditahap isolasi genom DNA.
Sebaiknya keringkan atau uapkan etanol dengan membuka tutup tube
dan taruh pada suhu ruangan (namun memerlukan waktu o.n atau
“over night”). Untuk melarutkan genom DNA, gunakan buffer Tris 10
mM pH 7-8. Hindari penggunaan air atau ddH2O. Agar memudahkan
genom DNA cepat larut, dapat diinkubasi suhu 65C selama 10 menit.
Pemanasan ini juga akan merusak DNase, sehingga genom DNA tidak
rusak. Hindari vorteks saat melarutkan genom DNA.
7 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Cara menghitung konsentrasi dan kemurnian genom DNA
Genom DNA hasil isolasi dapat diukur konsentrasi dan
kemurniannya dengan cara mengetahui mengukur nilai OD dari
genom tersebut menggunakan teknik spektrofotometri. Genom DNA
diencerkan dan dibaca pada panjang gelombang 230 nm, 260 nm dan
280 nm. Saat ini, telah ada alat spektrofotometer yang dapat
digunakan untuk mengukur kemurnian dan konsentrasi genom DNA
dalam jumlah yang sangat sedikit, antara 0.5 – 2.0 uL. Alat ini akan
menghitung konsentrasi DNA secara otomatis dan tanpa perlu
pengenceran. Untuk mengetahui kemurnian DNA, diukur berdasarkan
perbandingan absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm dan
260/230 nm. Kemurnian yang baik adalah jika nilai perbandingan
260/280 nm : 1.8 – 2.1 dan 260/230 nm 2-2.2. Jika nilai kurang atau
lebih dari kisaran tersebut, menunjukkan masih ada senyawa organik
atau garam dalam sampel DNA hasil isolasi. Untuk mengatasi
kemurnian yang tidak baik, dapat dilakukan pengulangan tahap
isolasi, atau dilakukan pengenceran dengan tujuan untuk memperkecil
senyawa bukan DNA dalam sampel. Namun, pengenceran akan
menurunkan konsentrasi dari sampel DNA hasil isolasi. Sampel DNA
dengan konsentrasi rendah (0.01 ng/uL) masih dapat digunakan
untuk tahapan RT PCR (qPCR) selama kemurniannya dalam kisaran
yang baik.
Isolasi genom dari liur
Isolasi genom dari liur atau saliva, merupakan salah satu
teknik yang sederhana, tidak melukai dan mudah pengerjaannya.
Bahan dan alat yang dibutuhkan adalah liur, tabung reaksi 30 mL,
etanol, buffer saline (PBS), larutan lisis, PCI dan amonium asetat serta
alat sentrifuse dan tabungnya. Kadang teknik dikombinasikan dengan
pemberian asam cuka encer.
Prosedur kerja:
1. Sepuluh milliliter larutan NaCl fisiologis (buffer saline)
digunakan untuk berkumur selama 60 detik.
2. Ludahkan dalam tabung sentrifuse 25 mL, ulangi hingga 2 kali.
8 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
3. Tabung kemudian disentrifuse pada kecepatan maksimum
(5000 rpm) selama 20 menit. Lebih baik jika menggunakan
sentrifuse dingin.
4. Hati-hati dalam membuang supernatant, jangan sampai pellet
sel terlepas dari dinding tabung.
5. Tambahkan 1 mL mL larutan lisis buffer yang terdiri dari
campuran 0.5% SDS, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris-HCl.
6. Tambahkan 50 uL Proteinase K
7. Kocok perlahan, jangan berbuih (ingat kita menggunakan
sabun), sampai pellet terlepas dari dinding tabung. Kemudian
inkubasi 560C selama 3 jam atau biarkan dalam suhu kamar
selama 1 malam.
8. Setelah 3 jam atau dibiarkan satu malam, tambahkan larutan 1
mL PCI (fenol-8OH-TE) dengan perbandingan volume yang
sama. Kocok kuat-kuat selama 30 detik, lalu sentrifuse
kecepatan maksimum selama 10 menit. (gambar 1)
9. Ambil lapisan atas dan pindahkan ke tabung baru yang berisi
kloroform dengan volume yang sama. Hati-hati dalam
memindahkan DNA yang terlarut dalam fase cair (larutan
bening), jangan sampai tercampur dengan daerah interfase
yang berwarna putih, dan lapisan bawah yang merupakan fase
fenol (larutan kuning). Tabung baru yang telah berisi hasil
sentrifuse no 8 dan kloroform, kemudian dikocok dan
disentrifuse kecepatan maksimum selama 10 menit.
Pindahkan larutan atas ke tabung baru. Fungsi kloroform
dalam percobaan ini untuk membersihkan fenol dari sampel.
10. Tambahkan setengah volume (kira-kira 1 mL) 7.5 M amonium
asetat, tabung dibolak-balik 10 kali.
11. Tambahkan etanol 95% dingin sebanyak 2 x jumlah volume
larutan sebelumnya, misalkan jumlah volume total DNA dan
amonium asetat 3 ml, maka tambahkan etanol 6 mL. Bolak
balik dengan pelan, maka akan muncul helaian DNA seperti
kapas. Ambil helaian DNA secara hati-hati dengan
9 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
menggunakan batang kaca dan pindahkan ke tabung yang
sudah mengandung 3 etanol 70% dingin.
12. Sentrifuse pada kecepatan maksimum selama 5 menit. DNA
akan mengendap di bagian bawah tabung seperti lapisan atau
butiran putih.
13. Buang hati-hati etanol tersebut, buang sebanyak mungkin,
kemudian keringkan di oven dengan tutup tabung terbuka,
pada suhu 700C.
14. Setelah kering, pellet DNA dapat dilarutkan dengan 100 uL
buffer TE (Tris EDTA). Biarkan semalam dalam temperatur 40C
sehingga DNA larut.
15. Untuk memeriksa keberhasilan kita, dapat digunakan uji
elektroforesis dan nanodrop untuk menghitung kemurnian-
konsentrasi DNA.
Gambar 1. Isolasi DNA pada Pemisahan Fenol (www.genetargetsolutions.com.au/product/5prime-phase-lock-gel/)
Isolasi Genom dari darah dengan metode fenol-kloroform
Bahan :
- dH2O
- Larutan salin (NaCl 0.8%)
- Larutan lisis terdiri dari 14 g NH4Cl dan 0.144 g NH4HCO3
dibuat dalam 1 L air steril (dH2O)
10 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
- Proteinase K
- 10% SDS
- STE pH 7.4, yang terdiri dari 2.92 g NaCl; 3.03 g Trizma base;
0.19 g EDTA dibuat dalam 500 mL air steril
- TE yang terdiri dari 1.21 g Trizma base; 0.37 g Na-EDTA dibuat
dalam 900 mL. Larutan TE ini adalah stock, jika akan dibuat pH
8, maka larutan TE tersebut ditetesi 1 N HCl hingga pH 8,
kemudian ditambahkan air steril hingga 1 L. Hal yang sama
dilakukan jika untuk membuat pH 7.6
- TE-Saturated Phenol pH 8 dengan penambahan 0.1% 8-
hydroxyquinoline
- Kloroform
- 99.5% etanol
- 3 M Na-Asetat
- 70 % etanol
Prosedur:
Cell Lysis.
Darah (sekitar 2ml) disentrifus pada
kecepatan 5,000 rpm selama 5 menit
pada suhu ruang.
Tiga lapisan akan terbentuk (serum,
Buffy coat dan eritrosit/RBC).
Serum dibuang (jika dibutuhkan, simpan
di tabung lain).
Tambahkan salin untuk mencuci pellet, sentrifus pada
kecepatan 5,000 rpm selama 5 menit pada suhu 40C (atau suhu
ruang).
Buang lapisan atas (supernatan) dan pindahkan buffy coat ke
tabung baru (tabung mikro1.5 mL).
Ulangi langkah 4 dan 5 sehingga akan diperoleh buffy coat (sel
darah putih) dalam jumlah yang banyak.
Tambahkan lysing solution (volume maksimum) ke dalam
tabung yang berisi buffy coat, kocok dan campur dengan baik
Serum
RBC
Buffy coat
11 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
selama 5 menit. Kemudian disentrifus dengan kecepatan
15,000 rpm selama 5 menit pada 40C.
Ulangi langkah ke 7 tiga kali, dan harus yakin tidak ada
eritrosit yang tersisa (hanya buffy coat).
putih terlarut sempurna.
Tambahkan 20 L 10% SDS, campur dengan baik.
Tambahkan 4 L proteinase K, dan campur dengan baik (kocok
pelan-pelan, jangan berbuih).
Biarkan semalaman pada 370C atau simpan pada inkubator
suhu 600C untuk 1-2 jam.
Phenol-Chloroform Reaction
Tambahkan 400 L TE-saturated phenol, kocok perlahan-lahan
selama 5 menit.
Sentrifus pada 15,000 rpm selama 5 menit dalam suhu kamar.
Dapat terlihat 3 lapisan, bagian lapisan atas (DNA), tengah
(protein yang terdegradasi), bawah (phenol).
Pindahkan lapisan atas (DNA) ke dalam tabung mikro baru 1.5
mL menggunakan pipet tetes.
chloroform dingin dan campur dengan
baik (bolak-balik) untuk 5 menit dan sentrifus pada 15000
rpm selama 5 menit. (chloroform dapat berfungsi untuk
membuang atau menetralkan phenol, phenol harus
disingkirkan karena akan medetnaturasi protein enzim yang
akan digunakan pada step PCR atau analisis lain.)
mikro baru 1.5 mL menggunakan pipet bersih.
Ulangi dua langkah sebelumnya hingga seluruh phenol yang
ada hilang.
Tamba ethanol 99.9
%.
Campur dengan baik, dan DNA akan tampak.
12 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Sentrifuse pada 15,000 rpm selama 5 menit. Buang supernatan
ethanol.
Tambahkan 1mL 70% ethanol, dan sentrifus pada 15,000 rpm
selama 5 menit.
Buang ethanol seluruhnya.
DNA dapat dikeringkan menggunakan sentrifus vakum selama
5 menit hingga tidak ada ethanol yang tersisa.
Jika tidak ada sentrifus vakum, cukup letakkan pada blok
inkubator suhu 600C dan biarkan hingga kering.
Larutkan DNA pellet menggunakan larutan 100
per 1ml darah).
Simpan pada 40C.
Selain metode konvensional, ada beberapa metode yang
memudahkan peneliti dalam isolasi DNA, yaitu menggunakan spin
kolom.
13 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
BAB II. ELEKTROFORESIS
DAN IDENTIFIKASI GENOM DNA
Gel elektroforesis adalah suatu teknik yang digunakan untuk
memisahkan fragmen DNA dari makromolekul lain (RNA dan protein)
berdasarkan ukuran dan muatannya. Molekul ini akan bergerak
melalui gel menuju arah yang berbeda muatan dan kecepatan. Untuk
molekul DNA, semua molekulnya memiliki muatan listrik yang sama
yaitu negatif, sehingga pergerakannya akan dipengaruhi oleh
ukurannya.
Gel elektroforesis untuk pemisahan DNA adalah agarose yang
merupakan polisakarida. Ketika agarose dilarutkan dalam buffer
garam kemudian dipanaskan dan setelah terlarut sempurna,
didinginkan, maka akan membentuk suatu bahan solid, namun tidak
keras dan permukaan yang licin. Pada prinsipnya agarose yang
mengeras menyerupai makanan agar-agar atau jello. Pada
pengamatan molekular, agarose gel merupakan matriks yang
molekulnya satu sama lain disatukan oleh ikatan hidrogen dan
membentuk semacam pori-pori atau lubang saringan kecil.
Untuk mengamati fragmen DNA, maka gel agarose tersebut
ditempatkan dalam suatu wadah berisi larutan buffer garam serta
dialirkan listrik melalui panel elektroda positif dan negatif. Saat
pembuatan gel agarose, dalam cetakan akan ditaruh sisir DNA,
sehingga saat gel agarose mengeras, akan ada sumur-sumur tempat
menuangkan cairan DNA. Adanya gugus fosfat pada DNA, maka DNA
akan bermuatan negatif. Oleh karena itu, posisi sumur untuk DNA
diletakkan dalam wadah elektroforesis di area kutub elektroda
negatif. Saat aliran listrik mengalir dalam gel agarose, DNA akan
bergerak ke arah kutub elektroda positif. Pergerakan kecepatan DNA
dalam gel agarose dipengaruhi oleh ukuran dari fragmen DNA
14 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
tersebut. Jika ukuran fragmen DNA adalah kecil, maka pergerakan
menuju kutub elektroda positif akan cepat, karena molekul DNA akan
mudah melewati pori-pori gel agarose. Jika ukuran fragmen DNA-nya
besar, maka kecepatan akan melambat akibat hambatan dari pori-pori
gel agarose yang kecil.
Gambar 2. Gel Elektroforesis Agarose (Drabik, 2016)
Pemeriksaan DNA genom dengan gel agarose
1. Siapkan agarose 1.5 % dan buffer elektroforesis (TBE atau
TAE)
2. Tuang larutan agarose cair yang sudah mengandung etidium
bromide dalam cetakan agarose.
3. Tunggu sampai kering.
4. Pindahkan agarose bersama cetakannya ke dalam bak
elektroforesis yang sudah berisi larutan elektroforesis.
15 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
5. Masukkan 1 uL genom DNA hasil isolasi kita.
6. Jalankan elektroforesis (ingat DNA berjalan dari kutub negatif
ke positif).
7. Setelah 30 menit, hasil elektroforesis dapat dilihat di lampu
UV. (gambar 2)
Gambar 3. Elektroforesis Genom DNA (dokumentasi pribadi)
16 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
BAB III. ISOLASI RNA
RNA (asam ribonukleat) adalah polimer yang ada dalam sel
hidup dan banyak virus, yang terdiri dari rantai panjang tunggal
untaian fosfat dan unit ribosa dengan basis nitrogen adenin, guanin,
sitosin, dan urasil, yang terikat pada gula ribosa. RNA digunakan
dalam semua langkah sintesis protein di semua sel hidup dan
membawa informasi genetik untuk banyak virus.
Isolasi RNA dengan kualitas tinggi adalah langkah penting yang
diperlukan untuk melakukan berbagai eksperimen biologi molekuler.
TRIzol Reagen adalah reagen siap pakai yang digunakan untuk isolasi
RNA dari sel dan jaringan. TRIzol bekerja dengan menjaga integritas
RNA selama homogenisasi jaringan, sementara pada saat yang sama
mengganggu dan memecah sel dan komponen sel. Penambahan
kloroform, setelah sentrifugasi, memisahkan larutan menjadi fase
berair dan organik. RNA hanya tersisa dalam fase air.
Setelah mentransfer fase berair, RNA dapat diperoleh kembali
dengan presipitasi dengan isopropil alkohol. Tetapi DNA dan protein
dapat pulih dengan pemisahan berurutan setelah penghilangan fase
berair. Pengendapan dengan etanol membutuhkan DNA dari interfase,
dan presipitasi tambahan dengan isopropil alkohol membutuhkan
protein dari fase organik. Total RNA yang diekstraksi oleh TRIzol
Reagent bebas dari kontaminasi protein dan DNA. RNA ini dapat
digunakan dalam analisis Northern blot dan lain-lain.
Pada umumnya, prosedur isolasi RNA tradisional diutamakan
terhadap agen penghambat kerja RNase (biasanya denaturants kuat
seperti garam guanidine, sodium dodecylsulfate (SDS), atau senyawa
berbasis fenol yang dirancang untuk menurunkan risiko degradasi
RNA dalam sampel). Namun pada kenyataannya, sebelum dan sesudah
isolasi, integritas RNA berada pada risiko tertinggi.
17 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Teknik isolasi RNA atau total RNA hampir sama dengan teknik
isolasi DNA, namun harus diperhatikan sifat fisik dari RNA yang labil
dibanding DNA sehingga mudah mengalami kerusakan jika kerja kita
tidak baik. Hal yang wajib diperhatikan adalah proses pengambilan
dan pengantaran sampel, metode yang akan digunakan untuk isolasi
RNA, dan proses penyimpanan hasil isolasi RNA.
Berikut ini, akan dijelaskan proses isolasi RNA dari berbagai
sumber. Namun sebelumnya akan dijelaskan tahapan yang perlu
diperhatikan:
1. Koleksi sampel dan perlindungan terhadap sampel
Harus diingat, RNA sama seperti DNA, dapat diperoleh dari
jaringan atau sel yang berinti. Teknik isolasi untuk mendapatkan RNA
tergantung dari jenis sampel yang kita gunakan. Menemukan metode
koleksi dan perlindungan sampel RNA yang tepat akan
memaksimalkan hasil dan kualitas RNA yang diisolasi. Pada umumnya,
untuk memperoleh hasil RNA yang baik, sampel yang diisolasi harus
segera dibekukan baik dengan nitrogen cair atau es kering. Bagaimana
jika tidak mempunyai bejana nitrogen cair ataupun es kering. Itu kita
harus memikirkan cara mengontrol kondisi agar hasil yang diperoleh
tetap terjaga walaupun mungkin kualitasnya sedikit menurun. Hal
yang paling baik adalah, sampel yang diperoleh langsung digunakan
untuk diisolasi RNA-nya. Namun, jika kita tidak dapat segera
melakukannya, maka siapkan es balok atau es batu dalam termos.
Sampel dapat disimpan sementara dalam termos es selama maksimal
6 jam hingga kita memindahkan sampel tersebut dalam lemari
pendingin beku. Untuk sampel RNA yang bersumber dari jaringan atau
organ, dapat disimpan dalam formalin dingin (jika larutan tersebut
tersedia).
2. Preparasi RNA
Banyak teknologi yang sudah diproduksi massal untuk
mengisolasi RNA. Setiap metode ada kelebihan atau kekurangannya.
Umumnya pada kemudahan dalam kerja isolasi RNA. Sejumlah
18 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
teknologi persiapan RNA tersedia secara luas yang dapat
diklasifikasikan ke dalam empat teknik umum: metode ekstraksi
organik, format keranjang spin, metode partikel magnetik, dan metode
lisis langsung. Sementara semua dapat digunakan untuk menyiapkan
RNA berkualitas tinggi yang cocok untuk berbagai macam teknik
analisis, ada beberapa faktor yang perlu dipertimbangkan dalam
memilih teknologi pemurnian yang tepat.
Metode Ekstraksi Organik
Metode ekstraksi organik dianggap sebagai standar emas
untuk persiapan RNA. Selama proses ini, sampel dihomogenisasi
dalam larutan yang mengandung fenol dan kemudian disentrifugasi.
Selama sentrifugasi, sampel dipisahkan menjadi tiga fase, yaitu fase
organik ada di area lebih rendah, fase tengah di area tengah yang
mengandung protein terdenaturasi dan gDNA, serta fase berair di area
atas yang mengandung RNA. Fase berair di atas dipindahkan dan RNA
diendapkan oleh pengendapan alkohol dan rehidrasi. Kelebihan
menggunakan metode ekstraksi organik adalah denaturasi nukleasi
yang cepat dan menstabilkan RNA.
Metode Filter-sentrifuse
Dasar metode ini adalah filter atau penyaringan menggunakan
membran berbahan serat kaca, silika atau penukar ion. Sampel
dilisiskan dalam buffer yang mengandung inhibitor RNase (biasanya
garam guanidin), dan asam nukleat terikat ke membran dengan
melewatkan lisat melalui membran menggunakan gaya sentrifugal.
Larutan pencucian kemudian dilewatkan melalui membran dan
dibuang. Pelarut elusi yang tepat diterapkan dan sampel dikumpulkan
ke dalam tabung dengan sentrifugasi. Beberapa teknik dapat
dilakukan dengan sentrifugasi atau vakum sentrifugasi.
3. Jumlah RNA
Untuk mencapai keberhasilkan dalam kerja dengan RNA, maka
perlu dilakukan identifikasi hasil isolasi RNA, yaitu dengan
19 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
menggunakan teknik agarose elektroforesis dan atau dengan
menggunakan teknik spektrofotometer.
Gambar 4. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian RNA dengan UV Spektrofotometer nano drop.
(Koleksi pribadi) Tampak konsentrasi 2912,071 ng/uL dengan kemurnian 2,05.
Prinsip dasar menggunakan agarose, serupa dengan
identifikasi hasil isolasi DNA. Molekul RNA juga memiliki muatan
negatif karena adanya gugus fosfat sebagai tulang punggungnya,
dengan demikian proses pergerakan elektroforesisnya adalah dari
kutub negatif ke kutub positif. Untuk mengetahui kemurnian dan
konsentrasi RNA, digunakan spektrofotometer. Saat ini telah ada
teknologi dalam mengukur kemurnian dan konsentrasi RNA
menggunakan alat UV spektrofotometer nano drop. Jika kita tidak
memiliki UV Spektrofotometer nano drop dapat menggunakan UV
Spektro biasa. Absorbansi sampel RNA yang diencerkan diukur pada
panjang gelombang 260 dan 280 nm. Konsentrasi RNA dihitung
dengan menggunakan hukum Beer-Lambert, memprediksi perubahan
linier dalam absorbansi dengan konsentrasi. Menggunakan persamaan
ini, maka pembacaan pada panjang gelombang 260 nm dari 1.0 setara
dengan ~ 40 ug/mL RNA untai tunggal. Rasio absorbansi pada 260
nm/280 nm digunakan untuk menilai kemurnian RNA. Nilai 1.8 – 2.1
20 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
menunjukkan RNA dengan kemurnian yang sangat baik. Jika kita
mempunyai alat UV Spektrofotometer nano drop, kita hanya
meneteskan 1 uL sampel larutan RNA hasil isolasi dan mesin akan
langsung menghitung konsentrasi serta kemurniannya.
Gambar 5. Hasil elektroforesis RNA. Hasil isolasi yang baik, akan memberikan gambaran 2 pita, yang menunjukkan RNA ukuran 28 S dan
18S (Dokumentasi pribadi)
Isolasi RNA menggunakan TRIzol merupakan teknik yang
umum dilakukan saat ini. Selain menggunakan TRIzol dengan teknik
konvesnional, ada juga teknik TRIzol yang dikombinasikan dengan
tabung kolom seperti pada isolasi DNA. Namun, secara prinsip dasar
kedua metode sama yaitu memisahkan RNA dari bahan biologis
lainnya.
Isolasi RNA dari darah menggunakan TRIzol-kloroform
Bahan:
- Darah
- 10x RBC lisis buffer steril (89.9 g NH4Cl, 10 g KHCO3, 2 mL 0.5
M EDTA dalam 1 L dengan pH 7.3), sebagai larutan stok.
- TRIzol
- PBS
- Isopropanol
28S
18S
Kontaminasi
DNA
28S RNA
18S RNA
21 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
- Etanol
- RNAse-free water
Prosedur:
1. 1 mL darah ditambahkan dalam 9 mL 1x RBC lisis buffer.
Bolak-balik pelan dan biarkan 10 menit pada suhu 40C.
2. Sentrifuse 1500 rpm selama 10 menit pada suhu ruang.
3. Buang supernatan dengan hati-hati, jangan sampai pellet
terbawa.
4. Tambahkan 1 x RBC lisis pada pellet, lakukan pemipetan “up
and down atau sedot sebul” hingga pellet larut dalam larutan
RBC lisis tersebut dan pindahkan ke tabung sentrifuse 2 mL.
5. Sentrifuse 3000 rpm selama 5 menit pada suhu 40C
(sebaiknya).
6. Buang supernatan, kemudian tambahkan 1 mL PBS, lakukan
pemipetan “sedot sebul”, kemudian ulangi lakukan sentrifuse
seperti pada tahap sebelumnya.
7. Tambahkan 1200 uL TRIzol dalam tabung berisi pellet, lalu
lakukan pemipetan “sedot sebul” sehingga pellet menjadi
terlarut dalam TRIzol.
8. Tambahkan 200 uL kloroform, vortex 10 detik, kemudian
sentrifuse pada kecepatan 13000 rpm selama 10 menit pada
suhu 40C.
9. Dalam tabung akan ada 3 lapisan larutan, lapisan bening atas;
lapisan tipis putih tengah dan lapisan merah muda bawah.
RNA berada di lapisan bening atas, DNA berada di lapisan
putih tengah (interface) dan protein berada di lapisan bawah,
larutan yang berwarna merah muda.
10. Ambil lapisan bening bagian atas dengan hati-hati tanpa
membawa lapisan putih dan merah muda, kemudian
pindahkan ke tabung baru yang bersih-steril.
11. Tambahkan 500 uL larutan isopropanol dingin dan lakukan
pemipeting “sedot-sebul” atau dikocok. Isopropanol akan
mengendapkan RNA. Biarkan 10 menit.
22 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
12. Taruh sampel di -200C jika tidak digunakan.
13. Sentrifuse 13000 rpm selama 10 menit pada suhu 40C. Buang
supernatan.
14. Buang supernatan dengan hati-hati, jangan sampai pellet putih
terbawa. Kemudian tambahkan 500 uL 75% etanol dingin.
15. Sentrifuse selama 10 menit pada kecepatan 13000 rpm dengan
temperatur 40C.
16. Buang supernatan, keringkan tabung jangan sampai ada etanol
sisa.
17. Tambahkan 30 uL air yang bebas RNA dalam tabung, biarkan
selama 2 jam agar larut.
18. RNA sudah diperoleh. Simpan pada suhu -200C.
Metode lain yang dapat digunakan adalah kombinasi TRIzol
dan kit isolasi PCR. Kami menggunakan Direct-zol RNA Miniprep Plus
dari Zymo Research. Metode kombinasi ini membantu mengurangi
waktu kerja dan mudah dalam pelaksanaannya.
23 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
BAB IV. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
Hibridiasasi atau aneling (penempelan) merupakan dasar dari
kemampuan untai tunggal asam nukleat untuk melakukan
pengikatnya spesifik dengan untai komplementernya (pasangannya).
Ketika untai ganda DNA mengalami denaturasi atau dipanaskan, maka
untai akan terpisah, jika pemanasan dihilangkan atau dilakukan
penurunan temperatur, maka untai terpisah akan bergabung kembali.
Prinsip dasar ini yang menjadi dasar pada proses PCR, di mana
saat terjadi penurunan suhu pada proses PCR, akan terjadi proses
penempelan untai oligonukleotida. Proses penempelan ini
dipengaruhi oleh faktor yang mempengaruhi proses pembentukan
ikatan hidrogen antara basa nukelotida pasangannya, yaitu
temperatur, pH, larutan garam dan sebagainya.
Telah diketahui bahwa basa nukleotida G akan berpasangan
dengan basa nukleotida C dengan bantuan tiga (3) jembatan hidrogen,
sedangkan basa nukleotida A akan berpasangan dengan T melalui dua
jembatan hidrogen. Untuk memutuskan jembatan yang
menghubungkan basa-basa tersebut diperlukan energi (untuk
laboratorium dalam hal ini adalah pemanasan yang tinggi).
PCR merupakan suatu metode in vitro dalam sintesis DNA.
Prinsip dasar metode ini adalah perbanyakan fragmen DNA
menggunakan enzim polymerase pada temperatur yang tinggi yang
dilakukan secara berulang. Pada proses PCR dibutuhkan
oligonukleotida pendek (primer DNA) yang berperan dalam
mengawali proses ini. Primer akan menempel atau hybrid pada untai
tunggal DNA saat temperatur diturunkan setelah terjadi pemisahan
untai ganda DNA. Produk hasil PCR dapat diamati menggunakan
teknik eletroforesis agarose.
24 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
PCR memiliki beragam aplikasi, tidak hanya dalam penelitian
dasar tetapi juga dalam bidang diagnosa medis, forensik, dan
pertanian. Seperti dijelaskan di halaman ini, beberapa contoh aplikasi
PCR meliputi:
1. Ekspresi gen
2. Deteksi genotipe
3. Kloning
4. Mutagenesis
5. Analisis metilasi
6. Sekuensing
7. Kesehatan, forensik dan aplikasi lainnya
Hingga saat ini, metode PCR telah berkembang dari metode
PCR yang umum hingga metode PCR yang dapat digunakan langsung
untuk melihat apakah sampel tersebut memiliki mutasi atau tidak,
tergantung aplikasi apa yang akan dipakai apakah untuk identifikasi
molekuler, sekuensing atau rekayasa genetika. Beberapa PCR yang
telah dikembangkan saat ini:
1. PCR standar, metode dasar PCR dan hasil produk PCR dapat
digunakan untuk tahap selanjutnya seperti kloning,
sekuensing, restriksi enzim.
2. ARMS PCR, atau Amplification Refractory Mutation System
(ARMS) PCR adalah aplikasi PCR di mana menggunakan
primer spesifik. Metode ini yang sangat berguna untuk
identifikasi mutasi titik atau polimorfisme.
3. GAP-PCR, mutasi delesi pada gen cluster seperti -globin, dapat
dideteksi oleh PCR standar menggunakan sepasang primer
yang komplemen dengan untai DNA yang di dalamnya ada area
delesi. Untuk delesi yang kecil, kurang dari 1 kb, maka akan
dihasilkan dua buah produk fragmen, satu fragmen besar dan
satu fragmen kecil (fragmen yang ada delesi kurang dari 1 kb).
Untuk delesi yang lebih besar (2 kb), jarak antara kedua
primer yang mengapit produk PCR (amplikon) terlalu besar,
sehingga sukar didapatkan dua fragmen produk (hanya yang
terbentuk fragmen yang delesi/fragmen kecil, sedang framen
25 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
normal tidak terbentuk), untuk itu diperlukan teknik khusus
untuk memperoleh kedua fragmen tersebut. Oleh karena itu,
teknik GAP-PCR digunakan. Teknik ini banyak digunakan
untuk deteksi alfa talasemia, di mana delesi yang terjadi sangat
besar (gambar 3).
4. RFLP PCR, metode ini digunakan jika ada area pemotongan
enzim restriksi. Pada alel homozigot/mutan yang memiliki
situs pemotongan, maka produk PCR akan dapat dipotong oleh
enzim restriksi tertentu (atau sebaliknya). Untuk alel hetero,
maka produk PCR yang diamati adalah kombinasi antara pita
yang terpotong dan yang tidak terpotong (gambar 4).
5. Kuantitatif-PCR, metode ini digunakan untuk menghitung
kuantitas atau jumlah produk spesifik hasil PCR, biasanya
dikenal dengan sebutan real-time PCR (“RT-PCR”). RT PCR di
sini, berbeda dengan Reverse Transcription (RT) PCR. Pada
Reverse Transcription PCR (RT-PCR), pcr didisain untuk
amplifikasi DNA dari RNA. Hasil jumlah amplifikasi DNA dari
RNA dapat diamati dengan menggunakan “RT-PCR”.
6. Multipleks tandem PCR, metode untuk mendeteksi banyak
target pada satu sampel. Pada metode ini, satu sampel akan
menggunakan banyak primer spesifik dan proses PCR dijalan
serentak. Karena menggunakan banyak primer, maka akan
dihasilkan banyak amplikon (produk PCR) dengan ukuran
yang beragam (gambar 5).
Masih banyak lagi jenis PCR, namun kami hanya menjelaskan
PCR yang sering digunakan untuk identifikasi penyakit. Semua metode
ini dikembangkan untuk memudahkan peneliti atau pekerja
laboratorium dalam mengidentifikasi sampel DNA seperti bidang
forensik, mikrobiologi dan sebagainya.
26 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 6. Gap-PCR (http://www.ithanet.eu/ithapedia/index.php/Protocol:Gap-PCR)
Gambar 7. ARMS PCR (koleksi pribadi CYP1A1*2A)
Aplikasi PCR atau teknologi amplifikasi telah banyak
digunakan, biasanya di klinik/rumah sakit hingga membuat area
spesifik dari DNA dan diperbanyak untuk digunakan dalam kloning
teknologi. Di bawah ini merupakan ringkasan kelebihan dan
kekurangan teknologi amplifikasi:
Kelebihan teknologi amplifikasi:
1. Hasil cepat diperoleh (namun tergantung metode ataupun kit
PCR yang digunakan dan dikembangkan oleh pihak developer).
27 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
2. Lebih sensitif dan spesifik dibandingkan metode deteksi
konvensional.
3. Reprodusibilitinya sangat baik (kembali tergantung jenis kit
PCR dari berbagai developer).
4. Hasil amplifikasi dapat dihitung secara kuantitatif atau semi
kuantitatif, biasanya untuk teknik “RT-PCR”.
5. Mudah dikembangkan teknologi terbaru untuk dalam
pemeriksaan penanda kelainan genetik.
Kekurangan teknologi amplifikasi:
1. Memerlukan ruangan dengan alur proses kerja satu arah
(untuk mencegah kontaminasi).
2. Mudah terkontaminasi dalam melakukan pekerjaannya.
3. Target sekuensing DNA sasaran harus diketahui terlebih
dahulu, dan harus melakukan perancangan primer serta
kondisi alat yang sesuai dengan tujuan target yang diinginkan.
4. Biaya alat dan bahan untuk metode “RT PCR” yang mahal.
Prinsip dasar prosedur kerja PCR semua adalah sama, yaitu
harus ada primer, dNTP, Taq polimerase enzim, dH2O, buffer PCR
dengan atau tanpa MgCl, dan DNA template (sampel DNA genom).
Setiap teknik, pada dasarnya yang berbeda adalah:
1. Prosedur temperatur hibridisasi (penempelan) dan elongasi
(pemanjangan) produk PCR serta siklus dan waktu.
2. Desain primer (metode ARMS akan berbeda dengan metode
PCR standar).
3. Ada tidaknya area restriksi.
4. Perlu tidaknya menggunakan probe (primer yang berpendar).
Pemanfaatan PCR metode konvensional
1. PCR -globin
a. Bahan:
Primer:
Forward primer F5’-TAGCAATTTGTACTGATG GTATGG-3’
dan
Reverse primer R5’-TTTCCCAAGGTTTGAAC TAGCTCTT-3’.
28 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
10X PCR buffer
Tag Polimerase
dNTP
DNA template
b. Cara kerja
Siapkan semua bahan dalam tabung PCR
Untuk program PCR yang digunakan:
1. Denaturasi awal 950C selama 3 menit.
2. Denaturasi PCR 980C selama 20 detik.
3. Hibridisasi PCR 600C selama 15 detik.
4. Elongasi PCR 720C selama 60 detik.
5. Ulangi no 2 – 4 untuk 35 siklus.
6. Elongasi akhir 720C selama 60 detik.
7. Pendinginan 240C.
c. Hasil: akan didapatkan produk PCR atau amplikon dengan
ukuran 1200 bp.
Gambar 8. Hasil PCR gene b-globin (dokumentasi pribadi)
Hasil PCR b-globin ini dapat digunakan untuk identifikasi
hemoglobinopati menggunakan sekuensing DNA.
29 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
2. PCR ARMS gen ALAD
a. Bahan
ALAD F 5’-GCCTCAGTCTTCCCTCCTATTTAGT-3’
ALAD R 5’-TCCCTTCTTAGCCCTTCCTTTGATT-3’
ALAD C 5’-TTCTGTCCTGGGGGCTTGAG-3’
ALAD N 5’-TCAGCATCTCTTCCAGCCGC-3’
ALAD M 5’-TCAGCATCTCTTCCAGCCGG-3’
Bahan lain sama dengan PCR standar
b. Cara kerja
PCR tahap 1:
1. Campur semua bahan kecuali primer CNM.
2. Denaturasi awal 940C selama 3 menit.
3. Denaturasi PCR 940C selama 30 detik.
4. Hibridisasi PCR 600C selama 30 detik.
5. Elongasi PCR 720C selama 30 detik.
6. Ulangi no 2 – 4 untuk 40 siklus.
7. Elongasi akhir 720C selama 60 detik.
8. Pendinginan 240C.
9. Produk PCR adalah 306 bp.
Gambar 9. Hasil PCR Tahap 1 (Dokumentasi pribadi)
PCR tahap 2
1. Campur semua bahan ditambah primer CN untuk
pengecekan sampel normal dan CM untuk sampel mutan.
30 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
2. Denaturasi awal 940C selama 3 menit.
3. Denaturasi PCR 940C selama 30 detik.
4. Hibridisasi PCR 600C selama 30 detik.
5. Elongasi PCR 720C selama 10 detik.
6. Ulangi no 2 – 4 untuk 32 siklus.
7. Elongasi akhir 720C selama 60 detik.
8. Pendinginan 240.
Gambar 10. Hasil PCR Tahap 2. Lajur 1 dan 3 (sampel PCR A dan B) menggunakan primer mutan, sedangkan lajur 2 dan 4 (sampel PCR A dan B) menggunakan primer normal. Hasil menunjukkan sampel A
genotipe GG (ALAD – 1) dan sampel B genotipe GC (ALAD – ½) (Dokumentasi pribadi)
3. PCR RFLP CYP1A1*2A
a. Bahan
Primer A 5'-TAGGA GTCTT GTCTC ATGCC T-3'
Primer B 5'-CAGTG AAGAG GTGTA GCCGC T-3'
Enzim restriksi Msp I.
Bahan lain sama dengan bahan untuk PCR standar.
b. Cara kerja
Campur semua bahan kecuali enzim restriksi MspI, menjadi
satu.
Ambil 24 uL larutan campuran, masukkan ke dalam tabung
PCR, tambahkan 1 uL sampel DNA. Kemudian dimasukkan
ke dalam alat PCR.
31 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Program PCR untuk CYP1A1*2A restriksi MspI, adalah
1. Denaturasi awal, 950C 3 menit.
2. Denaturasi PCR, 950C 3 menit.
3. Hibridisasi PCR, 600C 15 detik.
4. Elongasi PCR, 720C 2 detik.
5. Ulangi no 2 – 4 sebanyak 35 siklus.
6. Elongasi akhir 720C 5 detik.
Periksa hasil PCR menggunakan agarose elektroforesis. Jika
didapatkan hasil produk PCR 340 bp, proses PCR telah
sukses.
Ambil 5 uL produk PCR di atas, masukkan dalam tabung
PCR yang telah ada larutan campuran MspI dan buffernya
(masing-masing tergantung dari Kit perusahaan yang
menjual).
Inkubasi pada mesin PCR untuk suhu 370C selama 4 – 24
jam.
Hasil pemotongan diamati menggunakan 1.5 % agarosa
elektroforesis.
A: Band with 340 bp B: DNA Marker size 100 bp
C,D, F: Band with 340, 200 and 140 bp E: Band with 140 and 200 bp
(Dokumentasi pribadi)
32 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
4. Multiplex PCR deteksi 0-talassemia
Pada metode ini, kita dapat mendeteksi adanya mutasi
menggunakan lebih dari 1 primer dalam waktu yang bersamaan.
Primer-primer yang digunakan hanya mengenali atau
berkomplementasi dengan target. Metode ini dikenal juga sebagai
MARMS atau multiplex amplification refractory mutation system.
a. Bahan
- Kodon 17-M: 5’-CTC ACC ACC AAC TTC AGC CAC GTT CAG
CTA-3’
- Kodon 41/42-M: 5’-GAG TGA CAG ATG CCC AAA GGA CTC
AAC CT-3’
- Kodon 71/72-M: 5’-AGG TTG TCC AGG TGA GCC AGG CCA
TCA ATT-3’
- IVS1nt1-M: 5’-TTA AAC CTG TCT TGT AAC CTT GAT ACC
GAA-3’
- S-primer: 5’-ACC TCA CCC TGT GGA GGC AC-3’
- P1-primer: 5’-GCG ATC TGG GCT CTG TGT TCT-3’
- P2-primer: 5’-GTT CCC TGA GCC CCG ACA CG-3’
b. Prosedur Material uL
10x PCR buffer X 2.5 50 mM MgCl2 X 0.9 10 mM dNTPs X 0.75 5 uM S primer X 3.0 5 uM P1 X 0.5 5 uM P2 X 0.5 5 uM mutan primer @ 0.5 uL X 2 5U/uL HotStart Taq DNA X 0.13 dH2O X 7.72 DNA Sampel 7
c. Program
Nama Suhu (0C) Waktu Siklus Denaturasi awal 95 00:15:00 1 x Denaturasi 94 00:01:00 Annealing 65 00:01:00 35 x Extensi 72 00:02:00 Extensi final 72 00:07:00 1 x Pendinginan 24 99:99 1 x
33 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 12. Hasil PCR MARMS b-globin deteksi b-thalassemia. M: DNA Ladders/Markers; 1: kontrol b-thal CD71/72, 535 bp; 2: kontrol b-thal
CD41/42, 439 bp; 3: kontrol IVS1nt1, 281 bp; 4: kontrol b-thal CD17, 239 bp; 8: kontrol internal kontrol fragmen, 314; 5-7 dan 9-13 sampel
pasien (Dokumentasi pribadi, pelatihan di Chiang-Mai University)
34 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
BAB V. REAL-TIME PCR/
KUALITATIF PCR (RT-PCR/QPCR)
Telah dijelaskan sebelumnya secara singkat bahwa PCR adalah
teknik perbanyakan area DNA pada suatu gen, yang menjadi sasaran
oleh peneliti. Secara teoritis, PCR akan meningkatkan jumlah DNA
secara eksponensial atau dengan kata lain melipat gandakan jumlah
molekul target pada setiap amplifikasi siklus. Pada teknik PCR, pada
umumnya hanya untuk mengetahui bahwa DNA dari yang dituju telah
berhasil diamplifikasi. Sedangkan real-time PCR (RT-PCR) atau qPCR
bertujuan secara kuantitatif atau mengetahui jumlah DNA sasaran.
Harap dibedakan pengertian antara RT-PCR di sini dengan RT-PCR
yang reverse transcription PCR (RT-PCR) yang berfungsi dalam
mengubah RNA menjadi cDNA kemudian dilakukan qPCR.
Jika diaplikasikan dalam bidang kesehatan, teknik PCR
ditujukan untuk mengetahui ada tidaknya gen bakteri/virus dalam
tubuh pasien, dengan kata lain, jika ditemukan gen bakteri pada darah
pasien, maka pasien tersebut terinfeksi oleh bakteri tersebut.
Sedangkan qPCR bertujuan apakah dengan pengobatan akan
menurunkan atau tidak jumlah gen bakteri, dengan kata lain jika suatu
obat berhasil mengobati, maka jumlah gen mikroorganisme (bakteri)
akan turun.
Dalam RT-PCR, jumlah DNA diukur dalam setiap siklus melalui
pewarna berfluoresen (berpendar) yang akan meningkatkan sinyal
sejalan dengan bertambahnya jumlah produk amplikon. Senyawa
berfluoresen ini akan bergabung (hibridisasi) dalam untai DNA selama
proses PCR. Data sinyal akan dikumpulkan dalam fase eksponensial
dan diproses melalui perangkat lunak (software) dari alat PCR serta
diterjemahkan dalam plot amplifikasi yang mewakili akumulasi
produk selama durasi proses PCR.
35 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Perbedaan yang mendasar dalam deteksi hasil PCR dan qPCR
dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
Gambar 13. PCR konvensional dan RT-PCR (qPCR) (Vilborg Matre, 2020)
Pada gambar di atas tampak bahwa pada siklus ke 45 dari PCR
konvensional, pita agarose akan menunjukkan hasil yang tajam
dibandingkan pada siklus sebelumnya. Kotak hijau merupakan area
amplifikasi PCR konvensional jika dipindahkan pada grafik fluoresensi
di RT-PCR. Ini berarti, gambaran pita siklus 45 pada elektroforesis
PCR konvensional merupakan produk akhir dari amplifikasi (gambar
pita tampak jelas dibandingkan siklus lain). Sedangkan pada teknik
RT-PCR, proses amplifikasi langsung terdeteksi oleh sistem di awal
peningkatan grafik (kotak merah). Jika pada PCR, hasil amplifikasi
tampak jelas pada siklus 45, di mana pada siklus ini dihasilkan jumlah
fragmen DNA sasaran (amplikon) sejumlah 6.9 x1019, maka pada RT-
PCR, hasil amplikon dapat terbaca oleh sensor alat berjumlah 9x106.
Hal ini menunjukkan RT-PCR lebih sensitif dan cepat dalam hasil
Akhir produk amplifikasi
36 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
amplifikasi DNA gen sasaran dibandingkan PCR konvensional. Atau
dengan kata lain, RT-PCR akan memonitor secara simultan proses
amplifikasi DNA target selama PCR berlangsung, sehingga akan lebih
cepat dalam memberikan hasil dibandingkan PCR konvensional. Selain
cepat, RT-PCR mempunyai kelebihan dalam konsentrasi jumlah DNA
sasaran, artinya jika konsentrasi sampel DNA target sangat banyak
(misalnya 100 ng/uL) maka siklus awal sensor membaca produk
amplifikasi akan lebih cepat atau pendek dibandingkan konsentrasi
sampel DNA target yang sangat sedikit (misalnya 1 ng/uL). Oleh
karena itu, metode RT-PCR dibidang medis digunakan untuk
mengetahui apakah dalam tubuh suatu obat berhasil digunakan untuk
membunuh bakteri/mikroba, di mana jika awal saat penderita sakit,
jumlah mikrobanya banyak yang berarti jumlah DNA sasaran sangat
tinggi (siklus PCR akan lebih cepat, maka saat pengobatan sukses,
jumlah mikroba (dalam hal ini DNA sasaran) turun, akan digambarkan
dengan siklus amplifikasi yang makin lama.
Gambar 14. Jumlah Siklus, Konsentrasi Sampel (Life Technology, 2010)
Pada gambar di atas, warna merah mewakili sampel dengan
konsentrasi 108 ng/uL, biru mewakili 107 ng/uL hingga warna kuning
mewakili 101 ng/uL. Pada konsentrasi total DNA sampel 108, amplikon
37 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
yang mencukupi jumlahnya, terbaca oleh alat pada siklus 14, begitu
juga pada konsentrasi yang lain hingga NTC (atau air), maka pola
kemunculan grafik fluorosensi makin lama (siklus makin tinggi). Pola
grafik seperti ini dapat digunakan dalam bidang medis untuk
mengetahui apakah suatu obat dapat menurunkan atau memusnahkan
mikroba, di mana jika jumlah mikroba masih tinggi, siklus amplifikasi
masih terdeteksi.
Dengan demikian, kita dapat melihat keuntungan RT-PCR
dibandingkan PCR konvensional sebagai berikut:
Dengan RT-PCR, kita dapat memantau kemajuan reaksi PCR
dari waktu ke waktu.
Dengan RT-PCR, kita dapat mengukur jumlah produk PCR
(amplikon) dengan tepat pada setiap siklus sehingga
memungkinkan kuantifikasi jumlah yang akurat dari bahan
sampel.
Proses amplifikasi dan deteksi terjadi dalam satu tube,
sehingga dapat menghilangkan manipulasi pasca-PCR
(manipulasi foto hasil elektroforesis PCR untuk menghasilkan
pita yang jelas).
RT-PCR selain dapat digunakan untuk mengetahui jumlah
amplifikasi, dapat juga digunakan untuk mengetahui adanya mutasi
dalam urutan DNA target suatu gen. Salah satu yang telah digunakan
dan dikembangkan adalah teknik hibrid-probe untuk mengetahui jenis
mutasi yang sering ditemukan pada penderita talasemia. Pada teknik
ini, digunakan probe yang akan menempel di salah satu nukleotida
DNA target dan hasilnya dianalisis berdasarkan kurva melting (kurva
leleh).
Analisis kurva leleh adalah suatu metode di mana saat suhu
DNA dinaikkan, untai DNA akan berdisosiasi yang akhirnya akan
meningkatkan intensitas absorbansi cahaya fluorosensi menuju
kondisi hiperkromisitas absorbansi (atau dengan kata lain
penyerapan sinar flourosen meningkat ketika dua untai DNA
terpisahkan). Kurva leleh atau kurva melting merupakan kondisi di
mana suhu meningkat dan 50% DNA mengalami denaturasi sehingga
38 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
akan berdisosiasi (berpisah). Adanya kurva melting ini, dapat
digunakan dalam mengetahui ada tidaknya mutasi atau perubahan
tunggal pada basa nukleotida DNA. Misalnya pada dua sampel, 30
urutan DNA target sampel A memiliki basa no 25 adalah A, namun
sedangkan sampel B adalah C, maka jika ditotal jumlah energi yang
dibutuhkan untuk memisahkan dua untai DNA pada sampel A dan B
dalam kondisi kurva melting, akan berbeda. Perbedaan ini menjadi
penanda adanya perubahan basa nukleotida pada 2 sampel yang
berbeda namun untuk target gen yang sama.
Gambar 15. Kurva melting pada 3 sampel dengan DNA gen target yang sama
Pada gambar di atas memperlihatkan 4 warna yang berbeda.
Setiap warna mewakili mutasi dan no sampel. Jika warna merah muda
(pink) adalah sampel no 1, maka kuning adalah sampel nomor 2, ungu
nomor 3 dan biru nomor 4 (atau air). Keempat sampel direaksikan
dengan bahan pereaksi yang sama, namun menghasilkan gambaran
puncak grafik yang berbeda. Jika kita perumpamakan jumlah target
DNA adalah 200 pasang basa (bp) dengan posisi mutasi A menjadi G
pada basa ke 70, maka warna merah muda dan biru mewakili salah
satu basa nukleotida tersebut (A atau G). Jika kita perumpamakan
warna merah muda adalah sampel 1 yang memiliki basa A pada posisi
39 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
70, maka ungu adalah sampel 2 yang memiliki basa G pada posisi 70.
Perubahan basa akan menyebabkan perubahan pada temperatur
melting untuk masing-masing sampel. Sehingga akan mengubah kurva
melting. Sampel 1 dapat dinyatakan homozigot untuk basa A (harap
ingat kembali pengertian konsep pasangan alel). Begitu juga dengan
sampel 2 yang dinyatakan homozigot untuk G. Sedangkan untuk garis
grafik kuning atau sampel 3, tampak ada dua puncak grafik yang
berada diposisi sampel 1 dan 2, maka sampel 3 dinyatakan sebagai
heterozigot karena mempunyai kedua basa di pasangan alel-nya.
RT-PCR atau qPCR juga dapat digunakan untuk pemeriksaan
SNP genotipe. SNP genotipe adalah pengukuran variasi genetik
polimorfisme nukleotida tunggal (SNPs) antara anggota suatu spesies.
Ini adalah bentuk genotipe, yang merupakan pengukuran variasi
genetik yang lebih umum. SNP adalah salah satu jenis variasi genetik
yang paling umum. SNP adalah mutasi pasangan basa tunggal pada
lokus tertentu, biasanya terdiri dari dua alel (di mana frekuensi alel
yang jarang adalah> 1%). SNP ditemukan terlibat dalam etiologi
banyak penyakit manusia dan menjadi minat khusus dalam
farmakogenetika. Karena SNP dilestarikan selama evolusi, mereka
telah diusulkan sebagai penanda untuk digunakan dalam analisis sifat
kuantitatif (QTL) dan dalam studi asosiasi di tempat mikrosatelit.
Penggunaan SNP sedang diperluas dalam proyek HapMap, yang
bertujuan untuk menyediakan set minimal SNP yang diperlukan untuk
genotipe genom manusia. SNP juga dapat memberikan sidik jari
genetik untuk digunakan dalam pengujian identitas. Meningkatnya
minat terhadap SNPs telah tercermin oleh perkembangan besar-
besaran beragam metode genotipe SNP. Prinsip teknik SNP genotipe
merupakan kombinasi teknik RFLP dan hampir sama dengan
hibidrisasi probe, hanya analisisnya tidak menggunakan kurva melting
namun “end point genotyping”. Berbedaan dengan RFLP adalah
menggunakan enzim restriksi pada yang dapat memotong area SNP
dan RFLP menggunakan teknik PCR konvensional kombinasi dengan
elektroforesis agarose (telah dijelaskan di pembahasan PCR
sebelumnya). Persamaannya adalah dianalisis pada akhir proses PCR.
40 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 16. Hasil SNP genotipe menggunakan LC 480-Roche dan analisis “end point genotyping”, warna biru mewakili homo G, hijau adalah homo
A dan merah adalah hetero GA. Abu-abu adalah negatif sedangkan merah muda adalah alel yang tidak diketahui.
(Koleksi pribadi)
Gambar 17. Hasil RFLP pada target gen yang sama dengan gambar sebelumnya
(Dokumentasi pribadi, pelatihan pre conference IMMAN 2019)
41 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Dijelaskan sebelumnya bahwa identifikasi SNP dapat
dilakukan dengan real time PCR. Pemanfaatan teknologi ini akan
memudahkan peneliti dalam hal waktu dalam bekerja dan analisis.
Berbedaan yang paling mendasar dalam SNP-RFLP dan SNP-RT PCR
adalah biaya. Jika dalam RFLP, enzim yang dipakai dapat digunakan
untuk identifikasi target gen lain selama enzim tersebut mengenali
area pemotongan. Sedangkan untuk SNP-RT PCR, karena menggu-
nakan probe khusus dan spesifik, maka probe tersebut hanya menge-
nai fragmen target pada daerah sarannya dan probe SNP tidak dapat
digunakan untuk fragmen target yang lain. Dengan demikian metode
SNP RFLP menjadi lebih murah. Namun dalam hal waktu pengerjaan,
SNP-RT PCR lebih cepat karena dalam 1 “plate tube PCR” yang berisi
96 sumur, kita dapat melakukan uji SNP untuk 96 sampel secara ber-
samaan. Dan dalam waktu kurang lebih 2 jam, kita dapat memperoleh
hasil serta analisis hasil secara bersamaan. Sedangkan untuk SNP
RFLP, memerlukan waktu lebih lama untuk memeriksa 96 sampel
(kurang lebih 1-2 hari). Berikut ini, beberapa contoh percobaan yang
dapat digunakan untuk uji menggunakan RT PCR (qPCR).
1. Identifikasi makanan mengandung produk non halal
(babi)
Metode ini kami kembangkan dari percobaan yang telah
dilakukan oleh Tanabe (2007).
Bahan:
- Sampel DNA dari produk makanan (seperti bakso), lihat
prosedur isolasi genom dari makanan siap saji.
- Primer sapi : Forward 5’- CCCGATTCTTCGCTTTCCAT -3’
Reverse 5’- CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG -3’
- Primer babi : Forward 5’ - CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG -3’
Reverse 5’ - CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC -
3’ (Tanabe, 2007)
- Kit Sybrgreen (harap membaca manual dari masing-masing
manufaktori produsen kit) untuk LC480 (LightCycler@480
SBYR Green).
- “plate well” untuk LC480
42 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Prosedur:
- Encerkan masing-masing primer hingga konsentrasi 10 uM
- DNA sampel diukur konsentrasinya dengan spektrofotometer.
Jika konsentrasi di atas 60 ng/uL dan kemurnian 1.8 – 2,
lakukan pengenceran 1:9. Jika konsentrasi kurang dari 60
ng/uL dan kemurnian 1.8 – 2, lakukan pengenceran 2:8. Pada
dasarnya, pengenceran dilakukan berdasarkan nilai
kemurniannya. Jika makin rendah kemurniannya, maka jumlah
pelarut untuk pengenceran lebih banyak dari jumlah sampel
DNA. Sebaiknya, lakukan pengenceran dengan menggunakan
pelarut elusi DNA.
- Buat larutan “mix PCR” yang terdiri dari:
- Masukkan 22 uL “mix PCR” ke dalam masing-masing sumur di
“well plate”, kemudian tambahkan 3 uL sampel DNA yang telah
diencerkan.
- Tutup “plate well” dengan plastik penutupnya.
- Masukkan ke dalam alat real time PCR
- Lakukan pengaktifan alat real time PCR sesuai masing-masing
prosedur alat PCR-nya.
- Untuk LC480, telah melakukan optimasi sebelumnya dengan
tahapan:
o Lakukan optimasi suhu annealing menggunakan teknik PCR
konvensional.
o Amati hasil PCR konvensional menggunakan teknik agarose
elektroforesis dan lihat pada lampu UV.
o Hasil optimasi suhu yang tepat, akan digunakan untuk real
time PCR identifikasi kandungan B2 (babi) pada bakso.
o Sebelum melakukan identifikasi kandungan B2 pada bakso,
lakukan pembuatan kontrol positif bakso yang
menggandung B2. Hal ini bertujuan untuk menguji
sensitivitas metode dalam melacak adanya B2 dalam bakso.
o Program real time PCR yang digunakan sebagai berikut
43 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Target (0C) Waktu Siklus Denaturasi awal 95
00:10:00
1 x
PCR 95 60 72
00:00:10 00:00:20 00:00:30
30 x
Kurva Melting 95 60 97
00:00:05 00:01:00
1 x
Pendinginan 40
00:00:10
1 x
Hasil percobaan:
Mencari suhu optimun untuk “annealing”
Gambar 18. 1= 590C; 2= 59.50C; 3= 600C; 4= 60.50C; 5= 610C; 6= 61.50C; 7= 62.50C; 8= DNA Ladder 100 bp, besar amplikon sekitar 100 – 150 bp
(Dokumentasi pribadi)
44 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 19. Garis hijau adalah NTC atau kontrol negatif, garis sigmoid merah adalah sampel DNA bakso sapi menggunakan primer DNA sapi
(Dokumentasi pribadi)
Pada gambar di atas, kami ingin mengidentifikasi apakah
primer DNA sapi yang kami kutip dari Tanabe akan menempel pada
target dan menghasilkan amplikon produk PCR dengan sampel bakso
sapi. Munculnya kurva garis sigmoid menunjukkan terjadi amplifikasi
bakso sapi dengan primer sapi.
45 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 20. Garis grafik sigmoid warna merah adalah primer babi dengan sampel beberapa bakso babi, dengan konsentrasi terendah 6.67
ng/uL. Garis warna hijau adalah NTC atau dH2O (Dokumentasi pribadi).
Pada gambar di atas memperlihatkan bahwa primer babi dapat
mendeteksi bakso yang mengandung DNA babi dengan konsentrasi
DNA 6.67 ng/uL. Ini menunjukkan jika sampel mengandung produk
non halal (babi), maka akan dapat terdeteksi menggunakan metode
ini. Selanjutnya kita dapat gunakan primer tersebut untuk menguji
produk bakso, apakah mengandung babi atau tidak.
46 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 21. Primer babi digunakan untuk identifikasi produk bakso yang ada babinya. Garis kurva sigmoid adalah kontrol bakso babi,
sedangkan garis hijau adalah bakso yang diuji (Dokumentasi pribadi).
Dengan melihat gambar di atas, maka kita dapat melakukan
percobaan untuk identifikasi makanan yang mengandung babi. Selain
melihat kurva kenaikan amplifikasi, ada cara lain untuk melihat
apakah makanan dalam hal ini bakso mengandung babi, dengan
melihat kurva leleh atau kurva melting.
47 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 22. Kurva leleh atau kurva melting. Grafik garis biru adalah menggunakan primer sapi untuk bakso sapi, sedangkan garis merah
adalah menggunakan primer babi untuk bakso babi. Grafik garis hijau adalah primer sapi dengan bakso babi, sedangkan garis abu-abu adalah
primer babi dengan bakso sapi (Dokumentasi pribadi).
2. Identifikasi SNP RS9642880 menggunakan prosedur dan
pereaksi Tagman
Real time PCR juga dapat digunakan untuk identifikasi adanya
satu mutasi pada suatu fragmen target gen, yang biasanya disebut
dengan SNP (senip). Banyak mesin real time PCR yang dapat
digunakan untuk mendeteksi SNP dengan menggunakan sistem
pereaksi terbuka (open system) atau bahan pereaksi uji tidak berasal
dari satu pabrik dari mesin, sebagai contoh LC 480 dari Roche dapat
digunakan untuk identifikasi SNP menggunakan bahan pereaksi uji
bukan dari 1 perusahaan yang sama. Di sini kami akan memberikan
langkah prosedur dalam identifikasi SNP RS9642880 menggunakan
pereaksi Taqman dan mesin LC 480 dari Roche.
48 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Bahan:
- Hasil isolasi DNA (dapat dari cairan tubuh)
- SNP Genotyping assay kit RS9642880, dengan probe
sekuensing VIC/FAM: GCAAAGGCTGGAGTTAGGAGAACCC[G/T]
TGGTTGATGGCTTTGTTAATTATTA
- dH2O bebas dari RNA dan DNA
Prosedur:
- Ukur konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi, kemudian
lakukan pengenceran sampel hingga konsentrasi berkisar 10
ng/uL, dan dilanjutkan lakukan dilusi pada sampel tersebut
dengan perbandingan 1:4 (1 sampel : 4 dH2O).
- Siapkan “master mix reagent” atau larutan pereaksi dalam satu
tabung PCR atau tabung 2.0 mL sesuai petunjuk dari kit
Taqman SNP Genotyping Assay.
- Masukkan dalam “plate well LC480” larutan pereaksi sebanyak
8 uL dan tambahkan 2 uL sampel uji.
- Masukkan “plate” tersebut pada mesin LC480, jalankan mesin
dengan program sebagai berikut:
o Format deteksi: dual color hydrolysis?UPL Probe
o Analysis: Endpoint Genotyping
o Prosedur eksperiment:
Name Cycles Analysis
Mode Target
(0C) Acquisition
Mode Hold Ramp
UNG 1 None 50 None 00:02:00 4.4 Poly ACt
1 None 95 None 00:00:20 4.4
PCR 50 Quantification 95 None 00:00:03 4.4 60 Single 00:00:20 2.2
Finish 1 None 40 None 00:00:30 2.2
49 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 23. Hasil analisis “SNP Genotyping” Taqman Kit RS9642880. Warna mewakili alel, hijau untuk alel minor homozigot; merah untuk alel heterozigot, biru untuk alel mayor homozigot dan abu-abu untuk
NTC atau air (Dokumentasi pribadi)
3. Identifikasi gen AGTR1 RS5186 dengan metode rhAmp
SNP
Metode lain yang dapat digunakan untuk deteksi SNP dengan
real time PCR adalah “rhAmp SNP assay”. Secara ekonomis, metode ini
lebih murah namun sensitivitas sama dengan metode lain. Ayawey,
dkk. (2019) telah melakukan uji perbandingan antara beberapa
pereaksi deteksi SNP.
Bahan:
- Genom DNA hasil isolasi yang telah diukur konsentrasinya.
50 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
- Larutan campuran pereaksi rhAmp SNP (ikuti petunjuk dari
cara kerja) atau dapat mengikuti prosedur di bawah ini.
Cara kerja:
- Lakukan pengenceran 2:4 jika kemurnian di bawah 1.8 dan
konsentrasi kurang dari 20 ng/uL. Jika konsentrasi di atas 20
ng/uL namun kemurnian di bawah 1.8, lakukan pengenceran
1:4
- Masukkan 3 uL larutan campuran pereaksi rhAmp SNP dalam
masing-masing sumur di “plate well”, lalu tambahkan 2 uL
sampel.
- Adapun komponen campuran pereaksi rhAmp SNP sebagai
berikut:
Material uL Master Mix 0.95 x ((2n+1)x 2.65 )uL dH2O 2 x (2n+1) uL rhAmp@SNP 0.25 x (2n+1) uL Reporter Mix 0.05 x ((2n+1)x 2.65)uL n = jumlah sampel; 2 = duplikasi sampel (jika biasa menggunakan triplikasi, maka
angka 2 dapat diganti menjadi 3)
- Masukkan ke dalam mesin LC480 dan jalankan program
sebagai berikut:
Name Cycles Analysis
Mode Target
(0C) Acquisition
Mode Hold Ramp
Enz Act
1 None 95 None 00:10:00 4.4
PCR 50 Quantification 95 None 00:00:10 4.4
60 68
Single None
00:00:30 00:00:20
2.2 2.2
Finish 1 None 40 None 00:00:30 2.2
51 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 24. Warna biru adalah alel mayor homozigot; warna merah adalah alel heterozigot sedangkan abu-abu adalah NTC atau dH2O. Pada
percobaan ini, alel minor homozigot tidak terdeteksi (Dokumentasi Pribadi).
4. Identifikasi hemoglobin varian HbE dengan Hibridisasi-
probe kurva melting
Metode Hybridization Probe Melting Curve Genotype (Hybrid
Probe) atau hibridisasi probe kurva melting merupakan metode
terbaru yang dikembangkan oleh Yamashiro dkk (2012) untuk
mendeteksi adanya mutasi pada urutan DNA secara cepat dan akurat.
Hybridization Probe Melting Curve Genotype terdiri atas kombinasi
antara teknik PCR menggunakan Probe dan teknik kurva melting Real
time PCR pereaksi formamide. Metode tersebut menggunakan DNA
52 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
probe yang telah dilabel dengan suatu penanda yang memiliki prinsip
kerja reaksi fluoresen. DNA probe yang telah dilabel akan
berkomplementasi dengan DNA target melalui hibridisasi sehingga
dapat mendeteksi keberadaan gen tertentu.
Bahan :
- Kit PCR Takara (bisa diganti Kit PCR lainnya)
- Genom DNA sampel
- DNA control positif
- Tube PCR
- Agarose dan buffer elektroforesis
- Hi-di Formamide
- Primer :
o Forward primer β7: 5’-CCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCA-
3’
o Reverse Primer β8: 5’-CCTTCCTATGACATGAACTTAACCAT-
3’
- Probe[
o HbE : CD26 GAG→AAG
Sensor Probe:LCRed640-CCCAGGGCCTCACCACC-
Phosphate
Anchor Probe:CCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCA
ACC-Fluorescein
o Probe : CD41/42 TTCTT→TT
Sensor Probe:CTTAGGCTGCTGGTGGTCTACC-Fluorescein
Anchor Probe:LCRed640-TTGGACCCAGAGGTTCTTTGAG
TCCTTT-Phosphate
Cara kerja :
- Lakukan pembuatan larutan campuran PCR sesuai dengan
prosedur di bawah ini.
Bahan N x 1 (uL) dH2O 10.9 10x Buffer 2.0 2.5mM dNTP 1.6
53 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Bahan N x 1 (uL) 5 pmol Primer Forward 2.0 5 pmol Primer Reverse 2.0 Taq Polimerase 0.1 Sampel genom 1.0
- Masukkan tube PCR yang telah berisi bahan uji dan sampel ke
alat PCR konvensional.
- Aktifkan mesin dengan program PCR sebagai berikut.
Nama Suhu (0C) Waktu Siklus Denaturasi awal 94 00:03:00 1 x Denaturasi 94 00:00:40 Annealing 62 00:00:30 35 x Extensi 72 00:01:00 Pendinginan 24 00:03:00 1 x
- Periksa hasil amplifikasi PCR menggunakan agarose 1.5%
- Siapkan larutan campuran Hibri-Probe untuk uji HbE ataupun
talasemia CD41/42 sebagai berikut
(uL) dH2O 2 PCR Produk 10 Hi-di Formamide 4 Campuran Probe 4
- Masukkan larutan campuran dan amplikon PCR (hasil uji PCR
b-globin) dalam sumur di plate well.
- Taruh “plate” dalam mesin real time PCR dengan program
sebagai berikut
Nama Suhu (0C)
Waktu Siklus Analisis
Denaturasi 95 00:05:00 1 None annealing 28 00:02:00 1 Melting Curves
Melting 28-80 Continous-Acquistion
Mode 1 Melting Curve
Cooling 40 00:01:00 1 Melting Curves
54 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Hasil
Gambar 25. Hasil elektroforesis PCR b-globin (Dokumentasi pribadi)
Gambar 26. Hasil Hibri-Probe kurva melting untuk deteksi talasemia tipe CD41/42
(Dokumentasi pribadi)
55 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 27. Hasil Hibri-Probe kurva melting untuk deteksi HbE (Dokumentasi pribadi, Pelatihan Thalassemia 2013)
5. Deteksi -thalassemia-1 SEA menggunakan gap-Real time
PCR
Metode ini dikembangkan oleh Pornprasert (2008) dalam
deteksi -thalassemia menggunakan real-time PCR. Delesi yang besar
pada urutan DNA gen -globin menjadi salah satu kendala dalam
teknik deteksi -thalassemia. Metode deteksi gap-PCR dengan real
time PCR dan pereaksi Sybr green akan memudahkan dalam deteksi
dan analisis hasil percobaan.
Bahan:
- Sampel DNA
- Kit Sybr Green
Primer Sequence 5’3’:
NaI-Forward primer AGA AGC TGA GTG ATG GGT CCG
NaII-Reverse primer ACA AAC GCC CGT CCG ACT CAA
NaIII-Reverse primer TGG ACT TAA GTG ATC CTC CTG CCC
- dH2O
56 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Prosedur :
Nama uL PCR Mix Sybr Green X 10 uL Primer NaI 10 uM X 0.5 uL Primer NaII 10 uM X 0.76 uL Primer NaIII 10 uM X 0.5 uL dH2O free Dnase/Rnase X 1.24 uL Sampel DNA 7 uL
Program real time PCR:
Nama Suhu (0C) Waktu Siklus Analisis Denaturasi 95 00:15:00 1 None Denaturasi 94 00:00:20 Annealing 60 00:00:20 40 None Elongasi 72 00:00:20
Melting 80 – 95 Continous-Acquistion
Mode 1
Melting Curve
Cooling 40 00:01:00 1 None
57 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 28. Hasil Real time PCR uji -thal-1 SEA (Dokumentasi pribadi, pelatihan Chiang Mai University 2016)
6. Estimasi semikuantitatif area delesi -thalassemia dengan
Junction- Real Time PCR
Percobaan ini bertujuan mencari area lokasi delesi dari suatu
gen dengan mengukur masing-masing dosis/konsentrasi gen hingga
mencapai lokasi pertemuan area di mana dosis gen kurang dari 75%.
Mencari lokasi pertemuan diperlukan karena area gen delesi yang
panjang sehingga harus dilakukan penyisiran urutan basa gen yang
dituju.
58 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Gambar 29. Lokasi gen b-globin di kromosom 11 yang breakpoint? sulit ditentukan
Bahan:
- Sampel DNA
- Mastermix SybrGreen I Roche Diagnostic
- Set primer 5’bLCR dan LPL-9
- ddH2O
Prosedur:
1. Siapkan bahan master mix untuk 5’-LCR dan LPL-9. LPL-9
adalah internal kontrol.
2. Buat kurva standar dengan konsentrasi DNA kontrol: 3,75 ng;
1,875 ng; 0,9375 ng dan 0,46875 ng.
3. Sampel dilakukan pengenceran hingga konsentrasi DNA
adalah 1,875 ng. Konsentrasi ini yang digunakan untuk
menghitung “copy number”.
4. Masukkan masing-masing sampel ke dalam tabung 2 mL yang
berisi master mix, sesuai langkah dari FastStart DNA Master
SYBRGeen I Roche.
5. Pindahkan ke dalam plate tube 20 uL.
6. Masukkan ke dalam mesin dengan langkah sebagai berikut.
59 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Nama Suhu (0C) Waktu Siklus Analisis Denaturasi 95 00:00:10 1 None Denaturasi 94 00:00:10 Annealing 60 00:00:30 40 None Elongasi 72 00:00:10
Melting 70 – 95 Continous-Acquistion
Mode 1 Melting Curve
Cooling 40 00:01:00 1 None
7. Dosis gen DNA sampel diekspresikan dengan “ratio copy
number dari gen -globin terhadap LPL-9. Jika tidak ada delesi
nilai ratio adalah 1 sedangkan 0,5 jika terdapat delesi.
8. Masukkan dalam tabel, jadi kita dapat mengamati lokasi delesi.
Kode Pasien
LCR-1-a
LCR-2
LCR-3
LCR-6
LCR-63-a
LCR-7-2
LCR-8
LCR-10
P6 1.30 1.25 0.59
0.63 0.64 0.52 X
P8 1.47 1.27 1.24 1.47 1.33 0.58
Y
60 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
BAB VI. MERANCANG PRIMER
Primer merupakan oligonukleotida pendek (terdiri dari 18-30
bp) yang akan menempel di untai tunggal DNA target serta akan
memulai proses perpanjangan untai tunggal membentuk untai ganda
DNA atau sintesis DNA. Dalam organisme hidup, proses sintesis DNA
akan melibatkan banyak faktor, tidak hanya primer DNA. Namun
dalam laboratorium, sintesis DNA hanya melibatkan DNA target,
primer, dNTP (A,T,C,G), buffer dan enzim polimerase.
Keberhasilan dalam memperbanyak fragmen DNA target,
sangatlah tergantung dari keberhasilan kita dalam melakukan desain/
perancangan primer yang tepat. Ketidakspesifikan dalam perancangan
primer akan menyebabkan primer tidak akan menempel di area gen
target, atau dapat menempel tidak hanya di area gen target namun di
area lain maupun penempelan sesama primer sehingga akan
menghasilkan produk PCR atau amplikon yang tidak spesifik.
Banyak aplikasi atau link website yang dapat kita gunakan
dalam merancang primer. Umumnya peneliti merancang primer
melalui NCBI, Primer3 atau melalui link berbayar seperti Oligo7 dan
sebagainya. Namun secara garis besar dalam merancang primer harus
memenuhi persyaratan sebagai berikut:
1. Primer harus bisa menempel hanya didaerah target. Primer ini
dirancang untuk memiliki urutan yang merupakan pelengkap
kebalikan dari wilayah template atau DNA target yang akan
diPCR.
61 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
2. Panjang primer antara 18-30 bp (biasanya 18-24 bp), primer
yang pendek akan mengakibatkan spesifisitas rendah sehingga
menghasilkan amplifikasi non-spesifik, sedangkan jika terlalu
panjang akan mengurangi efisiensi pengikatan atau
penempelan dengan DNA template pada suhu annealing
normal dan memungkinkan membentuk struktur sekunder
seperti “hairpins”.
3. Konten basa G + C sekitar 50-60% akan memberikan suhu
leleh (Tm) untuk penempelan (annealing) primer ke template
yang baik, dan akan memberikan stabilitas hibridisasi yang
sesuai.
4. Suhu leleh (Tm) merupakan faktor penting dalam menentukan
suhu annealing PCR berkisar 500 – 700C atau rata-rata terbaik
600C.
5. Karena primer bekerja berpasangan (“forward” primer dan
“reverse” primer) maka harus dipastikan suhu annealing PCR
cocok untuk kedua primer tersebut. Perbedaan maksimum
yang diizinkan adalah 30C. Semakin dekat Tanneal semakin baik.
Cara menghitung Tanneal adalah (Tm primer F + Tm primer R) :
2. Jadi jika suhu Tm F adalah 580C maka sebaiknya suhu Tm R
adalah berkisar 56 – 60. Jadi suhu Tanneal berkisar 590C.
5 CTGATCAAGTCGATGGCTTG 3 Fw 590 C
5 GATGGAGAGGCTTGACTGC 3 Rv 580 C
62 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
6. Dalam merancang primer, hindari terjadinya “hairpins” dan
“stemloop”.
7. Hindari juga komplementer di ujung 3’- dari primer antara
primer F dan primer R.
Jika kita merancang sendiri primer menggunakan software
yang bebas seperti di NCBI, software akan menghitung panjang
primer, persentase GC, suhu leleh. Namun, kita juga dapat menghitung
suhu leleh secara manual dengan rumus:
Tm = 4 x (G + C) + 2 x (A + T)
Dalam melakukan kerja PCR, ada baiknya kita lakukan
pemeriksaan optimasi primer menggunakan teknik PCR gradien.
Teknik ini dilakukan untuk mencari suhu annealing yang terbaik
untuk primer yang kita gunakan sebelum kita memakainya
menggunakan sampel sesungguhnya. Misalnya kita ingin menguji
primer A untuk digunakan pada DNA pasien, maka terlebih dahulu
kita lakukan uji optimasi primer A menggunakan sampel non pasien
atau sampel kontrol positif. Hal ini dilakukan mengingat untuk
mendapatkan sampel pasien lebih sulit dibandingkan sampel non
pasien atau kontrol positif.
63 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Contoh membuat primer sendiri:
Merancang primer b-globin manusia
Prosedur:
1. Buka Wikipedia, pilih HBB (betaglobin). Wikipedia adalah
pilihan termudah jika kita ingin mencari informasi dari suatu
gen.
2. Lihat di box paling kanan, ada gambar 3D HBB, cari kolom
ortologi (Orthologs), tarik kursor mouse di pilih ensembl
human, enter.
64 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
3.
4. Akan dibawa ke link ensembl khusus untuk human b-globin.
Lihat kotak paling kirim tertulis Gene-based displays, pilih
sequence, maka anda akan dapat urutan DNA b-globin
manusia.
65 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
5. Pilih area yang akan anda teliti atau periksa dengan PCR,
misalkan huruf terblok kuning dengan tulisan merah yang blok
ke 3 dimulai dengan CGGC… tarik kursor hingga akhir blok ke
empat dengan urutan CTTTAC, copy/salin urutan tersebut
6. Pindah link ke NCBI/Primer-blast atau Primer3web jika
software NCBI sedang bermasalah.
66 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
7. Masukkan area urutan basa (daerah yang kita inginkan) dari
salinan no 5 ke dalam kotak PCR template.
8. Lalu lihat di kotak yang tertulis Pick Primer, taruh kursor di
tulisan tersebut dan tekan, maka anda akan mendapatkan
rancangan primer yang dilakukan oleh software.
67 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
BAB VII. ISOLASI PROTEIN
Studi tentang protein dalam suatu organisme hidup
merupakan bagian terintegrasi dari penelitian ilmu hayati atau biologi.
Protein adalah kelompok molekul biologis yang paling beragam dan
sangat penting untuk struktur dan fungsi seluler. Langkah pertama
dalam analisis protein adalah ekstraksi seluler. Karena protein begitu
heterogen, tidak ada satu metode atau reagen yang optimal untuk
isolasi protein secara umum. Selain itu, teknik ekstraksi protein
bervariasi tergantung pada sumber bahan awal, lokasi di dalam sel
protein yang diminati dan aplikasi di hilir. Banyak teknik telah
dikembangkan untuk mendapatkan hasil dan kemurnian protein
terbaik untuk berbagai jenis sel dan jaringan, dengan
mempertimbangkan di mana sesuai, lokasi subselular protein dan
kompatibilitas ekstrak protein dengan langkah selanjutnya dalam
percobaan.
Pada penelitian ilmu hayati, protein biasanya diekstraksi dari
sel mamalia yang dibudidayakan atau dikultur. Saat mengeluarkan
protein dari jaringan mamalia, gangguan mekanis diperlukan untuk
mengisolasi sel dari matriks jaringan mereka. Untuk sel mamalia dan
primer kultur, yang hanya memiliki membran plasma yang
memisahkan isi sel dari lingkungan, pelarut pereaksi yang
mengandung detergen dan komponen lainnya dapat dengan mudah
mengganggu lapisan bilayer membran protein-lipid, dengan demikian
ekstraksi protein relatif mudah. Organisme lain yang juga umum
digunakan dalam penelitian protein, termasuk bakteri (sebagai alat
untuk ekspresi protein), ragi (sebagai model untuk biologi sel) dan
tanaman (untuk bioteknologi pertanian) mengandung dinding sel,
yang secara tradisional memerlukan lisis mekanis. Namun, solusi
berbasis detergen telah dikembangkan untuk secara efisien melisiskan
68 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
sel-sel ini tanpa menggunakan gangguan fisik. Penggunaan lisis sel
dapat mengganggu selaput sel dan organel yang menghasilkan
aktivitas proteolitik dan dapat mengurangi hasil dan fungsi protein.
Untuk mencegah degradasi protein yang diekstraksi serta
mendapatkan hasil dan aktivitas protein terbaik diperlukan
penghambat lisis, protease dan fosfatase dapat ditambahkan ke
pereaksi lisis. Sejumlah senyawa telah diidentifikasi dan digunakan
untuk menghambat aktivitas protease dan fosfatase dengan mengikat
secara reversibel atau tidak. Karena beberapa detergen yang
digunakan dalam formulasi ekstraksi protein dapat menonaktifkan
fungsi enzim yang diminati atau mempengaruhi stabilitas jangka
panjangnya, maka sangat penting untuk menghilangkan detergen
setelah lisis sel. Selain itu, konsentrasi tinggi detergen atau garam
dapat mengganggu metode penelitian umum seperti tes protein,
pemurnian protein, imunopresipitasi, elektroforesis gel dan
spektrometri massa (MS). Dalam beberapa kasus, zat yang
mengganggu dapat dikurangi hanya dengan pengenceran atau dialisis.
Secara historis, pelisisan fisik merupakan metode terbaik
untuk ekstraksi protein. Namun dalam beberapa tahun terakhir,
metode lisis berbasis detergen telah menjadi standar. Telah banyak
vendor atau perusahaan yang telah mengembangkan kit yang baik dan
lengkap serta siap pakai untuk isolasi sel dan ekstraksi protein yang
efisien. Reagen ekstraksi protein dioptimalkan untuk jenis sel dan
jaringan tertentu, lokasi seluler dari protein yang diminati, dan pada
kebanyakan kasus, tidak memerlukan lisis fisik. Selain itu, produk ini
kompatibel dengan aplikasi biologi protein hilir yang paling umum
digunakan.
Protein membran memainkan peran kunci dalam proses
biologis mendasar, seperti pengangkutan molekul, pensinyalan,
pemanfaatan energi, dan pemeliharaan struktur sel dan jaringan.
Sekitar 30% gen ditentukan oleh protein membran, dan lebih dari 50
%-nya merupakan target obat saat ini. Meskipun penting,
pengetahuan kita tentang struktur dan fungsi protein membran pada
tingkat molekuler tertinggal jauh di belakang untuk protein terlarut.
69 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Protein membran terintegral di lingkungan lipid membran biologis.
Untuk mendapatkan protein membran, maka diperlukan teknik
pemurnian, penanganan, dan analisis untuk protein larut di
lingkungan lipid tersebut. Hal ini biasanya dilakukan dengan
menambahkan detergen yang melarutkan biomembran dan
membentuk kompleks yang mudah larut dengan protein lipid dan
membran. Solubilisasi id sini harus dioptimalkan secara hati-hati
untuk menghindari kehilangan protein dan inaktivasi, di mana
denaturasi protein dan/atau agregasi sering dijumpai. Oleh karena itu
solubilisasi adalah salah satu aspek yang paling penting dalam
penanganan protein membran.
Pada isolasi protein, langkah pertama yang harus dipikirkan
adalah bagaimana membuang bagian dari sel yang bukan protein,
sehingga kita akan memperoleh protein murni. Secara umum, sel
hewan lebih mudah dalam isolasinya dibandingkan sel bakteri, jamur
maupun tumbuhan. Ada beberapa metode di bawah ini, namun bukan
menjadi metode mutlak:
1. Metode dengan pencacahan menggunakan “blender” teknik
homogenisasi pada sel hewan, akan memecah dan mencacah
jaringan sehingga dinding sel akan hancur.
2. Metode lisis, menggunakan larutan EDTA-Lisozim, dapat
digunakan untuk melarutkan dinding sel bakteri gram negatif,
sedangkan jika menggunakan pelarut organik seperti toluen
dapat melarutkankan bakteri dan yeast/jamur.
Semua metode yang paling umum untuk ekstraksi protein,
memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing metode.
7.1. Pemurnian Protein
Teknik isolasi dan pemurnian yang akan diterangkan dalam
buku ini adalah dalam bidang biologi molekular di mana akan
mengisolasi protein dari suatu mikroorganisme. Teknik ini tetap dapat
digunakan untuk isolasi protein pada organisme lain dengan
melakukan modifikasi.
70 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
7.2. SDS-Page
Elektroforesis gel poliakrilamid adalah salah satu teknik yang
paling sering digunakan untuk memisahkan makromolekul (DNA, RNA
dan protein). Banyak digunakan untuk menampilkan dan untuk
memisahkan protein maupun asam nukleat yang berbeda panjangnya.
Untuk memperoleh hasil pemisahan makromolekul, khususnya
polipeptida atau protein, diperlukan kondisi yang tepat meliputi
konsentrasi poliakrilamid, ketebalan gel dan sebagainya.
Elektroforesis secara umum merupakan proses pemisahan
makromolekul yang didasarkan pada muatan molekul tersebut dalam
suatu larutan dan resistansinya. Pada gel matriks poliakrilamid atau
agarose, resistansi yang diberikan oleh matriks berkaitan dengan
ukuran molekul dan bentuk molekul saat melewatinya. Untuk ukuran
pori tertentu, molekul yang besar akan mengalami hambatan yang
lebih besar sehingga bergerak lebih lambat saat melewati matriks
daripada molekul yang kecil.
Protokol Sederhana Protein Purifikasi dan Analisisnya
1. Homogenisasi jaringan mamalia
Untuk memurnikan atau mengkarakterisasi protein
intraselular, penting untuk memilih metode yang efisien untuk
mengganggu sel atau jaringan yang secara cepat melepaskan protein
dari kompartemen intraselnya ke dalam penyangga yang tidak
berbahaya bagi aktivitas biologis protein yang diminati. Salah satu
metode yang paling banyak digunakan untuk mengacaukan jaringan
lunak adalah homogenisasi. Dalam protokol ini, cara untuk
homogenisasi jaringan dengan menggunakan pencacah dan pemotong
mekanis seperti homogenizer kaca Potter-Elvhjem -Teflon,
homogenizer Dounce, atau Waring. Metode ini cepat dan berisiko kecil
terhadap protein dibandingkan metode lain untuk isolasi protein dari
kompartemen seluler. Pada metode ini, kadang digunakan bahan
penghambat aktivasi enzim protease untuk mencegah terjadinya
degardasi proteolitik.
71 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Bahan:
Jaringan (jaringan mamalia)
Larutan stok DTT 0.5 M (Dithiothreitol) : harap diingat DTT
sangat berbahaya, gunakan pelindung diri saat membuatnya
seperti masker, sarung tangan dan dilakukan di lemari asam.
Buffer A homogenasi
1. 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2. 2 mM EDTA
3. 150 mM NaCl
4. 0.5 mM DTT
Buffer B homogenasi
1. 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
2. 10 % (v/v) gliserol atau 0.25 M sukrosa
3. 5 mM Mg-asetat
4. 0.2 mM EDTA
5. 0.5 mM DTT
6. 1.0 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride). Bahan ini
berbahaya, gunakan pelindung diri.
Alat:
Sentrifuse
Corong berfilter
Pisau
Alat teflon homogenasi dan tabung Potter-Elvehjem
Cara:
Jaringan mamalia dibersihkan dari lemak dan jaringan
pembungkusnya, rendam dalam buffer A kondisi dingin.
Potong kecil-kecil, agar memudahkan dalam penggilingan.
Masukan 4 volume buffer B yang dingin ke dalam tabung kaca
Potter, letakkan tabung kaca tersebut dalam wadah berisi air
dingin atau es.
Masukkan jaringan yang dipotong kecil-kecil (jangan langsung
banyak).
72 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Masukkan alat giling teflon, nyalakan mesin homogenasi,
dimulai dengan kecepatan 500 rpm, ditingkatkan hingga 1500
rpm. Gerakan tabung sehingga jaringan tergerus rata.
Tuangkan hasil gerusan ke tabung sentrifuse, sentrifuse pada
kecepatan 10.000 rpm suhu dingin selama 10 menit untuk
membuang sisa bahan potongan tak berguna.
Tuang supernatan ke corong berfilter, untuk membuang
lapisan lemak.
Supernatan yang telah disaring siap digunakan.
2. Isolasi protein penyusun sel darah merah (ghost red blood
cells)
Isolasi protein sel darah merah, merupakan salah satu teknik
isolasi protein yang sederhana. Kegunaan analisis protein di sini untuk
analisis ada tidaknya kerusakan membran protein dan sitoskeleton sel
darah merah. Adanya kelainan genetik pada komponen penyusun
membran sel darah merah, akan menyebabkan individu mengalami
anemia seperti pada kasus yang umum adalah pada ovalositosis,
eliptosisosi, sferositosis.
Bahan:
Darah
NaCl fisiologis
Buffer hipotonus lisis 15 mM
Buffer hipotonus lisis 10 mM
Alat:
Tabung darah EDTA
Tabung sentrifuse
Sentrifuse
Cara:
Ambil 5 mL darah, pisahkan sel darah merah dari plasma
dengan teknik sentrifugasi pada kecepatan 3.000 rpm selama
10 menit suhu 40C.
73 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Sel darah merah kemudian dicuci menggunakan larutan NaCl
fisiologis dan mensentrifugasinya selama 5 menit pada
kecepatan 3.000 rpm suhu 40C.
Pindahkan sel darah merah yang telah dicuci ke tabung
sentrifus yang berisi buffer lisis 15 mM dingin, dengan jumlah
volume perbandingan sel darah merah dan buffer 1:3. Sentrifus
pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 40C.
Buang supernatan.
Lakukan pelisisan buffer 15 mM sebanyak 3-4 X.
Pada hasil pelisisan dengan buffer 15 mM, akan didapatkan
endapan merah muda tua.
Tambahkan pada tabung sentrifuse yang berisi endapan pink
tersebut dengan buffer lisis 10 mM, diamkan 30 – 60 menit
pada lemari pendingin -200C, untuk mempercepat proses
pelisisan.
Sentrifuse pada kecepatan maksimal (13.000 rpm – 14.000
rpm) selama 20 menit. Ulangi proses ini 2 – 3 x, akan diperoleh
endapan merah muda samar – putih.
Endapan yang diperoleh dapat digunakan untuk tahap
selanjutnya.
3. Teknik SDS-PAGE protein penyusun sel darah merah
Bahan:
1.5 M tris (pH 8.8)
30 % akril/ 0.8 % bis-akrilamid
10 % SDS
10 % APS
TEMED
2x sampel buffer terdiri dari 100 mM tris-HCl ph 6.8; 20 %
gliserol; 4 % SDS; 0.2 % BPB (bromfenol biru); 20 mM DTT
atau 10 % BME
running buffer terdiri dari 25 mM Tris; 250 mM glisin dan 0.1
% SDS
74 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Cara:
Pembuatan gel pemisah konsentrasi 12 % (resolving gels/ separating
gesl)
Bahan 5 mL 10 mL 15 mL 20 mL 25 mL Air steril 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 1.5 M Tris 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 Akril/bis-akril 2 4 6 8 10 SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
Pembuatan gel penumpuk (stacking gels)
Bahan 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL Air steril 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 1.0 M Tris 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 Akril/bis-akril 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 APS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005
1. Bersihkan lempeng kaca dan plastik pembatas dengan alkohol
untuk menghindari lemak. Gunakan sarung tangan agar bercak
lemak tangan tidak menempel di lempeng kaca.
2. Taruh lempeng kaca 1 (lempeng yang besar), kemudian
pembatas terakhir lempeng kaca 2.
75 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
3. Jepit kanan kiri dengan penjepit kertas atau penjepit lainnya.
4. Tuang campuran air isopropanol, kira-kira setengah dari luas
lempeng kaca, lihat ada kebocoran atau tidak.
5. Buang cairan tersebut, balik untuk mengeringkan.
6. Setelah kering, tuang gel pemisah sampai 3.4 luas lempeng
kaca 2.
7. Biarkan 15 – 20 menit sampai mengeras/membeku, posisi
harus tegak berdiri tidak miring. Untuk mengetahui sudah
mengeras, ambil sedikit gel pemisah, taruh dalam tabung 1.5
mL diamkan sampai mengeras. Jika gel dalam tabung
mengeras, ini berarti gel dalam lempeng juga sudah mengeras.
Tuang butanol di atasnya agar gel tidak kering saat kita
menyiapkan gel penumpuk. Setelah gel penumpuk siap
dituang, buang larutan butanol tersebut.
8. Tuang gel penumpuk hingga melewati bibir lempeng kaca,
taruh lempeng sisir untuk membuat sumur sampel.
9. Biarkan sampai mengeras/membeku. Buka jepitannya
10. Gel SDS-PAGE siap digunakan.
11. Letakkan gel dan lempengannya dalam kotak elektroforesis,
jepit agar buffer SDS tidak tumpah saat dituang, tuang buffer
SDS (running buffer) dalam bak buffer atas bawah. Buka
lempeng sisir.
12. Ambil 100 uL sampel isolat protein dalam 2x sampel buffer.
76 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
(https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/sds-page.html)
13. Masukkan ke dalam sumur (kira-kira 10 uL).
14. Nyalakan sumber listrik dengan arus yang diatur. Biarkan
proses pemisahan terjadi dengan bergeraknya sampel hingga
batas 1/3 lempengan (harap ditandai batas 1/3 dari bawah
lempengan).
(https://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/course_Information/4581/techniques/ge
l_elect/page_protein.html)
77 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
15. Gel siap diwarnai dan dicuci untuk tahap lanjutannya.
16. Cuci lempengan tersebut dalam air mengalir untuk
menghilangkan bekas buffer.
17. Lepaskan gel dari lempengannya (harap hati-hati), taruh dan
rendam gel tersebut dalam larutan biru Coomassie. Biarkan
selama 3 – 4 jam, gunakan mesin penggoyang (shaker) dalam
gerakan pelan.
18. Setelah selesai perendaman, pindahkan gel ke dalam wadah
yang berisi larutan pencuci. Cuci selama 1-2 jam, setiap 30
menit, ganti larutan pencuci yang sudah berubah warna.
19. Gel siap dianalisis.
(https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/sds-page.html)
20. Hasil pencucian :
Koleksi pribadi
78 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Daftar Pustaka
1. Chris Adhiyanto, Rini Puspitaningrum. Genetika Molekuler dan
aplikasinya. UNJ Jakarta, 2018.
ISBN 978-623-7022-86-2
2. Chris Adhiyanto, Yasuhiro Yamashiro, Yukio Hattori, et al. A
New β0-Thalassemia Mutation (codon 102, AAC>ATCAC) in
Coexistence with a Heterozygous P4.2 Nippon Gene.
Hemoglobin, vol. 37, pp 227 -240, Apr 2013.
ISSN: 0363-0269 print/1532-432X online
DOI: 10.3109/03630269.2013.777847
3. Takenori Nitta, Fumio Kawano, Yasuhiro Yamashiro, Fumiya
Takagi, Tomoaki Murata, Tatehiko Tanaka, Mella Ferania, Chris
Adhiyanto, Yukio Hattori. A new Krüppel-like factor 1
mutation (c. 947G> A or p. C316Y) in humans causes β-
thalassemia minor. Hemoglobin, vol. 39, pp 121-126, March
2015.
ISSN: 0363-0269 (print), 1532-432X (electronic)
DOI: 10.3109/03630269.2015.1008702
4. Rini Puspitaningrum, Chris Adhiyanto, Annisa Firdausi,
Nurmasari Sartono, Ria Amelia, Mella Ferania, Yukio Hattori,
Yasuhiro Yamashiro, Riana Bagaskorowati, Saparuddin
Muktar. Identification Of The Levulinate Dehydratase (ALAD)
Gene Polymorphism And Whole Blood Hemoglobin In The
Students Of Elementary School In Kalideres. Asian Jr.of
Microbiol.Biotech.Env.Sc, vol 19, pp 897-904, Oct 2017.
5. Yasuhiro Yamashiro, Yukio Hattori, Takenori Nitta, Chris
Adhiyanto, Maryam M Matar, Mella Ferania, Fumiya Takagi.
Filipino-type β 0-thalassemia has 116 kb Deletion: Its Correct
79 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Breakpoints and Five Cases Found in Japan. Bull Yamaguchi
Med Sch, vol 59, pp 53-59, 2012.
6. Dewi Shinta, Chris Adhiyanto, Min Kyaw Htet, Umi Fahmida.
The Association of TMPRSS6 Gene Polymorphism and Iron
Intake with Iron Status among Under-Two-Year-Old Children
in Lombok, Indonesia. Nutrient, vol 11, pp 878, Apr 2019.
DOI:10.3390/nu11040878
7. Rini Puspitaningrum, Chris Adhiyanto, Nurmasari Sartono,
Palgunadi Palgunadi, Solihin Solihin, Yasuhiro Yamashiro,
Yukio Hattori. δ aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) gene
polymorphism of marine taskforce personnel whit routine
exposure of lead suspended in air. MATEC Web. Conf, vol 197,
pp 06002, 2018.
8. Chris Adhiyanto, Witri Ardini, Hoirun Nisa, Zeti Harriyati, Dina
A Amu, Kemal AL Fajar, Taslim Poniman, Rofi Saunar, W
Aditomo. Genetic pattern of CYP1A1* 2A (T> C) gene in patients
with colorectal cancer in South Jakarta–Indonesia. Prociding.
Advances in Health Sciences Research, Dec 2017.
DOI: https://doi.org/10.2991/ichlas-17.2017.5
9. YR Dewahrani, C Adhiyanto, W Futy, R Puspitaningrum.
Screening of hemoglobin E in students of biology Universitas
Negeri Jakarta using Hybri-Probe genotype method. Asian Jr.of
Microbiol.Biotech.Env.Sc, vol 17, pp 379-385, 2015.
10. Chris Adhiyanto, Nouval Shahab, Flori R Sari, Hipni Solehudin,
Mukhtar Ikhsan, Nurlaely Mida, Witri Ardini, Zati Harriyati,
Narila Mutia Nasir, Hari Hendarto. Identification Rs9642880
Taqman Genotyping Using Lightcycler 480. Asian Jr. of
Microbiol. Biotech. Env. Sc. Vol. 21, pp 920-923, Apr 2019.
11. Chris Adhiyanto, Narila Mutia Nasir, Flori R Sari, Risfy Gusti
Pamungkas, Intan Azis, Zeti Harriyati, Witri Ardini, Hari
Hendarto, Nouval Shahab, Endah Wulandari, Fase Badriah.
Preliminary Study: Identification Of Dna Variation With SNP
Numbers Rs1137101 And Rs8050136 In Patient’s Type 2
80 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Diabetes Mellitus At Salsabila Clinic Bogor Indonesia. Asian Jr.
of Microbiol. Biotech. Env. Sc. Vol. 21, pp 931-934, Apr 2019.
12. Richard J Simpson. Preparation of cellular and subcellular
extracts, in. Basic Methods in Protein Purification and Analysis,
Ed. RJ Simpson. Cold Spring Harbor Lab Press. 2008, pp 38.
13. Chris Adhiyanto. -
thalassemia complicated with P4.2Nippon may have developed
-thalassemia. Disertasi.
Yamaguchi University. 2013.
14. Stefan Surzycki. Laboratory Manual. Human molecular biology.
Blackwell Publishing. London-UK. 2003.
ISBN:0-63204-676-7
15. Siun Chee Tn, Beow Chin Yiap. Review article. DNA, RNA and
protein extraction: the past and the present. Journal of
Biomedicine and Biotechnology, vol 2009, pp 1-10, Nov 2009.
https://doi.org/10.1155/2009/574398
16. -. G-Biosciences, Protein Electrophoresis. www.GBiosciences.
com
17. -. Tools and reagents form optimal protein extraction. Thermo
Scientific. thermofisher.com/proteinbiology
18. Drabik A, Bodzon-Kulakowska A, Silberring J. Gel
Electhrophoresis in Proteomic Profiling and Analytical
Chemistry 2nd. The Crossroads. Elsevier. London-UK. 2016.
ISBN:978-0-444-63688-1
https://doi.org/10.1016/B978-0-444-63688-1.00007-0
19. http://www.ithanet.eu/ithapedia/index.php/Protocol:Gap-PCR
20. https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/
articles/biology/sds-page.html
21. https://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/course_Informatio
n/4581/techniques/gel_elect/page_protein.html
81 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Tentang Penulis
Lahir di Semarang pada tahun 1969. Lulus S1 dari Fakultas Biologi
Unas pada tahun 1994. Dan langsung melanjutkan studi ke
pascasarjana bidang Biomedik FKUI. Setelah lulus, bekerja sebagai
staf dosen kontrak FKUI dari tahun 2000-2004. Kemudian pindah
ke FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada tahun 2004 hingga
sekarang. Tahun 2008, melanjutkan pendidikan S3 di Yamaguchi
University. Faculty of Medicine and Health Sciences. Program
Medical Technologies. Selesai pendidikan, kembali bekerja di UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta sebagai dosen tetap FKIK dan Kepala
Laboratorium FKIK. Beberapa hasil penelitian telah dipublikasikan
di jurnal internasional.
Chris Adhiyanto, S.Si., M.Biomed, Ph.D
Adalah dokter gigi dan dosen tetap pada Fakultas Kedokteran,
Universitas Islam Negeri (FK UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta,
sejak 2008. Lahir di Jakarta pada tahun 1978. Ia mendapatkan
gelar sarjana bidang Kedokteran Gigi di Universitas Indonesia,
pada tahun 2001. Tahun 2003, ia mendapatkan beasiswa Monbu-
kagakusho untuk program S-3 pada Graduate School of Dental
School di Kyushu University, Jepang. Ia mendalami mengenai jaras
sinyal apoptosis dan survival pada sel tumor mulut. Beberapa
artikelnya telah diterbitkan dalam jurnal internasional dan
nasional.
drg. Laifa Annisa Hendarmin, Ph.D
82 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler
Lahir pada tahun 1968 di Kota Jakarta. Lulus S1 dari
Fakultas Biologi UNAS pada tahun 1993. Kemudian melanjutkan ke
pascasarjana Bidang Biomedik & Biologi Molekuler di FKUI.
Setelah lulus bekerja mengajar di FMIPA Universitas Negeri Jakarta
(UNJ) mulai tahun 2011 hingga sekarang. Pada tahun 2005,
melanjutkan pendidikan S3 di bidang yang sama di Biomedik FKUI
dan Universitas Liverpool Inggris untuk Program Sandwich like
DIKTI tahun 2009. Menyelesaikan pendidikannya tersebut pada
tahun 2010. Karya ilmiah hasil risetnya di bidang Biokimia dan
Biologi Molekuler telah dipublikasikan dalam beberapa jurnal
sains nasional maupun internasional. Pada tahun 2011-2012
mengikuti program Research Postdoc bidang Proteomic di
Universitas JLU Gessen, Jerman menggunakan blaya pemerintah
Indonesia PAR C dan beasiswa DAAD dari pemerintah Jerman.
Selain bekerja sebagai staf pengajar di Fakultas MIPA UNJ Jakarta,
juga menjadi Koordinator Pusat SAINTEK dan Olahraga di
Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat (LPPM)
UNJ.
Dr. Rini Puspitaningrum. S.Si., M. Biomed.