PENGENALAN SPEKTROFOTOMETER

Peralatan spektroskopi merupakan peralatan analisa deteksi atau pengenalan bahan.

Spektroskopi digunakan untuk menentukan struktur dan reaksi kimia senyawa-senyawa.

Keunggulannya:- Tidak memerlukan perusakan bahan- Berpotensi utk dikembangkan dan dijalankan

secara otomatis- Bahan analisa yg dibutuhkan hanya sedikit dan

bahkan dalam keadaan tercampur

Spektrofotometer : suatu metode analisis yg melibatkan bagaimana sinar berinteraksi dengan atom (atau molekul) dalam suatu sampel

• Sinar tampak hanya sebagian kecil dari keseluruhan spektrum elektromagnetik dan dalam sinar terdapat warna umum yang dapat diobservasi (merah, kuning, hijau, biru dan violet). Spektrum tampak terdiri dari radiasi elektromagnetik yang mempunyai panjang gelombang dari 400 nm sampai mendekati 800 nm.

• Warna suatu sinar berkaitan dengan masing-masing panjang gelombang yang dapat diobservasi dengan mata.. Kisaran visible suatu sinar berkisar antara 400 sampai 700 nm.

Pembagian daerah UV-visibelλ Warna yang

diserapWarna yang

teramati410430480500530560580610680720

VioletBiru-violet

BiruHijau-biru

HijauKuning-hijau

KuningJinggaMerah

Merah-ungu

Kuning-hijauKuningJinggaMerah

Merah-unguViolet

Biru-violetBiru

Hijau-biruHijau

Spektrum Elektromagnetik

Warna & panjang gelombang COLORCOLOR WAVELENGTH (WAVELENGTH (λ in nm)λ in nm)

UltravioletUltraviolet < 380< 380

VioletViolet 380 – 435380 – 435

BlueBlue 436 – 480436 – 480

Greenish-blueGreenish-blue 481 – 490481 – 490

Bluish-greenBluish-green 491 – 500491 – 500

GreenGreen 501 – 560501 – 560

Yellowish-greenYellowish-green 561 – 580561 – 580

YellowYellow 581 – 595581 – 595

OrangeOrange 596 – 650596 – 650

RedRed 651 – 780651 – 780

Near InfraredNear Infrared > 780> 780

Sin

ar ta

mpa

k

Sinar putih yg dapat diobservasi, sebenarnya merupakan campuran semua warna sinar

Mengapa hampir semua substansi mempunyai warna ?

Apabila sinar melewati suatu substansi, energi tertentu (atau warna) diabsorbsi, sementara warna lain dapat melewati atau dipantulkan oleh substansi tersebut

• Apabila suatu substansi tidak dapat mengabsorbsi sinar, substansi tersebut akan berwarna putih (semua sinar dipantulkan) atau tidak berwarna (semua sinar ditransmisi). Suatu larutan mempunyai warna tertentu karena absorbansi dan transmisi sinar nampak.

• Sebagai contoh , larutan berwarna biru nampak biru karena larutan tersebut mengabsorbsi semua warna kecuali warna biru.

• Jumlah sinar yg diabsorbsi oleh suatu larutan tergantung pada:

1. kemampuan komponen untuk mengabsorbsi

sinar (molar absorptivity),

2. jarak dimana sinar dapat melewati sampel

(path length)

3. konsentrasi molar senyawa dalam larutan. • Jika senyawa yg sama digunakan dan path

length dipertahankan konstan, maka absorbansi akan proporsional dengan konsentrasi sampel.

Spektrofotometer didesain untuk mendeteksi absorbansi sinar pada panjang gelombang yang berbeda apabila sinar dapat melewati suatu larutan dengan konsentrasi tertentu

Beberapa senyawa mengabsorbsi sinar lebih banyak pada suatu panjang gelombang tertentu daripada pada panjang gelombang lainnya, sehingga panjang gelombang harus disesuaikan setiap ganti senyawa yang akan di analisis untuk mencapai hasil yang optimum dari spektrofotometer. Panjang gelombang sinar diseleksi melalui penetapan panjang gelombang dan terlihat di display panjang gelombang.

Warna suatu sinar berkaitan dengan masing-masing panjang gelombang yang dapat diobservasi dengan mata.. Kisaran visible suatu sinar berkisar antara 400 sampai 700 nm.

Spekrofotometer

• Spektrofotometer digunakan untuk memberikan sumber sinar dari energi tertentu (wavelength) dan untuk mengetahui jumlah sinar yang diabsorbsi oleh sampel.

Light Bulb Prism Filter Slit Sample Detector

Prinsip kerja Spektrofotometer • spektrofotometer meliputi sumber radiasi sinar

putih yg melewati suatu monokromator. • Monokromator merupakan prisma yang

memisahkan sinar putih menjadi semua warna dari visible spektrum.

• Setelah sinar terpisah, sinar akan melalui suatu filter (untuk memblok out sinar yang tidak dinginkan, seringkali sinar dari warna yang berbeda).

• Selanjutnya suatu sinar melewati sampel dan bagian yang tidak terabsorbsi mengenai fotodetektor.

• Sinar kemudian menjadi output yang digunakan dalam analisis suatu sampel.

Absorpsi sinar

• Sinar putih – Semua warna– Sinar Polychromatic

Absorpsi sinar

• Sinar Monochromatic – Sinar dari salah satu warna

Sinar merah diabsorbsi Oleh larutan

hijau

Spektrofotometer

Susunan alat spektrofotometer UV/UV-visibel 1. Sumber radiasi

Lampu D atau H : UV Lampu W atau Xe : UV-visibel

2. Sel Sampel

 Kuvet kuarsa : UV dan UV - visibel

Kuvet Plastik : UV- visibel

 3. Monokromator

Celah, lensa, cermin atau prisma Menyaring cahaya → monokromatis

 4. Detektor

Foton Energi yang ditangkap : energi foton (hv)

Energi foton diubah menjadi energi listrik:

pulsa listrik diperkuat oleh amplifier

dan direkam oleh rekorder

 5. Rekorder

 Menampilkan out put :

spektra atau angka

Peralatan:

1. Monokhromator

2. Cuvette

3. Fotosel

4. Celah

5. Spektrofotometer pencatat otomatis

Dasar pengukuran radiasi, energi dan struktur kimia

- Sinar, panas dan radiasi elektromagnetik lain terdiri dari gelombang elektromagnetik yg merambat.

- Jumlah energi dlm masing-masing kuantum menentukan panjang gelombang dari radiasi.

- Seperti halnya atom, elektron dlm molekul dpt berubah tingkat energinya apabila sejumlah quanta radiasi diserap atau dilepaskan oleh molekul shg muncul istilah spektrum serapan dan lepasan.

Jenis spektrum dan kegunaannya

- Satu spektrum dpt digambarkan sbg suatu jumlah energi yg diserap atau dilepaskan oleh suatu sistem pd panjang gelombang atau bahan elektromagnetik yg lain.

- Macam spektrum:a. Spektrum elektronik: timbul karena elektron

sebelah luar dr suatu atom berubah tingkat energinya. Spektrum elektronik terjadi dlm daerah nampak dan UV dan biasanya diikuti oleh perubahan tingkat energi rotasi dan vibrasi.

b. Spektrum getaran perputaran, disebabkan oleh adanya perubahan tingkat energi getaran. Spektrum ini terjadi pada daerah infra-merah-dekat dan mungkin diikuti oleh perubahan energi perputaran.

c. Spektrum perputaran, terjadi dalam daerah infra-merah jauh dan microwave, dan ini jarang dipakai dlm penelitian biokimia. Spektrum resonansi perputaran elektron muncul karena perubahan arah perputaran elektron, sedang spektrum resonansi magnetik inti karena perubahan arah perputaran inti dlm medan magnet.

- Untuk bahan penyerap yg seragam, jumlah radiasi yg dpt lewat disebut transmitansi (T). T = I/IoI = jumlah kekuatan radiasi yg masukIo = jumlah kekuatan radiasi yg dilepas

- Serapan (A), atau ekstingsi (E)A = log 1/T = log Io/I

- Transmitansi dpt bernilai antara 0-100%, tetapi serapan tidak ada satuannya, berkisar antara 0 – tak terhingga.

Hukum dasar penyerapan sinar

I

Spektrofotometri UV-VIS

- Spektrum yg diabsorpsi oleh suatu senyawa adalah sejumlah sinar yg diserap atau hilang oleh suatu senyawa pada panjang gelombang tertentu.

- Daerah spektrum nampak (400-700nm) dan UV (200-400nm)

- Peningkatan panjang gelombang disebut perpindahan batokhromik, sedangkan penurunan panjang gelombang disebut hipokhromik.

SPECTROPHOTOMETR READINGS

ULTRAVIOLET SPECTRUM

Slope of Standard Curve = AC

1 2 3 4 5

1.0

0.5

Concentration (mg/ml)

Absorbance at 280 nm

There is some A vs. C where graph is linear.

NEVER extrapolate beyond point known where becomes non-linear.

SPECTROMETRIC ANALYSIS USING STANDARD CURVE

1 2 3 4

0.4

0.8

1.2Absorbance at 540 nm

Concentration (g/l) glucose

Avoid very high or low absorbencies when drawing a standard curve. The best results are obtained with 0.1 < A < 1. Plot the Absorbance vs. Concentration to get a straight line