Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode Cuprac ... · dalam penelitiannya menyatakan bahwa ... seperti asam ursolat, asam betulinat, dan asam oleat yang terdapat dalam Orthosiphon

PENGUKURAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE CUPRAC, DPPH, DAN FRAP SERTA

KORELASINYA DENGAN FENOL DAN FLAVONOID PADA ENAM TANAMAN

NIKEN WIDYASTUTI

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2010

ABSTRAK

NIKEN WIDYASTUTI. Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman. Dibimbing oleh ELLY SURADIKUSUMAH dan MOHAMAD RAFI. Keadaan stres oksidatif merupakan keadaan ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan yang dapat menyebabkan kerusakan oksidatif mulai dari tingkat sel, jaringan, hingga ke organ tubuh. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan dari 6 tanaman obat dan menentukan hubungan antara aktivitas antioksidan dan kandungan fenol serta flavonoidnya. Penelitian ini dilakukan menggunakan beberapa tanaman obat, yaitu kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung. Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan 3 metode yaitu CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity), DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), dan FRAP (ferric reducing antioxidant power). Dari hasil penelitian diketahui bahwa semua tanaman tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP berbeda nyata secara statistika. Walaupun demikian metode CUPRAC dan FRAP menghasilkan urutan aktivitas antioksidan yang sama dari 6 tanaman. Kandungan total fenol berkorelasi kuat dan searah dengan aktivitas antioksidan tetapi tidak memiliki korelasi dengan flavonoid. Jadi, aktivitas antioksidan tidak hanya bersumber dari golongan flavonoid.

ABSTRACT NIKEN WIDYASTUTI. Measurement of Antioxidant Activity CUPRAC, DPPH, and FRAP Method and their Correlation with Phenol and Flavonoids in Six Herbs. Under direction of ELLY SURADIKUSUMAH and MOHAMAD RAFI.

Oxidative stress is the imbalance condition between free radical and antioxidants that can cause oxidative damage in cell, tissues, organ, accelerates the aging process, and emergence of diseases. This study aims to determine the antioxidant capacity of 6 herbs, and the relationship between phenol and flavonoids content with their antioxidant activity and relationship between phenol and flavonoids content in the ethanol extract of some Indonesian herb, there are Orthosiphon stamineus, Sonchus avensis, Sida rhombifolia, Guazuma umifolia, Andrographis paniculata, and Parkia biglobosa. The measurement of antioxidant activity use 3 methods, that are CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity), DPPH (2,2-diphenyl-1-pickrylhidrazyl), and FRAP (ferric reducing antioxidant power). The research of the six herbs showed antioxidant activity. Statistic test from three method antioxidant showed that measurement antioxidant activity with CUPRAC, DPPH, and FRAP gave a significantly different result, but CUPRAC and FRAP give the same response of the six herbs. The phenol has no correlation with flavonoids content but have highly correlation with their antioxidant activity. Flavonoids have no correlation with antioxidant activity.

PENGUKURAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE CUPRAC, DPPH, DAN FRAP SERTA

KORELASINYA DENGAN FENOL DAN FLAVONOID PADA ENAM TANAMAN

NIKEN WIDYASTUTI

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2010

Judul Skripsi : Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC,

DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman

Nama : Niken Widyastuti NIM : G44076004

Disetujui

Pembimbing I Pembimbing II

Ir. Elly Suradikusumah, MS Mohamad Rafi, S.Si, MSi NIP 19450214 197010 2 001 NIP 19770316 200604 1 010

Mengetahui, Ketua Departemen

Prof.Dr. Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002

Tanggal lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah swt atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah berjudul Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman dapat diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Mei sampai Agustus 2009 dan bertempat di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Ir. Elly Suradikusumah, MS dan Bapak Mohamad Rafi, S.Si, MSi selaku pembimbing. Ungkapan terimakasih juga penulis haturkan kepada Abah, Mamah, Mas Kris, Mbak Dypus, Teh Diah, dan Mas Wahyu. Selain itu ucapan terima kasih diperuntukan kepada seluruh staf Laboratorium Uji Pusat Studi Biofarmaka, Ibu Nunu, Ibu Salina, Ka Agung, Endi, Nio, Mbak Wiwi, dan Pak Mul serta semua teman-teman.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Desember 2009

Niken Widyastuti

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 14 September 1984 sebagai anak ketiga dari tiga bersaudara dari pasangan Iman Warsito dan Ida Mardiyah. Tahun 2002, penulis lulus seleksi masuk Akademi Kimia Analisis (AKA) Bogor melalui jalur seleksi rapor. Pada tahun 2005, penulis berkesempatan mengikuti praktik kerja lapangan di Balai Pengujian Mutu Produk Perternakan, Bogor. Akhir tahun 2005 penulis lulus dari Akademi Kimia Analisis dan tahun 2006 bekerja di Orang Tua group Divisi Sweet Water Product. Tahun 2007, penulis melanjutkan pendidikan S1 kimia di IPB melalui jalur S1 Kimia Penyelenggaraan Khusus. Selama perkuliahan, penulis pernah mengajar di bimbingan belajar BTA 8 dan bimbingan belajar Math Magic School. Agustus 2009, Penulis juga berkesempatan untuk menjadi asisten praktikum pada program keahlian Analisis Kimia di Diploma IPB.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ......................................................................................................... vii

DAFTAR GAMBAR .................................................................................................... vii

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................. vii

PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1

TINJAUAN PUSTAKA Radikal Bebas dan Antioksidan .......................................................................... 1 Uji Aktivitas Antioksidan .................................................................................. 1 Fenol dan Flavonoid .......................................................................................... 2 Kumis Kucing ..................................................................................................... 2 Tempuyung ........................................................................................................ 2 Sidaguri .............................................................................................................. 2 Jati Belanda ........................................................................................................ 3 Sambiloto ............................................................................................................ 3 Kedaung ............................................................................................................. 3 Troloks ................................................................................................................ 3

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ................................................................................................... 4 Metode ............................................................................................................... 4 Analisis Data ...................................................................................................... 5

PEMBAHASAN Ekstrak Tanaman ................................................................................................ 5 Aktivitas Antioksidan ......................................................................................... 5 Kandungan Total Fenol ...................................................................................... 7 Kandungan Total Flavonoid ............................................................................... 7 Hasil Uji Korelasi ............................................................................................... 8

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ............................................................................................................. 9 Saran ................................................................................................................... 9

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................... 10

LAMPIRAN .................................................................................................................. 12

vi

DAFTAR TABEL

Halaman

1. Kapasitas antioksidan metode CUPRAC .................................................................. 5

2. Kapasitas antioksidan metode DPPH ........................................................................ 6

3. Kapasitas antioksidan metode FRAP ........................................................................ 6

4. Kandungan total fenol ............................................................................................... 7

5. Kandungan total flavonoid ........................................................................................ 7

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Stuktur dasar flavonoid ........................................................................................... 2

2. Tanaman kumis kucing ........................................................................................... 2

3. Tanaman tempuyung .............................................................................................. 2

4. Tanaman sidaguri ................................................................................................... 3

5. Tanaman jati belanda .............................................................................................. 3

6. Tanaman sambiloto ................................................................................................. 3

7. Tanaman kedaung ................................................................................................... 3

8. Stuktur troloks ........................................................................................................ 4

9. Hubungan total fenol dengan kapasitas antioksidan ............................................... 8

10. Hubungan total flavonoid dengan kapasitas antioksidan ........................................ 9

11. Hubungan total fenol dengan total flavonoid .......................................................... 9

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Bagan alir penelitian .............................................................................................. 13

2. Penentuan kadar air ................................................................................................ 14

3. Rendemen ekstrak kering ....................................................................................... 15

4. Kapasitas antioksidan metode CUPRAC ............................................................... 16

5. Kapasitas antioksidan metode DPPH ..................................................................... 17

6. Kapasitas antioksidan metode FRAP ..................................................................... 18

7. Uji-F dan Uji-t untuk metode pengukuran kapasitas antioksidan .......................... 19

8. Penentuan total fenol .............................................................................................. 22

9. Kandungan total flavonoid ..................................................................................... 23

vii

PENDAHULUAN

Antioksidan adalah zat penghambat reaksi oksidasi akibat radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan asam lemak tak jenuh, membran dinding sel, pembuluh darah, basa DNA, dan jaringan lipid sehingga menimbulkan penyakit (Subeki 1998). Suatu tanaman dapat memiliki aktivitas antioksidan apabila mengandung senyawaan yang mampu menangkal radikal bebas seperti fenol dan flavonoid.

Beberapa penelitian telah dilakukan untuk melihat hubungan antara kandungan fenol, flavonoid, dan aktivitas antioksidan. Hasil penelitian Kao et al. (2007) menunjukkan bahwa kandungan fenol dan flavonoid dalam blackberry berbanding lurus dengan aktivitas antioksidan. Sementara Khamsah et al. (2006) dalam penelitiannya menyatakan bahwa aktivitas antioksidan tidak hanya bergantung pada kandungan total fenol tetapi juga dipengaruhi oleh senyawa lain, seperti asam ursolat, asam betulinat, dan asam oleat yang terdapat dalam Orthosiphon stamineus.

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan beberapa tanaman obat, yaitu kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, kedaung, dan sambiloto. Ekstrak etanol dari tanaman tersebut diukur nilai kandungan fenol, flavonoid, dan aktivitas antioksidannya. Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan 3 metode, yaitu DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), FRAP (ferric reducing antioxidant power) dan CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan dari 6 tanaman obat. Selain itu, hubungan antara kandungan fenol, total flavonoid dan aktivitas antioksidannya juga ditentukan. Diduga terdapat keterkaitan hubungan antara kandungan total fenol, total flavonoid, dan aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol beberapa tanaman obat Indonesia.

TINJAUAN PUSTAKA

Radikal Bebas dan Antioksidan Radikal bebas adalah suatu molekul atau

atom yang mempunyai 1 atau lebih elektron tidak berpasangan. Radikal ini dapat berasal dari atom hidrogen, molekul oksigen, atau ion logam transisi. Senyawa radikal bebas sangat reaktif dan selalu berusaha mencari pasangan elektron agar kondisinya stabil (Subeki 1998).

Radikal dapat terbentuk secara endogen dan eksogen. Radikal endogen terbentuk dalam tubuh melalui proses metabolism normal di dalam tubuh. Sementara radikal eksogen berasal dari bahan pencemar yang masuk ke dalam tubuh melalui pernafasan, pencernaan, dan penyerapan kulit (Miller 1996). Radikal bebas dalam jumlah normal bermanfaat bagi kesehatan misalnya, memerangi peradangan, membunuh bakteri, dan mengendalikan tonus otot polos pembuluh darah serta organ-organ dalam tubuh (Yuwono 2009). Sementara dalam jumlah berlebih mengakibatkan stress oksidatif. Keadaan tersebut dapat menyebabkan kerusakan oksidatif mulai dari tingkat sel, jaringan, hingga ke organ tubuh yang mempercepat terjadinya proses penuaan dan munculnya penyakit (Yuwono 2009). Oleh karena itu, antioksidan dibutuhkan untuk dapat menunda atau menghambat reaksi oksidasi oleh radikal bebas.

Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat dibedakan menjadi antioksidan endogen dan eksogen. Antioksidan endogen terdapat secara alamiah dari dalam tubuh sedangkan antiosidan eksogen dari luar tubuh Percival (1998). Antioksidan eksogen sendiri dibedakan menjadi antioksidan alami dan sintetik (Miller 1996).

Uji Aktivitas Antioksidan

Pengukuran aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan beberapa metode di antaranya CUPRAC, DPPH, dan FRAP. Metode CUPRAC (Apak et al. 2007) menggunakan bis(neokuproin) tembaga(II) (Cu(Nc)2

2+) sebagai pereaksi kromogenik. Pereaksi Cu(Nc)2

2+ yang berwarna biru akan mengalami reduksi menjadi Cu(Nc)2

+ yang berwarna kuning dengan reaksi: n Cu(Nc)2 2+ + AR(OH)n → n Cu(Nc)2

+ + AR(=O)n + n H+

Metode DPPH menggunakan 2,2difenil-1-

pikrilhidrazil sebagai sumber radikal bebas. Prinsipnya adalah reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari zat antioksidan dengan reaksi sebagai berikut:

Metode FRAP (Benzie & Strain 1996) menggunakan Fe(TPTZ)2

3+ kompleks besi-ligan 2,4,6-tripiridil-triazin sebagai pereaksi. Kompleks biru Fe(TPTZ)2

3+ akan berfungsi sebagai zat pengoksidasi dan akan mengalami reduksi menjadi Fe(TPTZ)2

2+ yang berwarna

kuning dengan reaksi berikut: Fe(TPTZ)2 3+ + AROH → Fe(TPTZ)22+ + H+

+ AR=O

Fenol dan Flavonoid

Senyawaan fenol biasanya terdapat dalam berbagai jenis sayuran, buah-buahan dan tanaman. Turunan senyawaan fenol merupakan metabolit sekunder terbesar yang diproduksi oleh tanaman. Senyawaan ini diproduksi dalam tanaman melalui jalur sikimat dan metabolisme fenil propanoid. Senyawaan fenol dapat memiliki aktivitas antioksidan, antitumor, antiviral, dan antibiotik (Apak et al. 2007). Diantara senyawaan fenol alami yang telah diketahui lebih dari seribu stuktur, flavonoid merupakan golongan terbesar (Subeki 1998). Flavonoid merupakan senyawa dengan bobot melekul rendah dan memiliki stuktur dasar C6C3C6, yaitu terdiri atas 2 buah cincin benzena yang dihubungkan dengan 3 karbon (Gambar 1). Flavonoid terbagi menjadi 7 kelompok, yaitu antosianin, proantosianin, isoflavon, flavonon, flavonol, flavanol, dan flavon. Flavonoid memiliki aktivitas antioksidan di dalam tubuh sehingga disebut bioflavonoid.

Gambar 1 Stuktur dasar flavonoid (Apak et

al. 2007).

Kumis Kucing

Kumis kucing (Orthosiphon stamineus) merupakan tanaman obat yang berasal dari wilayah Afrika tropis dan kemudian menyebar ke Asia dan Australia. Kumis kucing masuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), ordo Lamiales, suku Lamiaceae, genus Orthosiphon, spesies stamieus.

Kumis kucing merupakan tanaman tahunan dengan tinggi 50-100 cm (Gambar 2).

Kumis kucing mengandung saponin, kalium (Wirakusumah & Setyowati 1994), asam rosmarinat, diterpenoid, triterpenoid (Matkowski 2008), asam oleat, asam ursolat, asam betulinat, 3-hidroksi flavon, 3’,4’-dihidroksiflavon, dan 2’,3’-dihidroksiflavon (Khamsah et al. 2006).

Gambar 2 Tanaman kumis kucing.

Tempuyung

Tempuyung (Sonchus avensis) termasuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), bangsa Asterales, suku Asteraceae, genus Sonchus, spesies avensis. Tempuyung merupakan tanaman menahun yang tumbuh liar pada tanah lembap dan cukup sinar matahari (Gambar 3). Tempuyung mengandung kandungan senyawa kimia seperti flavonoid (kaemferol, luteolin-7-O-glukosida, dan apigenin-7-O-glukosida), kumarin, dan asam fenolat bebas (Sriningsih et al. 2002).

Gambar 3 Tanaman tempuyung.

Sidaguri

Sidaguri (Sida rhombifolia) merupakan tanaman liar yang tersebar di seluruh daerah tropis. Tanaman ini dapat mencapai tinggi 2 m (Gambar 4). Sidaguri masuk ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), ordo Malvaves, suku Malvaceae, genus Sida, spesies rhombifolia. Daun tanaman ini mengandung alkaloid, steroid, kalsium

2

oksalat, saponin, fenol dan asam amino (Khalil et al. 2006).

Gambar 4 Tanaman sidaguri.

Jati Belanda

Jati belanda (Guazuma umifolia) termasuk dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), bangsa Malvaves, suku Stercuiaceae, genus Guazuma, spesies ulmifolia. Jati belanda merupakan tanaman liar yang tingginya dapat mencapai 2,2 m (Gambar 5). Kulit batang tanaman ini mengandung glukosa dan asam damar (Wirakusumah & Setyowati 1994). Daunnya mengandung flavonoid, steroid, triterpenoid, saponin, dan tanin (Umar 2008).

Gambar 5 Tanaman jati belanda.

Sambiloto Sambiloto (Andrographis paniculata)

merupakan tanaman liar yang tingginya dapat mencapai 80 cm (Gambar 6). Tanaman ini banyak mengandung kalium dan garam natrium (Wirakusumah & Setyowati 1994).

Gambar 6 Tanaman sambiloto.

Sambiloto termasuk dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae), bangsa Scrophulariales, suku Acanthaceae, marga Andrographis, spesies paniculata.

Kedaung

Kedaung (Parkia biglobosa) merupakan tanaman liar yang tingginya dapat mencapai 45 m (Gambar 7). Biji tanaman ini mengandung glukosida, damar, tanin, dan garam-garam alkali (Wirakusumah & Setyowati 1994). Daun kedaung mengandung asam oksalat dan asam hidroksinamat (Alabi et al. 2005). Tanaman ini termasuk dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta (Angiospermae), kelas Magnoliopsida (Dicotyledonae) bangsa Fabales, suku Fabaceae, genus Parkia, spesies biglobosa.

Gambar 7 Tanaman kedaung.

Troloks

Troloks atau senyawa 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-asam karboksilat dengan bobot molekul 250,32 g/mol merupakan antioksidan sintetik (Gambar 8). Secara stuktur troloks serupa dengan α-tokoferol kecuali penggantian rantai samping hidrokarbon dengan gugus COOH. Troloks berupa bubuk berwarna putih sampai kuning dan memiliki titik leleh 189-195 °C. Senyawa ini stabil selama 2 bulan pada suhu 22-45 °C dan mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan α-tokoferol, BHA, serta BHT (Belitz 1999). Troloks sering dipergunakan sebagai standar dalam pengukuran antioksidan. Koefisien TEAC (troloks equivalent antioxidant capacity) adalah konsentrasi troloks yang memiliki kapasitas antioksidan yang ekuivalen dengan sampel yang dianalisis. Kapasitas antioksidan dari setiap metode dinyatakan dalam µmol troloks/g ekstrak etanol tanaman.

3

Gambar 8 Stuktur troloks®.

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan adalah daun dan batang dari 6 jenis tanaman obat, yaitu kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung, DPPH, Neokuproin alkoholik, TPTZ , kuersetin, asam galat, dan troloks produksi Aldrich, CuCl2·2H2O, FeCl3·6H2O, Folin-Ciocalteu, dan AlCl3 produksi Merck. Peralatan yang digunakan adalah spektrofotometer Shimadzu UV 2700.

Metode

Diagram alir penelitian ditunjukkan pada Lampiran 1. Analisis dilakukan pada ekstrak etanol dari daun kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung yang meliputi analisis kuantitatif total fenol, analisis kuantitatif total flavonoid, dan uji aktivitas antioksidan menggunakan 3 metode, yaitu CUPRAC, DPPH, dan FRAP. Preparasi Sampel

Daun dan batang tanaman dikeringkan

kemudian dihancurkan dan diayak dengan ukuran 100 mesh. Bahan ini kemudian dipergunakan untuk pengujian selanjutnya.

Penentuan Kadar Air (AOAC No 934.01 1998)

Sebanyak 1 g serbuk tanaman dimasukkan

dalam cawan porselen yang telah dikeringkan dalam oven pada suhu 105 °C selama 30 menit. Cawan porselen yang telah berisi simplisia tersebut dikeringkan dalam oven pada suhu 105 °C selama 3 jam, didinginkan dalam eksikator, lalu ditimbang bobotnya. Penimbangan dilakukan sampai diperoleh bobot tetap.

Ekstraksi Etanol (Macari et al. 2006) Serbuk tanaman dimaserasi dalam etanol

70% selama 3 x 24 jam dengan nisbah serbuk kering-etanol 1:13 (g/ml). Ekstrak dipekatkan dengan penguap putar dan dikeringkan dengan pengering beku kemudian ditimbang untuk menentukan rendemen. Analisis Kuantitatif Total Fenol (Slinkard & Singleton 1977)

Sebanyak 0,1 ml ekstrak etanol tanaman ditambahkan 3,9 ml akuades dan 0,5 ml pereaksi Folin-Ciocalteu (1:10 dalam akuades). Larutan tersebut didiamkan selama 3 menit kemudian ditambahkan 2 ml Na2CO3 20% dan diukur nilai absorbansnya pada 756,5 nm. Larutan asam galat digunakan sebagai zat untuk membuat kurva kalibrasi. Kandungan total fenol dalam ekstrak etanol diekspresikan sebagai mg asam galat ekuivalen/g serbuk kering. Analisis Kuantitatif Total Flavonoid (Pourmorad et al. 2006)

Sebanyak 0,5 ml ekstrak yang telah

diencerkan (1:10 g/ml etanol) ditambahkan 1,5 ml etanol; 0,1 ml AlCl3 10%; 0,1 ml natrium asetat 1 M; dan 2,8 ml akuades. Campuran larutan tersebut dibiarkan selama 30 menit dan diukur absorbansnya pada 417 nm. Kuersetin digunakan untuk membuat kurva kalibrasi. Kandungan total flavonoid dalam ekstrak etanol diekspresikan sebagai mg kuersetin /g serbuk kering.

Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC (Apak et al. 2007)

Sebanyak 1 ml ekstrak dilarutkan dalam

etanol 96% ditambahkan 1 ml CuCl2·2H2O 0,01 M; 1 ml neokuproin etanolik 0,0075 M; 1 ml bufer amonium asetat pH 7 1M; dan 0.1 ml akuades. Larutan didiamkan selama 30 menit dan diukur absorbansnya pada 453,4 nm. Sebagai blangko digunakan campuran larutan tanpa ekstrak. Kurva kalibrasi dibuat menggunakan larutan troloks dengan berbagai konsentrasi. Kapasitas antioksidan dinyatakan dalam µmol troloks/g serbuk kering.

Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH (Blois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005)

Sebanyak 1 ml larutan DPPH 1 mM

(dalam metanol) dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ekstrak etanol tanaman dilarutkan dalam metanol lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi hingga volume larutan tepat 5 ml. Larutan tersebut didiamkan selama 30 menit dan diukur absorbansnya pada 515,5 nm. Larutan troloks dengan berbagai konsentrasi digunakan untuk membuat kurva kalibrasi. Kapasitas antioksidan dinyatakan dalam µmol troloks/g serbuk kering.

Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode FRAP (Benzie & Strain 1996)

Pereaksi FRAP dibuat dengan campuran

bufer asetat 300 mM pH 3,6; TPTZ 10 mM dalam 40 mM HCl; dan 20 mM FeCl3·6H2O dengan nisbah 10:1:1. Sebanyak 150 µl ekstrak ditambahkan 4,5 ml pereaksi FRAP kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu 30 °C dan diukur absorbansnya pada 598 nm. Larutan troloks dengan berbagai konsentrasi digunakan untuk membuat kurva kalibrasi. Kapasitas antioksidan dinyatakan dalam µmol troloks/g serbuk kering.

Analisis Data Data hasil penelitian diolah untuk melihat

korelasi total fenol, flavonoid dan aktivitas antioksidan dengan CUPRAC, DPPH, dan FRAP. Data kemudian diolah dengan rancangan acak lengkap untuk melihat pengaruh metode pengukuran terhadap nilai aktivitas antioksidan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstrak Tanaman Semua serbuk tanaman terlebih dahulu

ditentukan kadar airnya. Pengukuran kadar air dilakukan untuk mengetahui daya simpan suatu bahan. Kadar air kedaung, kumis kucing, jati belanda, tempuyung, sambiloto, dan sidaguri secara berurut adalah 8,35; 11,34; 8,32; 10,31; 11,13; dan 6,93% (b/b) (Lampiran 2). Ekstraksi dilakukan dengan etanol karena merupakan pelarut yang aman digunakan dalam obat-obatan, sesuai dengan lisensi Badan POM. Sementara penggunaan etanol 70% didasarkan hasil penelitian Macari et al. (2006), yaitu pengujian antioksidan

tanaman obat dalam etanol 70% menunjukkan aktivitas yang tinggi dibandingkan dengan dalam konsentrasi ataupun beberapa pelarut lainnya. Sementara maserasi atau perendaman dalam pelarut tanpa adanya pemanasan bertujuan agar senyawaan yang terkandung dalam contoh tidak rusak. Proses ini dilakukan selama 3 hari kemudian dilanjutkan dengan pemekatan dan pengeringan ekstrak. Pengeringan ekstrak dilakukan dengan pengering beku pada suhu -70 °C.

Rendemen hasil ekstraksi untuk kedaung, kumis kucing, jati belanda, tempuyung, sambiloto dan sidaguri secara berurut adalah 15,13; 15,44; 14,87; 11,57; 7,11; dan 7,16% (Lampiran 3). Nilai rendemen ini berbeda untuk setiap jenis tanaman bergantung pada kandungan senyawa setiap tanaman itu sendiri.

Aktivitas Antioksidan

Metode CUPRAC

Pada metode CUPRAC (cupric ion

reducing antioxidant capacity), kompleks bis-neokuproin-tembaga(II) akan mengoksidasi senyawaan antioksidan dalam ekstrak tanaman dan mengalami reduksi membentuk kompleks bis-neokuproin-tembaga(I). Secara visual hal ini dapat dilihat dari perubahan warna kompleks larutan dari biru toska menjadi kuning. Pereaksi CUPRAC merupakan pereaksi yang selektif karena memiliki nilai potensial reduksi yang rendah, yaitu sebesar 0,17 V (Apak et al. 2007). Hasil pengukuran kapasitas antioksidan dengan metode CUPRAC ditunjukkan pada Tabel 1. Data selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 4.

Tabel 1 Kapasitas antioksidan metode

CUPRAC

Jenis Tanaman Kapasitas Antioksidan (μmol troloks/g serbuk

kering) Sidaguri 11,8879 Sambiloto 17,2824 Tempuyung 45,8327 Jati belanda 194,9299 Kumis kucing 209,4936 Kedaung 548,9904

Kapasitas antioksidan kedaung > kumis

kucing > jati belanda > tempuyung > sambiloto > sidaguri. Kedaung dari data di atas memiliki aktivitas antioksidan paling

tinggi yang diduga mengandung asam hidroksinamat (Alabi et al. 2005). Asam hidrosinamat termasuk golongan polifenol dan dapat berperan sebagai zat antioksidan karena memiliki atom hidrogen dari gugus hidroksil yang dapat disumbangkan pada radikal bebas.

Metode DPPH

Metode DPPH (2,2-difenil-1-

pikrilhidrazil) merupakan senyawa radikal nitrogen. DPPH akan mengambil atom hidrogen yang terdapat dalam suatu senyawa, misalnya senyawaan fenol. Mekanisme terjadinya reaksi DPPH ini berlangsung melalui transfer elektron. Larutan DPPH yang berwarna ungu memberikan serapan absorbans maksimum pada 515,5 nm. Larutan DPPH ini akan mengoksidasi senyawa dalam ekstrak tanaman. Proses ini ditandai dengan memudarnya warna larutan dari ungu menjadi kuning. Hasil uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dapat dilihat pada Tabel 2 sementara data selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 5.

Tabel 2 Kapasitas antioksidan metode DPPH

Jenis Tanaman Kapasitas Antioksidan (μmol troloks/g serbuk

kering)Sidaguri 17,9414 Sambiloto 16,1915 Tempuyung 71,4714 Jati belanda 126,5693 Kumis kucing 192,3260Kedaung 450,5449


kucing > jati belanda > tempuyung > sidaguri > sambiloto. Hasil pengukuran ini berbeda dengan pengukuran metode CUPRAC, yang diduga karena perbedaan pelarut dan sensitivitas metode. DPPH menggunakan pelarut metanol sehingga kemungkinan senyawa hidrofilik yang terekstrak dalam metanol lebih banyak dibandingkan dalam pelarut etanol. Metode DPPH ini mudah digunakan, cepat, cukup teliti (Prakash 2001), dan baik digunakan dalam pelarut organik, khususnya alkohol (Apak et al. 2007). Metode ini juga sensitif untuk menguji aktivitas antioksidan dalam ekstrak tanaman (Pourmorad et al. 2006). Akan tetapi, metode DPPH kurang sensitif untuk mengukur

aktivitas antioksidan selain dari senyawaan fenol (Apak et al. 2007) Metode FRAP

Pengujian aktivitas antioksidan dengan

metode FRAP (ferric reducing antioxidant power) didasarkan atas kemampuan senyawa antioksidan dalam mereduksi senyawa besi(III)-tripiridil-triazin menjadi besi(II)-tripiridil triazin pada pH 3,6. Hasil pengujian dengan FRAP ditunjukkan pada Tabel 3 sedangkan data selengkapnya di Lampiran 6. Tabel 3 Kapasitas antioksidan metode FRAP

Jenis Tanaman Kapasitas Antioksidan (μmol Troloks/g serbuk

kering) Sidaguri 3,8515 Sambiloto 5,4021 Tempuyung 10,2304 Jati belanda 14,3581 Kumis kucing 23,7300 Kedaung 90,1591


kucing > jati belanda > tempuyung > sambiloto > sidaguri. Pengukuran FRAP memberikan urutan respons yang sama dengan metode CUPRAC. Namun hasilnya menunjukkan aktivitas yang lebih kecil dibandingkan dengan data pengujian CUPRAC ataupun DPPH. Hal ini diduga karena larutan FRAP bersifat kurang stabil sehingga harus dibuat secara in time dan harus segera dipergunakan (Then et al. 2003). Menurut Ou et al. (2002), pengukuran antioksidan dengan metode FRAP dapat berjalan akurat apabila dilakukan pada senyawaan antioksidan yang bisa mereduksi Fe(III)TPTZ pada kodisi reaksi secara termodinamika dan memiliki laju reaksi yang cukup cepat. Selain itu, antioksidan yang teroksidasi dan semua produk reaksi sekundernya harus tidak memiliki serapan maksimum pada absorbansi 598 nm atau serapan Fe(II)TPTZ.

Pada kenyataannya kondisi ini sulit ditemui dan tidak realistis (Apak et al. 2007), Menurut Ou et al. (2002), hal ini disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu karena nilai potensial reduksi standar dari Fe (III)/Fe(II) adalah 0.77 V sehingga senyawa apapun dengan nilai potensial reduksi dibawah 0.77 V dapat mereduksi Fe(III) menjadi Fe(II) dan memberikan kontribusi pada pengukuran

6

antioksidan dengan metode FRAP. Selain itu, tidak semua antioksidan dapat mereduksi Fe(III) dengan waktu yang sesuai dengan waktu inkubasi. Menurut Pulido et al. (2000), absorbans dari beberapa senyawaan fenol seperti asam kafeat, asam ferulat, kuersetin, dan tanin tidak stabil dalam pengukuran FRAP karena waktu inkubasi yang dibutuhkan lebih lama dibandingkan dengan waktu inkubasi FRAP. Senyawaan antioksidan tipe-S seperti glutation juga membutuhkan waktu reaksi yang lebih lama sehingga tidak dapat diukur dengan metode FRAP (Ou et al. 2002). Penyebab lainnya, senyawaan pengganggu dapat memiliki serapan absorbans maksimum pada daerah pengukuran FRAP. Hal ini berlaku untuk contoh bahan alam yang memiliki banyak senyawa pengganggu sehingga FRAP tidak cocok untuk diaplikasikan pada contoh biologis.

Uji-F dan Uji-t

Pengukuran aktivitas antioksidan metode CUPRAC, DPPH dan FRAP pada enam tanaman obat memberikan hasil yang berbeda sehingga perlukan uji-F dan uji-t. Berdasarkan perhitungan nilai uji-F didapatkan nilai Fhitung untuk setiap jenis tanaman lebih besar dari F0,05(2,6) artinya minimal ada sepasang metode yang memberikan hasil berbeda nyata. Oleh karena itu, dilakukan uji lanjutan, yaitu uji-t yang menunjukkan bahwa setiap tanaman pada ketiga metode memberikan hasil yang berbeda nyata (Lampiran 7).

Kandungan Total Fenol Pengukuran kandungan total fenol

dilakukan dengan penambahan pereaksi Folin-Ciocalteau. Folin-Ciocalteau adalah pereaksi anorganik yang dapat membentuk larutan kompleks dengan senyawaan fenol. Warna yang terbentuk dapat dideteksi oleh sinar tampak pada panjang gelombang 756,5 nm. Senyawa fenol sebagai metabolit sekunder dalam tanaman berpotensi sebagai zat antioksidan. Hal ini disebabkan oleh keberadaan gugus hidroksil dalam senyawaan fenol. Gugus hidroksil dapat berfungsi sebagai penyumbang atom hidrogen ketika bereaksi dengan senyawa radikal melalui mekanisme transfer elektron sehingga proses oksidasi dihambat. Hasil pengukuran total fenol ditunjukkan pada Tabel 4.

Tabel 4 Kandungan Total Fenol Jenis Tanaman

Total fenol (mg as galat/

g serbuk kering) Sidaguri 4,9318 Sambiloto 5,2348 Tempuyung 12,0633 Jati belanda 20,2204 Kumis kucing 24,5345 Kedaung 57,2686 Data kandungan total fenol selengkapnya

dapat dilihat pada Lampiran 8. Dari hasil percobaan diketahui kandungan total fenol kedaung > kumis kucing > jati belanda > tempuyung > sambiloto > sidaguri. Kedaung memiliki kandungan total fenol yang paling besar di antara 5 tanaman herbal lainnya

Kandungan Total Flavonoid Kandungan total flavonoid diukur

berdasarkan keberadaan kuersetin di dalam ekstrak tanaman. Analisis kandungan flavonoid dilakukan dengan penambahan pereaksi AlCl3. Sebagai asam lewis, AlCl3 akan membentuk ikatan kompleks dengan gugus hidroksil dari senyawaan flavonoid. Perubahan ini diidentifikasi melalui absorbans pada daerah sinar tampak melalui alat spektofotometer. Semakin banyak kandungan senyawa flavonoid dalam suatu ekstrak maka secara visual warna kuning yang terbentuk akan semakin pekat. Kandungan total flavonoid dari setiap tanaman ditunjukkan pada Tabel 5. Data kandungan total flavonoid selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 9. Tabel 5 Kandungan Total Flavonoid

Jenis Tanaman Total flavonoid

(mg kuersetin/g serbuk kering)

Sidaguri 0,4153 Sambiloto 0,4598 Kumis kucing 0,6600 Tempuyung 0,7537 Kedaung 2,0835 Jati belanda 3,0480

Berdasarkan data tersebut kandungan total

flavonoid jati belanda > kedaung > tempuyung > kumis kucing > sambiloto > sidaguri. Urutan ini tidak sama dengan urutan kandungan total fenol, berarti tingginya kandungan total fenol tidak hanya disebabkan oleh golongan flavonoid. Perbedaan ini

7

kemungkinan disebabkan oleh ketidak-sensitifan metode ini dalam menguji semua golongan flavonoid. Menurut Apak et al. (2007), metode pengujian dengan menggunakan AlCl3 memiliki kekurangan. AlCl3 juga dapat mengkompleks beberapa kelompok dari flavonoid seperti flavon (krisin, apigenin, dan luteolin) dan flavonol (kuersetin, mirisetin, morin, dan rutin) tetapi tidak dapat mengkompleks golongan flavanon dan flavanonol.

Hasil Uji Korelasi Total Fenol dengan Aktivitas Antioksidan

Senyawaan fenol adalah senyawaan kimia

yang berpotensi sebagai antioksidan, tetapi aktivitas antioksidan tidak hanya disebabkan oleh senyawaan fenol. Senyawaan triterpena pentasiklik, vitamin C, zat warna seperti klorofil, senyawaan sulfur, ataupun nitrogen dapat berperan sebagai zat antioksidan (Khamsah et al. 2006). Analisis korelasi antara total fenol dan aktivitas antioksidan menggunakan metode CUPRAC, DPPH, serta FRAP bertujuan untuk menentukan kedekatan hubungan antara total fenol dan aktivitas antioksidan.

Hasil analisis korelasi ditunjukkan pada Gambar 9. Dari analisis korelasi tersebut didapatkan nilai korelasi untuk kandungan total fenol terhadap aktivitas antioksidan metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP adalah sebesar 0,995; 0,998; dan 0,978. Hal ini berarti terlihat hubungan korelasi yang positif dan kuat antara total fenol dan aktivitas antioksidan dengan ketiga metode tersebut. Dari hasil tersebut dapat dinyatakan bahwa aktivitas antioksidan disebabkan oleh kandungan total fenol dari suatu tanaman.

Keterangan:

1) sidaguri, 2) sambiloto, 3) tempuyung, 4) jati belanda, 5) kumis kucing, dan 6) kedaung.

Gambar 9 Hubungan total fenol dengan

aktivitas antioksidan (a) metode CUPRAC, (b) metode DPPH, dan (c) metode FRAP.

Total Flavonoid dengan Aktivitas Antioksidan

Senyawaan flavonoid dapat memiliki

aktivitas antioksidan sehingga dilakukan uji korelasi. Hasil korelasi ditunjukkan pada Gambar 10. Hasil uji korelasi (r) total flavonoid dengan aktivitas antioksidan metode CUPRAC, DPPH dan FRAP masing-masing sebesar 0,589; 0,495; dan 0,430. Nilai (r) ini mendekati nol sehingga dapat dinyatakan bahwa total flavonoid tidak berkorelasi dengan aktivitas antioksidan

(a)

(b)

(c)

y = 10,40x – 44,12 r = 0,995 R2= 0,989

y = 8,353x – 27,15 r = 0,998 R2= 0,996

y = 1,643x – 9,418 r = 0,978 R2= 0,956

8

Keterangan:

1)sidaguri, 2) sambiloto, 3) kumis kucing, 4)tempuyung, 5)kedaung, dan 6) jati belanda.

Gambar 10 Hubungan total flavonoid dengan

aktivitas antioksidan (a) metode CUPRAC, (b) metode DPPH, dan (c) metode FRAP.

Total Fenol dengan Total Flavonoid

Diketahui bahwa flavonoid merupakan

golongan terbesar senyawaan fenol (Subeki 1998). Dengan menghubungkan kandungan total fenol dengan kandungan flavonoid didapatkan nilai korelasi (r) sebesar 0,539 (Gambar 11). Hal ini berarti total fenol tidak

memiliki hubungan yang linear dengan total flavonoid karena nilai r mendekati nol (Mattjik dan Sumertajaya 2006). Hal ini menunjukkan bahwa untuk setiap jenis tanaman tingginya kandungan fenol dari setiap tanaman tidak selalu bersumber pada golongan flavonoid.

keterangan:

1) sidaguri, 2) sambiloto, 3) tempuyung, 4) jati belanda, 5)kumis kucing, dan 6) kedaung.

Gambar 11 Hubungan total fenol dengan total

flavonoid.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan Dari ekstrak etanol 70% 6 jenis tanaman

obat, yaitu, kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung diketahui bahwa semua tanaman tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP berbeda nyata secara statistika. Walaupun demikian metode CUPRAC dan FRAP memberikan urutan aktivitas antioksidan yang sama dari enam tanaman. Kandungan total fenol tidak memiliki memiliki korelasi dengan total flavonoidnya tetapi memiliki korelasi yang kuat dan searah dengan aktivitas antioksidannya. Kandungan total flavonoid tidak memiki korelasi dengan aktivitas antioksidan berarti aktivitas antioksidan tidak hanya bersumber dari golongan flavonoid.

Saran

Sebaiknya dilakukan penelitian lanjutan

dengan memperbanyak jumlah sampel dan populasi dari berbagai jenis tanaman obat Indonesia lainnya.

(a)

(b)

(c)

y = 0,029x + 0,619 r = 0,539 R2= 0,290

y = 13,07x + 8,456 r = 0,430 R2= 0,184

y = 74,97x + 53,11 r = 0,495 R2= 0,244

y = 111,5x + 33,42 r = 0,589 R2= 0,347

DAFTAR PUSTAKA

Alabi DA, Akinsulire OR, Sanyaolu MA. 2005. Qualitative determination of chemical and nutritional compotition of Parkia Biglobosa (Jacq) Benth. Afr J Biotechnol 4:812-815.

Apak R et al. 2007. Comparative evaluation

of various total antioxidant capacity assay applied to phenolic compounds with the CUPRAC assay. Molecules 12:1496-1547.

[AOAC] Association of Official Analytical

Chemistry. 1998. Official Methods of Analysis of AOAC International. Ed-16. Volume ke-2. Maryland: AOAC International.

Belitz HD, Grosch W. 1999. Food Chemistry.

Jerman: Springer. Benzie IFF, Strain JJ. 1996. The ferric

reducing ability of plasma (FRAP) as a measurement of ‘antioxidant power’ : the FRAP assay. Anal Biochem 239:70-76.

Femi-Ola TO, Ajibade VA, Avolabi A. 2008.

Chemical composition and termicidal properties of Parkia Biglobosa (Jacq) Benth. J Bio Sci 8:494-497.

Hanani E, Mun’im A, Sekarini R. 2005.

Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callispongia sp dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian 2:127-133.

Kamiloglu O et al. 2009. Total Phenolic and

antioxidant activity of jujube (Zyziphus Jujube Mill.) genotypes selected from turkey. Afr J Biotechol 8:302-307.

Kao MS et al. 2007. Phenolic content and

antioxidant capacities of Alabama-Grown thornless blackberries. Int J Fruit Sci 7:33-46.

Khalil NM, Sperotto JS, Manfron MP. 2006.

Anti-inflmmatory of the hydroalcoholyc extracts of leaves of Sida rhombifolia L (Malvaceae). Act Farm Bon 25:260-261.

Khamsah SM, Akowah G, Zhari I. 2006.

Antioxidant activity and phenolic content of orhosiphon stamineus Benth from different geofraphical origin. J Sust Sci Management 1:14-20.

Macari PdAT, Portela CN, Polhit AM. 2006. Antioxidant, cycotoxic, and UVB-absorbing activity of Maytenus guyanensisi Klotzch (celastaceae) bark extracts. Acta Amazonica 36:513-518.

Matkowski A. 2008. Antioxidant activity of

extracts and different solvent of Glechoma hederacea L and Orhosiphon stamineus (Benth) Kudo. Adv Clin Exp Med 17:615-624.

Miller AL. 1996. Antioxidant flavonoid:

structure, function and clinical usage. [terhubung berkala] http://public.carnet.hr/acphee/42305.pdf [ 24 Feb 09]

Ou B, et al. 2002. Analysis of antioxidant

activities of common vegetables employing oxygen radical absorbance (ORAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay: A comparative study. J Agric Food Chem 50:3122-3128.

Percival.M.1998.Antioxidants. [terhubung

berkala] http://acudoc.com/Antioxidants .pdf [19 Feb 09].

Pourmorad F, Hosseinimehr SJ, Shahabimajd

N. 2006. Antioxidant activity, phenol, and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants. Afr J Biotechnol 5:1142-1145.

Pulido R, Bravo L, Saura-Calixo F. 2000. Antioxidant Activity of dietary polyphenols as determined by modified ferric reducing antioxidant power assay. J Agric Food Chem 48:3396-3402.

Prakash A. 2001. Antioxidant activity.

Analitical progress 19:2. Slinkard, K dan Singleton VL. 1977. Total

phenol analysis: automation and comparison with manual methods. Am J Enol Victic 28:49-55.

Sriningsih et al. 2002. Analisa senyawa

golongan flavonoid herba tempuyung (Soncus Arvensis L). Pusat Teknologi Farmasi BPPT.

Subeki. 1998. Pengaruh cara pemasakan

terhadap kandungan antioksidan beberapa macam sayuran serta daya serap dan retensinya pada tikus percobaan [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor

Then M, Szentmihalyi K, Sarkőzi A, Varga IS. 2003. Examination on antioxidant activity in greater celadine (Celidonium majus L) extracts by FRAP method. Acta Bio szegediensis 47:115-117.

Umar F. 2008. Optimasi ekstraksi flavonoid

total daun jati belanda [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Wirakusumah ES, Setyowati RN. 1994. Cantik dan Bugar dengan Ramuan Nabati. Jakarta: Penebar Swadaya.

Yuwono A. 2009. Antioxidant and health

disease. [terhubung berkala] http://farmacology.org/specialistmedic/internist [ 2 Maret 2009]

11

LAMPIRAN

Lampiran 1 Bagan alir penelitian

Sampel daun atau batang tanaman

Ekstrak Etanol

Uji Total Fenol

Uji Total Flavonoid

Uji Antioksidan • Metode CUPRAC • Metode DPPH • Metode FRAP

Analisis Korelasi Total Fenol, Flavonoid dan Aktivitas Antioksidan

Preparasi Sampel Kadar Air

13

Lampiran 2 Penentuan kadar air

Jenis Tanaman Ulangan Bobot Awal (g)

Bobot Akhir (g)

Kadar Air (% [b/b])

Rerata (% [b/b])

SBR (%)

Kedaung 1 0,9991 0,9153 8,39 8,35 0,95 2 0,9980 0,9156 8,26

3 0,9988 0,9149 8,40 Sambiloto 1 0,9999 0,8874 11,25

11,13 0,97 2 0,9994 0,8886 11,09 3 1,0001 0,8896 11,05Tempuyung 1 0,9956 0,8916 10,45

10,31 1,36 2 0,9968 0,8940 10,31 3 0,9985 0,8970 10,17 Sidaguri 1 0,9934 0,9248 6,91

6,93 0,93 2 0,9978 0,9292 6,88 3 0,9988 0,9289 7,00 Kumis Kucing 1 0,9965 0,8824 11,45

11,34 1,00 2 0,9976 0,8845 11,34 3 0,9970 0,8851 11,22 Jati Belanda 1 1,0054 0,9220 8,30

8,32 0,93 2 0,9968 0,9144 8,27 3 0,9961 0,9123 8,41

# Kadar Air (%) = bobot awal – bobot akhir x 100% bobot awal Kadar Air (%) = 0,9991- 0,9153 x 100% = 8,39% 0,9991 # Simpangan Baku Rerata (%SBR) n

## Rerata (x) = ∑xi = (8,39 + 8,26 + 8,40) = 8,35% i=1 3

n n

## Standar Deviasi (s2) = ∑ (xi – x)2

i=1 n - 1

s2 = (8,39 – 8,35)2 + (8,26 – 8,35)2 + (8,40 – 8,35)2 = 0,0781

3-1 ## %SBR = s2 x 100% = 0,0781 x 100% = 0,95%

X 8,35

14

Lampiran 3 Rendemen ekstrak kering

Jenis Tanaman Ulangan Bobot Awal (g) Bobot Akhir(g) Rendemen (% [b/b])

Rerata (% [b/b])

Kedaung 1 38,4550 5,6136 15,93

15,13 2 38,4562 5,1951 14,74 3 38,4591 5,1893 14,72

Sambiloto 1 38,4556 2,4870 7,28

7,11 2 38,4535 2,1817 6,38 3 38,4602 2,6176 7,66

Tempuyung 1 38,4820 4,1194 11,94

11,57 2 38,3928 3,8977 11,32 3 38,4671 3,9503 11,45

Sidaguri 1 14,9920 0,9235 6,62

7,16 2 14,9915 1,0795 7,74 3 14,9967 0,9946 7,13

Kumis Kucing 1 38,4565 5,3340 15,64

15,44 2 38,4656 5,1490 15,10 3 38,4668 5,3107 15,57

Jati Belanda 1 38,4563 5,2043 14,76

14,87 2 38,4460 5,3240 15,11 3 38,4603 5,1988 14,74

# Rendemen (%) = bobot akhir x 100% = 5,6136 x 100% = 15,13% bobot awal x(1-kadar air) 38,4550 (1-0,0835)

15

Lampiran 4 Kapasitas antioksidan metode CUPRAC # Pembuatan Kurva kalibrasi

Larutan troloks (μM) Absorbans

25 0,049 50 0,166 75 0,276 100 0,416 150 0,692 200 1,044

Gambar Kurva standar troloks

# Pengukuran Kapasitas Antioksidan

Jenis Tanaman

Bobot Contoh (mg)

fp V-

contoh (ml)

Abs C-contoh

(μM troloks)

Kapasitas Antioksidan

(μmol troloks/g

ekstrak kering)


(μmol troloks/g

serbuk kering)

Rerata (μmol

troloks/g serbuk kering)

% SBR

Kedaung 24,8 20 25 0,91 183,0541 3690,6071 558,3889 548,9904 1,64 25,2 20 25 0,893 180,0468 3572,3577 540,4977

24,9 20 25 0,895 180,4006 3622,5025 548,0846

Kumis Kucing

25,4 20 25 0,266 69,1311 1360,8487 210,1150 209,4936 0,31 25,3 20 25 0,263 68,6004 1355,7394 209,3262

25,4 20 25 0,264 68,7773 1353,8841 209,0397

Jati Belanda

24,3 20 25 0,237 64,0010 1316,8938 195,8221 194,9299 0,59 24,5 20 25 0,236 63,8241 1302,5335 193,6867

24,3 20 25 0,236 63,8241 1313,2539 195,2809 Tempuyung 25,4 2 25 1,01 200,7440 395,1654 45,7206

45,8327 1,29 25,7 2 25 1,013 201,2747 391,5851 45,3064 25,1 2 25 1,015 201,6285 401,6504 46,4710

Sambiloto 25,2 5 25 0,156 49,6722 246,3900 17,5183 17,2824 2,36 25,2 5 25 0,156 49,6722 246,3900 17,5183

25,7 5 25 0,150 48,6108 236,4340 16,8105 Sidaguri 24,4 - 25 0,799 163,4183 167,4368 11,9885

11,8879 1,11 24,4 - 25 0,795 162,7107 166,7118 11,9366 25 - 25 0,802 163,9490 163,9490 11,7387

16

Lampiran 5 Kapasitas antioksidan metode DPPH # Pembuatan Kurva kalibrasi

Larutan troloks (μM) Absorbans Δ Absorbans Blanko 1,218 0,000

2,5 1,186 0,032 5 1,136 0,082

7,5 1,093 0,125 10 1,061 0,157

12,5 1,041 0,177 15 0,983 0,235 20 0,785 0,433 25 0,749 0,469 50 0,337 0,881

100 0,050 1,168 # Pengukuran Aktivitas Antioksidan

Jenis Tanaman

Bobot Contoh

(mg) fp

Volume contoh

(ml) Abs Δ Abs

C-contoh (μM

troloks)


(μmol troloks/g ekstrak kering)


(μmol troloks/g serbuk kering)

Rerata (μmol


% SBR

Blanko 1,218 Kedaung 25,0 50 25 0,420 0,798 59,4470 2972,3503 449,7166

450,5449 0,68 25,2 50 25 0,417 0,801 59,6936 2960,9925 447,9982 24,7 50 25 0,422 0,796 59,2826 3000,1317 453,9199

Kumis Kucing

25,0 50 25 0,835 0,383 25,3336 1266,6813 195,5756 192,3260 1,53 24,7 50 25 0,845 0,373 24,5116 1240,4665 191,5280

25,5 50 25 0,838 0,380 25,0870 1229,7561 189,8743 Jati

Belanda 24,7 40 25 0,880 0,338 21,6346 875,8941 130,2455

126,5693 2,52 25,6 40 25 0,882 0,336 21,4702 838,6790 124,7116 25,2 40 25 0,886 0,332 21,1414 838,9436 124,7509

Tempuyung

24,4 10 25 0,411 0,807 60,1868 616,6682 71,3485 71,4714 0,42 24,6 10 25 0,406 0,812 60,5978 615,8315 71,2517

25,5 10 25 0,373 0,845 63,3104 620,6907 71,8139 Sambiloto 25,3 40 25 1,071 0,147 5,9342 234,5538 16,6768

16,1915 3,85 24,6 40 25 1,078 0,140 5,3588 217,8376 15,4883 25,0 40 25 1,073 0,145 5,7698 230,7924 16,4093

Sidaguri 25,5 10 25 0,834 0,384 25,4158 249,1748 17,8409 17,9414 0,49 25,7 10 25 0,829 0,389 25,8268 251,2338 17,9883

25,2 10 25 0,835 0,383 25,3336 251,3257 17,9949

Gambar Kurva Standar troloks

17

Lampiran 6 Kapsitas antioksidan metode FRAP # Pembuatan Kurva kalibrasi

Larutan troloks (μM) Absorbans

25 0,016 50 0,06775 0,079

100 0,097150 0,264 200 0,403300 0,596

Gambar kurva kalibrasi troloks

# Pengukuran Aktivitas Antioksidan

Jenis Tanaman

Bobot Contoh (mg)

fp V-

contoh (ml)

Abs C-contoh

(μM Troloks)


(μmol troloks/g

ekstrak kering)


(μmol troloks/g

serbuk kering)

Rerata (μmol


% SBR

Kedaung 24,8 2 25 0,59 297,0818 598,9553 90,6219 90,1591 1,07 25,2 2 25 0,589 296,6294 588,5505 89,0477

24,9 2 25 0,594 298,8913 600,1833 90,8077 Kumis Kucing

25,7 - 25 0,279 155,6323 151,3933 23,3751 23,7300 1,49 25,5 - 25 0,281 156,7716 153,6976 23,7309

25,4 - 25 0,284 158,4805 155,9847 24,0840 Jati

Belanda 24,3 - 25 0,169 92,9720 95,6502 14,2232

14,3581 0,91 24,5 - 25 0,172 94,6809 96,6132 14,3664 24,3 - 25 0,172 94,6809 97,4084 14,4846

Tempuyung 25,3 - 25 0,156 85,5667 84,5521 9,7827 10,2304 3,86 24,8 - 25 0,162 88,9846 89,7022 10,3785

24,6 - 25 0,163 89,5542 91,0104 10,5299 Sambiloto 24,2 - 25 0,134 73,0347 75,4490 5,3644

5,4021 2,67 24,8 - 25 0,142 77,5918 78,2175 5,5613 24,2 - 25 0,132 71,8954 74,2721 5,2807

Sidaguri 24,4 - 25 0,05 52,8029 54,1014 3,8737 3,8515 0,50 24,4 - 25 0,049 52,3506 53,6379 3,8405

24,4 - 25 0,049 52,3506 53,6379 3,8405

y = 0,002x – 0,066 R2= 0,979

18

Lampiran 7 Uji F dan Uji t untuk metode pengukuran aktivitas antioksidan

1. Kedaung

Hipotesis: H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0 H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ Tabel analisis Ragam

Sumber Keragaman

Derajat bebas Jumlah Kuadrat

Kuadrat Tengah

F hitung F 0,05 (2,6)

Perlakuan 2 668083749,86 334041874,93 5780,02 5,143 Galat 6 346755,28 57792,55 Total 8 668430505,14

F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ # Uji t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √57792,55/3 = 138,80 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 138,80 = 480,23 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 138,80 = 496,90 Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP DPPH CUPRAC μmolTroloks/ g serbuk kering 3938,5087 19681,5917 23982,0828 Kesimpulan A B C

2. Kumis Kucing


Sumber Keragaman


Kuadrat Tengah

F hitung F 0,05 (2,6)


F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ # Uji t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √5301,88/ 3 = 42,04 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 42,04 = 145,46 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 42,04 = 150,50 Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP DPPH CUPRAC μmolTroloks/ g serbuk kering 995,4138 8067,5817 8787,7207Kesimpulan A B C

19

Lampiran 7 Uji-F dan Uji-t untuk metode pengukuran aktivitas antioksidan (lanjutan) 3. Jati Belanda


Sumber Keragaman


Kuadrat Tengah

F hitung F 0,05 (2,6)


F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ # Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √7762,16/ 3 = 50,87 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 50,87= 176,00 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 50,87 = 182,12 Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP DPPH CUPRAC μmolTroloks/ g serbuk kering 649,3428 5724,0906 8815,6943 Kesimpulan A B C

4. Tempuyung


Sumber Keragaman


Kuadrat Tengah

F hitung F 0,05 (2,6)


F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ # Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √6639,09/ 3 = 47,04 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 47,04 = 162,77 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 47,04 = 168,40 Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP CUPRAC DPPH μmolTroloks/ g serbuk kering 764,2311 3423,7997 5339,0675 Kesimpulan A B C

Lampiran 7 Uji-F dan Uji-t untuk metode pengukuran aktivitas antioksidan (lanjutan)

20

5. Sambiloto Hipotesis: H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0 H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ Tabel analisis Ragam

Sumber Keragaman


Kuadrat Tengah

F hitung F 0,05 (2,6)


F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ # Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √7519,92/ 3 = 50,07 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 50,07 = 173,23 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 50,07 = 179,25 Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP DPPH CUPRAC μmolTroloks/ g serbuk kering 1068,6293 3202,9242 3418,7241 Kesimpulan A B B

6. Sidaguri


Sumber Keragaman


Kuadrat Tengah

F hitung F 0,05 (2,6)


F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’ # Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat Hipotesis: H0 : μi =μi’ H1: μi≠μi’ Nilai kritis Duncan : SY = √KTG/r = √1926,38/ 3 = 25,34 Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,,46 x 25,34 = 87,68 Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 25,34 = 90,72 Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP CUPRAC DPPH μmolTroloks/ g serbuk kering 751,2899 2318,8902 3499,6937 Kesimpulan A B C

21

Lampiran 8 Penentuan total fenol Larutan asam galat (mg/L) Absorbans

12,5 0,058 25 0,12750 0,262

75 0,417100 0,535 150 0,801 200 1,033

Kandungan Total Fenol

Jenis Tanaman

Bobot Contoh (mg)

fp V-contoh (ml) Abs C-contoh

(mg/L)

Total fenol (mg ekuivalen as

galat/g ekstrak kering)

Total fenol (mg

ekuivalen as galat/g serbuk kering)

Rerata (mg ekuivalen as

galat/g serbuk kering)

% SBR

Kedaung 25,2 10 25 0,211 39,5936 392,7940 59,4297 57,2686 3,49 24,8 10 25 0,199 37,3020 376,0280 56,8930

25,3 10 25 0,198 37,1110 366,7096 55,4832 Kumis 24,8 - 25 0,826 157,0406 158,3071 24,4426

24,5345 0,42 Kucing 26,0 - 25 0,873 166,0163 159,6310 24,6470 25,6 - 25 0,855 162,5788 158,7684 24,5138 Jati 24,8 - 25 0,711 135,0790 136,1684 20,2482

20,2204 0,29 Belanda 25,1 - 25 0,720 136,7977 136,2527 20,2608 25,2 - 25 0,719 136,6068 135,5226 20,1522 Tempuyung 24,9 - 25 0,549 104,1417 104,5600 12,0976

12,0633 0,37 24,8 - 25 0,543 102,9959 103,8265 12,0127 24,8 - 25 0,546 103,5688 104,4041 12,0796

Sambiloto 24,7 - 25 0,380 71,8677 72,7406 5,1719 5,2348 1,04 24,7 - 25 0,387 73,2045 74,0936 5,2681

26,2 - 25 0,410 77,5968 74,0428 5,2644 Sidaguri 25,6 - 25 0,369 69,7670 68,1318 4,8782

4,9318 0,97 24,9 - 25 0,364 68,8122 69,0885 4,9467 25,4 - 25 0,373 70,5309 69,4202 4,9705

Konsentrasi contoh ekuivalen dengan asam galat y = 0,0052x + 0,0037 0,211 = 0,0052x + 0,0037 x = 39,5936 mg/L Total fenol = Vcontoh (l)x Ccontoh(mg/l) x fp

Bobot Contoh (g) Total fenol = 25 ml x 39,5936 mg/l x 10 x 10¯ ³l/ml

25,2 mg x 10¯ ³ g/mg Total fenol = 392,7940 mg ekuivalen as,galat/ g ekstrak kering

Total fenol = 392,7940 mg ekuivalen as,galat/ g ekstrak kering x rendemen Total fenol = 392,7940 mg ekuivalen as,galat x 1g ekstrak kering

g ekstrak kering (1/0,1513) g serbuk kering Total fenol = 59,4229 mg ekuivalen as,galat/ g serbuk kering

y = 0.0052x + 0.0037R2 = 0.9985

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 50 100 150 200 250

mg/L asam galat

Abs

orba

nsi

Gambar Kurva Standar Asam Galat

y = 0,0052x + 0,0037 R2= 0,9985

22

Lampiran 9 Kandungan total flavonoid Larutan Kuersetin

(mg/L) Absorbans

3,125 0,022 6,25 0,042 12,5 0,091

25 0,187 50 0,402 75 0,605

100 0,798 Kandungan Total Flavonoid

Jenis Tanaman

Bobot Contoh

(mg)

V-contoh

(ml) Abs C-contoh

(mg/L)

Total flavonoid (mg

kuersetin/g ekstrak kering)

Total flavonoid (mg

kuersetin/g serbuk kering)

Rerata (mg kuersetin/g

serbuk kering)

% SBR

Kedaung 25 25 0,103 13,6990 13,6990 2,0727 2,0835 1,26 25,1 25 0,103 13,6990 13,6444 2,0644

25,4 25 0,107 14,1926 13,9691 2,1135 Kumis Kucing 25,8 25 0,029 4,5667 4,4251 0,6832

0,6600 3,06 24,9 25 0,026 4,1965 4,2133 0,6505 25,8 25 0,027 4,3199 4,1859 0,6463 Jati Belanda 25,6 25 0,160 20,7333 20,2474 3,0108

3,0480 2,37 24,3 25 0,151 19,6227 20,1879 3,0019 25,2 25 0,164 21,2270 21,0585 3,1314 Tempuyung 24,4 25 0,044 6,4178 6,5757 0,7608

0,7537 1,02 24,6 25 0,044 6,4178 6,5222 0,7546 24,9 25 0,044 6,4178 6,4436 0,7455

Sambiloto 24,6 25 0,044 6,4178 6,5222 0,4637 0,4598 1,08 25,6 25 0,045 6,5413 6,3879 0,4542

25,2 25 0,045 6,5413 6,4893 0,4614 Sidaguri 25,5 25 0,040 5,9242 5,8080 0,4159

0,4153 1,50 25,7 25 0,041 6,0476 5,8829 0,4212 25,4 25 0,039 5,8008 5,7094 0,4088

y = 0.0081x - 0.008R2 = 0.9997

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 20 40 60 80 100 120

mg/L kuersetin

Abs

orba

nsi

Gambar Kurva standar kuersetin

y = 0,0081x – 0,008 R2= 0,9997

23

Documents

Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode Cuprac ... · dalam penelitiannya menyatakan bahwa ... seperti asam ursolat, asam betulinat, dan asam oleat yang terdapat dalam Orthosiphon