TUGAS IMMUNOSEROLOGI

MAKALAH TENTANG INTERLEUKIN

JUDUL : “Peningkatan ekspresi interleukin 17 pada penyakit radang usus”

Disusun oleh :

VERA NURTRIANA

G1C212013

PROGRAM STUDI D IV ANALIS KESEHATAN

FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG

2013

Peningkatan ekspresi interleukin 17 pada penyakit radang ususPenelitian ini berasal dari Jepang Universitas Ilmu Kedokteran, Seta-Tukinowa yang telah dilaksanakan oleh :

S Fujino , Andoh A , S Bamba , A Ogawa , K Hata , Y Araki , T Bamba  dan Y Fujiyama

A. Latar belakang dari penelitian Interleukin (IL) 17 adalah sitokin yang diberikannya kegiatan proinflamasi yang

kuat. Dalam penelitian ini kami mengevaluasi perubahan dalam IL-17 ekspresi dalam mukosa meradang dan dalam serum pasien dengan penyakit inflamasi usus (IBD).

Penyakit radang usus (IBD) seperti kolitis ulserativa (UC) dan penyakit Crohn (CD) yang ditandai dengan suar berulang peradangan dan sejarah enterocolitis kronis. Aktivasi sel T dan monosit / makrofag dianggap sebagai faktor penting dalam patogenesis IBD. Interleukin Manusia 17 (IL-17) adalah ~ 20 kDa glikoprotein dari 155 asam amino, dengan homologi urutan dekat dengan murine, IL-17 awalnya diidentifikasi sebagai antigen sitotoksik limfosit T terkait 8, dan virus IL-17, kerangka baca terbuka . 13 T Herpes saimiri lymphotropic  IL-17 sekresi telah dilaporkan dibatasi dalam limfosit T, terutama dalam memori CD45RO +sel. Baru-baru ini, telah dilaporkan bahwa IL-17F, anggota dari IL -17 keluarga, disekresikan oleh garis keturunan monosit / makrofag.  Sebaliknya, reseptor IL-17 secara luas didistribusikan pada berbagai jenis sel. Ada semakin banyak bukti bahwa IL-17 merupakan mediator potensial respon inflamasi pada berbagai jaringan . Sebagai contoh, IL-17 menginduksi beberapa gen yang terkait dengan peradangan, termasuk IL-6, granulocyte / makrofag-koloni merangsang faktor, faktor penghambat leukemia, dan molekul adhesi interseluler 1. Selain itu, IL-17 meningkatkan respon proinflamasi diinduksi oleh IL-1β dan tumor necrosis factor α (TNF-α).

IL-17 telah terlibat dalam gangguan inflamasi beberapa, seperti rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, sclerosis sistemik, lupus eritematosus sistemik, psoriasis, Helicobacter pylorigastritis terkait, asma bronkial, dan penolakan allograft ginjal.  Namun, peran patofisiologi IL-17 di IBD masih belum jelas. Dalam penelitian ini kami meneliti IL-17 ekspresi pada pasien IBD. Hasil kami memberikan bukti bahwa IL-17 yang lebih dinyatakan dalam mukosa yang meradang IBD dan karena itu dapat berperan dalam patofisiologi IBD.

B. Tujuan dari penelitianTujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui perubahan dalam IL-17

ekspresi dalam mukosa meradang dan dalam serum pasien dengan penyakit inflamasi usus (IBD).

C. Landasan teori1. Enzim terkait immunosorbent assay (ELISA) untuk manusia IL-17

Serum IL-17 tingkat ditentukan oleh enzim terkait uji kit (ELISA) immunosorbent untuk IL-17 manusia yang dibeli dari BioSource International (Camarillo, California, USA). Batas deteksi yang lebih rendah ELISA adalah 9

pg / ml untuk IL-17. Sampel serum dari 29 pasien dengan UC (15 aktif, aktif 14) dan 32 pasien dengan CD (15 aktif, aktif 17) dievaluasi. Kelompok kontrol terdiri dari 20 orang sehat yang tidak memiliki riwayat keluarga gangguan dimediasi IBD dan non-imun, atau 12 pasien dengan non-IBD penyakit diare. Darah vena Seluruh diperoleh, dan serum dipisahkan setelah pembekuan dengan sentrifugasi. Aliquot kemudian dibawa dan disimpan pada -80 ° C sampai tes dilakukan. Sampel diencerkan dengan PBS yang mengandung 0,1% Tween 20, dan prosedur dilakukan sesuai dengan petunjuk yang diberikan oleh BioSource.

2. Isolasi sel T perifer dan monosit / makrofag

Monosit manusia, positif untuk anti-CD68, dan sel T, positif untuk anti-

CD3, diisolasi dari darah perifer oleh FACS pandang (Becton Dickinson,

Mountain View, California, USA). Kemurnian penduduk masing-masing adalah

95-98%.Sel T dan monosit distimulasi dengan 50 ng / ml IL-2 (R & D Systems,

Minneapolis, Minnesota, USA) atau 100 ng / ml lipopolisakarida (Sigma-Aldrich

Jepang, Tokyo, Jepang), masing-masing.

3. Transkripsi terbalik-polymerase chain reaction (RT-PCR) untuk manusia

IL-17

Untuk mengkonfirmasi IL-17 ekspresi dalam monosit perifer manusia dan

sel T, kami melakukan analisis RT-PCR. IL-17 ekspresi mRNA di mukosa juga

dievaluasi oleh RT-PCR.Jumlah selular RNA diisolasi oleh asam guanidium

metode tiosianat-fenol-kloroform (AGPC). Untuk setiap sampel, untai pertama

cDNA ini disintesis menggunakan 0,5 ug RNA total selular dengan oligo (dT)

primer dan Superscript II reverse transcriptase (Gibco BRL, Rockville, Maryland,

USA). Sampel cDNA (1 ml) diamplifikasi dalam 25 ml dari campuran reaksi

yang mengandung 10 × Taq buffer (Perkin Elmer Cetus Corp, Norwalk,

Connecticut, USA), 1,5 mMMgCl2, 0,1 pM masing-masing 5 `dan 3` primer , dan 1

U polimerase TaqGold (Perkin Elmer Cetus-). PCR dilakukan dalam pengendara

sepeda termal (Model GeneAmp 2400, Perkin Elmer Cetus-) selama 35 siklus (94

° C selama 30 detik, 55 ° C selama 30 detik, dan 72 ° C selama 40 detik), diikuti

oleh perpanjangan delapan menit pada 72 ° C. Produk PCR (5 ml) menjadi

sasaran elektroforesis pada gel agarosa 1,5% dan diwarnai dengan 0,5 mg / ml

ethidium bromida. A 100 bp DNA ladder (Gibco BRL) digunakan sebagai

penanda. Primer spesifik untuk gen IL-17 manusia dibangun menurut data urutan

yang dipublikasikan  : 5 `-AGA GAT ATC CCT CTG TG ATC-3 ', 5`-TAC CCC

AAA GTT ATC TCA GG-3 `. Produk PCR diligasi ke vektor kloning TA

(Promega, Madison, Wisconsin, USA) dan sekuensing dengan metode terminasi

rantai dideoxynucleotide. 

D. Metode pemeriksaan dan Analisa

Diagnosis UC dan CD didasarkan pada kriteria klinis, endoskopi, dan

histopatologi konvensional. Spesimen bedah atau biopsi berasal dari daerah yang

terlibat dari usus besar dengan UC (n = 20) dan CD (n = 20) diperoleh dengan

informed consent. Penyakit aktivitas pada pasien UC dievaluasi sesuai dengan indeks

aktivitas penyakit UC dan pada pasien CD ditentukan oleh indeks aktivitas CD. 

Semua pasien IBD diobati dengan salisilat tetapi tidak diperlakukan dengan agen

imunosupresif (misalnya, azathioprine) . Biopsi sampel berasal dari kolitis infeksi (n

= 5) dan kolitis iskemik (n = 8) diperoleh dengan kolonoskopi.Jaringan kolorektal

normal juga diperoleh (n = 15).

Pemeriksaan secara immunohistokimia,Sampel difiksasi dengan 10% buffered

formalin, dehidrasi dalam etanol, dan ditanam dalam parafin. Bagian (4 pM) yang

pretreated dengan merebusnya dalam buffer sitrat (pH 6.1) dalam microwave (700 W,

satu menit). Setelah pendinginan, non-spesifik mengikat diblokir dengan pereaksi

Dako memblokir (# X0909, Dako Jepang, Kyoto, Jepang) diikuti oleh inkubasi

dengan antibodi poliklonal kambing IL-17 antihuman (diencerkan 1:100 fosfat

buffered saline (PBS) yang mengandung 5% susu skim, Santa Cruz Bioteknologi,

Santa Cruz, California, USA) selama 48 jam pada suhu 4 ° C dalam ruang

lembab. Sebagai kontrol negatif, bagian diinkubasi dengan IgG kambing normal

(Santa Cruz Biotechnology). Setelah inkubasi dengan antibodi primer, bagian

direaksikan dengan 0,1% H 2 O 2 dalam 0,1 M PBS dan diperlakukan dengan biotin

kelinci antigoat terkonjugasi IgG (diencerkan 1:02 di PBS yang mengandung susu

skim 1%, Vector, Burlingame, California, USA) selama 60 menit pada suhu kamar

dan diikuti oleh avidin-biotin peroksidase-kompleks (Vector). Aktivitas peroksidase

yang divisualisasikan menggunakan diaminobenzidine.

Untuk pewarnaan ganda dengan anti-IL-17 ditambah anti-CD3 dan / atau anti-IL-

17 ditambah anti-CD68, pretreatment slide deparaffinised dilakukan seperti dijelaskan

di atas. Antibodi anti-IL-17 (diencerkan 1:100) diaplikasikan pertama dan diinkubasi

selama 48 jam pada suhu 4 ° C dalam ruang lembab. Selanjutnya, mouse monoklonal

antihuman CD3 atau CD68 (diencerkan 1:100 di PBS yang mengandung susu skim

5%, Novocastra, Dossenheim, Jerman) diaplikasikan dalam semalam pada suhu 4 °

C. Texas merah berlabel antigoat IgG (diencerkan 1:500 di PBS yang mengandung

1% susu skim dan X100 Triton 0,1%, Rockland, Gilbertsville, Pennsylvania, USA)

dan isothiocyanate fluorescein (FITC) berlabel kuda antimouse IgG (diencerkan

1:500, Vector) adalah diterapkan untuk 120 menit pada suhu kamar. Gambar yang

diperoleh oleh sistem laser scanning confocal digital MRC-600 (Bio Rad, Hercules,

California, USA). Kambing normal atau IgG digunakan sebagai kontrol negatif.

E. Hasil dan PembahasanUntuk mengevaluasi ekspresi IL-17 protein dalam, spesimen biopsi mukosa dan /

atau pembedahan sampel resected diwarnai dengan anti-IL-17 antibodi. Seperti yang ditunjukkan pada gambar 1, tidak ada sel IL-17 + dalam mukosa kolon normal atau dalam sampel dari kolitis iskemik. Demikian pula, dalam kolitis infeksi tidak ada immunostaining untuk IL-17 (data tidak ditampilkan). Sebaliknya, peningkatan yang ditandai dalam IL-17 + sel terlihat di wilayah meradang aktif UC dan pasien CD. Secara khusus, IL-17 + sel meningkat tajam dalam sampel dari pasien CD

aktif. Pada pasien UC aktif, IL-17 + sel terletak terutama dalam lamina propria tetapi pada pasien CD aktif sel-sel yang tersebar di seluruh submucosa dan propria muskularis. Seperti ditunjukkan pada gambar 2, jumlah IL-17 + sel secara signifikan meningkat pada pasien IBD aktif. Secara khusus, jumlah IL-17 + sel secara signifikan meningkat pada pasien CD aktif dibandingkan dengan pasien UC aktif. Jumlah IL-17 + sel menurun pada sampel dari pasien IBD aktif dibandingkan dengan pasien IBD aktif

Jumlah interleukin 17 (IL-17) sel positif dalam mukosa. Hasil dinyatakan sebagai jumlah sel positif per lapangan (× 400). Margin bawah dan atas kotak mewakili persentil ke-25 dan ke-75, dengan lengan diperpanjang mewakili persentil ke-10 dan ke-90, masing-masing.Median ditampilkan sebagai garis horizontal dalam kotak. UC kolitis, ulserativa, CD, penyakit Crohn.

Untuk mengkonfirmasi asal seluler IL-17 pada pasien IBD, sampel dari pasien CD dan UC aktif yang ganda diwarnai dengan fluoresensi berlabel anti-CD3 (khusus untuk sel T), anti-CD68 (khusus untuk monosit / makrofag), dan anti- IL-17 antibodi (gambar 3). Dalam sampel dari pasien CD (ara 3A-F), ada banyak sel ganda positif (kuning) untuk CD68/IL-17 (ara 3F) serta untuk CD3/IL-17 (ara 3C). Hal ini menunjukkan bahwa monosit / makrofag dan sel T merupakan sumber IL-17 dalam mukosa meradang pasien CD. Pola pewarnaan yang sama juga diamati pada sampel dari pasien UC (ara 3G-L). Ada sel positif ganda untuk CD3/IL-17 (ara 3I) dan CD68 / IL-17

Transkripsi terbalik-polymerase chain reaction (RT-PCR) analisis interleukin 17 (IL-17) ekspresi mRNA. Dimurnikan T sel dirangsang oleh interleukin 2 selama tiga jam, dan dimurnikan monosit / makrofag dirangsang oleh lipopolisakarida selama tiga jam. Jumlah selular RNA diekstraksi dengan metode tiosianat-fenol-kloroform guanidium asam (AGPC) dan IL-17 ekspresi mRNA dievaluasi oleh RT-PCR analisis. Demikian pula, IL-17 ekspresi mRNA diselidiki dalam sampel mukosa dari individu normal dan pada penyakit aktif Crohn (CD) dan kolitis ulserativa (UC) pasien. Kami mengevaluasi IL-17 serum pada pasien IBD. Seperti ditunjukkan pada gambar 5, IL-17 tidak terdeteksi dalam serum dari orang normal, atau kolitis infeksi atau kolitis iskemik. Serum IL-17 secara signifikan meningkat pada pasien dengan aktif UC dan pasien CD dibandingkan dengan orang yang sehat. Secara khusus, IL-17 tingkat yang nyata meningkat pada pasien CD aktif.

Interleukin serum 17 (IL-17) tingkat pada pasien dengan penyakit inflamasi usus. IL-17 tingkat ditentukan oleh ELISA untuk IL-17 manusia yang dibeli dari Sumber Bio International (Camarillo, California, USA). 

Batas bawah ELISA adalah 9 pg / ml IL-17. Margin bawah dan atas kotak mewakili persentil ke-25 dan ke-75, dengan lengan diperpanjang mewakili persentil ke-10 dan ke-90, masing-masing. Median ditampilkan sebagai garis horizontal dalam kotak. UC kolitis, ulserativa, CD, penyakit Crohn.Respon imun diubah telah terlibat dalam patogenesis IBD. Banyak penelitian menangani patogenesis IBD telah berfokus pada sekresi sitokin gangguan mukosa. Misalnya, semakin banyak penelitian telah melaporkan peningkatan konsentrasi mukosa sitokin proinflamasi dan kemokin, termasuk IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16, IL-18, interferon γ, dan lain-lain.

IL-17 terutama berasal dari sel T diaktifkan. . laporan terbaru menunjukkan bahwa IL-17F, anggota keluarga IL-17, yang disekresi oleh monosit / makrofag  IL-17 merangsang ekspresi dan produksi sitokin proinflamasi dalam sel manusia,  dan sifat proinflamasi IL-17 tergantung pada aktivasi kB faktor transkripsi faktor nuklir.  Infiltrasi sejumlah besar sel T dan monosit / makrofag ke dalam mukosa meradang telah dijelaskan pada pasien IBD tetapi peran IL-17 sekresi oleh sel inflamasi belum diselidiki. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi kemungkinan bahwa IL-17 aktivitas meningkat pada pasien dengan IBD. IL-17 sekresi awalnya diselidiki dalam mukosa meradang pasien IBD dengan teknik imunohistokimia. Jumlah IL-17 + sel secara signifikan meningkat pada mukosa yang meradang IBD. Secara khusus, jumlah IL-17 + sel meningkat pada lesi aktif pasien CD.Pewarnaan ganda baik menggunakan anti-CD3 atau anti-CD68 dengan anti-IL-17 antibodi mengungkapkan bahwa sel T dan monosit / makrofag adalah sumber lokal IL-17 dalam mukosa yang meradang IBD pasien. Sesuai dengan sifat biologis IL-17, hasil kami menunjukkan bahwa IL-17 berasal dari sel T diaktifkan dan monosit / makrofag bisa terlibat dalam induksi dan ketekunan respon inflamasi mukosa di IBD.

Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa sitokin proinflamasi beberapa meningkat dalam sera pasien IBD. Misalnya, di ketinggian pasien IBD di tingkat serum IL-6, TNF-α, CC-kemokin eotaksin, dan faktor penghambat makrofag telah dilaporkan. Elevation sitokin proinflamasi dianggap berhubungan dengan keparahan peradangan usus . Dalam studi ini, kami menunjukkan peningkatan yang signifikan serum-17 IL tingkat pada pasien IBD aktif.Khususnya, serum IL-17 tingkat secara signifikan lebih tinggi pada pasien CD aktif dibandingkan pada pasien UC aktif. Hasil ini kompatibel dengan pengamatan imunohistokimia menunjukkan bahwa jumlah IL-17 + sel lebih besar dalam mukosa meradang pasien CD aktif dibandingkan dengan pasien UC. Sehubungan dengan studi tentang hubungan antara serum-17 IL tingkat dan aktivitas penyakit, laporan sebelumnya , menemukan bahwa serum IL-17 tingkat yang diubah sesuai dengan aktivitas penyakit.Kegunaan serum IL-17 dalam memperkirakan aktivitas penyakit IBD pasien masih belum jelas. Penelitian lebih lanjut yang melibatkan lebih banyak pasien akan memperjelas kegunaannya pada pasien IBD.

Sebagai kesimpulan, kami telah menunjukkan bahwa IL-17 mukosa ekspresi dan serum IL-17 tingkat yang meningkat pada pasien IBD aktif. Hasil ini menunjukkan bahwa IL-17 mungkin memainkan peran penting dalam patofisiologi pasien IBD. Penelitian lebih lanjut dalam jumlah besar pasien IBD diperlukan untuk menentukan mekanisme yang terlibat dalam sekresi mukosa peningkatan IL-17 dan peran imunologi dari IL-17 di IBD.

F. Kesimpulan

IL-17 ekspresi di mukosa dan serum meningkat pada pasien IBD. Sangat

mungkin bahwa IL-17 ekspresi dalam IBD dapat dikaitkan dengan respon kekebalan

dan inflamasi diubah dalam mukosa usus.

Penyakit radang usus (IBD) seperti kolitis ulserativa (UC) dan penyakit Crohn

(CD) yang ditandai dengan suar berulang peradangan dan sejarah enterocolitis

kronis. Aktivasi sel T dan monosit / makrofag dianggap sebagai faktor penting dalam

patogenesis IBD. 

Interleukin Manusia 17 (IL-17) adalah ~ 20 kDa glikoprotein dari 155 asam

amino, dengan homologi urutan dekat dengan murine, IL-17 awalnya diidentifikasi

sebagai antigen sitotoksik limfosit T terkait 8, dan virus IL-17, kerangka baca

terbuka . 13 T Herpes saimiri lymphotropic  IL-17 sekresi telah dilaporkan dibatasi

dalam limfosit T, terutama dalam memori CD45RO +sel.  Baru-baru ini, telah

dilaporkan bahwa IL-17F, anggota dari IL -17 keluarga, disekresikan oleh garis

keturunan monosit / makrofag.  Sebaliknya, reseptor IL-17 secara luas didistribusikan

pada berbagai jenis sel.  Ada semakin banyak bukti bahwa IL-17 merupakan mediator

potensial respon inflamasi pada berbagai jaringan . Sebagai contoh, IL-17

menginduksi beberapa gen yang terkait dengan peradangan, termasuk IL-6,

granulocyte / makrofag-koloni merangsang faktor, faktor penghambat leukemia, dan

molekul adhesi interseluler 1.  Selain itu, IL-17 meningkatkan respon proinflamasi

diinduksi oleh IL-1β dan tumor necrosis factor α (TNF-α). 

IL-17 telah terlibat dalam gangguan inflamasi beberapa, seperti rheumatoid

arthritis, multiple sclerosis, sclerosis sistemik, lupus eritematosus sistemik,

psoriasis, Helicobacter pylorigastritis terkait, asma bronkial, dan penolakan allograft

ginjal. Namun, peran patofisiologi IL-17 di IBD masih belum jelas. Dalam penelitian

ini kami meneliti IL-17 ekspresi pada pasien IBD. Hasil kami memberikan bukti

bahwa IL-17 yang lebih dinyatakan dalam mukosa yang meradang IBD dan karena itu

dapat berperan dalam patofisiologi IBD.