PENUNTUN PRAKTIKUM DASAR BIOTEKNOLOGI

TANAMAN

Disusun oleh:

Dr. Ir. Sukendah, MSc.

Dr. Ir. Pangesti Nugrahani., MSi.

Dr. Ir.. Makhziah, MP.

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI, FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN” JAWA TIMUR

2017

UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN” JATIM FAKULTAS PERTANIAN

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

Nama Mahasiswa : ……………………………………………………

N P M : ……………………………………………………

Gol / Kelompok : ……………………………………………………

Nilai Akhir : ……………………………………………………

KARTU TANDA PESERTA PRAKTIKUM

No

Materi Praktikum Tanggal Nilai

Praktikum Laporan Aktifitas Laporan

I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

X

XI

XII

Mengetahui, Pembimbing Praktikum, Ka. Lab. Bioteknologi

.................................... ...........................................

KATA PENGANTAR

Puji syukur dipanjatkan ke hadirat ALLAH SWT, karena tim penyusun telah

menyelesaikan penuntun Praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman. Penuntun Praktikum

ini disusun dengan tujuan sebagai pegangan dan membantu mahasiwa melakukan

praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman.

Praktikum Dasar Bioteknologi Tanaman ini memberi bekal kepada mahasiswa

kemampuan teknik in vitro dan molekuler khususnya untuk isolasi DNA. Setelah ini

mahasiswa diharapkan terampil dalam berbagai mata praktikum ini, antara lain:

membangun tanaman kultur in vitro, mulptiplikasi dan aklimatisasi anggrek komersial,

Mikroprogasi tanaman melalui organogenesis tidak langsung, membuat benih sintetis

enkapsulasi dan isolasi DNA tanaman.

Tim penyusun menyampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah

memberi motivasi, dorongan dan bantuan dalam penyediaan referensi dalam penulisan

penuntun praktikum ini.

Saran dan tanggapan guna kesempurnaan materi dalam penuntun praktikum ini

sangat diharapkan. Semoga penuntun praktikum ini dapat membantu dan bermanfaat

bagi pihak yang membutuhkannya. Terima kasih.

Surabaya, Februari 2017

Tim Penyusun

DAFTAR ISI

Halaman

Kata Pengantar…………………………………………………………............

Daftar Isi ......................................................................................................

i

ii

Terminologi .................................................................................................

iii

Persyaratan Laboratorium ...........................................................................

iv

I

Pengenalan Peralatan dan Bahan ..............................................................

1

II

Sterilisasi ....................................................................................................

3

III

Membuat Larutan Stok Unsur Hara ............................................................

7

IV

Membuat Media Tanam MS .......................................................................

11

V

Propagasi Tanaman In Vitro ......................................................................

13

VI

Multiplikasi dan Aklimatisasi Anggrek .........................................................

18

VII

Organogenesis ...........................................................................................

23

VIII

Enkapsulasi Benih Sintetis .........................................................................

26

IX

Isolasi DNA Tanaman..................................................................................

29

Daftar Pustaka ............................................................................................

33

3

TERMINOLOGI

1. Aseptik Bebas dari mikroorganisme kontaminan

2. Kalus Masa sel yang tidak berdiferensiasi membentuk organ dan

terbentuk karena pengaruh hormon tanaman pada level tertentu

3. Etiolasi Tanaman yang memanjang dan berwarna kuning karena

kekurangan atau tidak menerima cahaya

4. Eksplan Bagian dari tanaman yang digunakan sebagai sumber bahan

tanam in vitro

5. Embriogenesis Embryogenesis adalah proses pembentukan dan

perkembangan embrio sampai menjadi biji yang siap untuk

berkecambah

6. BAP 6-Benzylaminopurine, salah satu hormon tanaman yang

digunakan untuk menstimulasi dan pembentukan tunas

7. IAA Indoleacetic acid, hormon tanaman untuk meningkatkan

perpanjangan sel di bawah kondisi tertentu. Implikasi dari IAA

adalah menstimulasi pembelahan sel dan pembentukan akar

8. IBA indole-3-butyric acid, salah satu auksin endogen

9. In Vitro "di dalam kaca" adalah istilah yang dipakai untuk menyebutkan

kultur suatu sel, jaringan, atau bagian organ tertentu di dalam

laboratorium

10. NAA 1-Naphthalene acetic acid adalah salah satu auksin sintetik

11. Organogenesis Kemampuan sel atau bagian tanaman untuk membentuk organ

12. Totipotensi Kemampuan untuk membentuk tanaman utuh dari bagian kecil

tanaman (sel, jaringan, organ)

13. 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), salah satu sintetik

auksin yang sangat kuat

iv

v

PERSYARATAN LABORATORIUM

Ruangan Laboratorium

- Laboratorium Bioteknologi Tanaman mempunyai ruangan-ruangan

khusus yang terpisah antara satu dan lainnya dengan tujuan tertentu,

misalnya ruangan untuk persiapan media dan sterilisasi, ruangan

untuk tanam dan ruangan untuk penumbuhan.

- Laboratorium Bioteknologi Tanaman juga dilengkapi dengan

peralatan molekuler untuk isolasi DNA tanaman. Ruangan untuk

isolasi DNA masih menjadi satu dengan ruangan persiapan media

dan sterilisasi.

.

Glassware (peralatan gelas)

- Penggunaan glassware hanya untuk kepentingan kultur jaringan,

bukan untuk penggunaan di lapang atau eksperimen lainnya. Bahan-

bahan logam beracun akan terabsorbsi dalam glassware dan bisa

menjadi problem untuk kultur in vitro

- Cuci glassware dengan detergen kemudian bilas dengan air kran

- Sebelum digunakan bilas glassware dengan air aquadest

Air Aquadest

- Gunakan air aquadest untuk semua prosedur kultur in vitro.

Sebaiknya tidak menyimpan air kran karena bisa menjadi sumber

kontaminan.

- Untuk keperluan sterilisasi dan inokulasi eksplan gunakan air aquadest

steril.

Bahan Tanam-Eksplan

- Tanaman yang digunakan untuk kultur in vitro harus sehat dan

sedang aktif tumbuh. Tanaman yang sedang stres terutama stres air

biasanya tidak akan tumbuh dalam in vitro.

- Tanaman untuk sumber eksplan sebaiknya yang bebas hama dan

penyakit serta kontaminan lainnya. Sebaiknya diperlakukan lebih

vi

dulu dengan meletakkan di green house yang relatif steril atau

disemprot dengan pestisida

- Untuk mendapatkan eksplan yang steril bisa dengan menggunakan

benih yang dikecambahkan secara in vitro

Teknik Aseptik

Yang paling penting untuk teknik aseptik adalah mencegah

serangan mikroorganisme (kontaminan) selama proses pengkulturan.

Bahan tanam (eksplan), peralatan, botol kultur, dan media harus dalam

kondisi steril.

Media dan peralatan bisa disterilkan dengan autoklaf tekanan 15

lbs/inch2 (121°C) selama15 menit.

Bahan-bahan hormon yang sangat labil terhadap suhu panas

seperti GA3 disterilkan dengan filter sterilization

Inokulasi dan subkultur dilakukan di d a l a m laminar a i r flow cabinet

yang dilengkapi dengan penyaring udara sehingga mikroorganisme tidak

bisa masuk.

Bahan yang dapat digunakan untuk sterilisasi adalah etil alkohol,

HgCl, NaOCl

1

I. PENGENALAN PERALATAN DAN BAHAN

Pendahuluan

Kegiatan yang dilakukan di dalam Laboratorium Bioteknologi dilakukan

dengan menggunakan berbagai beralatan. Peralatan tersebut dapat digolongkan

menjadi peralatan sterilisasi, dissecting kit, peralatan inokulasi, perlatan ukur dan

glass ware (peralatan gelas).

Jenis peralatan yang diperlukan dari suatu laboratorium kultur jaringan

umumnya adalah sebagai berikut:

1. Hot plate/magnetic stirrer

2. Peralatan gelas (gelas ukur, erlenmeyer)

3. Peralatan stainless steel untuk memanaskan dan melarutkan media

4. Alat sterilisasi dengan tekanan uap (autoclave)

5. pH meter

6. Timbangan (analitical)

7. Gelas ukur gradual

8. Botol kultur dengan penutupnya

9. Dispenser

10. Alat diseksi (spatula, scalpel, pinset, gunting)

11. Refrigerator

12. Distiling unit atau water deionizer

13. Oven

14. Microwave

15. Mikroskop

16. Pipet ukur

17. Shaker

18. Laminar air flow

Peralatan gelas yang digunakan di lab kultur jaringan umumnya terbuat

dari Pyrex. Erlenmeyer dari berbagai ukuran (50, 125, 250, 500, 1000 atau 2000

ml) digunakan untuk wadah kultur dan pembuatan media. Tabung gelas, cawan

petri, botol jam atau bekas selai juga sering digunakan sebagai botol kultur.

Peralatan gelas tesebut harus tahan panas selama proses sterilisasi dengan

oven atau autoclave. Peralatan gelas lain yang biasanya digunakan adalah gelas

piala, gelas ukur, pipet dan labu ukur.

2

Bahan kimia dan bahan sterilisasi, merupakan bahan-bahan yang

dipergunakan dalam kegiatan di laboratorium Bioteknologi. Bahan kimia

dipergunakan untuk membuat media tanam, sedangkan bahan sterilan

dipergunakan untuk sterilisasi eksplan dan peralatan.

Tujuan

Praktikum bertujuan memperkenalkan peralatan yang dipergunakan

dalam kegiatan laboratorium Bioteknologi / kultur jaringan.

Bahan dan Alat

1. Berbagai bahan kimia / unsur hara makro dan mikro

2. Berbagai bahan hormone dan vitamin

3. Berbagai bahan sterilan

4. Berbagai peralatan laboratorium

Prosedur kerja

1. Catat seluruh alat yang dipergunakan di laboratorium Bioteknologi,

meliputi nama, fungsi/kegunaan, cara kerja dan gambar / foto.

2. Catat seluruh bahan kimia dan bahan sterilan yang dipergunakan di

laboratorium Bioteknologi, meliputi nama dan kegunaannya.

Lembar / Daftar Pengamatan

Daftar Perlatan

1. Nama Alat : Gambar

Fungsi : 2. Nama Alat : Gambar

Fungsi :

Daftar Bahan

No. Nama Bahan / Rumus Kimia Penggunaan 1 2

3

II. STERILISASI

Pendahuluan

Sebelum melaksanakan pekerjaan di dalam Laboratorium Bioteknologi,

harus dipastikan bahwa ruang. perlatan, media, dan eksplan dalam keadaan

bersih dan steril. Sterilisasi merupakan kegiatan untuk menghilangkan

kontaminan yang dapat menyebabkan kontaminasi dan kegagalan kultur

jaringan. Sterilisasi dilakukan terhadap ruangan, peralatan, media tanam, bahan

tanam, serta personil pelaksana. Ruang kerja dalam laminar flow biasanya

sudah dilengkapi dengan lampu UV, sehingga sterilisasinya dilakukan dengan

UV dan diikuti dengan membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam

laminar.

1. Sterilisasi dengan autoclave

Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap

air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini

antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik,

peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati

bila diautoclave pada suhu 121o C dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit

Macam-macam otoklaf berupa sederhana (manual) dan yang dapat

deprogram (programmable). Otoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap

dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam otoklaf, pemanasan airnya

menggunakan kompor. Otoklaf programmable menggunakan sumber energi dari

listrik yang dilengkapi dengan timer dan thermostat.

Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan

tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 1210C, tekanan yang

biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm.

Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air

disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari

volume bahan yang disterilkan.

Sterilisasi media yang terlalu lama dapat menyebabkan :

a. Penguraian gula.

b. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.

c. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.

d. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.

4

2. Dengan Sistem Filter

Beberapa zat pengatur tumbuh (hormon) seperti asam amino dan

vitamin sangat labil dalam kondisi panas dan akan rusak jika disterilisasi

dengan menggunakan autoklaf. Sterilisasi hormon yang tidak tahan pemanasan

atau vitamin dilakukan dengan menggunakan membran filter 0.22 μm to 0.45μm

size.

3. Radiasi

Sterilisasi dengan sistem radiasi hanya bisa dilakukan di suatu area yang

dilengkapi dengan sinar UV. Sinar UV biasanya digunakan untuk mensterilkan

petridish atau pipet di dalam suatu lemari yang dilengkapi dengan sinar

tersebut. Sinar UV digunakan untuk membunuh organisme di dalam ruangan

atau di area kerja (dalam laminair) dan sinar ini dalam gelombang panjang

tertentu bisa merusak mata dan kulit.

4. Laminar Airflow Cabinet

Laminar Airflow Cabinet alat yang dipakai untuk menipulasi ruangan

aseptik. Udara ditarik ke arah kipas elektrik dan melewati filter coarse kemudian

melalui filter bakteri halus (HEPA-High Efficiency Particulate Air Filter). Dengan

sistem kerja seperti ini, ruang kerja di dalam laminair bebas dari

mikroorganisme. Sebelum dipakai ruangan kerja di sterilkan dengan

menyemprot alkohol 70%.

5. Oven dan pembakaran

Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat

disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130o C - 170o C

selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven,

tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu

170 OC.

Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau

laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol

96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi

pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-

hati karena alkohol sangat mudah terbakar.

5

1. Sterilisasi Ruang Kerja

Langkah kerja sterilisasi ruang:

Ruang kultur harus dibersihkan setiap hari dan setiap saat akan

dipergunakan. Lantai ruang dipel dengan bahan pembersih lantai yang

mengandung disinfektan (misal Wipol dsb.)

Dinding dan perabotan dilap dengan air bersih yang ditambahkan

bahan pembersih mengandung disinfektan

Laminar air flow disterilkan dengan cara :

Satu malam sebelum lat digunakan, nyalakan lampu UV untuk

menstrerilkan bagian dalam air flow cabinet, dan minimalisasi kontaminasi

yang disebabkan olek mikroba.

Pagi hari, lampu UV dimatikan (jangan lupa mematikan lampu UV,

apabila lampu UV menyala pada saat bekerja maka operator dalam

kondisi berbahaya karena dapat terkontaminasi radiasi UV yang dapat

mengakibatkan iritasi kulit dan selaput mata serta gangguan reproduksi.

Setelah lampu UV dimatikan, bagian dalam laminar didesinfeksi dengan

alkohol 70% dan laminar siap digunakan.

2. Sterilisasi Alat-alat

Bahan dan peralatan yang digunakan pada sterilisasi dengan autoklaf

adalah: peralatan kaca/Glass ware (seperti botol kultur, Erlenmeyer, petridish,

gelas piala), peralatan penanaman /Dissecting kit (seperti pinset, scalpel),

aluminium foil, kertas paying, karet gelang, kertas merang, kertas pembungkus,

plastic seal. Beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah:

a. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas

atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan

aluminium foil). Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang

autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang, karena selama pemanasan

terjadi pemuaian.

b. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset,

gunting, gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong,

jarum dan pipet.

6

c. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau

ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain

tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak

direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat

masuk ke dalam bungkusan.

d. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum,

dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan

penggunaan Aluminium foil, karena uap sukar masuk kedalam

bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.

e. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau

kertas merang.

Prosedur Kerja sterilisasi dengan autoclaf

1. Glass ware dan dissesting kit dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan

air lalu dikeringkan. Setel;ah kering mulut botol ditutup dengan

aluminium foil dan dieratkan dengan plastic seal (segel plastik). Pinset

dan scalpel dibungkus dengan kertas aluminium foil.

2. Glass ware dan dissesting kit disterilisasi dengan autoklaf pada

suhu 120oC pada tekanan 17,5 psi selama 30 menit.

3. Selama proses sterilisasi berlangsung, autoklaf ditutup rapat sehingga

tekanan didalam autoklaf naik. Tekanan tinggi tersebut

dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan api, dilakukan

selama tiga kali.

4. Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai katup dibuka untuk

membuang uap air hingga tekanan 0 psi.

5. Autoklaf dibuka dan peralatan yang disterilisasi diambil.

6. Peralatan disimpan di tempat yang bersih.

7

III. MEMBUAT LARUTAN STOK UNSUR HARA

Pendahuluan

Larutan stok adalah larutan yang berisi satu atau labih komponen media

yang konsentrasinya lebih tinggi daripada konsentrasi komponen tersebut dalam

formulasi media yang akan dibuat. Larutan stok bisa dibuat dengan konsentrasi

10, 100, atau bahkan 1000 kali lebih pekat.

Larutan stok dalam media kultur jaringan dikelompokkan dalam: stok

makro, stok mikro, stok Fe, stok vitamin dan stok hormon.

Larutan stok sebaiknya disimpan dalam ruang gelap dan bersuhu rendah,

karena ada beberapa bahan yang tidak tahan suhu tinggi dan cahaya. Stok

vitamin tidak dapat dismpan terlalu lama, bisa dibuat untuk digunakan dalam 1 –

2 minggu. Stok hormon dapat disimpan antara 2 – 4 minggu, sedangkan stok

hara dapat disimpan 4 – 3 minggu. Larutan stok yang sudah tersimpan lama

biasanya mengendap dan ditumbuhi mikroorganisme. Larutan yang sudah

terkontaminasi mikroorganisme ini sudah tidak dapat digunakan lagi. Oleh sebab

itu kondisi tempat simpan dan wadah larutan harus diusahakan sesteril mungkin.

Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya dilakukan hanya

dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja.

Hal-hal yang harus diperhatikan pada larutan stok :

1. Larutan stok sebaiknya tidak disimpan terlalu lama, terutama vitamin dan

ZPT. Oleh karena itu pembuatan larutan stok harus diperhitungkan betul

jumlah kebutuhannya

2. Larutan stok yang telah mengalami perubahan, misalnya: ada

pengendapan atau terkontaminasi (ditumbuhi mikroorganisme)

sebaiknya tidak digunakan lagi

3. Semua alat-alat yang digunakan untuk membuat larutan stok dibilas

terlebih dahulu dengan aquadest guna mencegah terkontaminasi

dengan zat-zat lain yang tidak diinginkan

4. Setiap larutan stok harus berlabel mengenai: tanggal pembuatan, jenis

larutan stok dan kepekatan.

5. Untuk larutan stok yang bersifat labil seperti vitamin dan ZPT

disimpan di dalam refrigerator. Hindarkan larutan stok dari cahaya

langsung, simpan dalam botol yang berwarna gelap.

8

Tujuan:

Praktikum bertujuan agar mahasiswa trampil membuat larutan stok media tanam

untuk kultur in vitro

Bahan dan Peralatan:

1. Bahan kimia hara makro

2. Bahan kimia hara mikro

3. Vitamin

4. Aqudestilata

5. Peralatan gelas

6. Peralatan ukur

7. Label

Prosedur kerja :

Larutan Stok Makronutrien 200 ml (20 kali konsentrasi)

1. Timbang bahan-bahan kimia yang tersebut di bawah ini dengan timbangan

analitik. NH4NO3 33000 mg KNO3 38000 mg CaCl2 . 2H2O 8800 mg

MgSO4 . 7H2O 7400 mg KH2. PO4 3400 mg

2. Larutkan bahan-bahan tersebut satu per satu ke dalam erlenmeyer 250 ml

yang telah diisi dengan 150 ml akuadest.

3. Gojog erlenmeyer setiap kali penambahan bahan kimia, sampai larut.

4. Setelah semua bahan kimia masuk dan terlarut, tambahkan akuades sampai

volume larutan menjadi 200 ml.

5. Untuk membuat 1 liter medium MS diperlukan 10 ml larutan stok makro.

6. Beri label : MS MAKRO, 20 X, 10 ml / lt Artinya : untuk membuat 1 liter

medium MS, diperlukan 10 ml stok. Simpan dalam lemari es.

Larutan Stok Mikronutrient 500 ml (100 kali konsentrasi)

1. Timbang bahan-bahan kimia yang tersebut di bawah ini dengan timbangan

analitik. MnSO4 .4H2O 2230 mg ZnSO4.4H2O 860 mg H3BO3 620 mg KI 83

mg Na2MoO4.2H2O 25 mg CuSO4.5H2O 2,5 mg CoCl2.6H2O 2,5 mg

2. Masukan bahan-bahan kimia yang telah ditimbang satu per satu ke dalam

Erlenmeyer 500 ml yang telah berisi akuadest steril 300 ml. Setiap kali

memasukkan bahan kimia harus segera diaduk/dilarutkan. Setelah larut,

bahan kimia berikutnya dimasukkan. Cara memasukkan seperti ini untuk

9

menghindari terjadinya endapan. Pengadukan dapat dilakukan dengan

dengan menggunakan pengaduk magnetik

3. Setelah semua bahan kimia masuk, dan larut, tambahkan akuadest sampai

volume larutan menjadi 500 ml.

4. Tutup gelas Erlenmeyer yang berisi larutan mikronutrient.

5. Beri label : MIKRO, MS 100 x, 5 ml / l Artinya untuk membuat 1 liter medium

MS, diperlukan 5 ml larutan mikronutrient stok.

Larutan Stok Vitamin 200 ml (50 kali konsentrasi)

1. Timbang bahan-bahan yang tersebut di bawah ini dengan timbangan

analitik Glycine 100,0 mg Nicotinic acid 25,0 mg Pyridoxine-HCl 25,0 mg

Thiamin-HCl 5,0 mg

2. Masukkan bahan-bahan 2.a. satu per satu ke dalam Erlenmeyer 200 ml,

yang telah berisi akuadest steril 150 ml. Setiap kali memasukkan bahan,

dilarutkan dengan menggunakan pengaduk, baru kemudian dimasukkan

bahan berikutnya.

3. Setelah semua bahan masuk, tambahkan akuadest sampai volume

seluruhnya 200 ml.

4. Tutup rapat Erlenmeyer yang berisi larutan vitamin stok

5. Beri label : VITAMIN, MS 50 x, 4 ml / l Artinya : untuk membuat 1 liter

medium MS, diperlukan 4 ml stok, simpan dalam lemari es

Larutan Stok Iron (besi) 200 ml (40 kali konsentrasi)

1. Timbang 1492 mg Na2EDTA dan 1112 mg Fe2SO4.7H2O

2. Larutkan masing-masing bahan tersebut di atas pada Erlenmeyer 200 ml

yang terpisah, yang masing-masing berisi 75 ml.

3. Jika bahan-bahan tersebut sukar larut, tambahkan beberapa tetes HCl, lalu

panaskan

4. Setelah larut, campur kedua macam larutan bahan tersebut ke dalam satu

Erlenmeyer

5. Biarkan dingin pada suhu kamar

6. Tambahkan akuadest sampai volume menjadi 200 ml

7. Tutup rapat dan beri label : IRON, MS 40, x 5 ml / l (Artinya : untuk membuat

1 liter medium MS, diperlukan 5 ml stok).

10

Larutan Stok Hormon (IAA, NAA, 2,4-D dan IBA) 100 ml (1000 ppm)

1. Timbang masing-masing hormon sebanyak 100 mg

2. Tuangkan masing-masing hormon ke dalan gelas Erlenmeyer 100 ml yang

berisi akuadest kira-kira 70 m

3. Sambil di aduk-aduk teteskan sedikit larutan KOH 1 N dengan hati-hati

sampai larut (tampak jernih)

4. Pindahkan ke dalam gelas ukur 100 ml, tambahkan akuadest sampai 100 ml

5. Pindahkan ke dalam gelas Erlenmeyer 100 ml

6. Tutup rapat dan beri label: IAA (1 mg / l), NAA (1 mg / l), 2,4-D (1 mg / l), IBA

(1 mg / l) (Artinya : 1 ml stok sama dengan 1 mg hormon), Simpan dalam

lemari es.

11

IV. MEMBUAT MEDIA TANAM MS

Pendahuluan :

Jika seluruh larutan stok yang dibutuhkan sudah dibuat, gula dan

pemadat medianya ditimbang sesuai kebutuhan, kita dapat meracik dan

membuat media.

Salah satu medium yang banyak dipakai, terutama untuk tanaman-

tanaman herba adalah medium dasar Murashige dan Skoog (medium MS).

Media MS mengandung konsentrasi garam mineral yang tinggi dan senyawa N

dalam bentuk NO3- dan NH4+ . Konsentrasi sukrose dan agar yang ditambahkan

di dalam media juga akan bervariasi tergantung kebutuhan eksplan. Untuk satu

liter media MS biasanya digunakan 30 gram sukrose dan 8 gram agar.

Konsentrasi agar dapat bervariasi tergantung media yang diinginkan berupa

media padat (solid), semi-solid atau cair.

Tujuan :

Praktikum bertujuan untuk melatih ketrampilan mahasiswa membuat

media tanam, khususnya media MS.

Bahan dan Alat :

1. Larutan Stok Makronutrien, mikronutrien, vitamin, besi dan myo-inositol

2. Erlenmeyer, beakerglass, gelas ukur, pengaduk, pipet ukur, botol kultur,

plastic penutup botol, karet gelang

3. Timbangan

4. Magnetic stirrer

5. Autoclave dan kompor

Cara Kerja

Membuat Media Murashige & Skoog (Media MS)

1. Siapkan erlenmeyer 1000 ml yang telah diisi dengan 500 ml akuadest,

2. Tambahkan 10 ml larutan stok makronutrient, aduk merata menggunakan

magnetic stirrer

3. Kemudian tambahkan satu per satu, larutan stok hara mikro, vitamin, iron

(besi), vitamin, dan myo-inositol.

12

4. Masukkan ZPT jika dibutuhkan. Volume yang digunakan disesuaikan dengan

kebutuhan dan stok ZPT yang telah dibuat

5. Masukkan sucrose atau dapat diganti dengan gula pasir sebanyak 30 gram

per liter media MS

6. Ukur pH larutan dan sesuaikan pH nya sehingga berada pada pH 5.7-5.8.

Jika terlalu basa ditambah dengan HCl dan jika terlalu asam maka ditambah

larutan NaOH.

7. ukur lagi larutan tersebut sehingga mencapai 1 liter dan dikembalikan ke

dalam beaker atau Erlenmeyer

8. Tambahkan agar 8 gram untuk 1 liter media (media solid) dan aduk serta

panasi media hingga mendidih menggunakan magnetic stirrer.

9. Tuang ke dalam botol kultur secukupnya. Kemudian tutup dengan alumunium

foil /plastic dan beri label (MS).

10. Sterilisasi dalam autoclaf dengan temperatur 121 oC selama 15 menit.

Preparasi Medium Agar Kosong (MS 0)

a. Timbang agar sebanyak 4 gram, masukkan ke dalam erlenmeyer yang

berisi aquadest 500 ml

b. Panaskan pada kompor sampai agar-agar larut dan larutan mendidih

c. Masukkan dalam botol jam yang tinggi secukupnya, beri label pada

masing-masing botol

13

V. PROPAGASI TANAMAN IN VITRO

Pendahuluan

Kemajuan teknik propagasi tanaman dengan cara in vitro telah memacu

perkembangan ilmu tanaman dengan pesat. Propagasi tanaman in vitro kini

bukan hanya sekedar bertujuan untuk perbanyakan tanaman pangan saja,

namun telah meluas kepada berbagai komoditi tanaman. Bahkan

perkembangan metode propagasi tanaman in vitro lebih banyak diterapkan

terhadap tanaman non pangan, antara lain tanaman hias dan tanaman obat-

obatan.

Tanaman hias dibudidayakan untuk memenuhi kebutuhan akan

keindahan dan kenyamanan, serta sebagai sarana penyaluran hobi /

kesenangan (to have fun growing). Budidaya tanaman hias dengan metode

kultur jaringan in vitro, selain untuk mengembangbiakkan tanaman, juga

sekaligus untuk memperoleh bibit tanaman yang unik dengan cara

memanipulasi media dan lingkungan tumbuh in vitro.

Keunikan tanaman tumbuh di dalam sebuah wadah kaca, dapat

menjadi daya tarik yang memiliki nilai jual. Tidak salah jika dikatakan bahwa

kultur jaringan tanaman adalah: “… the art and science of multiplying plants in

vitro.”

Tujuan

Praktikum bertujuan untuk membuat tanaman mini in vitro unik yang

memiliki daya jual.

Bahan dan Peralatan

1. Bahan tanaman (eksplan): shoot tip (tunas pucuk) tanaman Puring,

ujung daun muda tanaman Sansivera, batang Krisan, daun Begonia,

daun African violet

2. Media padat dalam botol kultur: (MS+BAP), (MS+NAA)

3. Sterilant (Alkohol, Larutan sublimat dan Bayclin)

4. Aquadest steril

5. Peralatan : laminar flow cabinet, pisau scalpel, pinset, botol

kultur, lampu bunsen, gunting, petridish, hand sprayer, tisu,

label. (Semua peralatan sudah disterilkan).

14

Prosedur Kerja

a. Sterilisasi eksplan

Eksplan berupa tunas pucuk (shoot tip) Puring sepanjang ± 5 cm,

b a t a n g K r i s a , daun muda Sansivera, African violet dan Begonia, diambil

dari tanaman di dalam Green House. Pemotongan tunas dilakukan dengan

menggunakan pisau atau gunting yang bersih dan tajam.

Tunas pucuk dicuci bersih di bawah air mengalir selama 15 menit,

direndam dalam larutan deterjen selama 15 menit, kemudian direndam dalam

larutan fungisida + bakterisida 2% selama 30 menit. Bilas hingga benar-benar

bersih. Pembilasan terakhir dilakukan dengan menggunakan aquadest steril,

kemudian ditiriskan.

Dilakukan pemotongan untuk memperkecil ukuran eksplan.

Pemotongan dilakukan di dalam LAF dalam kondisi aseptik.

Dilakukan sterilisasi bertingkat sebagai berikut:

a. direndam dalam larutan alkohol 70% selama 15 menit,

b. bilas dengan aquadest steril

c. direndam dalam larutan sublimat (Hg2Cl2) 0.1% + 5 tetes Tween

d. bilas dengan aquadest steril

e. larutan Clorox 20% selama 15 menit

f. bilas dengan aquadest steril

g. larutan Clorox 5% selama 15 menit

h. celupkan dalam larutan Bethadine 50% selama 1 detik

b. Penanaman eksplan

Penanaman dilakukan di dalam LAF yang telah disterilkan dengan sinar

UV dan dilap dengan larutan alcohol 70%

eksplan yang telah disterilkan selanjutnya ditanam dalam botol kultur

yang telah berisi media tanam.

Setiap botol diisi dengan 4 atau 5 eksplan

Penanaman dengan menggunakan pinset yang senantiasa

diterilkan dalam larutan alcohol 90% dan dibakar pada lampu Bunsen.

Mulut botol kultur diusahakan agar selalu dekat dekat lampu Bunsen

Setelah penanaman, botol kultur segera ditutup kembali dan diberi label

15

c. Penumbuhan dan multiplikasi eksplan

Eksplan dalam botol kultur disimpan dalam rak kultur di ruang inkubasi

Dilakukan pengamatan visual eksplan setiap hari

Dijaga agar suhu udara, kelembaban udara dan cahaya konstan

Setelah eksplan tumbuh dan bertunas, dilakukan multiplikasi (pemisahan

tunas) dan ditumbuhkan dalam media tanam baru (sub kultur)

Eksplan yang akan disubkultur diletakkan di petridish, kemudian segera

ditanam pada media sesuai perlakuan dengan menggunakan pinset

setiap botol diisi satu atau dua eksplans, kemudian botol ditutup

Multiplikasi dilakukan sebulan sekali

Eksplan yang telah berdaun lengkap dipindahkan (sub kultur) pada

media untuk perakaran.

d. Perlakuan

Setiap jenis tanaman diperlakukan dalam beberapa komposisi media

tanaman sebagai berikut:

Tabel 1. Perlakuan Media Tanam

Tahap Puring, Krisan Sansivera African violet, Begonia

Penumbuhan tunas MS+BAP 1 mg/L MS+BA 1 mg/L MS+BAP 0.2 mg/L

Sub kultur MS+BAP 3 mg/L MS+BAP 1 MS+BAP 0.4 mg/L

Perakaran MS+NAA 3 mg/L MS+NAA 0.4mg/L MS+NAA 0.2 mg/L

Aklimatisasi Pasir+kompos Pasir+Kompos Pasir+kompos

16

Pengamatan

a. Persentase pertumbuhan eksplan (%)

Kultur dikatakan tumbuh adalah berwarna hijau, secara visual ukuran

bertambah, berat bertambah dan perubahan embriogenesis maupun

morfogenesis. Persentase tumbuh dihitung tiap minggu dengan rumus:

Persentase tumbuh = Jumlah eksplan yang tumbuh x 100%

Jumlah eksplan per perlakuan

b. Jumlah tunas (tunas)

Dihitung jumlah tunas yang terbentuk dari setiap planlet yang

dilakukan pada akhir penelitian.

c. Panjang tunas (cm)

Tinggi planlet diukur dengan menggunakan kertas milimeter yang diukur

dari tempat munculnya tunas (pangkal) sampai ujung tunas tertinggi dilakukan

pada akhir penelitian.

c. Jumlah daun (helai)

Jumlah daun dihitung dari daun yang terbentuk yang telah terbuka

sempurna dari setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian.

d. Jumlah akar (helai)

Jumlah akar dihitung dari jumlah akar yang terbentuk dari leher akar

pada setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian.

e. Bentuk daun

Bentuk daun dilihat daun membulat atau melebar pada setiap planlet

yang dilakukan pada akhir penelitian.

f. Warna daun

Warna daun dilihat berwarna hijau, kuning atau perpaduan kuning dan

hijau pada setiap planlet yang dilakukan pada akhir penelitian.

Tugas Praktikum

1. Setiap kelompok melakukan percobaan dengan satu jenis

tanaman, dan setiap mahasiswa menanam eksplan dalam 5 botol

kultur (5 ulangan)

2. Setiap mahasiswa melakukan pemeliharaan dan pengamatan pada

tanaman masing- masing dan tanaman kelompoknya

3. Membuat catatan pengamatan mingguan (Tabel 1 dan 2)

4. Melaporkan hasil kegiatan praktikum pada akhir praktikum

17

Tabel 1. Pengamatan Pertumbuhan Eksplan

Tanggal Perlakuan / ulangan

% eksplan berbentuk

kalus

% eksplan membentuk

tunas

∑ tunas per

eksplan

% eksplan mati dan

terkontaminasi

Penyebab kontaminasi

Table 2. Pengamatan Visual

Perlakuan

Ulangan

Tanggal

18

VI. MULTIPLIKASI DAN AKLIMATISASI ANGGREK

Pendahuluan

Biji anggrek hasil silangan pada praktikum sebelumnya hanya memiliki

embrio dan tidak memiliki endosperm (cadangan makanan) sehingga tidak bisa

disemaikan dengan cara biasa. Umumnya biji anggrek disemaikan dengan cara

in vitro pada media buatan yang berperan sebagai endosperm yaitu cadangan

makanan bagi embrio untuk tumbuh (Arditti, 1992). Di alam biji anggrek

akan berkecambah apabila di tempat jatuhnya terdapat cendawan mycoryza.

Hasil dari metabolisme mycoryza berupa senyawa-senyawa organik sederhana

yang dimanfaatkan biji anggrek untuk berkecambah dan tumbuh sebelum

mampu memproduksi makanan sendiri. Embrio yang berkecambah

membentuk protocorm yaitu struktur seperti corm (batang berlapis) berukuran

sangat kecil, berwarna hijau dan dapat melakukan fotosintesis. Setelah senyawa

organik yang terbentuk mencukupi dalam protocorm, barulah tunas dan akar

akan terbentuk (Wattimena et al., 1992)

Planlet anggrek yang diperoleh dari protocorm selanjutnya di multiplikasi

dalam media multiplikasi untuk mendapatkan anggrek dalam jumlah yang

banyak. Setelah cukup dewasa anggrek dipindahkan dari botol kultur di

dalam laboratorium ke pot yang ada di screen house (aklimatisasi).

Aklimatisasi anggrek tidak hanya sekali dilakukan, tetapi beberapa kali

tergantung fase pertumbuhannya.

Tujuan

Praktikum ini bertujuan agar mahasiswa mampu:

1. melakukan subkultur planlet anggrek.

2. melakukan aklimatisasi planlet anggrek dari botol ke compot.

3. memelihara tanaman anggrek dengan baik dan benar selama di screen

house.

Bahan dan Metode

Bahan utama yang digunakan pada praktikum ini Bibit Anggrek dalam

botol jenis Dendrobium, Vanda atau Phalaenopsis, media MS, dan agar.

Bahan-bahan tambahan yang dibutuhkan yaitu alkohol 70%, aquades, spiritus,

plastik, karet gelang, dan tisu.

19

Sedangkan bahan yang digunakan pada proses aklimatisasi yaitu bibit

anggrek, arang sekam, sphagnum moss, serbuk pakis, cocopeat, dan fungisida.

Peralatan

Alat-alat yang digunakan yaitu otoklaf, laminar air flow cabinet, neraca

analitik, botol kultur, bunsen, hand sprayer, pinset, cawan petri, labu erlenmayer,

gelas piala, gelas ukur, pisau, corong, scapel, pengaduk kaca, pipet, labu takar,

pH meter, dan kain pembersih. Sedangkan alat yang digunakan untuk

proses aklimatisasi yaitu: pinset, baker glass dan hand sprayer.

Prosedur Kerja

a. Multiplikasi planlet

1 ) Persiapan Planlet.

Planlet anggrek yang digunakan berasal dari biji-biji anggrek silangan

yang dikulturkan secara in vitro. Planlet dikeluarkan dari botol dan

diletakkan pada cawan petri steril (Gambar 2). Setiap planlet dipisahkan

satu persatu dari rumpun menggunakan scapel.

2 ) Penanaman planlet.

Penanaman planlet pada seluruh media dilakukan di dalam laminar

air flow cabinet. Alat-alat, bahan atau tangan harus disterilisasi terlebih

dahulu dengan menyemprotkan alkohol 70% ketika menanam.

Penanaman planlet dilakukan dengan menancapkan ke dalam media 2

planlet setiap botol.

3 ) Pembesaran dan pemeliharan planlet.

Pembesaran dan pemeliharaan planlet dilakukan dengan menjaga

keadaan lingkungan ruangan kultur yaitu memberikan penyinaran lampu

flourescent berintensitas cahaya 1000 lux pada rak kultur tempat botol-

botol diletakkan dan suhu ruangan diatur 20-25 C. Kondisi ini terus

berlangsung selama 24 jam setiap hari.

c. Aklimatisasi

Persiapan bibit dan media

1) Media tanam yang akan digunakan dicuci hingga bersih terlebih

dahulu kemudian direndam dalam fungisida 1 g/l selama 5 menit

kemudian ditiriskan. Setelah itu masing-masing media dimasukkan ke

20

dalam pot. Bibit yang akan digunakan dikeluarkan dari botol. Buka tutup

botol, kemudian isi dengan air. Kemudian satu persatu bibit ditarik

dengan kawat yang ujungnya dibentuk U, dan diusahakan akar keluar

dulu (Gambar 2.2). Apabila sulit dikeluarkan, botol dapat dipecahkan.

2) Bibit dicuci bersih sampai media agar-agarnya hilang, kemudian

dimasukkan bak yang berisi fungisida dan direndam beberapa menit.

Bibit diangkat dan ditiriskan di atas nampan yang dialasi kertas atau tisu

bersih (Gambar 2.3).

3) Penanaman

Pot komunitas (compot) diisi pecahan batu bata sebanyak 1/3 bagian

bawah, arang pada lapisan tengah, dan lapisan atas diisi pakis. Bibit

ditanam sedalam 1- 2 cm. Dalam satu compot (Ø15 cm) jumlah yang

ditanam tidak lebih dari 20 bibit.

Gambar 2. Planlet anggrek dalam botol yang dikeluarkan untuk diaklimatisasi

21

4) Pemeliharaan

Pot diletakkan pada tempat yang terkena sinar matahari pagi dan diberi

naungan (bisa dengan paranet 35 %) (Iswanto, 2002). Pemeliharaan

dilakukan dengan penyiraman 2 kali sehari, pemupukan menggunakan

pupuk daun Vitabloom (30-10-10) 2 g/l satu kali seminggu dengan

cara disemprotkan ke daun dan pencegahan cendawan

menggunakan Dithane M-45 berbahan aktif Mancozeb 80% sebanyak 3

g/l 2 minggu sekali.

5) Pemindahan Tanaman dari Compot ke Single Pot

Setelah tanaman mencapai ketinggian 5 cm atau lebih sebaiknya bibit

dipindahkan satu per satu ke single pot. Cara pengisian media dan

penanaman bibit sama seperti pada compot (Iswanto, 2002).

6) Pemupukan

Pemupukan dilakukan melalui daun, caranya dengan penyemprotan

Pemupukan sebaiknya dilakukan pada pagi hari, antara pukul 07.00-

09.00. Sehingga pupuk yang diberikan tidak cepat menguap. Jika

pupuk diberikan lewat media, yang diambil oleh tanaman hanya yang

larut dalam air saja dan yang langsung kontak dengan ujung akar.

Sisanya akan terus berada dalam pot.

Pengamatan

Pembesaran planlet secara in vitro:

a. Jumlah daun, dihitung saat daun telah membuka sempurna.

b. Jumlah akar, dihitung saat akar mencapai 2 mm.

c. Tinggi tunas, diukur saat akhir pengamatan dari pangkal tunas hingga

titik pertemuan antara dua daun paling atas

d. Panjang daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terpanjang

dari pangkal hingga ujung daun.

e. Lebar daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terlebar di bagian

tengah daun.

f. Panjang akar, diukur saat akhir pengamatan pada akar terpanjang

dari pangkal hingga ujung akar.

22

Aklimatisasi bibit

a. Persentase hidup, dengan membandingkan bibit hidup dengan bibit

awal dikalikan 100%.

b. Jumlah daun, dihitung saat daun telah membuka sempurna.

c. Tinggi tanaman, diukur saat akhir pengamatan dari pangkal hingga titik

tumbuh tunas.

d. Panjang daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terpanjang

dari pangkal hingga ujung daun.

e. Lebar daun, diukur saat akhir pengamatan pada daun terlebar di bagian

tengah daun.

Contoh Tabel Pengamatan

Nama Anggrek :

Tanggal Tranplanting :

Jumlah awal :

∑ anggrek setelah transplanting

∑ daun Tinggi tanaman Panjang daun

Minggu ke Minggu ke Minggu ke Minggu ke

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

23

VII. ORGANOGENESIS

Pendahuluan

Kultur jaringan (Tissue culture) adalah membudidayakan suatu jaringan

tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat sama dengan induknya.

Juga merupakan metode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti protoplas,

sel, jaringan dan organ (daun, batang, akar, biji, bunga, buah) dan

menumbuhkan dalam kondisi aseptik (Rahardja 1989).

Bagian tanaman yang akan dikulturkan disebut eksplan. Jadi eksplan

bisa berupa mata tunas, anthera, batang, daun dan akar yang masih muda

dan terdiri dari sel-sel meristematis, yang mana sel-selnya masih aktif

membelah-belah dan apabila dikulturkan pada media tumbuh yang sesuai

secara in vitro, maka eksplan tersebut akan tumbuh dan berkembang biak

menjadi banyak (Nugroho dan Sugito 2004).

Organogenesis merupakan proses pembentukan organ-organ tubuh.

Untuk mendapatkan tanaman utuh dengan kultur jaringan tumbuhan dapat

melalui dua cara yaitu organogenesis dan embriogenesis somatik (Karim 2006),

secara langsung atau tak langsung melalui pembentukan kalus terlebih dahulu

(George & Sherington 1984). Organogenesis merujuk kepada proses yang

menginduksi pembentukan jaringan, sel atau kalus menjadi tunas tanaman

sempurna. Proses ini diawali oleh hormon pertumbuhan benziladenin dan

sitokinin lainnya, baik sendiri maupun dalam kombinasi dengan asam

naftalasetat atau asam indolasetat dan kadang-kadang dengan asam giberelat

menyebabkan diferensiasi dan pembentukkan tunas.

Media yang digunakan adalah media dasar Murashige Skoog (MS).

Media MS termasuk media kultur yang komposisi unsurnya lebih lengkap

dibandingkan media dasar lainnya, walaupun demikian perlu ditambah

suplemen seperti air kelapa untuk mendorong pertumbuhan jaringan.

Indeks keasaman (pH) media adalah 5,6. Komposisi dalam media

Murashige Skoog meliputi unsur-unsur makro, mikro, vitamin, gula, asam amino

dan zat pengatur tumbuh (ZPT), yang penting untuk differensiasi sel (Gunawan

1995).

24

Tujuan

1. Mahasiswa mampu melakukan mikropropagasi pada tanaman

2. Mahasiswa mampu melakukan proses organogenesis langsung pada

tanaman

3. Mahasiswa mampu melakukan proses organogenesis tidak langsung

pada tanaman

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah laminar, pinset, pisau,

botol steril, gelas ukur, bunsen, silk, plastik, dan karet.

Sedangkan bahan yang digunakan adalah benih / biji tanaman (jeruk,

sirsak, dll.), larutan fungisida dan bakterisida, larutan bayclin 5%, larutan tween,

alkohol 96%, alkohol 70%, dan media MS, Hormon BAP dan 2,4-D, aquadest

steril, label.

Prosedur Kerja

1. Menyiapkan bahan yang akan digunakan. Ambil biji / benih tanaman

dan direndam dengan larutan fungisida 2 g/ml, dan bakterisida 2 g/ml

selama 1 jam. Bilas dengan air mengalir selama 30 menit.

2. Bawa kedalam laminar, sterilisasi dengan alcohol 70% selama 5 menit.

Bilas dengan aquades steril, kemudian merendam dengan bayclin 20%

selama 10 menit. Bilas dengan aquades steril, kemudian rendam dengan

Bayclin 10% selama 5 menit. Bilas dengan aquades steril, kemudian

rendam/gojok dengan bayclin 5% selama 20 menit.

3. Terakhir bilas dengan akuades steril

Penanaman biji steril

Biji tanaman ditanam pada media MS dengan posisi tidur. Satu botol

kultur tiga biji steril. Botol kultur diinkubasi pada ruang kultur.

Induksi kalus dan tunas

1 . Setelah biji tanaman tumbuh menjadi bibit, ambil bagian kotiledon,

hypokotil dan internodia sebagai sumber eksplan. Tanam pada media

untuk induksi kalus (MS +BA 0.1 mg/l +2,4-D 1.0 mg/l) sedangkan

untuk proliferasi kalus pindah ke media MS+BA 0.1 mg/ l +2,4-D 0.5

25

mg/l. Media untuk induksi tunas tanaman adalah MS + BA 1.0-2 mg l–

1 + NAA 0.1 mg l–1.

2. Botol kultur yang berisi eksplan tanaman selanjutnya diinkubasi pada

ruang kultur yang dilengkapi dengan lampu inflourescent.

Pengamatan

Tabel Pengamatan

Tanggal Perlakuan / ulangan

% eksplan berbentuk

kalus

% eksplan membentuk

tunas

∑ tunas per

eksplan

% eksplan mati dan

terkontaminasi

Penyebab kontaminasi

Tugas Mahasiswa

a. Mahasiswa dibagi dalam 4 kelompok. Setiap kelompok melakukan

percobaan dengan satu jenis tanaman dan satu metode mikropropagasi,

yaitu organogenesis langsung atau tidak langsung

b. Setiap mahasiswa melakukan pemeliharaan dan pengamatan pada

tanaman masing- masing dan tanaman kelompoknya

c. Membuat catatan pengamatan mingguan

d. Melaporkan hasil kegiatan praktikum pada akhir praktikum

No. Kelompok Mahasiswa Jenis Tanaman Jenis Mikropropagasi

1. Kelompok I A Organogenesis Langsung

2. Kelompok II A Organogenesis Tidak langsung

3. Kelompok III B Organogenesis Langsung

4. Kelom[ok IV B Organogenesis Tidak langsung

26

VIII. ENKAPSULASI BENIH SINTETIS

Pendahuluan

Teknik enkapsulasi dikembangkan oleh Redenbaugh et.al (1985) yang

mengadopsi teknik benih buatan/sintetik, yaitu membungkus eksplan dengan

lapisan yang berfungsi sebagai fisik. Tujuannya memberikan tekanan secara fisik

pada eksplan yang disimpan sehingga berpengaruh dalam meminimalkan

pertumbuhan akibat reduksi proses respirasi. Pembungkus fisik yang biasa

digunakan adalah Natrium Alginat.

Teknik ini merupakan salah satu teknik dalam usaha konservasi plasma

nutfah secara ex situ (kultur in vitro) yang disebut preservasi. Preservasi

adalah kegiatan mereduksi atau mengurangi laju metabolisme tumbuhan hingga

sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitasnya dan memelihara

sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan (recovery) dan

kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri yang minimum.

Enkapsulasi termasuk dalam metode preservasi dengan cara menghambat

pertumbuhan (slow growth).

Hal ini dilakukan dengan cara membiakkan pada media yang

mengandung sumber karbohidrat konsentrasi tinggi dan zat pengatur tumbuh

sehingga menghambat pertumbuhan namun penampakannya tetap segar.

Teknik enkapsulasi memiliki beberapa keuntungan, yaitu teknik ini lebih efektif

untuk penyimpanan jangka panjang karena dapat dicegah adanya perubahan

genetik, teknik ini juga sangat efisien karena dalam satu wadah seperti berupa

botol dapat menyimpan puluhan eksplan bahkan ratusan, mudah dikendalikan,

skala produksi besar dengan biaya rendah, dan regenerasi sangat mudah.

Teknik enkapsulasi dilakukan untuk memproduksi biji sintetik atau biji

buatan yang menjadi aset penting dalam mikropropagasi. Enkapsulasi in vitro

didapatkan dari eksplan vegetatif tanaman untuk dikembangkan menjadi biji

sintetik yang digunakan sebagai pengganti alternatif biji sesungguhnya

(Faisal, et.al.,2006). Metode penyimpanan melalui teknik pertumbuhan minimal

dengan enkapsulasi untuk memperpanjang masa simpan kultur tanpa tindakan

subkultur secara berulang-ulang.

27

Tujuan

Praktikum bertujuan agar mahasiswa dapat membuat benih sintetik

dengan cara enkapsulasi eksplan secara in vitro.

Bahan dan Peralatan

Bahan tanaman adalah eksplan tanaman hasil praktikum sebelumnya.

Bahan kimia: media MS, sukrosa, CaCl2.2H2O, agar-agar, natrium alginat,

sterilan (alkohol, spiritus). Alat-alat yang digunakan terdiri dari botol kultur, petri

disk, pipet besar, alat diseksi, laminar air flow cabinet, dan rak kultur .

Cara Kerja

1. Siapkan bahan tanaman yang akan dienkapsulasi dari hasil perbanyakan

in vitro pada praktikum sebelumnya (± umur 30 hari setelah tanam atau

sub kultur).

2. Siapkan media cair MS 0, sebanyak 500 ml yang sudah disterilisasi

3. Siapkan matrik kapsul benih berupa larutan Natrium Alginat 3% (3 gram

dalam 100 ml) dalam media MS cair.

4. Siapkan pengeras matrik, yaitu larutan 2 gram CaCl2. 2 H2O dalam 150

ml MS 0

5. Potong kultur tanaman yang akan dikapsulasi dengan ukuran 2-3 mm.

Masing-masing potongan eksplan mengandung satu mata tunas (buku

tunggal).

6. Dengan menggunakan mulut pipet, potongan eksplan diteteskan ke

dalam larutan CaCl2.2H2O. Setelah membentuk kapsul, dibiarkan

terendam dalam larutan CaCl2.2H2O selama 30 menit sambil digoyang-

goyangkan.

7. Kapsul yang telah terbentuk disaring, kemudian dicuci/dibilas dengan

aquadest steril.

8. Bila diinginkan matrik yang lebih tebal, dilakukan pelapisan ulang dengan

larutan Natrium Alginat.

9. Penyimpanan benih sintetik dilakukan dalam botol steril yang berisi

aquadest steril.

10. Lakukan pengamatan terhadap benih yang tumbuh setiap hari, selama 2

minggu.

28

11. Tanam benih yang tumbuh pada media padat MS + 1 ppm BAP. Lakukan

pengamatan.

Pengamatan

1. Lakukan pengamatan pertumbuhan benih dan buatlah catatan

sebagai berikut:

Hari ke Jumlah benih tumbuh Persentase benih tumbuh 1 2 3

dst.

2. Lakukan pengamatan pertumbuhan tanaman in vitro dan buatlah

catatan sebagai berikut:

Hari ke panjang tunas jumlah daun panjang akar jumlah akar

1 2 3

dst.

29

IX. ISOLASI DNA TANAMAN

Pendahuluan

Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu DNA dan RNA. DNA

yang terdapat di inti sel adalah DNA kromosomal, DNA yang terdapat di luar inti sel atau

sitoplasmik adalah DNA ekstrakromosomal, yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA

plasmid.Proses denaturasi dan renaturasi molekul DNA tergantung pada banyaknya

factor, bebrapa diantaranya adalah suhu, pH, konsentrasi iso elektrolit dan rasio

(GC:AT). Suhu, T- melting (Tm) yang tinggi menyebabkan untai ganda (double helix)

DNA akan terurai menjadi untai tunggal (singke helix). Apabila suhu ini diturunkan secara

perlahan maka akan terjadi renaturasi menjadi untai ganda DNA kembali seperti semula.

pH (derajat keasaman) yang ekstrim pun (pH < 3, atau pH > 10) dapat menyebabkan

DNA terdenaturasi. Konsentrasi iso elektrolit seperti Na+ dan K, serta makin tinggi rasio

kandungan basa nukleotida (GC:AT) maka akan memperlambat proses denaturasi DNA.

Untuk memperoleh isolate DNA dari sampel ada beberapa hal yang harus diperhatikan

dan dilakukan secara benar (Fatchiyah dkk, 2008), yaitu

1. Pemecahan dinding sel atau jaringan yang DNA-nya akan di isolasi. Pemecahan

dinding sel yang sering dilakukan adalah dengan menggunakan bahan kimia. Sel

dirusak dengan buffer lysis yang mengandung senyawa kimia yang dapat merusak

interitas barrier dinding sel. Senyawa kimia yang mumnya digunakan adlah lysosim,

EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetat), Tris-Cl, atau detergen, SDS (sodium dodecyle

sulphate)

2. Debris sel dipisahkan dari larutan DNA

3. Presipitasi RNA dan protein agar diperoleh DNA yang murni

4. Presipitasi DNA dengan ethanol dingin

5. Pemurnian DNA dari ekstrak sel dengan menggunakan bahan kimia (fenol,

fenol:klorofor, isopropanol, fenol:kloroform:isoamylalkohol

6. Pemurnian DNA dari kontaminan protein menggunakan enzim protease yaitu Pronase

atau proteinase- K; dan kontaminan RNA dengan menggunakan RNAse.

7. Pemisahan DNA dari molekul RNA dan protein dapat dilakukan dengan menggunakan

densitas gradient sentrifugasi CsCl, dengan cara ini DNA akan terpisah pada band

yang berbeda dengan protein dan RNA, bahkan antara DNA linier dan DNA sirkuler.

Selain itu menggunakan garam dengan konsentrasi tinggi, misalnya 0.25M sodium

acetate atau 0.1M sodium chloride.

8. Presipitasi akhir DNA dapat dilakukan dengan menggunakan ethanol dingin dibawah

30

kondisi ionic yang kuat. Dan dicuci dengan EtOH 70%.

9. Pellet DNA dilarutkan dengan buffer TE atau ddH2O steril.

Jaringan tanaman yang akan di preparasi DNA-nya, harus diperlakukan lebih

dahulu dalam nitrogen cair (NO2) dan segera dilakukan penggerusan agar diperoleh

ekstrak sel yang halus. Kemudian ekstrak sel diperlakukan dengan ekstrak buffer yang

dicampur dengan mercaptoethanol (fresh) dan selanjutnya seperti pada jaringan

organism lain.

Tujuan

Mahasiswa dapat mengetahui dan melakukan proses-proses yang berkaitan

langsung untuk melakukan isolasi DNA. Serta mahasiswa dapat menginterpretasi data

terkait hasil PCR.

Bahan dan Peralatan

Bahan kimia yang digunakan antara lain Buffer ekstraksi CTAB (NaCl, Tris

HCl pH 8.0, EDTA dan Merkaptoethanol), nitrogen cair, PVP (polyvinilpirolidone),

CHISAM (Chloroform, Isoamilalkohol), buffer pencuci, buffer TE, RNAse, ethanol,

isopropanol, DNA ladder, agarosa, buffer elektroforesis (TAE/TBE), loading dye, ethidium

bromida, "PROMEGA " PCR reaction kit, dan primer mikrosatelit SSR. Bahan yang

digunakan dalam penelitian ini ialah daun sayuran (cabe, tomat, dll) yang tidak terlalu

tua dan sehat (ujung daun tidak menguning).

Alat yang digunakan antara lain: mortar, pestle, tip, gelas ukur, tabung eppendorf,

tissue, gunting, plastik pembungkus, mikropipet, spatula, erlenmeyer, microwave, mesin

spektrofotometer, mesin PCR, oven, mesin vortex, timbangan analitik, stirer, pH meter,

mesin elektroforesis, mesin centrifuge, autoclave, mesin UV transluminator dan lemari es.

Cara Kerja

Langkah kerja yang dilakukan mulai dari isolasi DNA dari daun bawang merah, uji

kualitas, amplifikasi progran PCR hingga analisa hasil ialah sebagai berikut:

Isolasi DNA

Isolasi DNA menggunakan metode isolasi Karsinah et al.(2002) yang telah

dimodifikasi dengan langkah kerja sebagai berikut :

1. Tabung eppendorf diisi dengan 1 ml buffer ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M,

EDTA 0,002M dan Tris- HCl 0,1M) dan 5 µl mercaptoethanol.

2. Daun sayuran disterilisasi dengan alkohol dan ditimbang 0,5 gram.

31

3. 0,5 gram daun sayuran digerus dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair dan

ditambah PVP 10 mg, kemudian dimasukkan kedalam eppendorf yang sudah berisi 1

ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 µl mercaptoethanol. Setelah itu ekstrak daun divortex

hingga homogen.

4. Ekstrak daun diinkubasi dalam suhu 65oC selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap

10 menit. Kemudian ditambahkan 700 µl Chloroform : Isoamylalcohol/CHISAM

(24:1). Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen.

5. Ekstrak daun kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000

rpm. Supernatan dimasukkan tabung baru dan ditambahkan 700 µl CHISAM.

6. Larutan supernatan dan CHISAM disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan

6000 rpm. Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah isopropanol dingin. Larutan

tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak benang-benang putih dalam larutan.

Larutan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit.

7. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan

6000 rpm setelah itu supernatan dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA

pellet tidak ikut terbuang.

8. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer pencuci dengan cara menambahkan 200 μl

buffer pencuci ke dalam tube, kemudian cairan di buang. Pencucian ini dilakukan 2

kali. Setelah itu endapan DNA pellet dikering anginkan.

9. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan 500 μl buffer TE lalu ditambah 1 μl

RNAse.

10. Larutan DNA yang sudah ditambah RNAse diinkubasi selama 30 menit pada Suhu

37°C.

11. Setelah larutan DNA diinkubasi, ditambahkan 1 ml ethanol absolute dingin dan

dibolak-balik perlahan.

12. Larutan DNA lalu diinkubasi pada freezer selama 30 menit.

13. Setelah inkubasi selesai kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada

kecepatan 6000 rpm. Pelet kemudian dikering anginkan.

14. Pelet diresuspensi dengan 100 μl buffer TE dan disimpan dalam lemari es.

Pengujian Kualitas DNA

Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis. Langkah kerja yang dilakukan

dalam elektroforesis ialah sebagai berikut :

1. Campur bahan untuk membuat 0,8 % gel agarose, yaitu 0,32 mg agarose dan 40 ml

buffer TBE dalam erlenmeyer.

2. Kemudian larutan gel dihomogenkan dengan cara dipanaskan dalam microwave

32

hingga larutan gel benar- benar homogen.

3. Setelah tidak terlalu panas, larutan gel dituangkan pada cetakan dan didiamkan

sampai memadat.

4. Gel yang sudah memadat dipindah ke dalam mesin elektroforesis. Kemudian

tuangkan buffer TBE ke dalam mesin elektroforesis hingga seluruh bagian gel

terendam.

5. DNA hasil amplifikasi (5 μl) dicampur dengan loading dye (1 μl) dengan cara

pipeting, kemudian dimasukkan ke dalam sumuran/wells.

6. Proses dilakukan selama 20 menit dengan tegangan listrik 100 V.

7. Setelah proses elektroforesis selesai dilakukan, hasil elektroforesis direndam dalam

larutan Ethidium Bromide selama ± 15 menit.

Pengamatan

Lakukan pengamatan DNA yang diisolasi dengan cara mengamatai Gel

yang telah direndam dalam Ethidium Bromide dengan UV transluminator

dan didokumentasikan/difoto.

33

DAFTAR PUSTAKA

Anonymous, 2008. Report on of The Validation on” Dellaporta Derived”. Method for DNA Extraction from Ground Maize Grains and Seeds. CRF-GMFF: maize grains and seeds DNA Extraction

Ardiana, Wahyuni, Dwi. 2009. Teknik Pemberian Benzil Amino Purin Untuk Memacu Pertumbuhan Kalus dan Tunas Pada Kotiledon Melon (Cucumis melo L.). Buletin Teknik Pertanian Vol 14, No 2, 2009, hal 50-53.

CIMMYT, 1998. Molecular Marker Applications to Plant Breeding. In: Amboinet’s First Training Workshop, 9 November-4 Desember, El Batan, Mexico.76 p.

Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow.12(1):13-15.

George.E.F. And Sherrington.P.D. 1984. Plant Propagation by Tissue Cultures. Handbook and Directory of Commercial Laboratories. England: Exegenetics limited.

Gunawan, L. W. 1998. Teknik Kultur Jaringan. Bandung: Laboratorium Kutur Jaringan PAU Bioteknologi IPB, Bogor. Hal: 252.

Gunawan, L. W. 1998. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Jakarta: Direktorat

Jendral Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Hal: 304.

Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies, and R. L. Geneve. 1990. Plant

propagation principles and practices. 6th ed. Prentice Hall, Englewood Cliffs, N.J.

Kyte, L. 1990. Plants From Test Tubes. An Introduction to Micropropagation. Oregon: Timbers Press, Portland.

Moega, J.P. 1991. Dasar-Dasar Genetika dan Pemuliaan Tanaman. Jakarta:

Erlangga. Hlm. 204-208. Redenbaugh K., J. Nichol, M.E. Kossler, B. Paasch. 1984. Encapsulation of

somatic embryos for artificial seed production, in vitro Cell. Dev. Biol., 20:256-257

Rout GR, Mohapatra A, Mohan Jain S. 2006. Tissue culture of ornamental pot plant: A critical review on present scenario and future prospects. Biotechnology Advances 24 (2006) 531–560. Available online at www.scienedirect.com

Sambrook J., E.F. Fritsch and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning : A

laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

USA. Santoso, Untung dan Nursandi, Fatimah. 2001. Kultur Jaringan Tanaman.

Malang: Universitas muhammadiyah Malang (UMM Press). Sarmast MK, Salehi M, Salehi H. 2009. The Potential of Different Parts of

Sansevieria Trifasciata L. Leaf for Meristemoids Production. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3(3): 2506-2509

Sudarmadji. 2003. Penggunaan Benzil Amino Purin Pada Pertumbuhan Kalus Kapas Secara in vitro. Malang. Buletin Teknik Pertanian Vol 8, No 1, 2003.

Wattimena, G. A. 1992. Sitokinin, Bioteknologi Tanaman. Bandung:

Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor. Hal: 66-67. Wijayani, Ari. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Kanisius. Yusnita. 2003. Kultur Jaringan: Cara memperbanyak tanaman secara

efisien. Agro Media Pustaka, Jakarta

34

Yusnita. 2003. Kultur Jaringan Kiat Mengatasi Masalah Praktis. Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efesien. Jakarta: Agromedia Pustaka.

Yusnita, Pungkastiani W, Hapsoro D. 2011. In Vitro Organogenesis of Two Sansevieria Cultivars on Different Concentrations of Benzyladenine (BA). Agrivita 33 (2):147-153

Zulkarnain. 2009. Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta: Bumi Aksara.