Simplexa™ CMV

REF MOL2200

Rev. E

Saggio basato su PCR in tempo reale per la quantificazione in vitro del citomegalovirus (CMV).

Per uso diagnostico in vitro

USO PREVISTO

Il saggio Simplexa™ CMV di Focus Diagnostics è destinato alla quantificazione in vitro degli acidi nucleici del citomegalovirus (CMV) in campioni di sangue e/o di plasma mediante il 3M Integrated Cycler.

Questo dosaggio, da utilizzarsi insieme all’esame clinico e ad altri marcatori di laboratorio della progressione della malatt ia, è utile nella gestione clinica e nel monitoraggio di pazienti infettati da CMV.

Il saggio non è studiato per essere utilizzato come test di screening per la rilevazione della presenza di CMV nel sangue o in emoderivati ed è esclusivamente per uso professionale.

RIASSUNTO E SPIEGAZIONE

Il citomegalovirus (CMV) umano, un herpesvirus di tipo beta, appartiene alla famiglia degli herpesvirus umani.1 L’infezione da

CMV è comune in tutte le popolazioni umane e il 70% circa degli adulti è sieropositivo agli anticorpi anti-CMV, cioè è stato precedentemente infettato dal virus. L’infezione primaria da CMV in individui sani è asintomatica o determina una malattia leggera e aspecifica. Nelle donne in gravidanza l’infezione primaria da CMV può causare infezioni congenite del feto o del neonato e nelle persone che ricevono trapianti d’organi solidi l’infezione primaria può causare una malattia grave.

2,3 Come tutti gli herpesvirus, CMV determina un’infezione latente nell’ospite dopo guarigione dall'infezione acuta. La riattivazione del virus può avere luogo in caso di immunosoppressione o di altre malattie. CMV è una causa ben nota di morbilità e mortalità nei pazienti immunocompromessi.

4 Per avviare un trattamento preventivo è necessario diagnosticare precocemente la replicazione

del CMV misurando i livelli del virus nei pazienti ad alto rischio. Quando viene raggiunto un livello predeterminato del virus nel sangue o nel plasma, prima della comparsa dei sintomi clinici, può essere indicata una terapia antivirale o una variazione dei regimi di immunosoppressione. Una volta effettuata la diagnosi, è fondamentale eseguire un’analisi che permetta di monitorare e quantificare la presenza di CMV nel sangue e nel plasma per poter gestire in modo efficiente ed efficace l’infezione da CMV in questi pazienti.

5,6

Il saggio Simplexa™ CMV è stato allineato allo standard OMS per il CMV

7. La carica virale per il saggio CMV Simplexa™ è

riportata in unità internazionali/ml (UI/ml). PRINCIPI DELLA PROCEDURA

Il test è basato su un sistema di amplificazione e identificazione tramite PCR in tempo reale, che sfrutta una sonda-primer bifunzionale fluorescente per il rilevamento del DNA del citomegalovirus nel sangue intero e nel plasma. Il saggio prevede due fasi principali: (1) estrazione del DNA dai campioni ottenuti dai pazienti e (2) utilizzo di una sonda-primer bifunzionale fluorescente che, insieme ad un primer inverso, permette di amplificare un target specifico (per l’analita e per il controllo interno). Il saggio fornisce un risultato univoco; per identificare il DNA virale nel campione si utilizza come bersaglio una regione ampiamente conservata del gene UL83 del genoma di CMV. Un controllo interno permette di monitorare il processo di estrazione e rilevare l’eventuale inibizione della PCR. Il segnale di amplificazione ottenuto per ogni campione viene messo a confronto con una curva di calibrazione e quantificato.

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MATERIALI FORNITI

Il kit SimplexaTM

CMV di Focus Diagnostics contiene reagenti sufficienti per 100 reazioni.

Descrizione del kit

Nome del componente REF SIMBOLO CE SULL’ETICHE

TTA

Nome abbreviato

Colore del

tappo

Numero di

flaconcini

Reazioni per

flaconcino /kit

Volume per

flaconcino

Simplexa™ CMV Primer Mix MOL2201 REAG A PM Marrone 2 50/100 50 µl

Simplexa™ Master Mix MOL2000 REAG B MM Verde 2 50/100 200 µl

Simplexa™ Extraction & Amplification Control DNA

MOL9001 CONTROL IC IC Blu 3 50/150 250 µl

Simplexa™ CMV Low Positive Control MOL2202 CONTROL + LPC Bianco 6 1/6 200 µl

Simplexa™ CMV High Positive Control MOL2203 CONTROL ++ HPC Rosso 6 1/6 200 µl

Descrizione del componente

Componente Descrizione

Simplexa™ CMV Primer Mix (PM) [miscela di primer]

Primer marcati con colorante fluorescente specifici per la quantificazione di CMV e per il controllo interno.

Target Fluoroforo sonda (colorante)

Eccitazione Emissione Gene bersaglio

CMV FAM 495 nm 520 nm UL83 gene

Controllo interno Q670 644 nm 670 nm A. thaliana

gene

Simplexa™ Master Mix (MM) [miscela master] DNA polimerasi, tampone e dNTP

Simplexa™ Extraction & Amplification Control DNA (IC) [DNA di controllo di estrazione e amplificazione]

Un frammento di DNA di 577 bp derivato dal gene codificante per la N-metiltransferasi della subunità grande della ribulosio-1,5-bifosfato carbossilasi/ossigenasi della pianta di Arabidopsis thaliana.

Simplexa™ CMV Low Positive Control (LPC) [controllo positivo basso]

CMV inattivato in una matrice di base di origine umana.

Simplexa™ CMV High Positive Control (HPC) [controllo positivo alto]

CMV inattivato in una matrice di base di origine umana.

Simplexa™ CMV Barcode Card [card con codice a barre]

Parametri specifici per il test.

MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI

1. Simplexa™ CMV Quantitation Standards REF MOL2210

2. 3M Integrated Cycler con software Integrated Cycler Studio versione 5.0 o superiore

3. Universal Discs (dischi universali) per utilizzo su Integrated Cycler

4. Nastro di copertura per dischi universali

5. a Roche MagNA Pure LC System e materiali di consumo associati.

6. aT

MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche N. Cat. N. 03038505001)

7. b Strumento bioMérieux NucliSENS

® easyMAG™ con reagenti e materiali di consumo associati

8. b Pipetta multicanale Biohit/bioMérieux

9. b Piastra con strip per saggio ELISA

10. Micropipette singole, multicanale e/o a ripetizione con range di accuratezza di 1-10 µl, 10-100 µl e 100-1000 µl

11. Congelatore (scongelamento manuale) impostato tra -10 e -30 °C (per la conservazione dei componenti del kit)

12. Frigorifero da 2 a 8 °C (per i campioni e i componenti del kit scongelati)

13. Cabina di biosicurezza (cappa a flusso laminare) per le estrazioni

14. Microcentrifuga

15. Miscelatore vortex

16. Puntali sterili monouso RNAsi/DNAsi-free con filtro barriera per aerosol per micropipettatore

17. Provette da 1,5 ml in polipropilene per microcentrifuga (provette RNAsi/DNAsi-free consigliate, ma non necessarie) e rack dedicato

18. Guanti monouso senza talco

19. Acqua priva di nucleasi, usata durante l’estrazione e come No Template Control (NTC, controllo privo di templato) 20. Rack di raffreddamento per provette da microcentrifuga da 1,5 ml a Da utilizzarsi con la metodica di estrazione Roche MagNA Pure LC

b Da utilizzarsi con la metodica di estrazione bioMérieux easyMAG

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PERIODO DI VALIDITÀ E MANIPOLAZIONE

1. Conservare i reagenti ad una temperatura compresa tra -10 e -30 °C (non usare un congelatore no-frost).

2. Prima dell’uso, lasciare scongelare i reagenti a temperatura ambiente (tra 18 e 25 °C circa).

3. Non utilizzare i kit o i reagenti dopo la data di scadenza.

4. Utilizzare la miscela di reazione entro un’ora dalla preparazione. Conservare la m iscela di reazione tra 2 e 8 °C fino al momento dell’impostazione della PCR.

5. Una volta scongelati, conservare la miscela di primer, la miscela master e il DNA del controllo di estrazione e amplificazione a una temperatura compresa tra 2 e 8 °C per non oltre 30 giorni.

6. Non ricongelare la miscela di primer, la miscela master, il DNA del controllo di estrazione e amplificazione o i controlli positivi. 7. Non utilizzare insieme reagenti provenienti da lotti di kit differenti.

AVVERTENZE E PRECAUZIONI

1. Tutti i materiali di origine umana devono essere trattati come potenzialmente infettivi. I materiali di partenza da cui è stato derivato questo prodotto (inclusi i controlli) sono stati sottoposti a screening per l’antigene di superficie dell’epatite B e per la presenza di anticorpi contro l’epatite C e HIV-1/2 (AIDS) tramite metodi approvati dalla FDA, e sono risultati negativi ai test. Siccome, però, nessun metodo conosciuto offre la totale certezza che i prodotti derivati da sangue umano non possano trasmettere questi o altri agenti infettivi, tutti i controlli, i campioni di siero e l’attrezzatura che venga a contatto con questi campioni devono essere considerati potenzialmente infettivi e devono essere decontaminati o smaltiti seguendo le precauzioni necessarie per i materiali che pongono un rischio biologico. I CDC (Centers for Disease Control) e i National Institutes of Health statunitensi raccomandano di manipolare gli agenti potenzialmente infettivi in strutture con un livello di biosicurezza 2.

8,9

2. Durante la manipolazione dei reagenti del kit, indossare dispositivi di protezione individuale quali, in modo non limitativo, guanti e camice da laboratorio. Lavarsi bene le mani una volta terminato il test.

3. Non pipettare con la bocca.

4. Non fumare, bere, mangiare, manipolare lenti a contatto o truccarsi nelle aree in cui siano in utilizzo i reagenti del kit e/o campioni umani.

5. Smaltire i reagenti del kit non utilizzati e i campioni umani in base alle normative locali, provinciali e nazionali.

6. Il flusso di lavoro in laboratorio deve procedere in maniera unidirezionale, partendo dalle aree di preamplificazione e spostandosi poi nell'area di amplificazione/rilevamento: segue la sequenza di operazioni da eseguire dall’estrazione del campione fino all’amplificazione con PCR in tempo reale:

Iniziare con l’estrazione del campione, quindi configurare lo strumento per la PCR in tempo reale, preparare i reagenti e infine eseguire l’amplificazione mediante PCR in tempo reale.

Non effettuare spostamenti di forniture e apparecchiature tra un’area e l’altra.

Le forniture e le apparecchiature usate per la preparazione dei campioni non devono essere impiegate per le attività di preparazione dei reagenti o per processare DNA amplificato o altre fonti dell’acido nucleico bersaglio.

Tutte le forniture e le apparecchiature per l’amplificazione devono essere sempre tenute nell’area dedicata alla strumentazione per PCR in tempo reale.

I dispositivi di protezione individuale, quali guanti monouso e camici da laboratorio, devono essere specifici per ogni area. 7. La contaminazione dei campioni dei pazienti o dei reagenti può determinare risultati errati. Utilizzare tecniche asettiche.

8. Pipettare e manipolare i reagenti con cautela per evitare di mescolare i campioni con quelli dei pozzetti adiacenti.

9. Utilizzare tecniche di pipettamento adeguate e mantenere lo stesso tipo di tecnica per l'intera procedura per assicurare valori ottimali e riproducibili.

10. Non sostituire o miscelare reagenti provenienti da lotti di kit diversi o di altri produttori.

11. Non scambiare i tappi dei flaconcini di reagente. Questo può comportarne la contaminazione e compromettere i risultati del test.

12. Utilizzare unicamente il protocollo descritto nel presente foglio illustrativo. Ogni deviazione dal protocollo o l’uso di tempi o temperature diversi da quelli specificati possono comportare risultati errati.

13. L’impostazione del saggio deve essere eseguita a temperatura ambiente (in un intervallo compreso tra 18 e 25 °C). Mentre si miscelano i reagenti, mantenere freddi gli enzimi utilizzando un blocco refrigerante.

14. Non riutilizzare dischi universali già esposti ai campioni dei pazienti o ai reagenti.

15. Smaltire i dischi usati senza rimuovere il nastro di copertura.

16. Se sullo stesso disco sono configurati diversi kit o lotti Simplexa™

, testare i controlli positivi e i controlli no template di ogni kit.

17. La miscela master contiene una percentuale di glicerolo >1%, che può causare irritazione in caso di inalazione o contatto con la pelle. In caso di inalazione o contatto con la pelle, adottare le misure di primo soccorso. Osservare le consuete misure precauzionali quando si manipolano sostanze chimiche. Il prodotto non è soggetto all’obbligo di codifica in base alle direttive sui materiali pericolosi.

18. Si sconsiglia la conservazione protratta dei campioni estratti a temperature comprese tra 2 e 8 °C, poiché non sono stati effettuati test per stabilire le prestazioni del dosaggio in queste condizioni.

19. Se la confezione o il suo contenuto appaiono rotti o danneggiati, non usarli e contattare Focus Diagnostics. I recapiti si trovano nell’ultima pagina di questo documento.

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ISTRUZIONI PER L’USO

A. RACCOLTA DEI CAMPIONI

I tipi di campione accettabili sono sangue intero o plasma prelevati tramite puntura venosa. Non utilizzare, per la raccolta del campione, provette contenenti l’anticoagulante eparina. L’eparina inibisce la PCR.

B. AREA DI ESTRAZIONE DEI CAMPIONI

Operare in un’area dedicata all’estrazione dei campioni e dei controlli. La preparazione dei campioni per l'estrazione deve essere eseguita in una cabina di biosicurezza.

Estrazione mediante il metodo Roche MagNA Pure LC

1. Estrarre gli acidi nucleici dai campioni dei pazienti e dai controlli del dosaggio utilizzando il kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Isolation e lo strumento Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Per eseguire l’estrazione degli acidi nucleici utilizzando questo kit, fare riferimento alle istruzioni per l'uso del produttore.

2. Nel menu a discesa “Protocol” [Protocollo] sul sistema MagNA Pure LC, selezionare “Total NA” [Acidi nucleici totali], quindi “Total NA Variable_elution_volume.blk” dall’elenco. In questo modo verranno caricate le impostazioni adeguate per la sessione.

3. Il Sample Protocol [Protocollo campione] deve essere “Total NA Variable_elution_volume”.

4. Impostare il Sample Volume [Volume campione] su 200 µl e il volume di eluizione su 50 µl.

5. Impostare il volume di diluizione su zero per tutti i campioni.

6. Verificare che il Post Elution Protocol [Protocollo post-eluizione] sia impostato su “None” [Nessuno].

7. Verificare che i campioni e i controlli siano correttamente posizionati sulla cartuccia campione.

8. Miscelare ciascun campione e il controllo positivo alto (HPC) e basso (LPC) per 2-4 secondi con il vortex, quindi centrifugare brevemente per far sì che il contenuto raggiunga il fondo della provetta.

9. Pipettare 200 µl di ciascun campione, di LPC, di HPC e del controllo no template nella posizione corrispondente della cartuccia campione.

10. Controllare visivamente il livello dei campioni e dei controlli nella cartuccia campione per accertarsi che i campioni siano stati effettivamente aggiunti.

11. Miscelare 2 volte con colpi di vortex il controllo interno di estrazione ed amplificazione (IC) e centrifugare brevemente per far scendere il contenuto sul fondo della provetta.

12. Per ciascun set di 16 campioni (campioni 1-16), pipettare 100 µl di controllo interno in 6 ml di tampone di lisi in una provetta conica. Miscelare brevemente con il vortex. Aggiungere al vassoio corretto sullo strumento di estrazione MagNA Pure.

o Se per esempio si estraggono più di 16 campioni (campioni 17-32), pipettare 200 µl di controllo interno in 12 ml di tampone di lisi in una provetta conica. Miscelare brevemente con il vortex. Aggiungere al vassoio corretto sullo strumento di estrazione MagNA Pure.

13. Trasferire la cartuccia campione sullo strumento MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor e avviare la sessione di estrazione.

14. Una volta completata l’estrazione degli acidi nucleici, la cartuccia contenente i controlli e i campioni dei pazienti estratti può essere rimossa dal MagNA Pure e sigillata. Conservare il DNA estratto ad una temperatura compresa tra 2 e 8 °C fino al suo utilizzo. Si sconsiglia di conservare i campioni estratti a questa temperatura per lunghi periodi. Mantenere i campioni di DNA estratti su un blocco refrigerante durante il caricamento del disco.

Estrazione mediante il metodo bioMérieux NucliSENS

® easyMAG™

1. Per il funzionamento dello strumento e del software, fare riferimento al manuale d'uso NucliSENS® easyMAG™.

2. Sul software NucliSENS® easyMAG™, scegliere Generic template [Templato generico] con le seguenti impostazioni:

Default Request [Richiesta predefinita]:

Generic 2.0.1 (or equivalent) [o equivalente]

Run Name Prefix [Prefisso nome sessione]:

(as appropriate) [come appropriato]

Sample ID prefix [Prefisso ID campione]:

(as appropriate) [come appropriato]

Sample Type [Tipo di campione]: Primary [Primario] Workflow Defaults [Valori predefiniti flusso di lavoro]:

On-board lysis Incubation [Incubazione di lisi integrata] On-board Silica Incubation [Incubazione silice integrata] Sample Addition Guidance Off [Aggiunta assistita campione disattivata]

Reagent Tracking [Tracciamento reagenti]:

Lysis, Silica, Internal Control reagent tracking disabled [Tracciamento reagenti di lisi, silice, controllo interno disattivato]

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3. Inserire le informazioni sul singolo campione nella schermata Extraction Request [Richiesta estrazione] come indicato di seguito.

Sample ID [ID campione]: (Enter sample name) [Inserire il nome del campione] Request [Richiesta]: Generic 2.0.1 (or equivalent) [o equivalente] Volume (ml): 0,200 Eluate [Eluato] (µl): 50 Type [Tipo]: Primary [Primario] Priority [Priorità]: Normal [Normale] Matrix [Matrice]: Other [Altro]

4. Creare una Extraction Run [Sessione di estrazione] nel software NucliSENS® easyMAG™ in base al manuale d'uso.

5. Miscelare ciascun campione e il controllo positivo alto (HPC) e basso (LPC) per 2-4 secondi con il vortex, quindi centrifugare brevemente per far sì che il contenuto raggiunga il fondo della provetta.

6. Pipettare 200 μl di campione, di LPC, HPC o del controllo no template nei contenitori dei campioni. 7. Miscelare il controllo interno due (2) volte con colpi di vortex e centrifugare brevemente per far scendere il contenuto sul

fondo della provetta. 8. Pipettare 5 µl di controllo interno in ogni campione e in tutti i pozzetti di controllo. Sostituire il puntale tra un campione e

l’altro. 9. Caricare i contenitori dei campioni, i nuovi materiali monouso per l'aspiratore e i reagenti sullo strumento easyMAG™ in

base al manuale d'uso. 10. Avviare la lisi integrata e incubare i campioni lisati per 10 minuti prima di aggiungere la miscela di silice magnetica. 11. Durante il periodo di incubazione della lisi, preparare la miscela di silice magnetica. Mescolare la silice e diluire in acqua

priva di nucleasi aggiungendo 1 parte di silice magnetica a 3 parti di acqua priva di nucleasi (per esempio, 270 μl di silice magnetica + 810 μl di acqua priva di nucleasi). Preparare un minimo di 135 μl di miscela di silice magnetica per campione.

12. Per trasferire la miscela di silice nei pozzetti della strip per ELISA, mescolare la miscela di silice magnetica e usare 1

puntale e la modalità operativa P2 della pipetta Biohit. Premere Start [Inizia].per aspirare 1050 μl di miscela di silice

magnetica, quindi premere di nuovo Start [Inizia] scartando il primo colpo nella provetta della miscela di silice. Premere Start [Inizia] per erogare 125 μl di miscela di silice magnetica negli 8 singoli pozzetti della strip per ELISA. Se

necessario, ripetere per le altre strip per ELISA. 13. Dopo i 10 minuti dell'incubazione di lisi, utilizzare 8 puntali (per ogni strip per ELISA) e la modalità operativa P3 della

pipetta Biohit per trasferire 100 μl di miscela di silice magnetica nel contenitore di ogni campione. Posizionare i puntali nei pozzetti delle strip per ELISA e premere Start [Inizia] per miscelare e aspirare la miscela di silice magnetica.

14. Trasferire la miscela di silice magnetica nell’appropriato contenitore del campione e posizionare il puntale nel campione al di sotto del livello del liquido. Premere Start [Inizia] per aspirare, distribuire e mescolare (x3) la silice magnetica e i

campioni. Assicurarsi che il puntale rimanga sotto il livello del liquido, per garantire una miscelazione corretta. 15. Ripetere i passaggi 13 e 14 negli altri contenitori dei campioni. 16. Dopo l'aggiunta della miscela di silice magnetica a tutti i contenitori dei campioni, avviare la sessione di estrazione. 17. Al termine della sessione, togliere i contenitori dei campioni dallo strumento. Se i campioni non devono essere utilizzati

subito, trasferirli in provette singole per ridurre al minimo la possibilità che la silice magnetica ricada nel campione. Conservare il DNA estratto a una temperatura compresa tra 2 e 8 °C fino al suo utilizzo. Si sconsiglia di conservare i campioni estratti a questa temperatura per lunghi periodi. Tenere il DNA estratto su un blocco refrigerante durante il caricamento del disco.

C. IMPOSTAZIONE DELLO STRUMENTO PER PCR IN TEMPO REALE

1. Fare riferimento al Manuale dell’operatore dell’Integrated Cycler per informazioni dettagliate su come configurare il software Integrated Cycler Studio e aggiungere una definizione dell’analisi, impostare le sessioni e analizzare le sessioni compiute con l’Integrated Cycler.

Nota: Prima di eseguire una sessione predittiva, deve essere definita una curva standard valida (sessione di calibrazione).

D. AREA DI PREPARAZIONE REAGENTI

Area dedicata alla preparazione della miscelazione di reazione per il dosaggio Simplexa™ CMV.

1. Lasciare scongelare la miscela di primer e la miscela master a temperatura ambiente (tra 18 e 25 °C circa). Ogni flaconcino compreso nel kit contiene reagente sufficiente per 50 reazioni. Prima di ogni uso, mescolare delicatamente la miscela di primer e la miscela master, quindi centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta.

2. Preparare il volume richiesto di miscela di reazione in una provetta in polipropilene per microcentrifuga di dimensioni adeguate, pipettando il volume di ogni componente come indicato nella tabella sotto.

Volumi della miscela di reazione

Reagente Miscela di reazione Volume / 1 reazione

Miscela di reazione Volume / 10 reazioni

Simplexa™ Master Mix 4,0 µl 40 µl Simplexa™ CMV Primer Mix 1,0 µl 10 µl

Volume totale 5,0 µl 50 µl

3. Mescolare delicatamente la miscela di reazione pipettando 8-10 volte. 4. Centrifugare brevemente in modo che il contenuto raggiunga il fondo della provetta.

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5. Procedere all’impostazione della PCR. 6. Utilizzare la miscela di reazione entro un’ora dalla preparazione. Se l’impostazione della PCR non viene eseguita

immediatamente, conservare la miscela di reazione preparata ad una temperatura compresa tra 2 e 8 °C.

E. AREA DI AMPLIFICAZIONE MEDIANTE PCR IN TEMPO REALE

Operare in un’area dedicata alla preparazione del Universal Disc a 96 pozzetti per il saggio Simplexa™ CMV.

1. Aggiungere 5,0 µl di miscela di reazione a ogni pozzetto. 2. Aggiungere 5,0 µl dei controlli positivi estratti ai pozzetti “HPC” e “LPC”. 3. Aggiungere 5,0 µl del campione paziente estratto al giusto pozzetto “S”. 4. Aggiungere 5,0 µl del controllo no template estratto al pozzetto “NTC”. 5. Coprire il disco con il Universal Disc Cover Tape. 6. Aprire il coperchio dell’Integrated Cycler. 7. Posizionare il Universal Disc sigillato sulla piastra. 8. Chiudere delicatamente il coperchio. 9. Fare clic su Run [Esegui]. 10. Fare clic su Start [Inizia].

F. ANALISI DEI DATI

1. Fare riferimento al Manuale dell’operatore dell’Integrated Cycler per informazioni dettagliate su come eseguire l’analisi dei dati e su come esportare le sessioni, se necessario.

CONTROLLO DI QUALITÀ

Ogni laboratorio deve stabilire i propri intervalli per il controllo qualità e la frequenza di tali controlli, in base alle leggi e ai regolamenti locali applicabili e alle buone pratiche di laboratorio standard.

REFERTAZIONE DEI RISULTATI

1. Validità della sessione

Determinare se la sessione è valida esaminando i risultati per CMV e per il controllo interno (IC) per i pozzetti del controllo positivo basso (LPC), del controllo positivo alto (HPC) e del controllo no template (NTC). Perché la sessione sia valida, tutti e tre i controlli devono soddisfare i criteri di accettabilità. Se la sessione non è valida, tutti i campioni dei pazienti devono essere nuovamente analizzati.

Criteri di accettabilità

Controllo CMV DNA del controllo di estrazione e

amplificazione (IC) No Template Control (NTC) Non rilevato Rilevato Low Positive Control (LPC) Entro i valori di tolleranza indicati

sull’etichetta specifica per il lotto Non applicabile

High Positive Control (HPC) Entro i valori di tolleranza indicati sull’etichetta specifica per il lotto Non applicabile

L’NTC soddisfa i criteri di accettabilità se CMKV non viene rilevato e il controllo interno viene rilevato. La rilevazione di CMV nell’NTC indica che i campioni potrebbero aver subito una contaminazione durante il processamento.

L’LPC soddisfa i criteri di accettabilità se al suo interno CMV viene rilevato entro i valori di tolleranza (come indicato sull’etichetta specifica per il lotto); il controllo interno dovrebbe essere rilevato, ma ciò non rappresenta un requisito indispensabile.

L’HPC soddisfa i criteri di accettabilità se al suo interno CMV viene rilevato entro i valori di tolleranza (come indicato sull’etichetta specifica per il lotto); il controllo interno dovrebbe essere rilevato, ma ciò non rappresenta un requisito indispensabile.

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2. Interpretazione dei risultati

Interpretazione dei risultati

Esempio Valore CMV Valore IC* Interpretazione

1 Non rilevato Rilevato CMV non rilevato

2 < 713 UI/ml N/A CMV rilevato, sotto il limite inferiore di quantificazione (LLoQ, Lower Limit of Quantitation).

3 X UI/ml N/A CMV rilevato ad una specifica concentrazione.

4 > 3,96 x 108 UI/ml N/A CMV rilevato, al di sopra del limite superiore di

quantificazione (ULoQ, Upper Limit of Quantitation). 5 Non rilevato Non rilevato Non valido, estrarre nuovamente e ripetere.

3. Validità dei risultati ottenuti per i campioni Un campione è considerato valido se, alternativamente,

1. CMV non viene rilevato e il controllo interno è rilevato.

2. CMV è rilevato. Non è necessario che il controllo interno sia rilevato per risultati positivi per CMV.

3. Per ogni risultato si dovrà esaminare la curva di amplificazione, con particolare attenzione a quelli per cui venga visualizzato il messaggio “Data Quality” [Qualità dei dati]. Una curva di amplificazione valida mostra un aumento esponenziale uniforme. Fare riferimento al manuale dell’operatore per le azioni consigliate.

LIMITAZIONI

1. Per uso diagnostico in vitro.

2. Solo per l'esportazione.

3. Il test deve essere eseguito solo da personale adeguatamente formato e che abbia acquisito familiarità con le procedure d’esame e l'interpretazione dei risultati.

4. Il software 3M Integrated Cycler Studio mantiene in memoria il file dell'ultima calibrazione valida per quantificare i campioni ottenuti dai pazienti. L’estrazione deve essere eseguita utilizzando per gli standard di quantificazione e i campioni ottenut i dai pazienti la stessa metodica; in caso contrario, si possono ottenere risultati errati.

5. Quando il test venga usato per il monitoraggio di un paziente, deve essere mantenuto lo stesso metodo di estrazione per tutte le determinazioni, altrimenti i risultati potrebbero non essere comparabili.

6. Tutti i risultati derivanti da questo e da altri test devono essere messi in correlazione con l'anamnesi clinica, i dati epidemiologici e gli altri dati in possesso del medico che esamina il paziente.

7. La prevalenza dell’infezione influisce sul valore predittivo del test.

8. Come accade per altri test, un risultato negativo non esclude la presenza di infezioni da CMV.

9. Si possono avere risultati falsi negativi quando il microrganismo infettante presenti mutazioni nuove, inserzioni, delezioni o riarrangiamenti del genoma.

10. Si possono avere risultati falsi negativi se il campione contiene un numero inadeguato di microrganismi a causa di basse cariche virali, prime fasi della malattia, prelievo, trasporto o manipolazione non corretti.

11. Come accade per altri test, si possono avere risultati falsi positivi. In alcuni scenari, può essere indicato ripetere il test o eseguirlo con un dispositivo differente.

12. Le prestazioni di questo test nello screening del sangue o degli emoderivati per la rilevazione di CMV non sono state definite.

13. Questo test non può escludere la presenza di malattie causate da altri patogeni batterici o virali.

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CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI

COMPARAZIONE DEI METODI

Il confronto con un dispositivo provvisto di marcatura CE è stato eseguito usando un’analisi di regressione lineare di Passing-Bablok sull’intervallo di linearità dei due saggi. I parametri di regressione lineare (pendenza e intercetta) all’intervallo di confidenza del 95% sono stati calcolati con il metodo di Passing-Bablok.

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RIPRODUCIBILITÀ

Gli studi di riproducibilità sono stati condotti usando un pannello costituito da campioni di plasma e di sangue intero preparati ad hoc e addizionati con diverse concentrazioni di un ceppo di CMV. Il pannello conteneva un insieme di campioni negativi (matrice non addizionata), positivi bassi (da 2 a 4 volte circa il LOD), positivi medi (da 8 a 10 volte circa il LOD) e positivi alti (prossimi all’intervallo di rilevazione superiore del saggio) per ogni matrice. In aggiunta a questo, si sono inclusi nel pannello tutti i livelli di calibratore ottenuti da un unico lotto di standard di quantificazione per CMV (n = 5) per analizzarli come “sconosciuti”.

Il pannello del campione (n=13) includeva il controllo positivo basso (LPC), il controllo positivo alto (HPC) e un controllo no template (NTC) ed è stato estratto una volta al giorno per ogni operatore con la strumentazione MagNA Pure LC, usando il kit MagNA Pure Total Nucleic Acid Isolation e il sistema NucliSENS easyMAG™, con i corrispondenti reagenti. Il pannello di DNA estratto è stato in seguito analizzato in quattro replicati mediante lo strumento Integrated Cycler. La tabella seguente riepiloga i risultati.

L’NTC, il plasma negativo, il sangue intero negativo e uno standard di quantificazione sono stati analizzati nel quadro del pannello di riproducibilità e sono risultati tutti riproducibili ma fuori dall’intervallo riportabile del saggio e quindi non inclusi nella riproducibilità quantitativa.

Riproducibilità quantitativa - QCMV

Componenti della deviazione standard

Tipo di campione

Nome del campione

Metodo di estrazione

Livello di concentrazion

e atteso (UI/ml)

Log del livello di

concentrazione atteso (UI/ml)

Media geometrica osservata

(UI/ml)

Media logaritmica osservata

(UI/ml)

N. di risultati

misurabili

Tra strumenti

Tra giorni

Tra sessioni

Nella stessa

sessione

Totale

CONTROLLI

HPC

MagNA Pure

2,00E+06 6,301

2,00E+06 6,300 80 0,060 0,000 0,056 0,029 0,087

easy MAG 2,53E+06 6,402 80 0,022 0,039 0,042 0,016 0,064

LPC

MagNA Pure

2,00E+04 4,301

2,00E+04 4,301 80 0,000 0,000 0,090 0,066 0,112

easy MAG 2,14E+04 4,330 80 0,000 0,024 0,045 0,037 0,063

PLASMA

REPRO 6

MagNA Pure

5,00E+07 7,699

1,05E+08 8,021 80 0,048 0,034 0,064 0,023 0,090

easy MAG 3,19E+08 8,504 72 0,000 0,053 0,050 0,026 0,077

REPRO 7

MagNA Pure

7,10E+03 3,851

9,72E+03 3,988 80 0,094 0,033 0,063 0,063 0,133

easy MAG 3,42E+04 4,534 80 0,000 0,033 0,069 0,036 0,084

REPRO 8

MagNA Pure

2,84E+03 3,453

3,11E+03 3,493 80 0,121 0,042 0,000 0,150 0,197

easy MAG 1,26E+04 4,099 80 0,000 0,000 0,065 0,036 0,075

QS

REPRO 2

MagNA Pure

2,05E+07 7,312

2,18E+07 7,338 80 0,000 0,000 0,056 0,020 0,059

easy MAG 2,02E+07 7,305 80 0,011 0,018 0,023 0,015 0,035

REPRO 3

MagNA Pure

2,10E+05 5,322

2,24E+05 5,351 80 0,000 0,000 0,046 0,025 0,053

easy MAG 2,06E+05 5,313 80 0,013 0,000 0,027 0,023 0,037

REPRO 4

MagNA Pure

1,87E+04 4,272

2,15E+04 4,333 80 0,047 0,000 0,040 0,079 0,100

easy MAG 1,91E+04 4,282 80 0,000 0,000 0,029 0,047 0,055

REPRO 5

MagNA Pure

4,74E+03 3,676

4,25E+03 3,629 80 0,000 0,000 0,000 0,138 0,138

easy MAG 5,13E+03 3,710 80 0,000 0,022 0,029 0,088 0,095

SANGUE INTERO

REPRO 10

MagNA Pure

7,10E+03 3,851

1,47E+04 4,168 80 0,085 0,000 0,090 0,069 0,142

easy MAG 4,08E+03 3,611 77 0,060 0,071 0,322 0,093 0,348

REPRO 11

MagNA Pure

2,84E+03 3,453

5,97E+03 3,776 80 0,069 0,000 0,099 0,101 0,157

easy MAG 2,23E+03 3,348 73 0,126 0,118 0,162 0,117 0,264

REPRO 9

MagNA Pure

5,00E+07 7,699

1,22E+08 8,087 80 0,083 0,068 0,066 0,038 0,132

easy MAG 3,78E+07 7,578 80 0,137 0,000 0,231 0,016 0,269

Simplexa™ CMV Pagina 11

SENSIBILITÀ ANALITICA / LIMITE DI RILEVAZIONE

I campioni LoD usati per questo studio erano stati ottenuti ad hoc da uno stock a concentrazione nota di un ceppo di CMV addizionato a matrici di plasma e sangue intero risultate clinicamente negative. Il pannello includeva una matrice negativa non addizionata e diverse concentrazioni di CMV prossime al LoD previsto, determinato in un’analisi di verifica.

Lo studio è consistito in diverse sessioni di valutazione del LoD del kit sperimentale Simplexa™ CMV, usando due metodi di estrazione.

Per determinare il LoD sono state eseguite 3 diverse estrazioni e sessioni di PCR. Ogni campione estratto è stato testato in otto replicati (un’estrazione, 8 pozzetti) insieme ai controlli (in singolo replicato). In totale, ogni membro del pannello è stato testato in 24 replicati. La concentrazione più bassa che ha fornito un tasso di rilevamento ≥95% secondo l’analisi Probit era il LoD. Il protocollo LoD è stato eseguito per ogni tipo di campione, con ciascuno dei due metodi di estrazione. I singoli valori del LoD sono illustrati nella tabella seguente. Il LoD del saggio CMV basato sul LoD più elevato per tutti i tipi di campione e di metodi di estrazione è risultato pari a 711 UI/ml.

Plasma Sangue intero

MagNA Pure EasyMag MagNA Pure EasyMag

UI/ml 711 99* 568 585

Copie/ml 180 25* 145 148

*Il LoD di questo tipo di campione è stato determinato come la concentrazione più bassa con rilevamento >95% su 24 replicati.

LIMITE INFERIORE DI QUANTIFICAZIONE (LLoQ, Lower Limit of Quantitation)

Il LLoQ è stato definito come il valore di concentrazione più basso per il quale la deviazione standard era ≤0,3 log UI/ml per tutti i tipi di campione e di metodi di estrazione. Il LLoQ è risultato pari a 713 UI/ml.

LINEARITÀ

La linearità è stata determinata usando campioni ottenuti ad hoc da uno stock a concentrazione nota di un ceppo di CMV addizionato a matrici di plasma e sangue intero risultate clinicamente negative. Il pannello consisteva di almeno 10 pool di copie note, che coprivano l'intervallo di linearità atteso. In questi pool, almeno 3 concentrazioni erano prossime al limite inferiore di quantificazione (LLOQ), 2 erano prossime al limite superiore di quantificazione (ULOQ) e le rimanenti erano distribuite in modo approssimativamente omogeneo tra il LLOQ e l’ULOQ. Ogni campione è stato analizzato in modo casuale, in almeno 3 replicati. Il protocollo di linearità è stato eseguito per ogni tipo di campione, con ciascuno dei due metodi di estrazione. I singoli valori dell’intervallo lineare sono illustrati nella tabella seguente.

Plasma Sangue intero

MagNA Pure EasyMag MagNA Pure EasyMag

UI/ml da 713 a 3,96 × 108 da 396 a 3,96 × 10

8 da 396 a 3,96 × 10

8 da 396 a 3,96 × 10

8

Copie/ml da 180 a 1,00 × 108 da 100 a 1,00 × 10

8 da 100 a 1,00 × 10

8 da 100 a 1,00 × 10

8

Simplexa™ CMV Pagina 12

Grafico della linearità del plasma con estrazione easyMAG

Grafico della linearità del sangue intero con estrazione easyMAG

Simplexa™ CMV Pagina 13

Grafico della linearità del plasma con estrazione MagNA Pure

Grafico della linearità del sangue intero con estrazione MagNA Pure

Simplexa™ CMV Pagina 14

INTERVALLO RIPORTABILE

Tutti i metodi di estrazione e i tipi di campioni erano lineari fino a <3,96 x 108 UI/ml. L’intervallo riportabile più basso del saggio era

basato sul tipo di campione e sul metodo di estrazione, con il valore più elevato per il limite inferiore di quantificazione (LLoQ) in UI/ml, che rientrava ugualmente nell’intervallo lineare. L’intervallo riportabile del saggio è risultato di >713 UI/ml - < 3,96 × 10

8

UI/ml. I campioni che si trovano al di sopra dell’intervallo lineare saranno riportati come >3,96 × 108 UI/ml e i campioni che si

trovano al di sotto dell’intervallo riportabile saranno riportati come <713 UI/ml.

REATTIVITÀ ANALITICA / CROSS-REATTIVITÀ

È stata valutata la specificità analitica/cross-reattività del saggio Simplexa™. Gli studi hanno indicato che i primer sono specifici per CMV e non danno reazioni crociate con altri virus o batteri che causano sintomi clinici simili o che sono presenti nella normale flora dei tipi di campione in questione. Ogni potenziale corss-reagente è stato analizzato in tre replicati.

Organismo

(plasma) Risultato Organismo

(sangue intero) Risultato

HBV (Materiali di controllo usati senza diluizioni)

Non rilevato NA NA

HCV (Materiali di controllo usati senza diluizioni)

Non rilevato NA NA

Adenovirus Non rilevato Adenovirus Non rilevato

HIV-1 Non rilevato HIV-1 Non rilevato

HIV-2 Non rilevato HIV-2 Non rilevato

HSV-1 Non rilevato HSV-1 Non rilevato

HSV-2 Non rilevato HSV-2 Non rilevato

HHV-6 Non rilevato HHV-6 Non rilevato

JCV Non rilevato JCV Non rilevato

HHV-7 Non rilevato HHV-7 Non rilevato

HHV=8 Non rilevato HHV-8 Non rilevato

Rubella Non rilevato Rubella Non rilevato

Parvovirus Non rilevato Parvovirus Non rilevato

Toxoplasma gondii Non rilevato Toxoplasma gondii Non rilevato

VZV Non rilevato VZV Non rilevato

EBV Non rilevato EBV Non rilevato

HTLV-1 Non rilevato HTLV-1 Non rilevato

INTERFERENZA

Il saggio Simplexa™ CMV identifica in modo specifico il DNA di CMV in presenza di potenziali agenti interferenti. È stato determinato che le sostanze interferenti sono sostanze probabilmente presenti nei campioni del paziente, possibili sostanze esogene presenti nei campioni o sostanze usate per il prelievo dei campioni. Lo studio è stato condotto su CMV e agenti interferenti addizionati nella matrice negativa del sangue intero e del plasma. Le sostanze interferenti analizzate sono state: azatioprina, ciclosportina, ganciclovir, idrossiclorochina, prednisone, abacavir, efavirenz e darunavir. Non è stata osservata alcuna interferenza.

CONTAMINAZIONE DA CARRYOVER

Il carryover di amplificato è stato valutato per lo strumento e il Universal Disc utilizzando altri saggi. Questi studi hanno ricercato la presenza di contaminazioni in campioni altamente negativi. Ogni studio è stato impostato posizionando alternativamente su ogni disco un campione altamente positivo ed uno altamente negativo. L’effetto da carryover è stato valutato confrontando il tasso di negativi osservato per i campioni altamente negativi con il tasso atteso, nelle normali condizioni di riproducibilità. Nei test eseguiti non è stato osservato alcun effetto dovuto a contaminazioni da carryover.

Simplexa™ CMV Pagina 15

BIBLIOGRAFIA

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Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A).

L’uso delle sonde Scorpions

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