PERKEMBANGAN DAN PENGGUNAAN HEWAN TRANSGENIK

Perkembangan perbaikan genetik dengan transgenesis lambat

Strategi introduksi gen ke kromosom hewan tk tinggi:-Gen diinjeksikan ke inti sel telur yang telah dibuahi-Telur diletakkan di dalam betina reseptif-Beberapa keturunan membawa gen sasaran-Hewan yang membawa gen sasaran di dalam sel nutfah disilangkan untuk mendapat galur baru

Transgenesis pada hewan alat:-mempelajari ekspresi gen dan perkembangan-hewan model untuk penyakit manusia-protein farmasetik bagi manusia (susu dari kelenjar susu)

Perbaikan genetik ternak dan hewan domestik perkawinan+ seleksi waktu lama & mahal

Produksi protein melalui kelenjar susu:Melalui air susu, karena:

1. dapat diperbaharui2. dapat diambil terus tanpa

membahayakan hewannya

-awal perkembangan transgenesis pada hewan-sejak 1980an: 100an gen galur baruKontribusi:-mengetahui regulasi ekspresi gen, perkembangan sel-mengetahui perkembangan tumor, spesifisitas imunologi-mengetahui proses biologi fundamental-pengujian kelayakan produksi obat terapetik manusia-model penyakit manusia

Tikus Transgenik

Protein farmasetik yang dihasilkan dalam air susu harus:

1. tidak mempunyai efek sampingan thd proses fisiologi dari hewan transgenik

2. melalui proses pascatranslasi mirip protein manusia

3. mudah melakukan purifikasi

Introduksi DNA sasaran ke dalam sel inangmelalui:1. Vektor retrovirus sel embrio tahap

awal betina reseptif2. Mikroinjeksi ke inti sel sperma yang

membesar (pronukleus jantan) dari sel telur yang telah dibuahi

3. Sel batang embrionik embrio stadia awal betina reseptif

Metode vektor retrovirus-keuntungan: integrasi transgen ke dalam

genom efektif-kerugian:

-transgen ukuran kecil (< 8 kb) shg transgen kekurangan regulator ekspresi gen

-genom retrovirus dapat melakukan replikasi walaupun menggunakan vektor defektif replikasisecara komersial jarang (tidak)digunakan

Metode mikroinjeksi DNATahapan:1. Meningkatkan jumlah telur terbuahi

stimulasi superovulasi pada betinadonorCara: serum kuda hamil injeksi48 jam: chorionic gonad-otropin manusia 35 sel telur (normal: 5-10sel)

2. Betina tsb x jantan telur diambil dari oviduct

3. Telur diinjeksi (segera)Transgen linier (bebas DNAprokaryot)

4. Telur ditanam di induk betina angkat 5. Identifikasi tikus transgenik

Tikus transgenik x WT integrasi transgen?

Tikus transgenik (lanjutan)

Injeksi sel telurMamalia:Sperma masuk ke sel telur inti sel sperma (pronukleus jantan)terpisah dari inti sel telur. Setelah inti sel telur selesai meiosis pronukleus betina fusi dengan pronukleus jantan (karyogami).Pronukleus jantan > pronukleus betina injeksi dilakukan pada pronukleus jantan (sel telur dapat difiksasi dan diorientasikan)

Penanaman sel telur ke induk betina palsu25-40 sel telur ditanam di betina angkat (bedah mikro) yang telah dibuat hamil palsu. Hamil palsu: perkawinan dengan jantan mandul (vasektomi) persiapan uterus untuk implantasi3 minggu lahir anak tikus

Identifikasi tikus transgenikDNA (ekor/darah) hibridisasi southern atau PCRTikus transgenik x WT integrasi transgen?Keturunan x sesamanya homozigot transgenik

66% telur hidup setelah diinjeksi25% telur yang ditanam berkembang menjadi anak25% anak yang lahir adalah transgenik

1000 telur diinjeksi 30-50 anak transgenik

Efisiensi

Sel dari embrio stadia blastosis proliferasi sel batang embrionik (ESC)ES pluripotent direkayasa tetap pluripotentTransgen diintegrasikan ke genom ES blastosis

ditanam transgenik

Transfeksi ESC dengan transgen:-sel dengan integrasi transgen pada situs bukan sasaran-sel dengan integrasi transgen pada situs sasaran-sel tidak mengandung transgen

Peningkatan jumlah sel dengan situs sesuai sasaran: seleksi positif – negatifSeleksi positif: memilih sel dengan integrasi di sembarang situsSeleksi negatif: membuang sel yang mengandung transgen terintegrasi di sembarang situs

Situs sasaran: di daerah yang bukan penyandi (tidak penting) sehingga perkembangan dan fungsi sel tidak terganggu

Metode sel batang embrionik yang telah direkayasa

1. 2 blok sekuen DNA (HB1 dan HB2) yang homolog dengan situs sasaran

2. Transgen (TG) fungsi baru untuk resipien

3. Sekuen DNA penyandi resistensi terhadap G418 (NeoR)

4. 2 gen berbeda untuk thymidine kinase (tk1 dan tk2) dari virus simplex herpes tipe I dan II (HSV-tk1 dan HSV-tk2)

Vektor untuk seleksi positif-negatif

Di antara HB: transgen dan gen neoR

Di luar HB: gen HSV-tk1 dan HSV-tk2

Jika integrasi terjadi pada situs bukan sasaran salah satu atau kedua HSV-tk terintegrasi kedalam genom sel resipienJika integrasi terjadi pada situs sasaran HSV-tk tidak terintegrasiSel + G418 sel tanpa neoR mati (sel hidup punya neoR). + gancyclovir sel yang mengekspresikan tk mati (gancyclovir diubah oleh tk menjadi toxin sel mati)Sel + G418 + gancyclovir sel yang mengandung transgen yang terintegrasi pada situs sasaran

Seleksi dengan PCR

ESC transgenik kultur disisipkan kedalam embrio stadia blastosisditanam pada betina pembawa (hamil palsu) galur transgenik.Homozigot: kawin sesama transgenik

Uji ESC yang mengandung transgen pada situs sasaran PCR

Fungsi gen di suatu organisme dapat diganggu melalui penyisipan potongan DNA (biasanya penanda seleksi) ke dalam gen tsb untuk:•mengetahui pengaruh suatu gen terhadap fisiologi dan pertumbuhanorganisme ybs•sistem model untuk mempelajari penyakit manusia secara molekulerInaktivasi gen = gene disruption = gene knockout

Inaktivasi fungsi gen

Contoh pemanfaatan gene disruption:Gangguan terhadap gen rhodopsin mencit kerusakan rod cells dariretina ~ retinitis pigmentosa pada manusia digunakan mengetahui degenerasi retina & pengaruh agen terapetik250 mencit yang mengalami gene knockout model untuk kajian berbagai kelainan pada manusia

Modifikasi genetik dengan sistem rekombinasi Cre-loxPSistem rekombinasi cre-loxP gene knockoutCre-loxP dari fage P1 (100 kb) linier-sirkuler genomP1: genom sirkuler replikasi genom viral (siklus lisis), linier (terintegrasi) jarangRekombinase Cre (circularization recombination): memotong &merekombinasi DNA dari situs loxP(locus of crossing over in P1)Situs loxP: 2 DNA berulang 13 bp yangdipisahkan oleh 8 bpHasil rekombinasi tergantung orientasi loxP:-berbeda arah: daerah pemisah mengalami inversi-searah: daerah pemisah kedua loxP eksisi (hilang)Cre-loxP berfungsi bila kedua situs loxP berjauhan

contoh: mencit yang mempunyai gen yang termodifikasi secara spesifik1. Tikus transgenik Cre: promoter spesifik sel + gen cre MT12. Klon DNA (termasuk smg) (floxed) diapit 2 loxP searah MT23. MT1 x MT2 MT3: rekombinasi antara 2 loxP karena ada rekombinase Cre

Rekombinasi Cre-loxP

Ekson2 diapit loxP searah hilang gen tidak berfungsi

Aktivasi gen dengan rekombinasi Cre-loxPKonstruksi floxed mengandung DNA yang mencegah transkripsiFloxed ditempatkan di antara promoter dan gen penyandiCre rekombinasi di loxP DNA yang mencegah transkripsi eksisi(hilang) gen diekspresikan

Transgenesis dengan vektor berkapasitas besarGen utuh, multigen vektor kapasitas besarKelompok gen b-globin= 250 kbAntibodi:tetramer: rantai berat (H) dan ringan (L)H: variable (VH), diversity (DH), joining (JH), constant (CH) di sel BL: tipe λ dan κ Vλ & Vκ, Jλ & Jκ, Cλ & Cκ

Antibodi H manusia: 95 VH, 30 DH, 6 JH dan 5 C (Cα, Cγ, Cδ, Cε, Cμ)Lokus k: 76 Vκ, 5 Jκ, 1 Cκ

H & κ @ 1-1.5 Mb

Penyakit alzheimer: kelainan otak, kehilangan ingatan secara progresif, gangguan bicara, lambanDi dalam neocortex dan hippocampus dari otak pasien alzheimer, serabut neofibril mengakumulasikan di dalam badan neuron senile plaque yang mengandung badan amyloid dan sel-sel otak (neuron) hilang. Protein utama badan amyloid Alzheimer: prot 4 kDa Aβ (β-amyloid, protein β, β−amyloid protein atau β/A4): 39-42 aa (terbanyak: Aβ40 & Aβ42) hasil pemotongan proteolitik β-amyloid precursor protein (APP) disebabkan oleh mutasi pada gen APP (beberapa famili)

Aplikasi tikus transgenik-model penyakit manusia uji senyawa terapetikmisal: Alzheimer, muscular dysthrophy, tumorigenesis, hypertension, neurodegenerative disorder, endocrinological dysfunction,

-Uji produksi

1. Model penyakit Alzheimer

Model penyakit AlzheimerPromoter dari virus spesifik otak + gen APP penyandi 100 aa terakhir dari ujung C yang mengandung βA4 histokimia: Alzheimer

Konstruksi model penyakit Alzheimer di tikus transgenik

Alzheimer: APP-177: Val Phe; APP-670/671: Lys+Met Asn+Leupromoter platelet-derived growth factor β + APP-cDNA intron tikus mengandung plaque amyloid, kematian sel neuron, kehilangan ingatanAPP-670/671 tikus dg penampakan Alzheimer (kelebihan Aβ42)

APP-177Val GUU GUC GUA GUGPhe UUU UUCAPP-670/671Lys AAA AAGAsn AAU AACMet AUGLeu UUA UUG CUU CUC CUA CUG

2. Model sistem ekspresi/produksi

Produksi susu yang mengandung protein dari transgenStudi fungsi CFTR (Cystic Fibrosis Trans-membrane Regulator) dan potensi terapi untuk CF (Cystic Fibrosis): CFTR perlu jumlah banyakCF rusak fungsi CFTR rusak (sebagai kanal klorida) aliran Cl rusak akumulasi lendir di pankreas & paru

Lendir: situs infeksi bakteri sulit dikendalikan dengan antibiotikBakteri mati lendir tebal fungsi organ terganggu:menyumbat saluran memperburuk efek CF(harapan hidup penderita CF: 25 th)

cDNA CFTR di tengah gen β-casein yang tidak lengkap dari kambing (delesi dari E2 akhir s/d E7 awal) di bawah kontrol promoter dan terminator β-casein. β-casein diekspresikan di kelenjar susu selama laktasi dan dalam jumlah yang tinggi

Produksi CFTR

Tikus transgenik: susu mengandung protein CFTR yang terikat di membran dari globule lemak (tidak ada efek negarif bagi induk & anak).CFTR mengalami glikosilasi dan mudah diekstraksi dari fraksi kaya lemak dari susu.Peningkatan produksi CFTR mamalia besar (sapi, kambing, domba)

In vitro, produksi CFTR rendah (akumulasi di membran).Penanggulangan: membran diambil (produksi tinggi, purifikasi mudah)Sel kelenjar susu sekresi lemak yang dibungkus oleh membranplasma (globule dalam susu)

Pengklonan ternak melalui transfer inti

Domba Dolly: inti dari sel mammary

Kelenjar susu: bioreaktor sapi sangat berpotensi (10.000 l/th, dengan 35 g protein/l susu)

Modifikasi mikroinjeksi pada tikusPenggunaan prosedur tanpa pembedahan dalam implantasi embrio: 2 sapi transgenik dari 2470 oocyte tidak efisienPerbaikan: uji sel embrio embrio transgenik implantasiSalah satu tujuan: mengubah kandungan susuKeju κ-casein over ekpresi transgen κ-caseinEkspresi lactase di kelenjar susu susu bebas laktosaTransgenesis pada sapi lambat (2 th dari telur terbuahi s/d anak sapi)Untuk ternak resistensi terhadap bakteri, virus, parasitImunisasi in vivo: introduksi transgen penyandi antibodi untuk antigen spesifik

Sapi Transgenik

-penekanan pada kelenjar susu sebagai bioreaktor protein farmasetik-metode: seperti tikus dengan promoter spesifik kelenjar susu-kambing, domba protein (manusia) yang disekresikan ke dalam susu mengalami glikosilasi, dan punya aktivitas-Ekspresi GH dengan promoter metallothionein di babi besar, tapi timbul penyakit bernanah di saluran pencernaan, terganggunya fungsi ginjal, hati.-potensi: produksi hemoglobin (darah) manusia dari babi?Daerah regulator β-globin manusia + 2 gen α1-globin manusia + 1 gen βA-globin manusia hemoglobin man

Kambing, Domba, dan Babi Transgenik

Mikroinjeksi ke telur yang sudah terbuahi sulit:-Fertilisasi: beberapa sperma masuk ke dalam sel telur sulit mengidentifikasi pronukleus jantan yang akan berfusi dengan pronukleus betina

-Injeksi DNA ke sitoplasma DNA tidak terintegrasi ke genom sel telur-Setelah fertilisasi telur cepat berkembang, diselimuti membran yang kuat, diliputi oleh albumin yang tebal, dan dilapisi membran cangkang dalam dan luar

Unggas Transgenik

Inokulasi embrio pada stadia blastoderma dengan vektor retrovirus yang defektif replikasi dan gen penanda ayam, puyuh transgenik

retrovirus?

Keturunan: campuran sel (donor+resipien) kimera

Seleksi kimera sel nutfah transgenik persilanganRadiasi (540-660 rad) terhadap embrio resipien meningkatkan rasio donor

Ayam transgenik:-resistensi penyakit-efisiensi pakan-penurunan kadar lemak dan kolesterol dalam telur

-kualitas daging

ESC unggas belum diidentifikasi?Sel blastoderma liposom (lipidkation) + transgen introduksi ke subgerminal embrio dari telur

Cara lain: rekayasa sel

Mikroinjeksi DNA kedalam sel telur terbuahi: salemPronukleur tidak terlihat dengan mikroskop DNA linier diinjeksikan kedalam sitoplasma sel telur yang sudah dibuahi atau ke embrio stadia awal (4 sel). Telur ikan berkembang di luar induk suhu lingkungan diaturSetelah injeksi, 35-80% embrio hidup transgenik 10-70%Identifikasi transgen PCR dengan cetakan DNA dari sel darah merahTransgenesis : GHPromoter gen penyandi protein antibeku dari ocean pout + cDNA GH salem + terminator gen antibeku dari ocean pout salem atlantikSalem transgenik: tumbuh cepat dan lebih besar (pada kondisi air dingin ekspresi GH sangat tinggi)

Ikan Transgenik