Pertanika 4(1), 21-24 (1981)

Pemerangkapan Thiobacillus denitrificans di dalam gelagaros bagi penurunan nitrate

(Entrapment of Thiobacillus denitrifi,cans in agarose gel for nitrate reduction)

A. B. SALLEH and M. AMINUDDINJabatan Biokimia dan Mikrobiologi, Fakulti Sains dan Pengajian Alam Sekitar,

Universiti Pertanian Malaysia, Serdang, Selangor, Malaysia.

Key words: Entrapment, Thiobacillus denitl'ificans, agarose; nitrate reduction.

RINGKASAN

Thiobacillus denitrificans telah diperangkap hidup-hidup ke dalam gel agaros. Keupayaan sel-selyang terperangkap untuk menurun nitrat telah dikesan melalui keaktifan enzim nitrat reduktase. Keaktifanenzim yang tinggi telah didapati dari sel-sel yang terperangkap dan pada amnya enzim tersebut telah bertindakserupa saperti di dalam sel-sel yang bebas. Sel-sel yang terperangkap telah berupaya untuk menurun nitratkepada nitrit apabila larutan nitrat disalurkan ke dalam reaktor berbentuk tiub yang mengandungi sel-gel.

SUMMARY

Thiobacillus denitrificans was entrapped live in agarose gel. The ability of entrapped cells to reducenitrate was monitored by the activity of the enzyme nitrate reductase. High enzyme activity was obtainedfrom the entrapped cells, and in general the enzyme acts similarly as it was in free cells. Entrapped cells wereable to reduce nitrate to nitrite when nitrate solution was pel/used through a tubular reactor containing cell-gel.

PENDAHULUAN

Kegunaan enzim dan sel lekatan (immobi­lised) di dalam bidang-bidang industri pemakanan,perubatan dan pertanian telah dibincang denganmendalam oleh Wiseman (1978) dan Chibata(1978). Pelekatan sel mungkin dapat mengatasiproses penulinan enzim yang komplek dan jugaboleh menambah kesetabilan sesuatu enzim.Sungguh pun terdapat beberapa cara bagi me­lekakan sel, pemerangkapan ialah suatu kaedahpelekatan yang didapati sesuai oleh Chibata(1978).

Thiobacillus denitrificans yang terperangkapdipercayai dapat digunakan bagi membuangnitrat di dalam cecair buangan. Thiobacillusdenitrificans ialah sejenis bakteria kimia lithotropikyang mendapat tenaganya untuk hidup melaluipengoksidan beberapa jenis sebatian sulfur bukanorganik. Ia juga menyahnitrat nitrat ke nitrogendan lain-lain gas terbitan nitrogen di dalamkeadaan anaerobik. Satu enzim penting di dalambakteria ini ialah nitrat reduktase yang mengguna­kan sulfit sebagai penderma elektron (Adamset al. 1971, Sawhney and Nicholas, 1977). Keakti­fan enzim ini dipastikan bagi mengukur kemam­puan penyahnitrat sel-sel bakteria yang telahterperangkap.

21

BAHAN DAN KAEDAH

Kultur dan pengasingan bakteria

Thiobacillus denitrificans strain 'Serdang' telahdipencil oleh Aminuddin et aI., (1979). Didalam kajian ini, pembiakan dan pengasinganbakteria dilakukan mengikut kaedah yang telahmereka gunakan. Ampaian bakteria 10% (berat/isipadu) di dalam penimbal fosfat, pH 7.5 telahdi sediakan untuk tindakan selanjutnya.

Kaedah pemerangkapan

Biji agaros (Sigma) sebanyak 5g bagi setiap100 ml air telah dilarutkan di dalam kelalangyang mempunyai alat pemeluap. Larutan agaroskemudian disejukkan hingga ke 50° sebelumdicampur ampaian sel. Bagi menghasilkan ke­pekatan 3.3% (berat/berat) sel/gel, 20 ml ampaiansel dicampur dengan: 50 ml larutan agaros. Bagimenghasilkan: sel terperangkap, campuran sel danagaros segera disejukkan di dalam kukus aishingga beku. Sel-gel telah dipotong mengikutisipadu kubus yang dikehendaki. Bagi semuaujikaji, kecuali jika dinyatakan sebaliknya, sei­gel dipotong dalam bentuk 2-3mm3 . Sel-geltelah disimpan di dalam penimbal fosfat pH 7.5pada suhu 4°.

A. B. SALLEH DAN M. AMINUDDIN

KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN

JADUAL 1Tindakbalas kawalan mengesan keaktifan nitrat

reduktase di dalam sel terperangkap.

'" sel-gel didalam penimbal dipanaskan di dalam kukusair menggelegak selama 15 min. sebelum pen­cerakinan keaktifan enzim dijalankan. 19 sel-gelmengandllngi O.033g sel; O.03g sel bebas menghasil113 M nitritJjam.

Jadual 1 menunjukkan tindakbalas kawalanyang dijalankan bagi membuktikan adanya aktivitinitrat reduktasc di dalam sel-gel. Keaktifanenzim di dalam sel terperangkap didapati kira­kira 50 pcratus daripada keaktifannya di dalamsel beb2.s.

66

o21

9

o

M nitrit terhasilJjamJg se1-gelKeadaan

sel-gel, NO], SO'?

tanpa NO;

tanpa 5°"32

sel-gel direblls'"

tanpa sel-gel

Gambarajah 2, yang menunjukkan kesanmasa terhadap penghasilan nitrit, dan gambarajah3, yang mengesani keaktifan nitrit reduktasemengikut pertambahan sel-gel dalam campurantindakbalas seterusnya menunjukkan ciri-ciritindakbal2.s enzim yang lazim. Aktiviti enzimbertambah mengikut pertambahan masa tindak­balas dan pertambahan seI.

60,...--=------------""saluran keluar---

Sistem biol'eakt01'

Sistem ini adalah saperti yang tertera dalamgambarajah 1. Sebanyak 16g sel-gel (beratbasah) diisi di dalam tabung plastik tubular(2 cm garis pusat dalam 9 cm panjang). Larutannitrat (5mM) yang mengandungi sulfit (10mM)dipam daripada bawah supaya kubus-kubus seI­gel tidak menjadi padat. Kepekatan nitrit diukurdi dalam cecair yang keluar.

Tindakbalas dijalankan pad2. suhu 35° danbekas digoncang sepanjang masa tindakbalas,iaitu selama 30 minit. Sebanyak 20-200 f.Ll alikuotdigunakan untuk mengukur nitrit.

Sel bebas atau kubus-kubus sel-gel di­campur dengan NaN03 (lOJLmol), Na2S03(20 JLmol) dan penimbal fosfat (Iarutan 50 nM).Sebanyak 2 ml campuran tindakbalas adalah dl­gunakan bagi sel bebas, tetapi jumlah isipadumungkin ditukar apabila tindakbalas yangmengandungi sel-gel dijalankan. Sel-gel mem­punyai ketumpatan kira-kira 19jmI.

Pencel'akinan keaktifan enzim

Keaktifan nitrat reduktase adalah diukurdengan mengesan nitrit mengikut kaedah yangdisediakan oleh Aminuddin dw Nicholas (1974).

Q)

ClI 40Q)til

Cl............

tilco

/~

E 20

t,""z

U penimbal~

- - :1

dan - - -substrat

0 20 40 60

min

Gambarajah 1: Sistem biol'eaJitor mengandungi sei­gel bagi penurunan nitl'at. Lal'utansubstl'at dipam pada kalajuan 0.4mljmin. Ujikaji dijalani padasuhu makmal (kil'a-kil'a 20°)

Gambal'ajah 2: Kesan masa tel'hadap keaktifannitl'at reduktase di dalam sel-gel.Ig sel-gel digunakan di dalam2 ml campul'an tindakbalas bagisetiap jangkamasa.

22

PEMERANGKAPAN THIOBACILLUS DENITRIFICANS Dr DALAM GEL AGAROS

250

a

E".~

-;;;

"-E"IN0Z

~:>.

0 5 10 15 20 25

pM NO;2 3 4

120

160_-----------------,

o

sel-gellg)

Kesan substrat-substrat terhadap keaktifannitrat reduktase di dalam sci terperangkap adalahdibentangkan di dalam gambarajah 4a dan 4b.Penurunan nitrat dipastikan oleh kepekatan awalnitrat dan sulfit yang digunakan di dalam cam­puran tindakbalas. .Kepeka~an substrat ya?~

tinggi merencat keaktlfan enZlm. Keputusa.n Inladalah bersamaan dengan laporan yang dlbuatoleh Adams et al. (1971) yang membuat kajiandengan ekstrak Thiobacillus denitrificans (strain'Oslo').

Ga11lbarajah 3 : Kesan perta11lbahan sel-gel ter­hadap keaktifan nitrat reduktase.o - 4g sel-gel digunakan di-dalam8 ml campuran tindakbalas.

150b

E"'f

-;;;

".cEIN0Z

~ 50:>.

25205o 10 15

M S02­I' 3

Gambarajah 4: Kesan kepekatan awal nitrat (a)dan sulfit (b) terhadap keaktifannitrat reduktase di dalam sel-gel.2g sel-gel digunakan di dalam4 ml campuran tindakbalas.

meresap kepada dan daripada sel-sel yang ter­perangkap. Faktor-faktor ini juga mungkindikawali oleh kepekatan agaros di dalam gel.Kepekatan agaros menentukan kepadatan gel dankepekatan gel yang diguna disini sesuai bagipengendalian sel-gel. Kepekatan yang lebihrendah akan menghasilkan gel yang terlalu lcmbek.Kepadatan gel mungkin juga akan mempengaruhikemampuan kaedah pemerangkapan, di manakebocoran sel mungkin berlaku semasa sel-geldigunakan untuk sesuatu proses.

Saiz kubus sel-gel ,uM nitrit terhasil/jam/g sel-gel

1 mm3 142

2-3 mm3 63

4-5 mm3 38

pH optimum yang berada di dalam lengkong­an pH 8.0 (gambarajah 5) adalah juga bersamaandengan hasil kajian Adams et al. (1971).

Jadual 2 pula menunjukkan kesan saiz kubussel-gel terhadap keaktifan enzim. .Tindakla~

hairan jika didapati kubus yang terkectl membenkeaktifan yang tinggi. Keaktifan pasti tertaklukkepada faktor-faktor saperti keluasan permukaangel dan kemudahan substrat dan hasil untuk

JADUAL 2Kesan saiz kubus sel-gel terhadap keaktifan

nitrat reduktase

23

A. B. SALLEH DAN M. AMINUDDIN

Telah di dapatijuga bahawa sel-gel agak stabiljuga semasa di dalam penyimpanan. Keaktifanenzirn berkurangan ca. 50 peratus selepas 60 haridisim.pan pada suhu 4° dan selepas 7 hari padasuhu 35°.

RUMUSAN

Gambarajah .'i : Kesan pH terhadap keaktifannitrat reduktase didalam sel gel.19 sel-gel digunakan di dalam 2mlcampuran tindakbalas. Penimbalyang diguna ialah posfat (-0-),TRIS-HCI (--0--) dan borate(-.-).

Keputusan-keputusan yang diperolehi adalahmenggalakkan, dan menunjukkan potensi peng­gunaan sel Thiobacillis denitrificans terperangkap­an. Kajian selanjutnya perlu dilakukan bagimenentukan matrik pemerangkap tahan lasakterutama jika sel-gel diguna di dalam keadaanyang tidak begitu terkawal (field conditions).Polirner-polimer asli dan sintetik lain sedangdikaj i juga. Keaktifan enzim juga berkemungkin­an dapat ditingkatkan, dan enzim-enzim penurun­an nitrat yang lain penting dikesani. Akhir katadi dalam sistem bioreaktor, satu sistem optimumbelum dikaji untuk mendapatkan prestasi yanglebih tinggi dari sel-sel yang terperangkap.

Kemampuan sel-gel menurun nitrat kenitrit boleh dilihat di dalam Gambarajah 6, dalammana sel-gel dimasukkan ke dalam satu tabungdan larutan mengandungi substrat-substrat dipam melalui celah-celah sel-gel yang tersusun.Di dalam kajian ini telah di dapati sel-sel ter­perangkap dapat menurun nitrat ke nitrit.Sungguh pun ujikaji telah berjalan selama 120jam terus menerus kemampuan untuk menurunnitrat tidak terjejas.

PENGIfARGAAN

Ucapan terima kasih kepada Cik Chew MeeLi dan Encik Burhanuddin Shamsuddin di atasbantuan teknik, dan Cik Hafizah Abdul Kadiryang telah menaip manuskrip ini.

ADAMS, C.A., WARNES, G.M., NICHOLAS, D.J.D.(1971) : A sulphite dependent nitrate reductasefrom Thiobacillus denit,·ijicans. Biochim. BiophysActa. 235, 398-405.

A:vIINUDDIN, M., NICHOLAS, D.J.D. (1974): An AMPindependent sulphite oxidase from Thiobacillllsdenitrijicalls. J. Gen. Microbiol. 82,103-113.

RUJUKAN

AMINUDDIN, M., KHAIRUDDIN AL BARRY, NYONYA A.RAZAK (1979): Thiobacilllls denitrijicalls - isolation,growth and some biochemical studies, Mal.l\o1ic1'Obiol. SY1llp. Abstract. 2, 27-28.

CHIBATA, I. (1978): Immobilised Enzymes. Tokyo.Kondansha Ltd.

B

14!

12

~"0

OB

0

~ 06

ON0Z

0·4

~~0·2

10 20 40 60 70 90 100 110 120

Jam

Gambarajah 6: Penurunan nitrat ke nitrit olehbioreaktor sel-gel. Larutanmengandungi nitrat dan sulfit di­salur melalui bi01'eaktor pada per­mulaan ujikaji. Pada titik A,larutan substrat diganti denganlarutan penimbal sahaja dankemudian larutan substrat disalurkembali pada titik B.

SAWHNEY, V., NICHOLAS, D.J.D. (1979): Sulphite andNADH - dependent nitrate reductase fromThiobacillus denitrijicans. J. Gen. Mic,·obiol. 100,49-58.

WISEMAN, A. (1978): Topics in Enzyme and Ferment­ation Technology Vols. 1 and 2. Chichester.Ellis Horwood Ltd.

(Received 7 January 1981)

24