Upload
rika-ardilla
View
227
Download
4
Embed Size (px)
DESCRIPTION
GENETIKA 1
Citation preview
KELOMPOK 7
Off H
RIKA ARDILLA
YUNITA NUR AGUSTININGSIH
The “Growing-Point Paradox” dan Sintesis DNA Diskontinyu
Penyelidikan dari molekul DNA dengan autoradiografi dan mikroskop elektron
mengindikasikan bahwa dua untai progeni disintesis pada masing-masing replikasi yang
bercabang menjadi dua yang diperpanjang pada keseluruhan arah yang sama, kurang lebih
pada level makromolekul. Sejak untai komplemen dari double helix memiliki polaritas yang
berbeda, ini berarti sintesis terjadi pada akhir untai 5’(atau 3’ 5’) dan pada akhir
untai 3’ (5’ 3’). Seperti pada diskusi terdahulu, meskipun semua tahu beberapa
polimerase memiliki persyaratan absolut untuk gugus hidroxyl bebas 3’ hanya mengeluarkan
sintesis (5’ 3’). Paradoks ini telah hidup selama beberapa tahun yang mana
pencarian biokimia yang sia-sia untuk beberapa polimerase baru yang bisa mengeluarkan
sintesis 3’ 5’. Tidak ada polimerase yang belum ditemukan. Malahan, bukti kuat
muncul yang terkumpul mengindikasikan bahwa semua sintesis terjadi pada arah 5’
3’. Resolusi dari paradoks muncul dari demonstrasi bahwa sintesis untai DNA adalah
Diskontinyu (terputus).
Autoradiografi dan mikroskop elektron menunjukkan bahwa 2 untai DNA yang mulai
muncul disintesis pada masing-masing replikasi yang bercabang menjadi dua telah
diperpanjang pada arah yang sama pada level makromolekul. Sejak untai komplemen dari
sebuah DNA rantai ganda memiliki polaritas kimia yang berlawanan, satu untai telah
diperpanjang pada semua arah 5’ 3’ dan pada untai lain diperpanjang pada semua arah
3’ 5’(Fig. 5.28, atas). Pada level makromolekul, bagaimanapun, sintesis sebenarnya
terjadi pada arah yang berlawanan (Fig. 5.28, bawah).
Figur 5.28. Sintesis DNA diskontinyu. (1) teknik resolusi lemah relatif seperti autoradiografi dan mikroskop elektron menunjukkan bahwa kedua rantai DNA yang baru muncul diperpanjang pada semua arah yang sama pada replikasi yang bercabang menjadi dua. Sejak dua rantai memiliki polaritas yang berlawanan, semua atau arah pemanjangan makromolekular harus 5’ 3’ pada satu rantai dan 3’ 5’ pada rantai lain. Keduanya diperpanjang dari kiri ke kanan, seperti contoh pada bingkai replikasi yang bercabang dua. (2) resolusi teknik biokimia yang lebih tinggi seperti pulse-labeling dan analisis kepadatan gradien menunjukkan bahwa replikasi sebenarnya diskontinyu untuk rantai yang diperpanjang pada semua arah 3’ 5’. Fragmen-fragmen pendek disintesis pada arah 5’ 3’ dan dengan subsekuen yang bergabung dengan polinukleotida ligase.
Pada level molekular, kedua untai baru disintesis pada arah 5’ 3’. Untai-untai
diperpanjang pada arah 3’ 5’ tumbuh oleh sintesis segmen-segmen pendek
(disintesis 5’ 3’), dan subsekuen yang bergabung pada segmen-segmen pendek ini oleh
polinukleotida ligase. Bukti untuk mode diskontinyu dari replikasi DNA datang dari
penelitian yang mana sintesis DNA intermediet yang berlabel dengan radioaktif oleh
pertumbuhan sel-sel untuk periode waktu yang sangat pendek pada medium yang berisi [3H]
thymidine(“pulse-labeling”). Ketika sel E.Coli pulse-labeled untuk 15 detik, seperti contoh,
semua label telah ditemukan pada potongan-potongan kecil, panjangnya 1000-2000
nukleotida. Potongan-potongan kecil ini atau segmen-segmen DNA, sering disebut “Okazaki
fragments” setelah R. Okazaki orang yang pertama mengidentifikasi mereka yang lebih kecil
panjangnya sekitar 100-200 nukleotida pada eukariot. Ketika periode pulse-labeling yang
lebih panjang digunakan, label lebih banyak ditutup kembali pada molekul DNA besar-
mungkin ukuran molekul berisi semua DNA yang hadir di kromosom utuh. Pada periode
pulse-labeling pendek, radioaktif hadir di fragmen pendek DNA menjadi disatukan pada
ukuran kromosom molekul DNA selama pertumbuhan subsekuen dari sel-sel pada medium
yang berisi thymidine nonradioaktif. Ini penting karena mengindikasikan bahwa “okazaki
fragments” adalah benar pada sintesis DNA intermediet daripada beberapa macam metabolik
oleh produk. Bukti ekstensif telah menunjukkan bahwa sintesis DNA adalah kontinyu untuk
pertumbuhan semua arah untai 5’ 3’ (kadang-kadang disebut untai “leading”) dan
diskontinyu untuk pertumbuhan untai arah 3’ 5’ (kadang-kadang disebut untai
“lagging”) seperti ditunjukkan pada fig. 5.28
Inisiasi dan Masalah Primer
Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, semua polimerase DNA dikenal memiliki
syarat mutlak untuk 3’-OH bebas pada DNA primer ditambah dengan DNA template yang
untainya tepat untuk aktifitas. Dengan demikian, tidak ada DNA polymerase yang dikenal
dapat memulai sintesis DNA untaian baru. Sejak bersintesis masing-masing “fragmen
Okazaki” membutuhkan sebuah acara inisiasi, dan berlangsung sebuah mekanisme efisien
inisiasi rantai penting untuk replikasi DNA. RNA polymerase merupakn enzim kompleks
yang mengkatalis sintesis molekul RNA dari DNA template, yang telah lama diketahui
mampu memulai sintesis rantai RNA baru di bagian spesifik DNA. Ketika hal ini terjadi,
hibrida RNA-DNA terbentuk, dimana RNA yang baru lahir adalah ikatan hydrogen DNA
template. Sejak polymerase DNA mampu memperpanjang rantai polinukleotida yang
mengandung RNA primer dengan 3’-OH bebas, maka para ilmuwan dibeberapa laboratorium
mulai menguji gagasan bahwa sintesis DNA diinisiasi oleh RNA primer. Sekarang ada bukti
definitive yang mendukung proposal sintesis DNA primer oleh segmen pendek RNA, yang
kemudian dihapus oleh 5’ 3’ exonuklease dan diganti dengan DNA sebelum kovalen
disegel oleh polinukleotida ligase (Gb. 5.29). Pada E. coli, RNA primer dipotong oleh
aktivitas 5’ 3’ exonuklease DNA polymerase I. Hal ini terjadi bersamaan dengan sintesis
untaian DNA baru (menggantikan helai RNA primer yang dipotong) oleh aktivitas enzim
5’ 3’ polymerase ini. (Gb. 5.29).
Sintesis RNA primer merupakan katalisis oleh enzim yang disebut primease, yang
memiliki sifat berbeda dari RNA polymerase.E. coli primease adalah hasil dari RNA yang
memiliki 10-60 nukleotida panjang. Pada eukariotik mereka cukup sedikit, sekitar 10
nukleotida panjang. RNA primer digunakan hampir setiap mekanisme, yang paling umum
digunakan untuk memulai sintesis DNA. Namun demikian, virus tertentu tampaknya telah
berevolusi sehingga mekanismenya sangat berbeda untuk inisiasi sintesis DNA (lihat
Kornberg, 1980).
Gb. 5.29 Ilustrasi skema inisiasi sintesis DNA melalui RNA primer. Sebuah RNA untai
pendek disintesis untuk memberikan 3’-OH primer untuk sintesis DNA. RNA primer ini
kemudian dihapus dan diganti dengan DNA oleh 5’ 3’ exonuklease ganda dan 5’ 3’
polymerase, kegiatan tersebut dibangun di dalam DNA polymerase I. DNA ligase kemudian
menutup rantai DNA yang baru lahir, dan mengkatalisis pembentukan hubunganantara
fosfodiester yang berdekatan dengan 3’-hidroksil dan 5’fosfat.
Kelengkapan “Aparat Replikasi” yang Kompleks
Ketika Watson dan Crick bekerja di luar struktur rantai ganda DNA, mereka segera
diakui bahwa sifat saling melengkapi dari dua helai rantai disediakan secara sederhana untuk
tetap menduplikasi materi genetik. Demonstrasi Meselson dan Stahl dari replikasi
semikonservatif dari kromosom E.coli didapatkan konsep bahwa dua untai dari percabangan
rantai ganda berfungsi sebagai template untuk sintesis untai komplementer. Dengan
demikian, rantai induk ganda mengarahkan sintesis dua heliks ganda identik keturunan.
Isolasi Kornberg dari enzim DNA polimerase I, mampu mensintesis DNA in vitro muncul
untuk memberikan link akhir dalam apa yang dianggap mekanisme sederhana untuk replikasi
genetik bahan tetapi seperti tidak terjadi. Dua puluh tahun kemudian, para ilmuwan masih
mencoba untuk bekerja keluar rincian mekanisme replikasi DNA.
Replikasi DNA yang kompleks itu dilakukan oleh kompleks multienzim, sering
disebut aparat replikasi atau replisome. Pada eukariota, komponen pembuatan replikasi baru
mulai diidentifikasi, bahkan dalam prokariota, replikasi DNA membutuhkan banyak protein
yang berbeda, dan rincian tentang bagaimana beberapa protein ini berfungsi dalam replikasi
DNA masih diselidiki hari ini. Misalnya, replikasi DNA pada E. coli memerlukan setidaknya
dua lusin produk gen yang berbeda. Banyak dari produk gen ini telah dimurnikan dan peran
mereka dipelajari dalam replikasi DNA secara in vitro. Gambar 5,30 menunjukkan
keterlibatan beberapa protein E.coli dalam replikasi DNA, hal ini dimaksudkan untuk
menggambarkan kompleksitas dari proses replikasi bukan untuk menggambarkan peran
spesifik dari produk gen individu.
Gambar 5.30.
Kompleksitas aparat replikasi E.coli. Hanya terjadi pada protein yang telah dimurnikan (atau
sebagian dimurnikan) dan penelitian secara in vitro ditunjukkan. Gen produk lainnya, seperti
produk-produk gen dnaJ, dnaK, dnaL, dnaP, dan dnaT yang diketahui diperlukan untuk
replikasi. Namun gen produk ini belum di identifikasi.
Pertama, dua untai komplementer dari double helix induk harus dipisahkan sehingga
masing-masing dapat seve sebagai template untuk sintesis untai anakan baru. Pembukaan dan
gerakan percabangan replikasi terjadi secara processively dengan untai menjadi transiently
dibatalkan menjelang percabanagn ketika bergerak di sepanjang kromosom. Tiga jenis
protein muncul untuk berkontribusi membuka untaian double heliks. (1) DNA protein
pembuka atau helicases DNA secara langsung terlibat dalam mengkatalisis pembukaan untai
double heliks. Pada E. coli, terdapat dua helicases yang berbeda yang terlibat. Satu helikase,
produk dari gen rep, mengikat dan merangsang pemisahan untai yang memiliki 3 'ke 5'
polaritas dalam arah gerakan replikasi fork. Helikase lainnya (identitas yang sebenarnya
masih belum pasti) mengikat dan membantu pembukaan dari untai yang memiliki 5 'ke 3'
polaritas dalam arah perpindahan percabangan. (2) DNA untai tunggal yang mengikat
protein (SSBPs) mengikat erat daerah DNA beruntai tunggal yang dihasilkan oleh helicases
dan membantu menstabilkan perpanjangan untai tunggal template yang dibutuhkan untuk
polimerisasi. SSBPs mengikat DNA sebagai tetramer, dan mengikat secara kooperatititas
(yaitu, pengikatan satu tetramer merangsang pengikatan tetramers tambahan untuk segmen
yang berdekatan dari DNA beruntai tunggal). Pengikatan SSBP untuk DNA beruntai tunggal
cenderung untuk menahan DNA yang dalam konfigurasi perpanjangan dan mencegah dari
melipat kembali pada dirinya sendiri. DNA tunggal yang jenuh dengan SSBP terikat
mereplikasi lebih dari 100 kali lebih cepat dari uncomplex DNA beruntai tunggal in vitro.
Sepertinya, uncomplex DNA alur tunggal membentuk struktur sekunder yang mengganggu
pergerakan polimerase DNA atau komponen lain dari kompleks replikasi sepanjang molekul
dengan cara processive normal. (3) Akhirnya, gyrases DNA, yang mengkatalisis
pembentukan superkoil negatif dalam DNA (lihat Gambar. 5.36), sangat penting untuk
replikasi dan diyakini memainkan peran kunci dalam proses pembukaan. Supercoil telah
diusulkan untuk membantu "drive" proses pembukaan, namun, kami masih tidak tahu
bagaimana ini bekerja. Baru-baru ini, telah menyarankan bahwa DNA girase dapat berfungsi
dengan menghapus superkoil positif yang menumpuk di depan percabangan replikasi sebagai
helicases yang membuka heliks ganda. Dalam kasus apapun, gyrases DNA sangat penting
untuk replikasi DNA dan entah bagaimana mempertahankan DNA sebelum dan sesudah
replikasi dalam struktur topologi yang tepat.
Untai DNA yang baru terbentuk mengiinisiasikan RNA primer dengan mekanismenya
terlebih dahulu. Sitesis RNA primer dikatalis menggunakan enzim khusus yang disebut
dengan primases. Enzim ini diaktifkan dengan formasi yang kompleks dari primases sendiri
dan stidaknya ada 6 protein lainnya , kompleks ini disebut dengan primosome. Pada
penggunaan primase, primosome terdiri protein dasar yang membentuk protein i, n, n’, dan
n” ditambah dengan produk gen dnaB dan dnaC (Table 5.4) primosome membawa keluar
awalan reaksi untuk untaian awal (untaian diperpanjang secara terus menerus pada seluruh
arah 5’ ke 3’) dan proses pengulangan priming (pembentukan) dari sintesis “Okazaki
fragment” untuk menghentikan pembentukan untaian (sintesis dihentikan pada seluruh arah
3’ ke 5’, tp untuk 5’ ke 3’ untuk di level molekular, lihat gambar 5.28). fungsi dari protein
tunggal dalam primosom masih belum tentu.
Pada perpanjangan kovalen (lihat gambar 5.26) dari pembentukan rantai DNA saat
replikasi kromosom di E coli membawa keluar DNA polimerase III. Tidak sepeti DNA
polimerasi I (yang merupakan polipeptida tunggal, lihat gambar 5.25), DNA Polimerase III
merupakan kompleks enzim yang terdiri dari 7 polipeptida yang berbeda (gambar 5.31) dan
seluruh polipeptida tersebut pasti digunakan untuk membantu fungsi replikasi. Aktivitas
polimerase 5’ ke 3’ dan aktivitas ektranuklease 5’ ke 3’ dua-duanya ditemukan pada α
polipeptida yang ada pada DNA polimerase III. Pengkoreksian cetakan pertama dari
polimerase III ditemukan pada € polipeptida. Fungsi untuk setiap subunit lain masih belum
tentu. Melanjutkan aktivitas DNA polimerase III pada replikasi garpu , DNA polimerase I
mengkatalis pemindahan dari RNA primer dengan aksi yang terpadu dari 5’ ke 3’ aktivitas
eksonuclease dan 5’ ke 3’ polimerase, dan DNA ligase mengkatalis penutupan dari hasil
untaian tunggal “nick” (gambar 5.30)
Beberapa komponen penting untuk replikasi DNA telah diidentifikasi secara genetik,
yaitu strain E. coli yang termutasi sehingga mengakibatkan ketidakmampuan untuk
mereplikasi DNA dalam kondisi tertentu (biasanya pada suhu tinggi) telah diidentifikasi.
Mutasi ini memiliki karakter gen tertentu , mereka ditemukan untuk mengidentifikasi satu set
gen (dnaA, dnaB, dsb) yang produknya diperlukan untuk sintesis DNA in vivo. Produk dari
beberapa gen tersebut telah diketahui. Contohnya adalah dnaE, dnaN, dnaX, dan dnaZ yang
merupakan kode untuk empat dari tujuh subunit enzim DNA polymerase III lengkap, dan
dnaG yang khusus untuk Primase. Produk dan fungsi dari protein lainnya masih belum
diketahui. Komponen lain untuk replikasi enzim (beberapa subunit DNA polimerase III) yang
ditemukan dengan analisis biokimia, dan gen-gen yang mengkode protein tersebut sampai
saat ini masih belum bisa diidentifikasi.
Diharapkan bahwa fungsi yang tepat dari banyak produk gen yang terlibat dalam
replikasi akan bekerja selama beberapa tahun ke depan. Sehingga dilakukan percobaan untuk
mengisolasi replisomes functional, namun telah banyak yang belum berhasil. Sedangkan
untuk pemulihan dari replikasi subcomplexes aparatur yang dimurnikan hasilnya lebih
sukses. Hal ini tidak diragukan lagi, hasil dari fakta bahwa kompleks yang diselenggarakan
bersama oleh interaksi protein-protein yang relatif lemah, yang terganggu selama prosedur
isolasi. Sebagai tambahan, kompleks replikasi mungkin berikatan dengan membran dan
membutuhkan struktur membran untuk perakitan mereka. Hal ini mebuktikan bahwa
replikasi garpu berhubungan dengan membran sel pada prokariota dan dengan nuclear
envelope di eukariota.
Pertanyaan
1. Bagaimana proses inisiasi sintesis DNA melalui RNA primer?
Jawab: sebuah RNA untai pendek disintesis untuk memberikan 3’-OH primer untuk
sintesis DNA. RNA primer ini kemudian dihapus dan diganti dengan DNA oleh 5’
3’ exonuklease ganda dan 5’ 3’ polymerase, kegiatan tersebut dibangun di dalam
DNA polymerase I. DNA ligase kemudian menutup rantai DNA yang baru lahir, dan
mengkatalisis pembentukan hubunganantara fosfodiester yang berdekatan dengan 3’-
hidroksil dan 5’fosfat.
2. Bagaimana konsep replikasi semikonservatifbdari kromosom E. coli?
Jawab: dua untai dari percabangan rantai ganda induk berfungsi sebagai template
untuk sintesis untai komplementer. Rantai induk ganda mengarahkan sintesis dua
heliks ganda yang identik ( keturunan).