Upload
ledung
View
214
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Pesticida Mancozeb
®:
Determinação de Limites de Risco para Ecossistemas de Água Doce
Manuel Samussone Mestrado em Biologia e Gestão da Qualidade da Água Departamento de Biologia 2014
Orientadora Ruth Maria de Oliveira Pereira, Professora Auxiliar, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
Co-orientadora Maria da Natividade Ribeiro Vieira , Professora Associada, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas.
O Presidente do Júri, Porto, ______/______/_________
AGRADECIMENTOS
Com a realização deste trabalho, gostaria, em primeiro lugar, de agradecer às minhas
orientadoras, a Professora Doutora Ruth Maria de Oliveira Pereira e à Professora
Doutora Maria da Natividade Vieira, por todo o apoio que deram, disponibilidade e
paciência em todo processo da elaboração até a fase de apresentação deste trabalho.
Agradeço também ao Professor Doutor António Paulo Carvalho, pelo seu contributo
nos ensaios de Danio rerio e sua disponibilidade nos trabalhos desta parte da tese.
E o meu muito obrigado a todos meus colegas do curso e do laboratório, em especial
à Ana Gavina e a Margarida Castro.
A equipa de técnicas de laboratório do Departamento de Biologia, por todo contributo
logístico e de utilização de equipamento, que deram ao longo deste ano.
O meu grande agradecimento vai para a equipa de seguranças da faculdade que
foram sempre pacíficos e atenderam-me sempre que precisei de ter acesso aos
laboratórios para fazer os meus trabalhos.
À Comissão Europeia através do programa Erasmus Mundus ACP2, pelo
financiamento do projeto através da Universidade do Porto, em particular o júri que
que validou a minha candidatura.
Meu muito obrigado a todos professores do curso de mestrado em Biologia e Gestão
da Qualidade da Água pela forma sábia e didática que ministraram os diversos
conteúdos deste mestrado.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para o sucesso deste trabalho.
Um obrigado especial para a minha família pelo incentivo e encorajamentos nos
momentos mais difíceis.
i
RESUMO
A agricultura é um dos setores que assegura a sustentabilidade das economias
mundiais e o combate à pobreza, contudo a utilização de água e de produtos
agroquímicos, que visam melhorar a produção, garantido o sucesso das culturas, tem
conhecido níveis muito elevados nos últimos anos. A utilização de pesticidas como
forma de proteção das culturas tem gerado inúmeros problemas a nível de dos
ecossistemas, devido à drenagem de resíduos químicos em ecossistemas aquáticos,
com impactos nos organismos não alvo, incluindo o Homem. Neste contexto, o
presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos ecotoxicológicos para organismos
aquáticos do fungicida Mancozan® (princípio ativo Mancozeb®), e determinar os limites
de risco para os referidos ecossistemas. Este pesticida pertence ao grupo dos etileno-
bis (ditiocarbamatos), e é amplamente utilizado, quer em Moçambique, quer na
Europa. Foram realizados vários ensaios ecotoxicológicos com uma bateria de
organismos de diferentes níveis tróficos, nomeadamente a bactéria Vibrio fisheri, a
alga verde Raphidocellis subcapitata, a planta aquática Lemna minor, o cladócero
Daphnia magna, e os peixes de água doce Carassius auratus e Danio rerio. Os testes
seguiram as normas padronizadas da OCDE, excepto para avaliação da atividade da
enzima acetilcolinesterase em Carassius auratus. As espécies animais foram as mais
sensíveis, sendo que o pesticida revelou elevada toxicidade em concentrações muito
inferiores às aplicadas no ambiente. Com base nos resultados obtidos foi determinado
um valor de PNEC (Predicted No Effect Concentration) de 0,024 mg L-1 de Mancozeb®.
Este trabalho permitiu ainda promover a transferência de conhecimento de
metodologias de avaliação de risco existentes na Europa, de forma a promover a sua
aplicação em países Africanos.
Palavras-chave: Mancozeb®, PNEC, ensaios ecotoxicológicos, espécies aquáticas
iii
ABSTRACT
Agriculture is a sector that ensures the sustainability of the world's largest economies
and that guarantees poverty reduction. However, the intensive use of pesticides as a
means of crop protection has generated numerous problems at the ecosystem level
due to drainage of agro-chemical residues into aquatic ecosystems, with impacts on
non-target species, including humans. In this context, the present study aimed to
assess the ecotoxicological effects to aquatic organisms of the fungicide Mancozan®
(active ingredient Mancozeb®), and determine the limits of risk for these ecosystems.
This pesticide belongs to the group of ethylene-bis (dithiocarbamate), and is widely
used both in Europe and Mozambique. A battery of ecotoxicological assays with
organisms of different trophic levels including the bacterium Vibrio fisheri, the green
alga Raphidocellis subcapitata, the aquatic plant Lemna minor, the cladoceran Daphnia
magna, and the freshwater fish Danio rerio and Carassius auratus, were performed.
The tests followed the standard OECD protocols, except for the evaluation of the
activity of the enzyme acetylcholinesterase in Carassius auratus. The animal species
were the most sensitive. The pesticide showed high toxicity at concentrations much
lower than those applied in the environment. Based on the results obtained a value of
PNEC (Predicted No Effect Concentration) of 0.024 mg L-1 was estimated for
Mancozeb®. This work also contributed for transfer of knowledge in risks assessment
methodologies, already established in Europe, in order to promote its implementation in
African countries.
Key words: Mancozeb®, PNEC, ecotoxicological assays, freshwater species
iv
ÍNDICE Agradecimentos……....………………………………………………………………………..i
Lista de quadros ........................................................................................................... 6
Lista de figuras ............................................................................................................. 6
Lista de abreviaturas..................................................................................................... 7
1.Introdução .................................................................................................................. 1
1.1. A agricultura nos países subdesenvolvidos: O caso de Moçambique em particular2
1.2. Principais impactos da agricultura no ambiente ..................................................... 4
1.2.1. Pesticidas e efeitos ecológicos dos seus usos .................................................... 4
1.2.2. Eutroficação ........................................................................................................ 7
1.2.3. Uso excessivo de água ....................................................................................... 9
1.2.4. O problema da falta de percepção do risco e de pessoas com a formação
adequada para efectuar monitorizações ambientais ................................................... 10
1.3.Objectivos geral e específicos da tese. ................................................................. 11
2. Material e Métodos ............................................................................................... 133
2.1. Pesticida Mancozeb® ......................................................................................... 133
2.2. Ensaio Ecotoxicológico ........................................................................................ 13
2.2.1. Ensaio de Microtox com V. fischeri ................................................................... 13
2.2.2 Manutenção de culturas e ensaio de inibição de crescimento com Raphidocelis
subcapitata ................................................................................................................. 14
2.2.3. Manutenção da cultura e ensaio de inibição de crescimento com Lemna minor 16
2.2.4. Manutenção da cultura e ensaio de imobilização com Daphnia magna ............ 19
2.2.5. Manutenção e teste de toxicidade com ovos de Danio rerio.............................. 20
2.2.6. Ensaio de inibição da actividade da enzima acetilcolinesterase em Carassius
auratus ....................................................................................................................... 21
2.2.7. Análise estatística ............................................................................................. 21
3. Resultados .............................................................................................................. 24
4. Discussão ............................................................................................................... 36
5. Conclusão ............................................................................................................... 42
Referências Bibliográficas .......................................................................................... 43
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição química do meio de cultura (MBL) para a microalga, R.
subcapitata (OECD, 2006)............................................................................................15
Tabela 2. Composição do meio Steinberg para culturas de L. minor............................17
Tabela 3. Resumos dos dados de toxicidade obtidos para Mancozeb® (substância
ativa) para a bateria de espécies testadas. Valores de toxicidade, e respetivos
intervalos de confiança a 95% (IC95%), assim como o valor de r do modelo ajustado
aos dados)....................................................................................................................24
Tabela 4. Valores de PNEC calculados para a substância comercial Mancozan®, e
expressas em termos da concentração do seu princípio ativo, determinados com base
na metodologia proposta pela Comissão Europeia para novos compostos químicos
(EC, 2003).....................................................................................................................33
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema representativo do desenho experimental concebido para o ensaio
de inibição de crescimento com L. minor para testar diferentes concentrações de
Mancozeb®…………………………………………………………….......………………….18
Figura 2. Taxa média de crescimento em Raphidocellis subcapitata exposta a uma
gama de concentrações do pesticida Mancozeb® (as concentrações correspondem a
concentrações do princípio ativo). As barras de erro correspondem ao desvio padrão,
e os asteriscos indicam diferenças significativas, relativamente ao controlo (p<0,05).
................................................................................................................................. 266
Figura 3. Percentagem média de inibição de crescimento em Raphidocellis subcapitata
exposta a uma gama de concentrações do pesticida Mancozeb®(as concentrações
correspondem a concentrações do princípio ativo). As barras de erro correspondem ao
desvio padrão ........................................................................................................... 266
Figura 4. Taxa média de crescimento em L. minor exposta a uma gama de
concentrações do pesticida Mancozeb® e calculada com base no número de frondes
produzidas (as concentrações no eixo dos XX, correspondem a concentrações do
princípio ativo). As barras de erro correspondem ao desvio padrão. Os asteriscos
indicam diferenças significativas, relativamente ao controlo (p<0,05). ...................... 288
Figura 5. Taxa média de crescimento em L. minor exposta a uma gama de
concentrações do pesticida Mancozeb® e calculada com base na biomassa seca (as
concentrações no eixo dos XX, correspondem a concentrações do princípio ativo). As
barras de erro correspondem ao desvio padrão. Os asteriscos indicam diferenças
significativas, relativamente ao controlo (p<0,05)...................................................... 288
Figura 6. Percentagem média de inibição de crescimento em L. minor (número de
frondes) exposta a uma gama de concentrações do pesticida Mancozeb® (a s
concentrações correspondem a concentrações do princípio ativo). As barras de erro
correspondem ao desvio padrão. .............................................................................. 299
Figura 7. Percentagem média de inibição de crescimento em L. minor (peso seco)
exposta a uma gama de concentrações do pesticida Mancozeb® (as concentrações
correspondem a concentrações do princípio ativo). As barras de erro correspondem ao
desvio
padrão................................................................................................................299
Figura 8. Atividade média da enzima acetilcolinesterase em C. auratus exposto a uma
gama de concentrações de Mancozeb®, durante 96 h (as concentrações
correspondem a concentrações do princípio ativo). As barras de erro correspondem ao
desvio padrão e os asteriscos destacam diferenças significativas relativamente ao
controlo (Dunnett p<0,05). .......................................................................................... 30
Figura 9. Percentagem média de embriões de D. rerio mortos, com anomalias e
eclodidos após exposição de 96 h a uma gama de concentrações de Mancozeb® (as
concentrações correspondem ao princípio ativo). As barras de erro representam o
desvio padrão em relação aos valores médios. Os asteriscos destacam diferenças
significativas relativamente ao controlo (Dunnett p<0,05).. ....................................... 322
Figura 10. Imagens microscópicas dos embriões de D. rerio após 96 h de exposição
ao pesticida Mancozeb®: a: CTL sem malformações; b: embrião exposto a 0.02 mg L-1
com malformação na notocorda; c: embrião exposto a 0.04 mg L-1 não eclodido com
edema do vitelo; d: embrião exposto a 0.13 mg L-1 com malformação na notocorda; e:
embrião exposto a 0.42 mg L-1 com malformação na notocorda/escoliose, atraso no
crescimento; e: embrião exposto a 1.36 mg L-1 com malformação na notocorda,
escoliose e atraso no crescimento; g e h: embriões expostos a 2.45 mg L-1, eclodido e
não eclodido, com atraso no crescimento e com anomalias diversas. ........................ 34
Figura 11. Representa a curva de distribuição de sensibilidade das espécies obtida
para Mancozeb®, obtida após ajuste do modelo linear log-normal aos valores de EC50
obtidos para as diferentes espécies testadas, seguindo protocolos padronizados. A
vi
distribuição permitiu a determinação da concentração de perigo (do inglês: HC5 -
hazard concentration) que afeta 5% das espécies .................................................... 355
LISTA DE ABREVIATURAS
AChE – Acetylcholinesterase enzyme (do Português: Enzima acetilcolinesterase)
ANOVA – Analysis of Variance (do Português: análise de variância)
AQUASTAT – FAO’s information System on Food and Agriculture (do Português:
Sistema de informação da FAO em Alimentação e Agricultura)
As - Arsénio (símbolo químico)
ASTM - American Standard of Testing and Materials
CIIMAR - Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental
CTL – tratamento controlo
Cu - Cobre (símbolo químico)
DDT- diclorodifeniltricloroetano (pesticida)
DNA /ADN - Ácido desoxirribonucleico
DQA - Diretiva Quadro da Água
DTNB - Ditiobisnitrobenzoato
EC50 - effect concentration for 50 of the organisms tested or that produces a 50%
effect (do português: Concentração que causa efeito em 50% dos organismos
testados, ou que causa um efeito de 50% no parâmetro avaliado)
EU – European Union (do português: União Europeia)
EUA - Estados Unidos da América
FAO - Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (do inglês:
Food and Agriculture Organization)
HC5 – Hazard Concentration for 5% of the species (do Português: Concentração
perigosa para 5% das espécies)
Hg - Mercúrio (símbolo químico)
INE - Instituto Nacional de Estatística
LOEC - Lowest-Observed-Effect Concentration (do Português: Concentração mais
alta para a qual já se observam efeitos significativos relativamente ao controlo)
MDG1 – Millenium Development Goal 1 (do Português: objetivo de Desenvolvimento
do Milénio 1 das Nações Unidas)
nm - nanómetro
NOEC- No Observed Effect Concentration (do Português: Concentração mais alta
para a qual não se observam efeitos significativos relativamente ao Controlo)
OCDE/OECD – Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Económico/
Organization for Economic Co-operation and Development
OMS - Organização Mundial de Saúde
PAN PESTICIDE - Pesticide Action Network (PAN) Pesticide Database
pH – potencial de hidrogénio
PIB - Produto Interno Bruto
PNEC - predicted no effect concentration (do português: concentração que se prevê
não causar efeitos)
UP - Universidade do Porto
Zn – Zinco (símbolo químico)
viii
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
1
1. Introdução
Das várias atividades antropogénicas adotadas pelo Homem, a agricultura aparece
como a prática mais viável para aliviar a situação da pobreza e da fome em diferentes
países do mundo, mas os seus efeitos nefastos sobrepõem-se muitas vezes aos
benefícios desta prática, na medida em que quando efetuada de forma não regrada
existem muitos fatores aliados à agricultura, que constituem um elemento de
desequilíbrio ecológico. O abate de áreas florestais, por exemplo, é um dos fatores
associado à agricultura cujos efeitos fazem parte do conjunto de causas que estão na
origem do aquecimento global (Ryan et al., 2014). Em Moçambique, o abate de
floresta para criação de áreas agrícolas é efetuado através de queimadas frequentes.
A utilização de produtos químicos sintéticos para a prevenção e combate de doenças
das plantas e animais ou para estimular o desenvolvimento das culturas é uma outra
preocupação. A transferência dos produtos usados na agricultura para os cursos de
águas e de solos constituem um grande risco, tanto para a saúde humana, como para
o ambiente. Alguns estudos chegam mesmo a apontar a exposição prologada a alguns
pesticidas como uma das principais causas de desenvolvimento de tumores (Peláez et
al., 2004). Para além disso, os agroquímicos são promotores da degradação da
qualidade da água e de solos, na medida em que afetam organismos não-alvo e
provocam desequilíbrios nas cadeias tróficas, o que leva muitos países a adoptar
medidas de correção e prevenção da contaminação das massas de água. Um dos
exemplos é a adopção a nível Europeu da Diretiva Quadro de Água (DQA, 2000/60/CE
de 2000), que tem uma boa abordagem para as questões da água (Mendes e Ribeiro,
2010).
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
2
1.1. A agricultura nos países subdesenvolvidos: o caso de
Moçambique em particular
Nas últimas décadas a população mundial tem aumentado exponencialmente e com
ela a produção de alimentos para satisfazer a sua sustentabilidade. Isto tornou-se a
principal causa de uma prática agrícola mais intensiva que utiliza de forma crescente
água e agroquímicos para aumentar a produtividade biológica das colheitas (Ramade,
1977). A utilização de agroquímicos em muitos países e, em particular, em
Moçambique, ainda é entendida e analisada meramente sob o ponto de vista
económico e social, na medida em que permite aumentar a produção de alimentos por
um lado, e a rentabilidade económica das culturas por outro. Em África, o contributo da
agricultura para a economia varia de país para país. Em alguns países, como Angola e
São Tomé e Príncipe, 80% das atividades agrícolas são de cariz familiar e em Cabo
Verde e Moçambique constata-se o mesmo para mais de 90% do setor, desde 2009.
Moçambique é um dos países africanos mais pobres do mundo, em que a agricultura
emprega mais de metade da força de trabalho, e representa a principal fonte de
subsistência para uma elevada percentagem da população ativa, apesar da rápida
expansão da atividade mineira e do setor energético (Cunguara e Hanlon, 2012;
Chichava et al., 2013), sendo por isso crucial para a segurança alimentar dessas
regiões (Chuku e Ochoye, 2009). Oficialmente, cerca de 70% da população de
Moçambique é rural, mas 80% está empregue na agricultura, o que demonstra que
mesmo nas zonas urbanas a atividade agrícola é importante (Cunguara e Hanlon,
2012). No entanto, a agricultura só contribuiu com 20% do Produto Interno Bruto (INE,
2010 in Cunguara e Hanlon, 2012), o que comprova que a sua contribuição para a
economia foi relativamente menor em relação a outros setores de atividade.
Um problema que torna a produção agrícola dos países africanos frágil é o fato
de esta ser largamente alimentada apenas pela precipitação, sendo que em
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
3
Moçambique, por exemplo, apenas 3% de terra arável tinha irrigação em 2007, ficando
assim à mercê de grandes variações pluviométricas, que englobam longos períodos
de seca (FAO, 2007). Sendo esta situação semelhante um pouco por toda a África
Subsariana (Burney e Naylor, 2012). A criação de infraestruturas de armazenamento
de água e o acesso a água potável, quer a partir de rios, quer de lençóis freáticos,
requer investimentos que não podem ser suportados por explorações familiares. Como
consequência, os usos da água atuais em Moçambique são pouco monitorizados, não
se sabendo ao certo a quantidade de água que é consumida, quer a partir de fontes
superficiais, quer subterrâneas, especialmente pelos consumidores de pequena escala
(van der Zaag et al., 2010). Estudos recentes apontam ainda para o facto de os
reservatórios disponíveis em algumas bacias hidrográficas (e.g. Bacia do Rio Limpopo)
não serem suficientes para a irrigação da produção agrícola que se pretende atingir
(van der Zaag et al., 2010). O declínio da qualidade do solo e os danos causados por
pragas estão entre outros fatores que afetam a produção agrícola nos países africanos
(Abate et al., 2000). Assim, considera-se importante investir em tecnologias que visam
o aproveitamento da água para a irrigação como parte de uma estratégia global do
setor agrário (Nhanombe, 2008), sendo este um dos grandes desafios de muitos
países Africanos. Desde o acordo de paz em 1992, o PIB teve um crescimento médio
de 8,3%, entre 1998 a 2008, o que está muito além da média Africana (Cunguara e
Hanlon, 2012). Esses direitos estão longe de ser alcançados em muitos países
Africanos, assim como a garantia da qualidade e preservação de recursos naturais.
Entre os problemas ambientais mais relevantes, destaca-se o consumo e a
degradação das reservas naturais de água doce, como resultado, entre outros fatores,
dos programas de desenvolvimento desenhados para melhorar a produção de
alimentos e o desenvolvimento económico.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
4
1.2. Principais impactos da agricultura no ambiente
A agricultura é um dos principais componentes da economia mundial, apesar da sua
importância, ela contribui de forma cada vez mais acentuada para a degradação da
qualidade da água e ecossistemas, através do lançamento excessivo de agrotóxicos,
(fertilizantes, pesticidas e antibióticos nestes sistemas (Marques et al., 2002). Os
problemas da agricultura estão para além daquilo que é visível ao Homem, ou seja,
muitos impactos da agricultura são refletidos a nível das comunidades biológicas e a
sua contribuição para alimentação humana pode ser comprometida a longo prazo pelo
nível de efeitos causados nos ecossistemas. Sendo assim, a estimativa da FAO indica
que aproximadamente 50% dos 250 milhões de hectares irrigados no mundo já
apresentam problemas de salinização, saturação e empobrecimento do solo e que 10
milhões de hectares são abandonados anualmente em virtude desses problemas,
entre outros (Júnior e Silva, 2010).
1.2.1. Pesticidas e efeitos ecológicos dos seus usos
A produtividade agrícola em África não só é uma das mais baixas do mundo como
estagnou até ao final de década de 90 (Clay, 1994; Abate et al., 2000), mostrando
ainda um declínio de 15%, entre 2002 e 2008 (Cunguara e Hanlon, 2012). No entanto,
a pressão imposta pelo significativo crescimento populacional, registado em muitos
países africanos, levou a que os governos procurassem modernizar a agricultura,
baseando-se no modelo da “revolução verde”, e estimulando a aplicação de
agroquímicos (fertilizantes, pesticidas, fungicidas e herbicidas) para aumentar a
produção. Muitos países africanos entraram assim num ciclo vicioso, na medida em
que o aumento da produção agrícola, levou à redução das áreas de floresta naturais, o
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
5
habitat de muitas das pragas, e ao desenvolvimento de culturas cada vez mais
sensíveis a essas mesmas pragas, em virtude do empobrecimento dos solos (Abate et
al., 2000). Não obstante este fato, não existiam, pelo menos até há uma década atrás,
dados detalhados sobre o uso de pesticidas em África (Abate et al., 2000). Mais
recentemente, estima-se que, mesmo apesar dos incentivos, apenas 3% da população
de Moçambique utiliza fertilizantes, sobretudo nas culturas de tabaco, pela facilidade
de crédito concedido pelas empresas internacionais (Cunguara e Hanlon, 2012). Por
sua vez, no Norte, apenas 0,3% dos agricultores utilizam pesticidas nas culturas de
milho, que são as mais estáveis do país (Cunguara e Hanlon, 2012). Grande parte dos
compostos usados nunca foram testados para avaliação da sua eficácia e/ou
impactes, e os utilizadores, numa grande maioria, não foram educados ou não estão
sensíveis aos riscos (Jepson et al., 2014).
Os pesticidas e outros produtos fito e zoo-sanitários são substâncias químicas
naturais ou de síntese, utilizadas na luta contra agentes patogénicos que afetam a
saúde pública ou que podem pôr em risco, em todos os estádios de desenvolvimento,
as espécies vegetais que nos alimentam (Mendes e Oliveira 2004). Com base na sua
composição química podem ser classificados em compostos organoclorados,
organofosfatos, carbamatos, piretróides sintéticos, pesticidas inorgânicos e ainda os
biopesticidas produzidos a partir de compostos bioativos naturais (Odukkathil e
Vasudevan, 2013). Na realidade, entre todos os xenobióticos (compostos químicos
sintetizados pelo Homem), os pesticidas são talvez dos mais preocupantes, pois foram
especificamente desenhados para serem bioativos e matarem organismos, sendo
ainda intencionalmente aplicados no ambiente (Hanazato, 2001). Contudo, a utilização
de pesticidas tornou-se praticamente indispensável para o controlo de plantas
infestantes, artrópodes e várias doenças (Carapeto, 1999). Mesmo assim, estima-se
que globalmente 35% das culturas são perdidas antes da colheita, devido a pragas
(Oerke, 2006), o que aumenta ainda mais a pressão colocada pela necessidade de
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
6
alimentar uma população humana em crescimento exponencial, que se espera que
atinja os 9,2 mil milhões, em 2050 (Popp et al., 2013). Por este motivo, os benefícios
decorrentes da aplicação de pesticidas (maiores rendimentos sociais, menores riscos
de perda de colheitas, criação de postos de trabalho) demonstram que mesmo que
novas tecnologias venham a ser desenvolvidas, estes químicos irão continuar a ser
indispensáveis para manter a elevada produtividade das culturas mundiais (Odukkathil
e Vasudevan, 2013; Popp et al., 2013). Contudo, o grande problema é que ao serem
introduzidos nos ecossistemas acabam por entrar nas cadeias tróficas provocando o
desaparecimento de várias espécies não-alvo mais sensíveis e provocando alterações
no equilíbrio e nas funções dos ecossistemas (Alves, 2010). Os pesticidas, como
outros poluentes orgânicos e inorgânicos, podem ter, além da sua ação direta, outros
efeitos que resultam de eventuais sinergismos (Mendes e Oliveira, 2004) que se
podem desenvolver nos diferentes compartimentos ambientais (Mendes e Oliveira,
2004), ou ainda efeitos indiretos que podem resultar de alterações nas complexas
interações entre os diferentes níveis das teias alimentares (Hanazato, 2001). Estes
problemas podem ainda ser superiores nos países em desenvolvimento, como os da
África Subsariana, onde a qualidade dos pesticidas existentes é muito baixa, devido ao
fraco controlo de qualidade aí existente (Popp et al., 2013). Ou ainda, noutros países
Africanos onde alguns pesticidas como o DDT, já banidos na Europa, continuam a ser
usados quer na agricultura, quer em programas de saúde, como no combate à malária
(Yohannes et al., 2013). Os riscos decorrentes da aplicação de pesticidas no ambiente
resultam de vários fatores que incluem desde as propriedades químicas do composto
e sua toxicidade, às propriedades do solo até às próprias práticas agrícolas que
determinam as quantidades, taxas, frequência e formas de aplicação e a realização
simultânea de correções orgânicas dos solos (Odukkathil e Vasudevan, 2013). No que
refere às propriedades químicas, pesticidas com maior estabilidade e fraca
solubilidade tendem a ser menos afetados pelos processos físico-químicos e, por isso,
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
7
mais persistentes no ambiente (Odukkathil e Vasudevan, 2013), ficando no solo ou
sendo arrastados para os cursos de água vizinhos onde os seus resíduos começam a
ser detetados em concentrações elevadas, causando preocupações ambientais, de
saúde pública e até mesmo económicas (Bagumire et al., 2008).
1.2.2. Eutroficação
A eutroficação cultural é o termo que define o aumento de produtividade biológica de
um sistema aquático, resultante da entrada excessiva de nutrientes, a níveis que
ultrapassam a capacidade que este tem de repor o equilíbrio (Wetzel, 1983; Smith e
Schindler, 2009). De acordo com a Avaliação do Milénio dos Ecossistemas (MEA,
2005), a agricultura está entre uma das principais atividades que sérios danos tem
causado às zonas húmidas interiores e costeiras, quer através de captação excessiva
de água para irrigação, quer através de aplicações excessivas de fertilizantes
(sobretudo azoto e fósforo). Em determinadas zonas estas aplicações são de tal forma
excessivas que os solos saturados continuam a contribuir por diversos anos com
cargas elevadas de nutrientes para os sistemas aquáticos (Smith e Schindler, 2009).
Em 2008 estimou-se que 28% dos lagos e reservatórios africanos estavam
eutrofizados (Nyenje et al., 2010). Contudo, e no que refere à África Subsariana, a
agricultura não parece ser a principal responsável pela degradação dos sistemas
aquáticos, mas sim as águas residuais urbanas que na sua grande maioria (cerca de
80%) permanecem sem qualquer tratamento sendo libertadas diretamente no solo,
através de fossas sépticas ou diretamente nos meios aquáticos (Nyenje et al., 2010;
Juma et al., 2014). Este fato é agravado pelo aumento populacional nos centros
urbanos, onde o saneamento básico continua a ser inadequado (Juma et al., 2014).
Na verdade, apesar de em determinadas regiões os fertilizantes serem de facto
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
8
utilizados, as quantidades aplicadas são reduzidas, muitas vezes devido limitações
económicas dos pequenos agricultores (Vanlauwe e Giller, 2006).
O aumento de nutrientes em massas de água provoca inúmeros problemas para
as comunidades aquáticas. Entre os principais impactos está a diminuição do oxigénio
dissolvido na água, alterações na estrutura das comunidades e diminuição da
diversidade biológica, assim como o aumento da turbidez o que leva a alterações de
estados dominados por fitoplâncton (sobretudo por blooms de cianobactérias) para
estados dominados por plantas aquáticas, muitas vezes com domínio de espécies
invasoras (Aguiar, et al., 2011; Ka et al., 2011; van Ginkel, 2012; Juma et al., 2014).
Associado aos blooms de cianobactérias está ainda a produção de cianotoxinas que
representam um problema de saúde pública e económico, na medida em que são
igualmente responsáveis pela morte de cabeças de gado (van Ginkel, 2011). O
excesso de nutrientes pode ainda contribuir para aumentar a abundância de agentes
patogénicos, promovendo o desenvolvimento dos seus hospedeiros (Smith e
Schindler, 2009), assim como para outros efeitos indiretos, que provocam profundas
alterações nas comunidades. Entre alguns dos efeitos indiretos, Turner e Chislock
(2010), por exemplo, demonstraram que um aumento do pH, provocado pelo aumento
da atividade fotossintética, resultante do excesso de nutrientes, provoca alterações
nas capacidades sensoriais em moluscos impedindo-os de detetar as pistas químicas
emitidas pelos seus predadores. Como consequência estes organismos ficam assim
mais sujeitos a pressões predatórias. Por outro lado, a ocorrência de picos de hipoxia
parece comprimir as espécies mais sensíveis de zooplâncton numa faixa mais estreita
do epilimnion, aumentando a sua exposição aos predadores e alimento de menor
qualidade. Este comportamento de evitamento das zonas com menor concentração de
oxigénio contribuiu para uma redução do tamanho do corpo e do conteúdo em RNA
(usado como indicador de fome) de Daphnia mendotae, no Lago Erie (América do
Norte) (Goto et al., 2012). Além das consequências apontadas pelo autor, é
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
9
igualmente de esperar que uma redução do tamanho do corpo das espécies
zooplanctónicas contribua para reduzir a sua capacidade de controlar a comunidade
fitoplanctónica, agravando ainda mais o processo de eutroficação.
Um estudo recente demonstra, contudo, que nem sempre a eutroficação se traduz
em efeitos adversos. Marroni e colaboradores (2014) demonstraram que o bivalve
invasor Corbicula fluminea reduz significativamente a sua taxa de filtração na presença
de cianobactérias, enquanto a espécie nativa Diplodon parallelopipedon mantém a sua
taxa de filtração inalterada, o que confere vantagens competitivas à espécie nativa.
Os problemas de eutroficação em África têm sido bem reportados,
particularmente para o lago Vitória (Juma et al., 2014), e para ecossistemas aquáticos
da África do Sul (van Ginkel, 2011; van Ginkel, 2012), sendo a informação disponível
para outros países Africanos muito escassa.
1.2.3. Uso excessivo de água
A água e outros recursos naturais foram sempre considerados abundantes e
facilmente exploráveis pelo Homem, que sempre escolheu locais para se implantar,
onde as condições eram favoráveis à vida, em especial no que refere à estabilidade do
clima e à disponibilidade de água. Mas com o aumento exponencial da população,
humana os recursos tornaram-se escassos. Nos últimos anos o acesso a água,
potável tornou-se um grande problema para as populações mundiais, principalmente
nas regiões áridas ou semi-áridas do planeta. O problema da desigualdade na
disponibilidade deste recurso tem tendência para se intensificar e as consequências
dessas desigualdades são imprevisíveis.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
10
Segundo o AQUASTAT, o sistema de informação global da FAO relativo à
água1, a agricultura encontra-se entre os setores que mais água consome,
correspondendo a cerca de 70% da água doce removida dos recursos de água doce
do planeta. Além do consumo excessivo, acrescem todos os impactos negativos em
termos de contaminação e eutroficação que a agricultura pode ter sobre os sistemas
aquáticos. Contudo, tal não é o caso da África Subsariana, onde as populações mais
pobres que vivem em áreas rurais dependem da precipitação para irrigar as suas
culturas, dependendo assim das flutuações climáticas e vendo a sua produtividade
limitada apenas aos meses de chuva (Burney, 2012). Quer nesta região do planeta,
quer na Ásia, a irrigação é considerada como fundamental no processo de combate à
pobreza, pois permitirá aumentar a produtividade agrícola, garantir o acesso dos mais
pobres à água para usos diversificados, reduzindo as desigualdades, aumentar o
emprego, os rendimentos e o consumo; melhor nutrição e saúde (Hanjra et al., 2009).
1.2.4. O problema da falta de perceção do risco e de pessoas com a
formação adequada para efetuar monitorizações ambientais
Remondou e colaboradores (2014), numa revisão recente sobre a perceção dos
riscos associados ao uso de pesticidas, constataram que nos países em
desenvolvimento a elevada taxa de iliteracia contribui para a reduzida perceção dos
riscos dos produtos agroquímicos por parte dos agricultores, que têm dificuldades em
perceber os valores de toxicidade reportados nas etiquetas e, na grande maioria dos
casos, não receberam qualquer formação relacionada com o uso e armazenamento de
pesticidas. De qualquer modo, os mesmos autores registaram ainda que a relação
entre a perceção dos riscos e os comportamentos daqueles que usam pesticidas,
1 http://www.fao.org/nr/water/aquastat/water_use/index.stm, disponível em Agosto de
2014.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
11
sobretudo no que refere à proteção da sua saúde, não é direta. Pelo que se pode
depreender que a falta de conhecimento e de um comportamento de proteção pessoal,
ocorrerá certamente a par com a falta de comportamentos que visem a proteção dos
ecossistemas naturais.
Neste contexto, e de acordo com Hanjra et al. (2009), com o objetivo de se reduzir
a pobreza na África Subsariana, a par com os investimentos em grandes infra-
estruturas de irrigação, deve-se investir quer na educação para a saúde, quer na
educação ambiental, ou ainda na educação dos agricultores para que aprendam a
utilizar os fertilizantes de forma eficaz, assim como outros produtos agroquímicos de
modo a reduzir os impactos no ambiente. Para o efeito torna-se premente formar
docentes com especialização em monitorização e educação ambiental, assim como
nas áreas de ecologia e de ecotoxicologia que sejam capazes de se envolver ou de
compreender a avaliação de riscos de compostos químicos e de perceberem os seus
efeitos no biota. Estes poderão, já nos seus países, contribuir para a formação de
pessoal técnico especializado nestas áreas, pronto a trabalhar no terreno, junto das
populações, para que possam contribuir para um desenvolvimento sustentado e
garantir que assim se atinjam os objetivos de desenvolvimento milénio definidos pelas
Nações Unidas, em particular o objetivo 1 (MDG1) de erradicação da fome e pobreza
extrema2.
1.3.Objetivos geral e específicos da tese
Face aos problemas referidos na Introdução, o presente estudo teve por objetivo
avaliar os efeitos ecotoxicológicos para organismos aquáticos e determinar os limites
de risco de um pesticida muito utilizado em Moçambique, na bacia de drenagem do rio
2 http://www.un.org/millenniumgoals, (acedido em Agosto de 2014).
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
12
Pungue, localizada no centro de Moçambique e partilhada com o Zimbabwe, onde tem
a sua origem. Este rio atravessa as províncias de Manica e de Sofala através dos
distritos de Manica, Gondola, Gorongosa, Nhamatanda, Dondo e Beira (figura i do
anexo I) e desagua no oceano Índico junto ao porto da cidade da Beira, depois de
atravessar diversas áreas de exploração agrícola, principalmente em Nhamatanda e
Dondo, onde o fungicida é largamente utilizado para combater ou proteger plantas
como cana-de-açúcar, tomateiro, repolho e milho, entre outras. A avaliação
ecotoxicológica é feita através de ensaios padronizados com uma bateria de
organismos de diferentes níveis tróficos nomeadamente a bactéria Vibrio fisheri, a alga
verde Raphidocellis subcapitata, a planta aquática Lemna minor, o cladócero Daphnia
magna, e os peixes de água doce Carassius auratus e Danio rerio. Para tornar
possível este objetivo são propostos três objetivos específicos:
1) Obter dados de toxicidade para a bateria de espécies acima mencionada;
2) Determinar um limite de risco (PNEC) para Mancozeb® (substância comercial)
integrando os dados obtidos numa curva de distribuição de sensibilidade das
espécies, para estimar quocientes de perigo; ou aplicando fatores de avaliação.
3) Adquirir conhecimento em avaliação de risco de compostos químicos, utilizando
ferramentas já disponíveis na União Europeia, e que poderão ser adotadas nos
países africanos.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
13
2. Material e Métodos
2.1. Pesticida Mancozeb®
O fungicida Mancozan® é um fungicida orgânico não sistémico cujo princípio ativo
Mancozeb® pertence ao grupo dos etileno-bis (ditiocarbamato), de largo espetro de
ação, utilizado em legumes, frutas e planta do tabaco (Bayer Crop Science, 2014).
Este composto apresenta baixa volatilidade e insolubilidade na maioria dos solventes
orgânicos (Alves, 2008). O produto comercial – Mancozan® - vendido na forma de um
pó amarelo, solúvel em água pela Bayer contém 80% (m/m) de Mancozeb® e 20%
(m/m) de coadjuvantes. A seleção deste produto baseou-se no facto de se tratar de
um fungicida largamente utilizado em Moçambique (tal como já foi previamente
descrito). Optou-se igualmente pela substância comercial por já se ter provado que
muitas vezes o princípio ativo revela menor ou maior toxicidade, sendo que os dados
gerados podem conduzir com frequência a sub ou sobrestimativas do risco destes
compostos (Pereira et al., 2009).
2.2. Ensaios ecotoxicológicos
2.2.1. Ensaio de Microtox® com V. fischeri
O ensaio de Microtox® com a bactéria Vibrio fischeri foi selecionado pelo fato de ter a
vantagem de ser rápido e simples (Parvez et al., 2006). Os mesmos autores afirmam
que a inibição da emissão de luminescência pela bactéria indica de forma eficaz
potenciais efeitos tóxicos de contaminantes em organismos superiores. O ensaio foi
realizado com base no protocolo do ensaio “Basic Test 81.9%” disponibilizado pela
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
14
MicrotoxOmni (AZUR Environmental, 1998). A bactéria foi exposta a uma gama de
concentrações de Mancozan® (substância comercial) diluídas em água a partir de uma
solução mãe preparada imediatamente antes do ensaio, e a luminescência foi medida
aos 5, 15 e 30 minutos, utilizando o analisador Microtox model 500 Analyser. Os
valores de ECx para cada um dos tempos de exposição foram calculados pelo
Software MicrotoxOmni (Azur Environmental, 1998).
2.2.2 Manutenção de culturas e ensaio de inibição de crescimento com
Raphidocelis subcapitata
A cultura de R. subcapitata é mantida em meio MBL, preparado a partir de água
destilada com macronutrientes e micronutrientes, assim como vitaminas de acordo
com as proporções descritas na Tabela 1. Para o efeito, foram preparados 5000 mL do
meio de cultura, posteriormente autoclavado, a 121ºC, durante 80 minutos. Após o
arrefecimento, adicionaram-se 500µL de vitaminas de acordo com o descrito no
protocolo 201 da OECD (OECD, 2006a). Depois de preparado, o meio foi inoculado
com 50 mL de cultura algal. As culturas, assim reiniciadas, são mantidas na câmara
climática com arejamento, temperatura controlada (20 ± 2ºC), fotoperíodo 16 hL:8 hE, a
uma intensidade luminosa de aproximadamente 7000 lux.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
15
Tabela 1. Composição química do meio de cultura (MBL) para a microalga, R. subcapitata
(OECD, 2006a).
Fórmula Química
Quantidade de composto para preparação de
solução stock (g L-1)
Volume da solução stock por cada litro do meio (mL)
Macronutrientes
CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O
NaHCO3 K2HPO4 NaNO3
Na2SiO3·9 H2O
36,76 36,97 12,6 8,71 85,01 28,42
1 1 1 1 1 1
Micronutrientes
Na2EDTA FeCl3·6H2O
CuSO4·5H2O ZnSO4·7H2O CoCl2·6H2O MnCl2·4H2O
Na2MoO4·2H2O
4,36 3,15 0,001 0,022 0,01 0,18 0,006
1 1 1 1 1 1 1
Vitaminas*
Tiamina HCl (B1) Biotina (H)
Cianocobalamina (B12)
0,1 mg L-1 0,5 mg L-1 0,5 mg L-1
1
TRIS (hidroximetilaminometano)
50 g/200 mL 2
(*) Só são adicionados ao meio após autoclavagem e e arrefecimento.
(**) O pH tem de ser ajustado a 7,2 a 20º C adicionando HCl
O ensaio de inibição com R. subcapitata foi realizado segundo o protocolo 201
da OECD (OECD, 2006a), em placas de 24 poços, a partir de um inóculo de algas
proveniente da cultura do laboratório (previamente descrita), retirado aquando a
cultura se encontra em fase de crescimento exponencial. Após ensaios preliminares,
as concentrações de Mancozan® testadas, expressas com base no princípio ativo
Mancozeb® (para este e todos os ensaios realizados), variaram entre 1,19 e 9,0 mg L-
1, separadas por um fator de diluição de 1,5. Para cada concentração testaram-se 3
réplicas (separadas em 3 poços distintos), cada uma com 900 L da solução de
Mancozeb®, mais 100 L de inoculo algal, de forma a iniciar o teste com uma
densidade algal de 104 células mL-1. O controlo foi preparado da mesma forma, mas
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
16
apenas com meio MBL. As placas foram mantidas durante 72 h nas mesmas
condições descritas para a manutenção da cultura. Duas vezes por dia, o conteúdo
dos poços foi agitado com recurso a uma pipeta.
Após o período de exposição procedeu-se à contagem do número de células por
mililitro de meio com recurso a uma câmara de Neubauer no microscópio Leitz Wetzlar
de transformador (240 v/60 HZ). Após a contagem de todas as réplicas, os critérios de
validade do ensaio, estabelecidos pelo protocolo, foram verificados e procedeu-se ao
cálculo da percentagem de crescimento algal e da percentagem de inibição.
2.2.3. Manutenção da cultura e ensaio de inibição de crescimento com Lemna
minor
À semelhança das culturas algais, para o ensaio de toxicidade com a espécie L.
minor, utilizaram-se plantas obtidas a partir do Laboratório de Ambiente Aquático da
Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, a manutenção da cultura foi feita em
meio Steinberg cuja constituição química pode ser observada na tabela abaixo e
consta do protocolo padronizado OECD 221 (OECD, 2006b).
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
17
Tabela 2. Composição do meio Steinberg para culturas de L. minor.
Composição química das Solução stocks
Quantidade do composto para solução stock
Volume de solução para o meio Steinberg
Solução Stock 1 KNO3 KH2PO4 K2PO4
17,50 g L-1 4,5 g L-1
0,63 g L-1
20 mL
Solução stock 2 MgSO4.7H2O
5 g L -1
20 mL
Solução Stock 3 Ca(NO3)2.4H2O
0,800 g L-1
20 mL
Solução Stock 4 H3BO3
120m g L-1
1 mL
Solução Stock 5 ZnSO4.7H2O
180 mg L-1
1 mL
Solução Stock 6 Na2MoO4.2H2O
44 mg L-1
1 mL
Solução Stock 7 MnCl2.4H2O
180 mg L-1
1 mL
Solução Stock 8 FeCl3.6H2O
760 mg L-1
1 mL
EDTA Disódio desidratado 1500 mg L-1 1 mL
(*) Só são adicionados ao meio após autoclavagem e e arrefecimento.
(**) O pH tem de ser ajustado a 7,2 a 20º C adicionando HCl
Assim, o meio Steinberg para cultura de L. minor foi preparado adicionando 20 mL
das soluções stock 1, 2 e 3 a água destilada e 1 mL das soluções stock de 4 a 7. De
seguida ajustou-se o volume até perfazer 1 L de meio de cultura. O meio foi
posteriormente autoclavado a 121ºC, durante 20 minutos por cada litro, antes da
adição de 1ml da solução 8, após o arrefecimento. Seguiu-se a manutenção das
culturas, mantidas em Erlenmeyrs previamente esterilizados de 500 mL de volume,
com 200 mL de meio e tapados com rolhas de algodão e gaze de modo a permitir o
arejamento dentro dos recipientes. As culturas são mantidas numa câmara
fotoclimática com temperatura 22±2ºC, fotoperíodo de 16 hL:8 hE e luminosidade de
aproximadamente 7000 lux.
Como desenho experimental deste ensaio (Figura 1), consideraram-se 6
tratamentos com uma gama de concentrações a variar entre 1,19 e 9,0 mg L-1 de
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
18
Mancozeb® separadas por um fator de diluição de 1,5. Para cada um destes 6
tratamentos, preparam-se 3 réplicas em Erlenmeyers de vidro de 250 mL, previamente
esterilizados.
Figura 1. Esquema representativo do desenho experimental concebido para o ensaio de
inibição de crescimento com L. minor para testar diferentes concentrações de Mancozeb®.
Assim, em cada Erlenmeyer colocou-se um volume total da solução de pesticida de
100 mL ou de meio Steinberg (no CTL) e 9 frondes de L. minor. Mediu-se o peso seco
de 3 conjuntos de 9 frondes da planta retiradas aleatoriamente da cultura, para
posterior comparação com o desenvolvimento ocorrido, no final do ensaio. A fim de se
proceder à determinação do peso seco, estes 3 conjuntos foram colocados na estufa a
uma temperatura de 60ºC, durante 24 h. Após este período, determinou-se o peso
seco com uma precisão de três casas decimais, numa balança eletrónica de precisão
(RDWAG Max 21 g; d=1 µg). A exposição decorreu durante um período de 7 dias, em
condições controladas de luminosidade (aproximadamente 7000 lux), temperatura (20
± 2ºC) e fotoperíodo (16 hL:8 hE). No final dos 7 dias de exposição, as frondes de cada
réplica foram contabilizadas e recolhidas para determinação do peso seco, tal como foi
já descrito. Após se ter verificado se os critérios de validade haviam sido cumpridos,
procedeu-se à determinação da taxa de crescimento e da percentagem de inibição de
crescimento para cada tratamento.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
19
2.2.4. Manutenção da cultura e ensaio de imobilização com Daphnia
magna
A cultura de D. magna do Laboratório de Ambiente Aquático da Faculdade de Ciências
da Universidade do Porto é iniciada com juvenis da 3ª à 5ª geração com menos de 24
h. Os organismos são mantidos em meio de cultura ASTM – hard water, em frascos
com 800 mL de meio e 30 indivíduos e colocados na câmara com luminosidade de
400-800 lux, fotoperíodo 16 hL:8 hD e à temperatura controlada de 20±2ºC. As culturas
são alimentadas com a microalga verde (R. subcapitata), adicionada a uma
concentração de 3,0 x 105 células mL-1 e com 4,8 mL de extrato de algas Algea® Fert
(Kristiansund Norway). O meio de cultura é renovado e os organismos são
alimentados a cada dois dias. O nascimento de neonatos é acompanhado e sempre
que surge uma nova ninhada esta é retirada do frasco das fêmeas adultas.
O ensaio de imobilização com D.magna foi realizado com 160 juvenis
(neonatos) obtidos na 4ª geração com menos de 24 h, segundo o protocolo
padronizado OECD 202 (OECD, 2004). Os indivíduos foram expostos a sete
concentrações de Mancozeb® mais o controlo com ASTM e monitorizados, em tubos
de ensaio de vidro, num volume de 25 mL. As concentrações testadas variaram entre
0,13 e 0,63 mg L-1, separadas por um fator de 1,3. Para cada concentração,
prepararam-se 4 réplicas, com 5 organismos cada, e a exposição decorreu durante 48
h. Às 24 e 48 horas os tubos foram inspecionados para verificar a existência de
indivíduos imobilizados, os quais foram contabilizados e retirados do tubo. No início e
no fim do ensaio mediu-se o oxigénio dissolvido e o pH em todas as concentrações
testadas.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
20
2.2.5. Manutenção e teste de toxicidade com ovos de Danio rerio
D. rerio é uma espécie de água doce muito usada na investigação científica sobretudo
para o estudo do desenvolvimento embrionário de vertebrados. A preferência por esta
espécie deve-se às suas características, como dimensões reduzidas, fácil manutenção
em laboratório, posturas com um número elevado de ovos, crescimento rápido dos
embriões, entre outros (Gerla, et al., 2000). É também uma espécie sensível a
substâncias químicas (Stehr et al. 2006), daí ter sido proposta como organismo teste
em protocolo padronizado OECD 236 (OECD, 2013).
Os ovos foram adquiridos a partir de uma cultura do laboratório do CIIMAR-UP.
Os ovos foram primeiramente inspecionados para selecionar apenas ovos fertilizados.
Os ensaios foram iniciados 1 h após a postura e foram realizados em placas de 24
poços, tendo-se colocado um ovo por poço, num total de 30 ovos por concentração
mais o CTL (com água desclorada, filtrada por um filtro de carvão ativado e arejada).
Os ovos foram separados em grupos de 10 por cada placa (3 por concentração),
exceto para o controlo em que se colocaram grupos de 20 ovos por placa, num total
de 60. Para o ensaio foram testadas 9 concentrações de Mancozeb®, a variar entre
0,02 e 2,45 mg L-1, separadas por um fator de diluição de 1,8. As diluições foram
preparadas com a água usada no CTL. Em cada poço colocou-se um volume de 2 mL
da diluição do pesticida ou de água do CTL. Após a recolha dos tanques de
reprodução, os ovos foram lavados, selecionados e colocados de imediato em
contacto com as soluções teste em caixas de Petri, sendo posteriormente transferidos
para as respetivas placas, onde foram mantidos em condições de luminosidade de
400-600 lux, fotoperíodo 14 hL:10 hE, e a uma temperatura de 26oC, durante 96 h. O
ensaio foi monitorizado a cada 24 h, e após este período as placas foram observadas
com recurso a uma lupa binocular para contabilizar os indivíduos mortos (indicadores:
coagulação dos ovos; ausência de formação de sómitos; ausência de eclosão dos
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
21
ovos e a falta de batimentos cardíacos), eclodidos e com anomalias. Os critérios da
validade impostos pelo ensaio foram verificados.
2.2.6. Ensaio de inibição da atividade da enzima acetilcolinesterase em
Carassius auratus
O ensaio com a espécie C.auratus teve como objectivo verificar os efeitos sub-letais
do pesticida Mancozan® (princípio ativo: Mancozeb®) em peixe-dourado, através da
quantificação da actividade da enzima acetilcolinesterase (AChE), a qual é
responsável por degradar o neurotransmissor acetilcolina em tiocolina e acetato, nas
sinapses colinérgicas, do sistema nervoso central (Yi et al., 2006).
Os organismos foram obtidos de uma loja de aquariofilia local e estiveram em
quarentena durante duas semanas, em aquários com água da torneira desclorada,
com arejamento e alimentados ad libitum diariamente. O ensaio foi realizado em
recipientes com 1 L de volume das soluções do pesticida, diluídas com água da
torneira desclorada, a qual foi usada para o controlo. Por cada recipiente colocou-se
um organismo. Foram testadas 6 concentrações do pesticida (substância comercial –
expressas em concentração do princípio ativo) a variarem entre 0,03 e 0,25 mg L-1
separadas por um factor de diluição de 1,5. A exposição durou 96 h com arejamento,
20±2oC de temperatura e condições de luminosidade e fotoperíodo naturais. Por cada
concentração mais o CTL, foram utilizados 5 organismos expostos individualmente.
Durante o ensaio, os organismos não foram alimentados.
No final do ensaio, os organismos foram retirados das soluções e
imediatamente decapitados, sem ser administrada qualquer anestesia, na medida em
o estudo tinha como objetivo avaliar um parâmetro do sistema nervoso. Cada animal
foi sacrificado individualmente, distante dos outros animais ainda vivos. As cabeças
foram imediatamente colocadas em tubos Falcon com 2 mL de tampão fosfato (0,1 M,
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
22
pH=7,2). Os homogeneizados foram posteriormente centrifugados a 6000 rpm,
durante 3 minutos, a 4ºC. Após a centrifugação, o sobrenadante foi separado para
análise da atividade enzimática e do conteúdo em proteína. A atividade da enzima
acetilcolinesterase foi medida pelo método descrito por Ellman et al. (1961). Como
referido em cima, a enzima acetilcolinesterase degrada a acetilcolina em colina mais
acetato. A tiocolina reduz o DTNB (ácido ditiobis-nitrobenzóico em nitrobenzoato de
cor amarela). A formação deste composto (ɛ=13.6 mM-1cm-1) é monitorizada a 412 nm,
durante 5 minutos, iniciados 10 minutos após o início da reação. O conteúdo total em
proteína da amostra foi determinada pelo método de Bradford (Bradford, 1976) e a
atividade enzimática é expressa em nmol de substrato hidrolizado min-1 mg-1 de
proteína.
2.2.7. Análise estatística
Em todos os ensaios (excepto para V. fischeri e D. magna), para os parâmetros
avaliados realizaram-se análises de variância (ANOVA) de uma via para testar
diferenças entre os tratamentos testados (diferentes concentrações do pesticida).
Sempre que se registaram diferenças significativas procedeu-se à realização de testes
de Dunnet, para determinação dos tratamentos para os quais se registavam diferenças
relativamente ao controlo. Com base nesta análise foram obtidos, sempre que possível
os valores de NOEC e LOEC.
Os valores de EC50, isto é a concentração que afeta 50% dos organismos teste
(e.g. mortalidade), ou que causa uma inibição de 50% no parâmetro testado (e.g.
inibição de crescimento), foi calculada com recurso a dois métodos estatísticos
distintos, utilizando dois softwares diferentes. Assim para a mortalidade de D. magna
os valores de EC50 e de EC20 e respetivos intervalos de confiança a 95%, foram
estimados com recurso à análise de PROBIT (Finney, 1971), utilizando o software
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
23
PriProbit versão 1.63. os valores de EC50 para os ensaios sub-letais e respetivos
intervalos de confiança a 95%, foram determinados após ajuste de regressões não
lineares aos dados utilizando o software Statistica 12.0 (StatSoft Inc. Tulsa, OK, USA).
Os valores ecotoxicológicos obtidos com base em protocolos padronizados
foram utilizados para estimar valores de PNEC para serem propostos como limites de
risco para Mancozeb®. Estes valores foram estimados com base em duas
metodologias propostas pelo documento guia da Comissão Europeia para Avaliação
de Risco (EC, 2003): curvas de distribuição de sensibilidade das espécies e fatores de
avaliação.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
24
3. Resultados
Os critérios de validade impostos pelos diferentes protocolos usados foram cumpridos,
pelo que os dados que se apresentam são os dados dos ensaios definitivos
realizados. A tabela 3 resume os valores de EC20 e EC50 estimados para as diferentes
espécies testadas. Como é possível verificar a bactéria V. fischeri foi sensível ao
pesticida, sendo que a toxicidade apresenta um comportamento variável, mostrando
tendência para diminuir ao fim de 15 minutos de exposição mas aumentando aos 30
minutos.
Tabela 3: Resumos dos dados de toxicidade obtidos para Mancozeb® (substância ativa) para a bateria de
espécies testadas. Valores de toxicidade, e respetivos intervalos de confiança a 95% (IC95%), assim
como o valor de r do modelo ajustado aos dados.
ECx (mg L-1
) IC 95% R
V. fischeri EC20-5min – 0,90
EC20-15min – 1,26
EC20-30min – 0.69
0,72-1,13
0,95-1,68
0,58-0,82
0.995
0,993
0,997
EC50-5min – 4,03
EC50-15min – 5,38
EC50-30min – 4,52
2,71-5,98
4,78-6,07
3.62-5,65
0.995
0,993
0,997
R. subcapitata EC20 – 1,75 1,49-2,02
0.993
EC50 – 8,52 7,67-9,37
L. minor (frondes) EC20 – 4,19 3.48-4.92 0.968
EC50 – 6,30 5,70-6,89
L. minor (peso seco) EC20 – 2,47 2.04-2.91 0.981
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
25
EC50 – 3,57 3,21-3,93
D. magna EC50_24h – 0,51 0,44-0,62 ---
EC50_48h – 0,26 0,22-0,31 ---
C. auratus EC50 – 0,0676 NC 0.949
D. rerio EC50 – 0,33 0,10-1,13 ---
Não obstante tratar-se de um fungicida, as concentrações de Mancozeb®
testadas inibiram igualmente e de forma significativa a taxa de crescimento da espécie
algal (F= 637,69; d.f. 17, 6; p<0,05) (Figura 2). As diferenças significativas
relativamente ao controlo foram registadas a partir da concentração mais baixa testada
(Dunnett: p<0,05). Contudo, a percentagem de inibição de crescimento não chegou a
atingir os 60%, na concentração mais alta testada (Figura 3).
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
26
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 1,19 1,78 2,67 4,00 6,00 9,00
Taxa
mé
dia
esp
ecí
fica
de
cre
scim
en
to (
dia
-1)
Mancozeb mg L-1
Raphidocellis subcapitata
Figura 2. Taxa média de crescimento em Raphidocellis subcapitata exposta a uma gama de
concentrações do pesticida Mancozeb® (as concentrações correspondem a concentrações do
princípio ativo). As barras de erro correspondem ao desvio padrão, e os asteriscos indicam
diferenças significativas, relativamente ao controlo (p<0,05).
0
10
20
30
40
50
60
1,19 1,78 2,67 4,00 6,00 9,00
Inib
ição
de
cre
scim
en
to d
e a
lgas
(%
)
Mancozeb mg L-1)
Raphidocellis subcapitata
Figura 3. Percentagem média de inibição de crescimento em Raphidocellis subcapitata exposta
a uma gama de concentrações do pesticida Mancozeb® (as concentrações correspondem a
concentrações do princípio ativo). As barras de erro correspondem ao desvio padrão.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
27
Analisando os valores de EC50 e EC20 estimados (Tabela 3), a planta aquática L. minor
apresentou uma sensibilidade ligeiramente superior a R. subcapitata, quando se
analisa o EC50 obtido quer para o número de frondes produzidas pela planta quer para
a taxa de crescimento. No que diz respeito à percentagem de inibição de crescimento,
determinada com base na biomassa seca, verifica-se que houve um aumento
progressivo com o aumento da concentração do pesticida tendo sido máxima na
concentração mais elevada de Mancozeb® testada (9 mg L-1), a qual foi semelhante à
testada para a alga verde (Figura 3). Contudo, no que refere ao número de frondes a
percentagem de inibição não chegou a atingir os 100% na concentração mais elevada.
Com base nos resultados da análise de variância de uma via, seguida do teste de
Dunnet, apenas se registaram diferenças significativas em termos do número de
frondes produzidas e da biomassa seca a partir da terceira e quartas concentrações
do pesticida testadas (Frondes: F=140.72; d.f. 14, 20; p<0.001; Peso seco: F=129,16;
d.f. 14, 20; p<0,001) (Figuras 4 e 5). Foi ainda possível obter LOECs (4,00 e 2,67 mg
L-1) para as taxas de crescimento estimadas com base no número de frondes e de
biomassa seca, respetivamente, valores estes que são semelhantes aos valores de
EC20 estimados (Tabela 3). O parâmetro peso seco ou biomassa seca revelou-se
como sendo o mais sensível para esta espécie.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
28
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
CTL 1,19 1,78 2,67 4,00 6,00 9,00
Taxa
mé
dia
de
cre
scim
en
to e
m n
ª d
e
fro
nd
es
Mancozeb mg.L-1
Lemna minor (Frondes)
*
*
*
Figura 4. Taxa média de crescimento em L. minor exposta a uma gama de concentrações do
pesticida Mancozeb® e calculada com base no número de frondes produzidas (as
concentrações no eixo dos XX, correspondem a concentrações do princípio ativo). As barras de
erro correspondem ao desvio padrão. Os asteriscos indicam diferenças significativas,
relativamente ao controlo (p<0,05).
-0,10
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
CTL 1,19 1,78 2,67 4,00 6,00 9,00
Mncozeb mg L-1
Lemna minor (biomassa seca)
*
*
*
*
Figura 5. Taxa média de crescimento em L. minor exposta a uma gama de concentrações do
pesticida Mancozeb® e calculada com base na biomassa seca (as concentrações no eixo dos
XX, correspondem a concentrações do princípio ativo). As barras de erro correspondem ao
desvio padrão. Os asteriscos indicam diferenças significativas, relativamente ao controlo
(p<0,05).
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
29
-20
0
20
40
60
80
100
1,19 1,78 2,67 4,00 6,00 9,00
% In
ibiç
ão d
o c
resc
ime
nto
em
nú
me
ro d
e
fro
nd
es
Mancozeb mg. L-1
Lemna minor (frondes)
Figura 6. Percentagem média de inibição de crescimento em L. minor (número de frondes)
exposta a uma gama de concentrações do pesticida Mancozeb® (as concentrações
correspondem a concentrações do princípio ativo). As barras de erro correspondem ao desvio
padrão.
0
20
40
60
80
100
120
1,19 1,78 2,67 4,00 6,00 9,00% d
e in
ibiç
ão d
o c
resc
ime
nto
em
b
iom
assa
se
ca
Mancozeb mg L-1
Lemna minor (biomassa seca)
Figura 7. Percentagem média de inibição de crescimento em L. minor (peso seco) exposta a
uma gama de concentrações do pesticida Mancozeb® (as concentrações correspondem a
concentrações do princípio ativo). As barras de erro correspondem ao desvio padrão.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
30
0
50
100
150
200
250
CTL 0,03 0,05 0,07 0,11 0,17 0,25
Ati
vid
ade
da
Ace
tilc
olin
este
rase
(m
M.m
in-1
.mg
-1)
Mancozeb mg L-1
Atividade Acetilcolinesterase em Carassius auratus
Figura 8. Atividade média da enzima acetilcolinesterase em C. auratus exposto a uma gama de
concentrações de Mancozeb®, durante 96 h (as concentrações correspondem a concentrações
do princípio ativo). As barras de erro correspondem ao desvio padrão e os asteriscos destacam
diferenças significativas relativamente ao controlo (Dunnett p<0,05).
Durante o período de exposição de 96 h, não se registou a ocorrência de
mortalidade. A atividade da enzima acetilcolinesterase foi claramente inibida em C.
Auratus, após uma exposição de 96 h (Figura 8). O efeito do fungicida sobre este
parâmetro é de certa forma curioso, na medida em que não se observou uma resposta
progressiva, mas sim um decréscimo abrupto na atividade enzimática dos organismos.
A análise de variância de uma via comprovou assim que houve uma inibição muito
significativa da atividade desta enzima (F=64.74; d.f. 6,37; p<0.001) que ocorreu a
partir da concentração de 0,07 mg L-1 de Mancozeb®, quando comparada com o nível
de atividade registada no controlo. Como NOEC e LOEC para estes valores, podem
indicar-se as concentrações de 0,05 e 0,07 mg L-1, respetivamente.
A figura 9 representa os resultados obtidos para a exposição de D. rerio a
diferentes concentrações de Mancozeb®, durante 96 h. A mortalidade no controlo foi
igual a 5% em todas as réplicas, pelo que o ensaio foi considerado válido. A
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
31
percentagem de embriões mortos foi significativamente superior ao controlo, apenas
na concentração mais baixa (0,02 mg L-1), o que se pensa que terá sido um efeito que
ocorreu por acaso e não provocado pelo pesticida (F=3,65, d.f. 20, 29, p=0,07). Os
primeiros efeitos sub-letais foram registados também a partir desta concentração, na
medida em que se registou uma redução muito significativa da percentagem de ovos
que eclodiram em todas as concentrações testadas relativamente ao controlo (Dunnet:
p<0,01). Assim, diferenças muito significativas foram registadas quer para o parâmetro
eclosão (F=3,65, d.f. 20, 29, p=0,07) quer para a ocorrência de anomalias (F=71,24,
d.f. 20, 29, p<0,01) entre tratamentos. Contudo, e apesar deste atraso na eclosão, a
grande maioria dos embriões estava vivo no final do ensaio. No que refere à
ocorrência de anomalias visíveis nos embriões, estas foram significativas a partir da
concentração de 0,23 mg L-1 de Mancozeb® a qual corresponde assim a um valor de
LOEC. O NOEC determinado correspondeu à concentração de 0,13 mg L-1. Uma vez
que a partir desta concentração houve um aumento progressivo da percentagem de
embriões com anomalias, chegando a atingir um valor igual ou superior a 80%, nas
três concentrações mais elevadas, foi possível obter um valor de EC50 para este
parâmetro (Tabela 3), o qual, em termos de parâmetros sub-letais, coloca esta espécie
entre as mais sensíveis das que foram testadas. As figuras 10 (a a h) demonstram
alguns exemplos das graves anomalias registadas, nomeadamente crescimento
retardado (e), má formação na notocorda (b, d, f) e edema no saco vitelino (c, g).
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
32
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
20,0
CTL 0,02 0,04 0,07 0,13 0,23 0,42 0,76 1,36 2,45
Nú
me
ro m
éd
io d
e e
mb
riõ
es
Mancozeb mg L-1
D. rerioMortos
Anomalias
Eclodidos
**
Figura 9. Percentagem média de embriões de D. rerio mortos, com anomalias e eclodidos após
exposição de 96 h a uma gama de concentrações de Mancozeb® (as concentrações
correspondem ao princípio ativo). As barras de erro representam o desvio padrão em relação
aos valores médios. Os asteriscos destacam diferenças significativas relativamente ao controlo
(Dunnett p<0,05).
A figura 11 representa a curva de distribuição de sensibilidade das espécies,
obtida após ajuste de um modelo matemático log-normal aos valores de EC50 obtidos
com base em protocolos padronizados. A partir desta curva foi possível estimar o valor
da concentração perigosa (do inglês: hazard concentration) para 5% das espécies e
respetivo intervalo de confiança a 5%: HC5= 0,121 mg L-1 (CI95%: 0,012-1,183). A
tabela 4, apresenta ainda os valores de PNEC calculados com base no valor de HC5
estimado, e ainda com base na aplicação dos fatores de avaliação. Os valores obtidos
são semelhantes, i.e. da mesma ordem de grandeza, na medida em que, no caso do
PNEC estimado a partir do valor de HC5, se optou por aplicar o fator máximo previsto
(5), pois o HC5 foi estimado com base em valores de EC50 e não de NOECs, e ainda
porque se usou a medida de tendência central e não o intervalo de confiança de 50%,
tal como previsto. No caso do valor de PNEC estimado com base nos fatores de
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
33
avaliação, aplicou-se um fator de 10, ao valor de EC50, mais baixo obtido, que
corresponde ao estimado para D. rerio.
Tabela 4. Valores de PNEC calculados para a substância comercial Mancozan®, e expressas em termos da concentração do seu princípio ativo, determinados com base na metodologia proposta pela Comissão Europeia para novos compostos químicos (EC, 2003).
PNEC baseado no HC5 (fator de 5)
PNEC baseado nos fatores de avaliação
(fator de 10)
Concentração de Mancozeb® (mg. L-1)
0,024 0,033
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
34
Figura 10. Imagens microscópicas dos embriões de D. rerio após 96h de exposição ao
pesticida Mancozeb®: a: CTL sem malformações; b: embrião exposto a 0.02mg L-1
com
malformação na notocorda; c: embrião exposto a 0.04 mg L-1
não eclodido com edema do
vitelo; d: embrião exposto a 0.13 mg L-1
com malformação na notocorda; e: embrião exposto a
0.42 mg L-1
com malformação na notocorda/escoliose, atraso no crescimento; e: embrião
exposto a 1.36 mg L-1
com malformação na notocorda, escoliose e atraso no crescimento; g e
h: embriões expostos a 2.45 mg L-1
, eclodido e não eclodido, com atraso no crescimento e com
anomalias diversas.
a b
c
d
e
f
g h
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
35
L. minor (frondes)
R. subcapitata
D. magna
D. rerio
L. minor (peso seco)
V. fischeri
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0.01 0.10 1.00 10.00 100.00 1000.00
Pro
po
rção
de e
sp
écie
s a
feta
da
Mancozeb mg L-1
Central Tendency
Figura 11. Curva de distribuição de sensibilidade das espécies a Mancozeb®, obtida após
ajuste do modelo linear log-normal aos valores de EC50 obtidos para as diferentes espécies
testadas, seguindo protocolos padronizados. A distribuição permitiu a determinação da
concentração de perigo (do inglês: HC5 - hazard concentration) que afeta 5% das espécies
HC5
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
36
4. Discussão
O presente estudo vem contribuir com um conjunto de dados ecotoxicológicos para
espécies aquáticas não-alvo, para o pesticida Mancozan® (princípio ativo: Mancozeb®),
largamente utilizado em Moçambique, assim como em países Europeus, como
Portugal. Os dados foram obtidos para a substância comercial, na medida em que se
considera serem de maior relevância, já que o princípio ativo não é aplicado de forma
direta nas culturas. A existência de informação ecotoxicológica para este pesticida é
vasta, como pode ser observado na base de dados PANPESTICIDE3, contudo nem
sempre foi obtida com recurso a protocolos padronizados, e apresenta uma grande
variabilidade entre espécies. Do mesmo modo, e não obstante as preocupações
levantadas pelos efeitos evidentes deste agroquímico, nunca se efetuaram esforços no
sentido de integrar os dados existentes para determinar limites de risco (Valores de
PNEC) para este composto ou para a sua substância comercial. Este trabalho cumpriu
ainda a sua função didática de iniciar um estudante do mestrado em Gestão e
Qualidade da Água na avaliação de risco de compostos químicos, o qual poderá vir a
contribuir para a formação de técnicos nesta área, no seu país de origem.
A toxicidade dos pesticidas da classe dos ditiocarbamatos, tal como o
Mancozeb®, é já claramente conhecida (Rath et al., 2011), contudo, e apesar de já ser
reconhecido como muito nocivo para os organismos aquáticos (Bayer Crop Science,
2014), este pesticida continua a ser largamente utilizado, primeiramente porque a
Organização Mundial de Saúde classificou-o como fazendo parte dos compostos com
baixa probabilidade de causarem efeitos agudos em humanos nas doses normalmente
usadas (Maroni et al., 2000) e, mais recentemente, porque é considerado um
composto pouco persistente e de baixa mobilidade no solo (Bayer Crop Science,
3 http://www.pesticideinfo.org/Detail_Chemical.jsp?Rec_Id=PC35080, acedido em Agosto de
2014.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
37
2014). Contudo, dada a sua elevada toxicidade que ocorre em concentrações bastante
inferiores às que são aplicadas no ambiente, não se pode ignorar a possibilidade de
este composto poder facilmente e rapidamente atingir os sistemas aquáticos, através
de escorrências superficiais, afetando organismos de diferentes níveis tróficos. Com
base nos dados de toxicidade obtidos no presente estudo, as espécies animais foram
claramente mais sensíveis, sendo que uma análise meramente numérica dos valores
de EC50 coloca as espécies testadas pela seguinte ordem decrescente de
sensibilidade: C. auratus > D. rerio > D. magna. No entanto, considerando que o
parâmetro avaliado nos cladóceros foi a mortalidade/imobilização, pode-se afirmar que
os invertebrados são certamente mais sensíveis que as duas espécies de vertebrados
testadas neste estudo. Tal afirmação resulta do facto de não se ter registado
mortalidade para as duas espécies de peixes, em concentrações equivalentes ao valor
de EC50 registado para D. magna às 48 h. Por este motivo, a entrada deste pesticida
nos sistemas aquáticos, além dos efeitos diretos reportados, poderá ter igualmente
efeitos a nível do controlo da biomassa algal, na medida em que vai afetar, de forma
significativa, consumidores primários e secundários. No que refere aos produtores
primários, a alga verde R. subcapitata foi menos sensível que L. minor. O valor de
EC50 obtido para a espécie algal neste estudo foi 8,52 mg L-1, o qual é superior ao
reportado previamente por Ma et al. (2007) (EC50=1,75 mg L-1). Este facto é
demonstrativo da elevada variabilidade que existe entre os dados reportados para este
pesticida.
Os mecanismos de ação dos ditiocarbamatos, especialmente para espécies
animais, são já bem conhecidos, cujos estudos foram revistos por Rath et al. (2011) e
biblografia por ele citada. Assim, entre outras formas de ação, destaca-se:
A ligação a outras moléculas com grupos SH, como as proteínas, péptidos e
enzimas, formando complexos disulfídicos mistos e modulando a ação destes;
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
38
A ligação covalente a resíduos de cisteína dos centros ativos de enzimas,
alterando a sua atividade;
A ação como agentes oxidantes, estimulando a formação de radicais livres por
ação do Cu e através da alteração do balanço entre glutationa oxidada (GSSG)
e reduzida (GSH) nas células, provocando uma redução da primeira forma
desta enzima, com um papel importante no combate ao stress oxidativo nas
células;
Inibição de acetilcolinesterases (AChE), enzimas com um papel importante na
degradação do neurotransmissor acetilcolina. Sem degradação deste
neurotransmissor e limpeza das fendas sináticas, a transmissão do impulso
nervoso é afetado, dando origem a neuropatias.
Disrupção endócrina.
No que refere à ação do pesticida sobre as enzimas AChE, o presente estudo é
talvez um dos primeiros a confirmá-la, na medida em que estudos anteriores ainda não
o haviam feito. Um estudo recente de Kubrak et al. (2012) não registou qualquer
inibição da atividade desta enzima em peixes da espécie C. auratus expostos a uma
concentração máxima de 3 mg.L-1, durante 96 h. No presente estudo, não só se
registou uma inibição da atividade de AChE para concentrações bem inferiores do
pesticida (>=0,07 mg L-1), assim como se observou uma resposta abrupta para este
parâmetro.
Relativamente aos invertebrados, outros autores reportaram ainda atrasos no
desenvolvimento e malformações em larvas do lepidóptero Spodopetera exigua
(Hübn) (Adamski e Ziemnicki, 2004) e em larvas do nemátode Caenorhabiditis elegans
(Easton et al., 2001), assim como mortalidade em colêmbolos, ácaros e diplópodes. O
que demonstra assim que o Mancozeb® persiste no solo tempo suficiente para causar
efeitos.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
39
As malformações observadas no presente estudo em D. rerio, estudos anteriores
atribuíram com frequência a sua origem, não ao Mancozeb®, mas sim ao metabolito
resultante da sua degradação (etileno-tioureia – vulgarmente conhecido por ETU), ao
qual a Organização Mundial de Saúde atribuiu propriedades carcinogénicas e
teratogénicas (WHO, 1988 in Calviello et al., 2006). Contudo, Calviello et al. (2006),
demonstraram que o Mancozeb®, e não o seu metabolito, é capaz de originar danos
no DNA de células de ratos, avaliados por quebras nas cadeias de DNA, assim como,
de induzir a apoptose das células. Os danos no DNA observados por estes autores,
ocorreram após 1 h de exposição e foram coincidentes com a formação de adutos de
DNA e com a formação de radicais livres de oxigénio. O que levou a que os autores
sugerissem a possibilidade de o stress oxidativo estar na base dos efeitos observados.
Outros autores reportaram anomalias no desenvolvimento de embriões D. rerio
expostos a um outro pesticida do grupo dos ditiocarbamatos (Sodium Metam®),
semelhantes às observadas no presente estudo (Haendel et al., 2004). As
malformações registadas por estes autores ocorreram fundamentalmente ao nível da
notocorda. A notocorda é um eixo primário nos embriões, que determina a formação
de e a diferenciação de outros tecidos. De acordo com estes autores, as substâncias
tóxicas que afetam a formação desta estrutura dão origem a deformações
permanentes no esqueleto, a anomalias nos músculos e a disfunções neuronais
(Haendel et al., 2004). No presente estudo, esta e outras anomalias, foram registadas
de forma significativa a partir da concentração de 0,23 mg L-1 de Mancozeb®, o que
mais uma vez se considera uma concentração baixa e ecologicamente relevante. Tal
como no estudo de Haendel et al. (2004), a mortalidade registada nos organismos não
foi significativa, para praticamente todas as concentrações testadas, contudo, em
condições naturais, as anomalias apresentadas comprometeriam a viabilidade dos
embriões, na medida em que os mesmos iriam ter sérias dificuldades para se deslocar
e se alimentarem.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
40
Múltiplos estudos demonstraram já que a toxicidade dos diferentes tipos de
pesticidas não se restringe apenas ao grupo alvo de organismos para o qual foi
produzido (e.g. Dias, 2012), e no caso particular do Mancozeb® isso registou-se uma
vez mais, pois apesar de se tratar de um fungicida, foram observados efeitos
significativos para bactérias, animais, algas e plantas. Contudo, e neste caso
particular, tal como já foi referido, quer R. subcapitata, quer L minor foram menos
sensíveis ao pesticida. Na verdade este pesticida é mesmo considerado como não
fitotóxico para plantas terrestres quando aplicado nas doses recomendadas, o que não
está muito de acordo com as observações efetuadas no presente estudo.
Os mecanismos de toxicidade de Mancozeb® em plantas são pouco conhecidos,
contudo, sabe-se que pesticidas do grupo dos etileno-bis-ditiocarbamatos, transforma-
se em etileno-di-isotiocianato que inativam grupos tiol (-SH) de enzimas e outros
metabolitos celulares nos fungos (Dias, 2012), pelo que a sua ação sobre enzimas nas
células das plantas, é certamente uma possibilidade. Mecanismos de stress oxidativo
são igualmente uma possibilidade, assim como alterações no processo respiratório, já
reportadas por Dias (2012) na sua revisão sobre a fitotoxicidade de fungicidas (Untiedt
and Blanke, 2004 in Dias, 2012). Mais recentemente, Pereira et al. (2014)
demonstraram que a exposição de folhas de alface expandidas (Lactuca sativa) a
Maconzeb®, promove alterações no metabolismo dos aminoácidos, do ascorbato e dos
açúcares, entre outros efeitos, assim como uma ativação dos mecanismos de proteção
contra o stress oxidativo.
Os valores de PNEC obtidos para Mancozeb® neste estudo, sugerem que a
utilização deste composto químico no ambiente deve ser controlada de uma forma
mais apertada, dada a sua elevada toxicidade, e posteriores impactos nos
ecossistemas de água doce. Apesar de o número de dados de toxicidade obtido neste
estudo ser ainda reduzido, os dois valores estimados, são muito semelhantes, pelo
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
41
que podem ser utilizados como um limite de risco preliminar, para a avaliar os riscos
resultantes da presença deste pesticida nos ecossistemas de água doce.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
42
5. Conclusão
O presente estudo procurou colocar em prática as ferramentas disponíveis para a
avaliação de risco de novos compostos químicos, as quais podem vir a ser estendidas
a outros países. Contudo, e para que as mesmas fossem completamente eficazes, no
que refere à proteção dos ecossistemas regionais, seria importante que os ensaios
fossem realizados com espécies nativas e em condições de exposição representativas
às que aí ocorrem. Contudo, e até que isso venha a ser possível, os limites de risco
determinados com base em espécies padrão, podem ser de grande utilidade.
Este estudo veio reforçar uma vez mais as preocupações relativas ao fungicida
Mancozeb®, o qual continua a ser aplicado no ambiente em doses bastante superiores
às que causam efeitos tóxicos acentuados em diferentes espécies de organismos.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
43
Referências Bibliográficas
Abate, T., van Huis, A., Ampofo, J.K.O., 2000. Pest management strategies in
traditional agriculture. An African perspective. Annu. Rev. Entomol. 45: 631–659.
Adamski, Z., Ziemnicki, K., 2004. Side-effects of Mancozeb on Spodoptera exigua
(Hübn.) larvae. J. Appl. Ent. 128: 212–217.
Aguiar, V.M.C., Neto, J.A.B., Rangel, C.M., 2011. Eutrophication and hypoxia in four
streams discharging in Guanabara Bay, RJ, Brazil, a case study. Mar Pollut Bull 62:
1915-1919.
Alves, C., 2010 . Tratamento de águas de abastecimento. 3ª ed , Porto. Pp.382
Azur Environmental, 1998. Microtox® Omini Manual, Azur Environmental, Carlsbad CA
USA.
Bagumire, A., Rumbeihab, W.K., Toddc, E.C.D., Muyanja, C., Nasinyamad, G.W.,
2008. Analysis of environmental chemical residues in products of emerging
aquaculture industry in Uganda as case study for Sub-Saharan Africa. Food Addit
Contam 2: 153-160.
Bayer Crop Science, 2014. Ficha de Dados de Segurança. Versão 2/P. Disponível em:
http://www.bayercropscience.pt/internet/produtos/produto.asp?id_produto=114,
acedido em Agosto de 2014.
Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:
248-254.
Burney, A.J., Naylor, R. L. 2012. Smallholder irrigation as a poverty alleviation tool in
Sub-Saharan Africa. World Development 40: 110-116.
Calviello, G., Piccioni, E., Boninsegna, A., Tedescoa, B., Maggiano, N., Serini, S., Wolf,
F., Palozza, P., 2006. DNA damage and apoptosis induction by the pesticide
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
44
Mancozeb in rat cells: Involvement of the oxidative mechanism. Toxicol Appl Pharm
211: 87 – 96.
Carapeto, C., 1999., Poluição das águas, causas e efeitos. 1ª ed, Universidade Aberta,
Lisboa 1: 48-59.
Chichava, S., Duran, J., Cabral, L., Shankland, A., Buckley, L., Lixia, T., Yue, Z., 2013.
Brazil and China in Mozambican Agriculture: Emerging Insights from the Field. IDS
Bulletin 44: 101-115.
Chuku, C., Ochoye, C., 2009. Increasing resilience and reducing vulnerability in sub-
Saharan African agriculture: Strategies for risk coping and management. African
Journal of Agricultural Research 4: 1524-1535.
Clay, R., 1994. A Continent in Chaos: Africa's Environmental Issues. Environ Health
Persp 102: 1018-1023.
Cunguara, B., Hanlon, J., 2012. Whose wealth is it anyway? Mozambique’s
outstanding economic growth with worsening rural poverty. Development and Change
43: 623-647.
Dias, C.M., 2012. Phytotoxicity: An overview of the physiological responses of plants
exposed to fungicides. Journal of Botany 2012: 1-4.
Easton, A., Guven, K., Pomerai, D.I., 2001. Toxicity of the dithiocarbamate fungicide
Mancozeb to the non-target soil nematode Caenorhabditis elegans. J Biochem Mol
Toxicol 15: 15-25.
EC – European Commission, 2003. Technical Guidance Document on Risk
Assessment Part II. European Commission, Joint Research Center, Italy. Pp. 104.
Ellman, G.L. Courtney, K.D. Andres, jr., V., Featherstone, R.M., 1961. A new and rapid
colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol 7: 88-
95.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
45
FAO – Food and Agriculture and Organization, 2007. Mozambique. FAO, Mozambique.
Disponível em:
http://www.fao.org/fileadmin/templates/tc/tce/pdf/Mozambique_factsheet.pdf, acedido
em Agosto de 2014.
Finney, D.J., 1971. Probit analysis. Cambridge University Press, Cambridge. Pp. 333.
Gerla, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A., 2000. Drinks like a fish: Zebra fish (Danio
rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects. Pharmacol Biochem Be 67:
773-782.
Goto, D., Lindelo, K., Fanslow, D.L., Ludsin, S.A., Pothoven, S.A., Roberts, J.J.,
Vanderploeg, H.A., Wilson, A.E., Höök, T.O., 2012. Indirect consequences of
hypolimnetic hypoxia on zooplankton growth in a large eutrophic lake. Aquat Biol 16:
217-227.
Haendel, M.A., Tilton, F., Bailey, G.S., Tanguay, R.L., 2004. Developmental Toxicity of
the Dithiocarbamate Pesticide Sodium Metam in Zebra fish. Toxicol Sci 81: 390–400.
Hanazato,T., 2001. Pesticide effects on freshwater zooplankton: an ecological
perspective. Environ Poll 112: 1-10.
Hanjra, M.A., Ferede, T., Guta, G.D., 2009. Reducing poverty in sub-Saharan Africa
through investments in water and other priorities. Agr Water Manage 96: 1062–1070.
Jepson, P.C., Guzy, M, Blaustein, K., Sow, M. Sarr, M. Mineau, P., Kegley, S., 2014.
Measuring pesticide ecological and health risks in West African agriculture to establish
an enabling environment for sustainable intensification. Phil Transactions R Soc B –
Biological Sciences vol. 369 (1639): 1-18.
Juma, W.D., Wang, H., Li, F., 2014. Impacts of population growth and economic
development on water quality of a lake: case study of Lake Victoria Kenya water.
Environ Sci Pollut Res 21: 5737–5746.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
46
Júnior, J.A.L., Silva, A.L.P., 2010. Estudo do processo de salinização para indicar
medidas de prevenção de solos salinos. Enciclopédia Biosfera, Centro Científico
Conhecer .6: 1-2.
Ka, S., Bouvy, M., Sené, S., Ba, N., Arfi, R., Thiaw, O.T., Pagano, M., 2011.
Zooplankton communities in the shallow lake guiers (Senegal, West Africa). Internat
Rev Hydrobiol 96: 405–424.
Kubrak, O.I., Atamaniuk, T.M., Husak, V.V., Drohomyretska, I.Z., Storey, J.M., Storey,
K.B., Lushchak, V.I., 2012. Oxidative stress responses in blood and gills of Carassius
auratus exposed to the mancozeb-containing carbamate fungicide Tattoo. Ecotox
Environ Safe 85: 37–43.
Ma, J., Wang, P., Chen, J., Y. Sun, Y., Che, J., 2007. Differential Response of Green
Algal Species Pseudokirchneriella subcapitata, Scenedesmus quadricauda,
Scenedesmus obliquus, Chlorella vulgaris and Chlorella pyrenoidosa to Six Pesticides.
Polish J Environ Stud 16: 847-851.
Maroni, M., Colosio, C., Ferioli, A., Fait., A. 2000. Organophosphorous
pesticides.Toxicology 143: 5–8.
Marques, M.N., Cotrim, M.B., Peres, M.A.F. 2002., Avaliação do impacto da agricultura
em áreas de proteção ambiental, Quimica Nova 30: 1171-1178.
Marroni, S., Iglesia, C., Mazzeo, N., Clemente, J., Mello, T.F., Pacheco, J., 2014.
Alternative food sources of native and non native bivalves in a subtropical eutrophic
lake Hydrobiologia. 735: 263–276.
MEA – Millenium Ecosystem and Health, 2005. Ecosystems and Human Well-Being.
Wetlands and Water Synthesis World Resources Institute, Washington, DC.
Mendes, B., Oliveira, J.F.S., 2004. Qualidade da água para o consumo humano:
parâmetros relativos a substâncias tóxicas, 1: 444-468, 3ª Ed, Universidade Nova de
Lisboa, Portugal.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
47
Mendes, M., Ribeiro, L., 2010. Nitrate probability mapping in the northern aquifer
alluvial system of the river Tagus (Portugal) using disjunctive kriging. Sci Total Environ
408: 1021–1034.
Nhanombe, J., 2008. Desenvolvimento Sustentável da Agricultura em Moçambique. O
Caso da Agricultura Familiar. Trabalho de Licenciatura em Gestão, Faculdade de
Economia, Universidade Eduardo Mondlane, Maputo.
Nyenje P.M., Foppen, J.W., Uhlenbrook, S., Kulabako, R., Muwanga, A., 2010.
Eutrophication and nutrient release in urban areas of sub-Saharan Africa. Sci Total
Environ 408: 447–455.
Odukkathil. G.N., Vasudevan, S., 2013. Toxity and bioremediation of pesticides in
agriculture. Rev Environ Sci Biotechnol 12: 421–444.
OECD Organization For Economic Cooperation And Development, Guideline, 2004.
Guidelines for the testing of chemicals Daphnia sp. Acute Immobilization Test. 202.
Disponível em: http://www.oecd-ilibrary.org/docserver/download/9720201e.pdf?expires
Acedido em Agosto 2014.
OECD, Organization for Economic Cooperation and Development, 2006a. OECD
Guideline for the testing chemical freshwater algal and cyanobacteria. Growth inhibition
Test 201.
Disponível em:http://www.nikkakyo.org/ontai/merumaga/Challenge/OECD/TG_201.pdf
acedido em Agosto de 2014.
OECD, Organization For Economic Cooperation and Development, 2006b. OECD
Guidelines for the Testing of Chemicals. Lemna sp. Growth Inhibition Test 221.
Disponível em: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-221-lemna-sp-growth-
inhabition-test_9789264016194-en, acedido em Agosto de 2014.
OECD, Organization For economic Cooperation and Development, 2013. OECD
Guidelines for the testing of chemicals draft proposal for a new guideline for fish
embryo toxicity test. Test 236.
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
48
Disponivel em:
http://www.researchgate.net/publication/255968359_oecd_guidelines_for_the test
acedido em Agosto 2014.
Oerke, E.-C., 2006. Crop losses to pests. J Agr Sci, 144, 31–43.
Parvez, S., Venkataraman, C., e Mukherji, S., 2006. A review on advantages of
implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of
chemicals. Environ Int 32: 265–268.
Peláez, S., Hierro, I., Oña, S., Alonso, L., Matill, A., 2004. Relationship between
pesticide exposure and low-grade superficial bladder urothelial carcinoma. Medicina
Clinica 123 (15): 571–574
Pereira, J., Antunes, S., Castro, B., Marques, C., Gonçalves, F., Pereira, R., 2009.
Toxicity evaluation of three pesticides on non-target aquatic and soil organisms:
commercial formulation versus active ingredient. Ecotoxicology 18:455–463
Pereira, S.I., Figueiredo, P.I., Barros, A.S., Dias, M.C., Santos, C., Duarte, L.F., Gil,
A.M., 2014. Changes in the metabolome of lettuce leaves due to exposure to
mancozeb pesticide. Food Chem 154: 291–298.
Popp, J., Pető, K., Nagy, J., 2013. Pesticide productivity and food security. Argon.
Sustain. Dev. 33: 243–255.
Ramade, F., 1977. Ecotoxicologie. Mason, Paris, France. 205 Pp.
Rath, N.C., Rasaputra, K.S., Liyanage, R., Huff, G.R., Huff, W.E., 2011.
Dithiocarbamate Toxicity - An Appraisal. In Pesticides in the Modern World - Effects of
Pesticides Exposure. Edited by Margarita Stoytcheva, ISBN 978-953-307-454-2,
InTech Publishers, 388 Pp. Open acess available at:
http://www.intechopen.com/books/pesticides-in-the-modern-world-effects-of-pesticides-
exposure, acedido em Agosto de 2014.
Remoundou, K., Brennan, M., Hart, A., Frewer, L.J., 2014. Pesticide Risk Perceptions,
Knowledge, and Attitudes of Operators, Workers, and Residents: A Review of the
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
49
Literature. Human and Ecological Risk Assessment: An International Journal 20: 1113–
1138.
Ryan, C.M., Berry, N.J., Josh, N., 2014. Quantifying the causes of deforestation and
degradation and creating transparent REDD+ baselines: A method and case study
from central Mozambique. Appl Geogr 53: 45-54.
Smith, V.H., Schindler, D.W., 2009. Eutrophication science: where do we go from
here?.Trends Ecol Evol 24: 201-207.
Stehr, C.M., Linbo, T.L., Incardona, J.P., Scholz, N.L., 2006. The Developmental
neurotoxicity of fipronil: notochord degeneration and locomotor defects in zebra fish
embryos and larvae. Toxicol Sci 92: 270–278.
Turner, A.M., Chislock, M.F., 2010. Blinded by the stink: Nutrient enrichment impairs
the perception of predation risk by freshwater snails. Ecol Appl 20(8): 2089-2095.
van der Zaag, P., Juizo, D., Vilanculos, A., Bolding, A. Uiterweer, N.P., 2010. Does the
Limpopo River Basin have sufficient water for massive irrigation development in the
plains of Mozambique? Phys Chem Earth 35: 832–837.
van Ginkel, CE. 2011. Eutrophication: Present reality and future challenges for South
Africa. Water SA. 35: 693-702. Disponível em http://www.wrc.org.za
van Ginkel, C.E., 2012. Algae, Phytoplankton and eutrophication research and
management in South Africa: past, present and future. Afr J Aquat Sci 37(1): 17-25.
Vanlauwe, B., Giller, K.E., 2006. Popular myths around soil fertility management in
sub-Saharan Africa. Agr Ecosyst Environ 116: 34–46.
Yi, M.Q., Liu, H.X., Shi, X.Y., Liang, P., Gao, X.W., 2006., Inhibitory effects of four
carbamate insecticides on acetylcholinesterase of male and female Carassius auratus
in vitro. Comp Biochem Phys 143:113–116.
Yohannes, Y.B., Ikenaka, Y., Saengtienchai, A., Watanabe, K.P., Nakayama, S.M.M.,
Ishizuka, M., 2013. Occurrence, distribution, and ecological risk assessment of DDTs
Pesticida Mancozeb®: Determinação de limites de risco ecossistemas aquáticos 2014
50
and heavy metals in surface sediments from Lake Awassa—Ethiopian Rift Valley Lake.
Environ Sci Pollut Res 20: 8663–8671.
Wetzel, R.G., 1983. Limnologia. Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa. Pp. 919.