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PGD EN ENFERMEDADES MONOGÉNICAS

Dra. Mª Dolores Lozano Arana

UGC de Genética, Reproducción y Medicina Fetal

Hospital Universitario Virgen del Rocío

Sevilla

X CONGRESO NACIONAL DE LABORATORIO CLÍNICO

PGD EN EL SIGLO XXI Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

PGD EN ENFERMEDADES MONOGÉNICAS

RESUMEN:

- Definición de enfermedades monogénicas

- Definición de PGD: tipos

- Programa de PGD para enferm. monogénicas:

evolución desde finales del S.XX hasta

la actualidad

- Futuro

X CONGRESO NACIONAL DE LABORATORIO CLÍNICO

PGD EN EL SIGLO XXI

NONE

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

ENFERMEDADES RARAS


ENFERMEDADES RARAS


- Prevalencia de 5/10.000

- Existen entre 6.000-8.000 enfermedades raras

- En su conjunto agrupan a un 5% de la población de

países desarrollados

ENFERMEDAD RARA


Características:

- Enfermedades hereditarias de inicio temprano

- Carácter crónico, elevada morbimortalidad y

discapacidad

- Complejidad etiológica, diagnóstica y evolutiva

- El 80% tiene un origen genético identificado

(OMIM: Online Mendelian Inheritance in Men)

ENFERMEDAD RARA


Problemas:

- Elevado coste social y familiar

- 8% estancias hospitalarias

- 70% niños en UCI

- 20% mortalidad infantil

- Ausencia de terapias

ENFERMEDAD RARA


ENFERMEDADES GENÉTICAS

Enfermedades monogénicas

Anomalías cromosómicas

Enfermedades multifactoriales (genéticos+ambientales)

Enfermedades de herencia citoplásmica (mitocondriales)


Atrofia Muscular Espinal

DM Duchenne

DM Steinert

Fibrosis Quística

Talasemias

Síndrome de Opitz

Hemofilia

Enfermedad de Huntington

Síndrome de X frágil

Síndrome de Duncan

Síndrome de Lowe

Poliposis Adenomatosa Familiar

Síndrome de Marfan

Pelizaeus Merzbacher

Enfermedad de Machado Joseph

Distrofia Muscular de Becker

Síndrome de Lowe

Enfermedad de Menkes

Síndrome de Morris

Hidrocefalia ligada a X Síndrome de Alport

ENFERMEDAD RARA

≈



Alteraciones causadas por cambios específicos

en la secuencia de ADN, alterando la función de

un único gen, siendo la causa directa de la

enfermedad






enfermedad

Patrón de herencia definido (mendeliano):


Incidencia Riesgo

Autosómicas dominantes 1% 50%

Autosómicas recesivas 0.2% 25%

Ligadas a X 0.2% AR: 50% V

AD: 50%

(





enfermedad


Ligadas a X A. dominantes

Hemofilias (R) Enf. de Huntington

DM Duchenne (R) DM Steinert

Síndrome X frágil (D)

A. recesivas

Fibrosis quística

Atrofia muscular espinal (


OBJETIVO = PREVENCIÓN

Consejo genético

Opciones reproductivas en parejas con

enfermedades monogénicas

No tener hijos

TRA con donación de gametos

Adopción

Diagnóstico Prenatal (DP)

PGD


(Handyside et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation

embryos sexed by Y-specific DNA amplification.

Nature1990;344:768-70)

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Análisis genético de los preembriones obtenidos

por técnicas de FIV antes de ser transferidos al

útero. Transferimos los no afectos para la

enfermedad de riesgo.

Diagnóstico Genético Preimplantatorio


Diagnóstico Genético

Preimplantatorio (PGD)

PGD es una forma precoz de DP Evitar IVE

Diagnóstico Prenatal (DP)

Opción reproductiva para parejas con alto riesgo

de trasmitir una enfermedad de base genética a

su descendencia


Opción reproductiva para parejas con alto riesgo

de trasmitir una enfermedad de base genética a

su descendencia

Diagnóstico Genético Preimplantatorio

INDICACIONES:

- Enfermedades monogénicas

- Anomalías cromosómicas


PGD de alto riesgo: PGD

PGD de bajo riesgo: PGS o PGD-AS

screening de aneuploidias

TIPOS PGD

MAYOR EFICACIA EN FIV

RIESGO GENÉTICO

AUMENTADO


LEY 14/2006, de 26 de mayo, sobre técnicas de

reproducción humana asistida

En España el PGD

está contemplado en la

Legislación vigente


Artículo 12.

12.1a- Detectar enfermedad hereditaria grave, de

aparición precoz y no susceptible de tratamiento

postnatal…..

12.1b- Detectar alteraciones que puedan comprometer

la viabilidad del embrión

Comunicarlos a las autoridades sanitarias

12.2. Aplicación del PGD para cualquier otra finalidad

no comprendida en el apartado anterior.…. (PGD-HLA,

mutaciones con penetrancia incompleta….)

Pedir autorización caso a caso


LEY 14/2006, de 26 de mayo, sobre técnicas de

reproducción humana asistida

En España el PGD

está contemplado en la

Legislación vigente

…….por el que se regula el Diagnóstico Genético Preimplantatorio en el

Sistema Sanitario Público de Andalucía, se crea la Comisión Andaluza

de Genética y Reproducción y se designa a la UGCGRMF del Hospital

Virgen del Rocío de Sevilla como centro de referencia.

SSPA DECRETO 156/2005 de 28 de junio


El PGD está incluido en la cartera básica de servicios del SNS

El PGS no


Programa de PGD Genética Reproducción

Genetistas

Ginecólogos

Embriólogos

Programa de PGD para enfermedades monogénicas Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

1. Consulta Conjunta de Genética y Reproducción

- Los pacientes conocen muy bien la enfermedad

para la que consultan (AD, AR, Lig X)

- Se asesora e informa sobre opciones reproductivas

No tener hijos

Donación gametos

Adopción

DP

PGD


1. Consulta Conjunta de Genética y Reproducción

Informe de Consejo Genético donde se especifique:

- Estatus de la pareja/familia consultante

- Identificación del gen implicado

- Mutación responsable

- Certeza de relación fenotipo/genotipo

Estudios genéticos previos (puesta a punto

para cada familia y enfermedad)

Estudio Básico Esterilidad


Día + 1

Día + 2

Día +0 Día +0

Mayor respuesta e ICSI

Día + 3

2.Programación y ciclo FIV


3.-Biopsia embrionaria

Tipos:

- Corpúsculo polar información

materna

- Blastómeras Habitual

- Blastocisto Más células

Poco tiempo

Día+3







4- Diagnóstico genético

Sexado mediante PCR,

amplificando una región Y

Ausencia de banda: - Ausencia de núcleo

- Fallo en la entubación

- Fallo en la amplificación

- Fenómeno ADO

Año 1990


HIBRIDACION IN SITU FLUORESCENTE (FISH)

Griffin et al; 1992

Fijación

núcleo

citoplasma núcleo

FISH

Verde - Cromosoma X Acqua - Cromosoma 18 Verde – Cromosoma 13 Rojo – Cromosoma 21


LIMITACIONES DE FISH

- Fijación de un núcleo en un porta

- Fallo de hibridación

- Solapamiento de señales

- 10% de embriones no informativos

- No se pueden estudiar todos los cromosomas

Enf. Ligadas a X

50% de los XY son sanos, y se descartan


SECUENCIA COMPLETA DEL GENOMA HUMANO (2000)


PCR MULTIPLE FLUORESCENTE

(GOLD STANDARD (Thornill et al., 2005))

ESTRATEGIAS METODOLÓGICAS

Limitaciones:

Escasez de ADN

Escasez de tiempo

6 pg


http://www.google.es/url?sa=i&rct=j&q=cadena+de+adn&source=images&cd=&cad=rja&docid=rf6iCqe45wpORM&tbnid=e9r6SLywodyd_M:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.subirimagenes.com/imagen-cadenadeadn-917971.html&ei=g6AaUfSdCZOAhQe9gIGwCQ&psig=AFQjCNHnXe6egvQn9DVHrMN6uYhus_2zEw&ust=1360785878668617

PCR múltiple fluorescente

Co-amplificación de diferentes loci en una

reacción de PCR única.

Permite realizar el análisis molecular indirecto y

en ocasiones el directo:

- Estudio indirecto de la enfermedad STR

- Diferenciar los portadores, enfermos y sanos

- Detectar contaminaciones y fenómenos de ADO

- Estudio directo de la mutación

cuando las mutaciones son dinámicas, ya que

afectan al tamaño del producto de la PCR,

siendo por tanto objetivable


DISEÑO DE LOS PROTOCOLOS BASADOS EN PCR

APLICADOS A PGD

a) Búsqueda de marcadores STR para estudio indirecto

Herramienta bioinformática: Genome Browser


HEMOFILIA A

Amplia variedad de

mutaciones en el gen F8

TEST INFORMATIVOS (Estudios de informatividad)

Se eligen los marcadores en función de:

- localización en la región (locus)

- Alta heterocigosidad Informativos para cada familia

- Eficiencia de la amplificación

ESTUDIO INDIRECTO

STR: secuencias de ADN en las que un fragmento se repite de forma

consecutiva. La variación en el nº de repeticiones crea diferentes alelos

Se buscan STR intragénicos y extragénicos flanqueantes de la región

donde se ubica la mutación, con alta heterocigosidad.

F8

Xq28

DSX9901 DSX8087 G16PD

STR22 STR213

DSX1108

TEL


Caso HEMOFILIA

Mujer portadora y tienen un hijo afecto.

El hijo habrá heredado la copia X mutada

de su madre

Haplotipo distinto

ESTUDIO DE INFORMATIVIDAD: Combinación de marcadores

asociados al alelo mutado Sano, portador o afecto.

X XX


DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE LOS PROTOCOLOS

BASADOS EN PCR APLICADOS A PGD

b) Diseño de primers para PCR múltiples (Primer3)

- Objetivo es amplificar todos los marcadores en una

única reacción de PCR

- Rango de tamaños de cada producto no sea solapante

- Para discriminar cada marcador marcar los primers

con fluorocromos que emitan a diferentes λ


DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE LOS PROTOCOLOS

BASADOS EN PCR APLICADOS A PGD

c) Material utilizado para la puesta a punto

ADN genómico en cantidades decrecientes

100ng/μl 5pg/μl

Posteriormente en célula única: blastómeras

d) Lisis celular: alcalina /enzimática

e) PCR múltiple: Qiagen Multiplex PCR KIT

f) Electroforesis capilar: secuenciador ABI Prism 3730

g) Análisis de los alelos (Genemapper)


Experiencia de nuestro Centro en DGP aplicado a

Hemofilia A 135 156 174 175 231 306

128/128 158 171

175/177 172/172 229/229 308

311

128 135

156 171

175/177 174/172 229 231 306 311

128 158 172 229 308

175

128

171

177 172

229 311

FATHER

MOTHER

NON-CARRIER FEMALE EMBRYO

AFFECTED MALE EMBRYO

NON-AFFECTED MALE EMBRYO

DXS1073 STR13 STR22 DXS9901 DXS1108 DXS8087

Marcadores subrayados: combinación específica de marcadores ligados a la enfermedad


Estudio indirecto de hasta 16 marcadores STR

PGD-HLA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

PCR múltiple fluorescente

Situaciones donde no es posible el diagnóstico con esta

metodología:

- Enferm. AD causada por mutación

puntual de novo (PAF)

- Casos complejos: No por

*STR no informativos en la familia Indirecto

*No existencia de STR muy polimórficos

en la región (SCA3)

Situaciones mejorables:

Enferm monogénica + HLA: Biopsia de 2 blastómeras

muchos marcadores


Picogramos Microgramos

WGA (Whole genome amplification)

Generar una nueva muestra igual que no se distingue de la original pero con una alta concentración

de ADN

Técnicas:

- PEP (primer extension preamplification).

(Zhang et al; 1992)

- DOP – PCR (degenerate oligonucleotide primed PCR)

(Telenius et al; 1992)

- Técnica MDA (Multiple displacement amplification)

(Dean et al., 2002)


MDA (Hellani et al., 2005)

- Se consigue una alta cantidad de ADN a partir de

una blastómera, con una baja tasa de error

- Se puede aplicar posteriormente una amplia

variedad de técnicas (PCRmf, secuenciación,

MLPA…)

se favorecen mayor nº de familias

- No compromete los resultados y permite realizar

repeticiones diagnóstico fiable

1 blastómera

Tranquilidad


Técnicas de WGA Mayor cantidad de ADN

Enfermedades

Monogénicas

Técnicas basadas

en PCR

Todo el complemento

cromosómico

aCGH Wells et al., 2008

Fiorentino et al., 2009

1 única célula

Transferir embriones sin la enfermedad y euploides (Obradors et al., 2008, Handyside et al., 2010, Daina et al., 2012)


5.Transferencia y congelación de embriones

12 ovocitos (M II)

(J. Harper)

10 fecundados 1 sin resultados

8 biopsiados 4 afectos

1 bloqueado

2 transferidos


5.Transferencia y congelación de embriones

Método de congelación Vitrificación

- En caso de gestación se recomienda DP

- TG/cp: 21% (ESHRE)


Enfermedades Autosómicas Dominantes Nº Enfermedades ligadas a X Recesivas Nº

Enfermedad de Steinert 28 Hemofilia A 33

Corea de Huntington 26 Distrofia Muscular de Duchenne 21

Poliposis adenomatosa familiar 11 Distrofia Muscular de Becker 4

Síndrome de Marfan 3 Hemofilia B 4

Enfermedad de Machado Joseph (SCA3) 2 Síndrome de Morris 3

Enfermedades Autosómicas Recesivas Nº Agammaglobulinemia tipo Bruton 3

Fibrosis quística 27 Hidrocefalia ligada a X 1

Atrofia muscular espinal 14 Síndrome de Lowe 1

Enfermedades ligadas a X Dominantes Nº Síndrome de Duncan 1

Síndrome de X-frágil 12 Retinosis Pigmentaria ligada a X 1

Síndrome de Alport ligado a X 4 Inmunodeficiencia Severa Combinada ligada a X 1

Tipaje HLA / PGD + Tipaje HLA Nº Alfa-talasemia ligada a X 1

Beta-talasemia Mayor + HLA 5 Enfermedad de Menkes 1

Tipaje HLA 2 Síndrome de Wiskott Aldrich ligado a X 1

Síndrome de Shwachman-Diamond + HLA 1 Enfermedad de Pelizaeus Merzbacher 1

Inmunodeficiencia por déficit de adenosín-deaminasa

+ HLA 1 Síndrome de Opitz ligado a X 1

Granulomatosis + HLA 1

Tabla R-1: Distribución de nº de pacientes según las distintas enfermedades.


Enfermedad Partos

HA y HB 14

DMD y DMB 9

DM Steinert 9

FQ 7

CH 3

AME 3

X- Frágil 3

Sd. Alport lig a X 2

PGD-HLA 2

Sd. de Lowe 1

PAF 1

54 partos y 66 rn

44% partos vaginales

3 DP

No discordancias

Resultados neonatales

Tparto/pareja: 25%


Enfermedad Partos

HA y HB 14

DMD y DMB 9

DM Steinert 9

FQ 7

CH 3

AME 3

X- Frágil 3

Sd. Alport lig a X 2

PGD-HLA 2

Sd. de Lowe 1

PAF 1

54 partos y 66 rn

44% partos vaginales

3 DP

No discordancias

Resultados neonatales

Tparto/pareja: 25%




Next-generation sequencing (NGS) Secuenciación masiva

Secuenciación 1º genoma humano

13 años -----100,000,000 dólares

NGS en blastómera

3 días----1,000 dólares




- Permite realizar PGD y PGS en una sola célula

- Abre el futuro a nuevas posibilidades:

- aumento de defectos genéticos que se pueden

diagnosticar (enf monogénicas)

- Mutaciones mitocondriales

- Síndromes microdeleccionales

- menor coste y poco tiempo




- Permite realizar PGD y PGS en una sola célula

- Abre el futuro a nuevas posibilidades:

- aumento de defectos genéticos que se pueden

diagnosticar (enf monogénicas)

- Mutaciones mitocondriales

- Síndromes microdeleccionales

- menor coste y poco tiempo

UN MÉTODO PARA TODO


TEST de COMPATIBILIDAD GENÉTICA

(Programas de donación de gametos)

Donante y receptor

(enfermedades AR)

Compatibles No compatibles

cambio de donante

Matching genético Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Métodos de diagnóstico genético al

alcance de la población general

Dirigidos a conocer nuestro estado de portador

Prevención enfermedades monogénicas

Queremos saber si

somos portadores

de…………

PGD


ADN nuclear libre

0.01ml

PGD / PGS

Nuevas fuentes de ADN

- Medios de cultivo (Assou et al,. 2014; Wu et al., 2015)

- Blastocele (Palini et al.,2014, Gianaroli et al.,2014, Tobler et al., 2015,

Magli et al., 2016)

TECNICAS NO INVASIVAS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Blastocentesis


Tecnología CRISPR/Cas9 E. Charpentier y J. Doudna

Técnica de edición genética

Avance científico del año 2015 – Science



Técnica de edición genética

Avance científico del año 2015 – Science

Bolotin et al., 2005

Mojica et al., 2005

Pourcel et al., 2005

J. Doudna

Terapia génica


Vassena et al., 2016 Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

J. Doudna



J. Doudna


PGD = opción reproductiva


[email protected]


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