Phan III. Cong Nghe Cac Chat Co Hoat Tinh Sinh Hoc

PHẦN III

CÔNG NGHỆ CÁC CHẤT CÓHOẠT TÍNH SINH HỌC

Phần III: CÔNG NGHỆ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC 281

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT, TINH SẠCH VÀXÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG Azadirachtin TRONG HẠT

XOAN CHỊU HẠN (Azadirachta indica A.Juss)

Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến ThắngPhòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Một trong những chất chính có tác động xua đuổi sâu bọ ở cây xoan chịu hạn Ấn Độ(Azadirachta indica) là azadirachtin. Nó có tác động xua đuổi đối với gần 90% loại sâu hại.Ngoài tác động xua đuổi, azadirachtin còn có tác động ức chế phát triển và sinh sản. Cácnghiên cứu trong hơn 20 năm qua cho thấy azadirachtin có tác động điều hòa sinh trưởng vàgây ngán ăn. Azadirachtin có tác động gây ngán ăn lên nhiều loại côn trùng gây bệnh cũngnhư một số loại tuyến trùng (2, 3).

Azadirachtin được cho là có cấu trúc tương tự với hocmon sâu hại, kiểm soát quá trìnhbiến thái của côn trùng, từ giai đoạn ấu trùng đến nhộng và giai đoạn trưởng thành.Azadirachtin kiểm soát quá trình tiết hocmon ở côn trùng, nó ức chế một số loại hóc mônchính, ngăn cản sự rụng lông và làm thay đổi biến thái bình thường của côn trùng (3).

Azadirachtin tập trung nhiều nhất ở hạt. Trung b ình 1g nhân (ở những cây đã trên 5năm tuổi) chứa từ 2g đến 4g azadirachtin. Hàm lượng azadirachtin trong nhân hạt xoan chịuhạn biến động tùy thuộc vào nguồn gốc, xuất xứ, điều kiện canh tác và khí hậu và thời điểmthu hoạch quả (3,4,5).

Việc chiết tách, tinh sạch và xác định hàm lượng azadirachtin trong hạt xoan chịu hạnlà cơ sở để nghiên cứu tác dụng đa dạng của nó lên sâu bọ gây hại cũng như phục vụ choviệc khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đến h àm lượng azadirachtin trong hạtxoan chịu hạn.

Vì mục đích trên, các tác giả đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất,tinh sạch và xác định hàm lượng azadirachtin trong hạt cây xoan chịu hạn trồng tại NinhThuận, một nguồn nguyên liệu quý để sản xuất thuốc trừ sâu thảo mộc và cải tạo môitrường ở những vùng đất khô cằn ở Việt Nam.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Hạt xoan chịu hạn (Az adirachta indica) được thu hái từ những cây xoan 4 nămtuổi trồng ở tỉnh Ninh Thuận, đ ược sử dụng làm nguyên liệu để chiết xuất, tinhsạch và xác định hàm lượng azadirachtin. Thu hoạch quả xoan chịu hạn tốt nhấtkhi nó mới chuyển sang màu vàng hay vàng xan h, lúc này hàm lượng azadirachtin

Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007282

cao nhất. Nếu để quả đã chín rụng xuống đất mới thu hoạch th ì hàm lượngazadirachtin sẽ bị giảm (3,4). Chiế t xuất, tinh sạch azadirachtin bằng sắc kí cột(flash chromatography) v ới chất nhồi là silicagel 60 (0.04 - 0.063) của hãng Merckvới hai loại cột có kích th ước: 29mm x 50cm; 15mm x 50cm. Các tiểu phầnchứa azdirachtin thu đ ược qua chạy cột được phát hiện bằng sắc kí bản mỏng vớichất phun hiện màu: 1g vanillin pha trong 100 ml axít sulfuric đậm đặc, vệtazaditachtin có màu nâu. Hàm lư ợng azadirachtin được xác định bằng sắc kí lỏnghiệu xuất cao (HPLC).

KẾT QUẢ1. Chiết xuất, tinh sạch azadirachtin từ hạt xoan chịu hạn bằng sắc kí cột

1.1. Chiết thô bằng dung môi và loại mỡ

Cân 250g nhân hạt xoan chịu hạn đã tách vỏ, nghiền và rây qua rây 0,5mm.

a. Chiết với dung môi n-hexan để loại mỡ: Ngâm kiệt bột nhân xoan chịu hạn bằngcách lắc trong n-hexan 6 lần với lượng dung môi và thời gian ngâm như sau: lần 1,2 và3 ngâm, lắc trong 500ml n-hexan trong 3 giờ, lần 4 và 5 ngâm, lắc trong 300ml n-hexantrong 2 giờ, lần cuối ngâm, lắc trong 200ml n-hexan trong 1 giờ (1).

b. Chiết với methanol: Bã sau khi chiết với n-hexan được chiết tiếp với methanoltheo quy trình sau: lần 1 và 2 ngâm, lắc trong 500ml methanol trong 3 giờ, lần 3 và 4ngâm, lắc trong 300ml methanol trong 2 giờ, lần cuối ngâm, lắc trong 200 ml methanoltrong 1 giờ.

Gộp các phần dịch chiết methanol v à giảm thể tích dịch thu được bằng cô quaytrong chân không ở 40oC còn khoảng 50ml dịch màu vàng. Chiết tiếp với n-hexan đểloại dầu béo trong mẫu. Sau đó gộp với dịch chiết n -hexan ban đầu, cô tiếp thu được89,5g dầu (35,8%).

Thêm 20ml nước cất vào cặn methanol thu được và chiết 5 lần với 50ml ethylacetat(EtOAc), làm khan dịch chiết bằng Na2SO4. Loại EtOAc trong chân không ở 40oC, thuđược 4,6g chất rắn màu vàng sậm (1,84%).

1.2. Tinh sạch trên sắc ký cột

Nhồi 120g silicagel 60 (0.040-0.063 m) của hãng Merck vào cột 29mm, dài50cm. Dung môi là hỗn hợp EtOAc/n-hexan tăng dần từ 10 đến 100%. Hòa tan4,6g mẫu thu được ở trên với khoảng 5ml EtOAc, thêm 3-5 g silicagel, loại dungmôi và đưa vào cột. Dung môi thôi mẫu theo thứ tự tỷ lệ EtOAc / n -hexan tăng từ 0đến 100%.

Lấy mỗi phân đoạn khoảng 100 ml. Tiến hành sắc ký bản mỏng để nhận dạngchất trên giấy F254 của hãng Merck. Vết azadirachtin hiện m àu nâu trong thuốchiện hình. Hỗn hợp dung môi chạy sắc kí bản mỏng the o tỷ lệ: n-hexan/aceton =3/2, vết có giá trị Rf là 0,16. Còn ở tỷ lệ n-hexan/aceton = 1/1, vết có giá trị Rflà 0,32.


Thu azadirachtin từ phân đoạn 16 đến 27, gom lại, cô quay chân không thu được1,6g. Toàn bộ chất thu được từ đợt chạy sắc ký trên cột 1, được đưa tiếp vào cột 2 vớikích thước 1,5 x 50cm tương ứng với lượng silicagel nhồi cột là 100. Rửa thôi cột bằnghỗn hợp dung môi ether petroleum/aceton, tỷ lệ 3/2. Sử dụng khoảng 1.800ml hỗn hợp,mỗi phân đoạn thu 20ml. Azadirachtin có trong phân đoạn từ 16 đến 38. Gom dịch và tiếnhành cô quay chân không, thu được 0,8432g azadirachtin.

2. Phân tích azadirachtin trên ph ổ IR và HPLC

Phân tích trên phổ HPLC bằng cách cho chạy sắc ký tr ên cột Hypercil BDSC18 với pha động MeOH/H 2O, detector đo ở 217nm với tốc độ dòng 0,6ml/ phút.Thời gian lưu là 1,274 phút. Độ sạch của azadirachtin đạt gần 95% (H ình 1).

Phổ IR: VKBr max (cm-1):

+ Azadirachtin chuẩn: 3442(OH), 2958(CH2,CH3), 1738(ester), 1439,1377,1269(acetat), 1046(vòng furan) - (Hình 2).

+ Azadirachtin chiết: 3454(OH), 2958(CH2,CH3), 1739(ester), 1441,1377,1268(acetat), 1046(furan) - (Hình 3).

Qua phân tích phổ IR có thể kết luận chất chiết từ hạ t xoan chịu hạn là azadirachtinvới hàm lượng 0,32% trong hạt đã tách vỏ.3. Định lượng azadirachtin trên HPLC

Máy sắc kí lỏng hiệu suất cao (HPLC): Hewlett Packard 1090, series1 -liquidchromatography.

Hình 1. Xác định độ tinh sạch azadirachtin tr ên HPLC

Nhựa Hypercil DBS-C18, 5 m, kích thước cột 4mm x125mm Lượng mẫu bơm vào: 0,5 l. Detector: = 217nm. Tốc độ dòng: 0,5ml/ phút


Dung môi chạy: MeOH/H2O - 80/ 20.Dựng đường chuẩn 5 điểm với chất chuẩn azadirachtin của h ãng Sigma (loại 0,5

mg/lọ), nhận được hằng số tương quan: R = 0,99601.

Hình 2. Sắc ký đồ phổ hồng ngoại củaazadirachtin chuẩn (hãng Sigma)

Hình 3. Sắc ký đồ phổ hồng ngoại củaazadirachtin chiết xuất từ nhân hạtxoan chịu hạn (Azadirachta indica)

trồng tại Ninh Thuận, VN

4. Quy trình chiết nhanh mẫu để phân tích azadirachtin tr ên HPLC

Mẫu được chiết nhanh bằng ethanol hoặc methanol theo các bước sau: 20g nhân hạtxoan chịu hạn đã được nghiền nhỏ trộn trong 200ml ethanol hoặc methanol, lắc 30 phúttrên máy lắc, sau đó lọc qua hút chân không, bã được chiết tiếp 5 lần với lượng dung môinhư trên. Các phần dịch chiết được gom lại, đem cô quay chân không cho đến khô kiệt.Cặn được loại hết mỡ với n-hexan bằng phễu chiết, khoảng từ 3 đến 5 lần, mỗi lần với100ml n-hexan và cô tiếp trên bếp cách thủy. Cân trọng lượng và hòa cặn với methanol, lọcqua lọc 0,45 m. Dịch lọc được dùng để định lượng azadirachtin trên HPLC.

Hàm lượng azadirachtin của mẫu được tách với ethanol là 868,12mg/kg Hàm lượng azadirachtin của mẫu được tách với methanol là 969,8mg/kgPhương pháp tách nhanh azadirachtin b ằng methanol cho kết quả cao h ơn 10,5% so

với tách bằng ethanol là phù hợp với các kết quả nghiên cứu đã công bố ở nước ngoài.Methanol được cho là dung môi chiết xuất azadirachtin tốt nhất. Hàm lượngazadirachtin có trong nhân hạt xoan chịu hạn trồng ở Ninh Thuận c òn thấp, có thể là dohạt xoan chịu hạn còn non, khoảng 4 năm tuổi. Theo kết quả nghi ên cứu của Việnnghiên cứu thực vật Ấn Độ, tuổ i khai thác hạt nên bắt đầu từ cây 5 năm tuổi trở lên đểđạt được năng xuất và chất lượng ổn định. Thời gian bảo quản mẫu cũng đ ược cho làmột yếu tố có ảnh hưởng đến hàm lượng azadirachtin có trong nhân hạt xoan chịu hạn.

KẾT LUẬN

1. Đã chiết tách và tinh sạch azadirachtin từ nhân hạt xoan chịu hạn (azadir achta indica),thu được azadirachtin với hiệu suất chiết xuất l à 0,32% và độ tinh sạch là 95%.


2. Đã hoàn chỉnh phương pháp xác định hàm lượng azadirachtin trên hệ sắc kí lỏnghiệu suất cao (HPLC).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dương Anh Tuấn và cs (2001). “Azadirachtin - hoạt chất gây ngán ăn mạnh đối vớisâu khoang được phân lập từ hạt neem (azadirachta indica họ meliaceae) di thựcvào Việt Nam”, Tuyển tập hội nghị khoa học và công nghệ hoá hữu cơ toàn quốclần thứ 2.

2. Nguyễn Tiến Thắng và cs (2003). ”Nghiên cứu và phát triển cây xoan chịu hạn(Azadirachta indica) tại Việt Nam”, Báo cáo nghiệm thu đề t ài nghiên cứu khoahọc công nghệ cấp Nhà nước theo nghị định thư.

3. Dennis Dearth IR (1992). “Neem, a tree for solving global problems”. NationalAcademy press, Washington, D.c..

4. Gunasena HPM, B. Marambe (1998). “Neem in Srilanka, a monograph”. APublication of University of Peradeniya, Oxford Forestry Institute(UK) ForestryResearch Link.

5. Otmar Schaaf, Andrew P. Jarvis, S, Andrew van de Esch, Germina Giagnacovo andNeil J. Oldham (2000). “ Rapid and sensitive analysis of azadirachtin and relatedtriterpenoids from neem (Azadirachta indica) by high - performance liquidchromatography - atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry”,Journal of Chromatography A, vol 886(1-2), pp 89-97.

SUMMARY

Extraction, purification and determination azadirachtin ,scontent in neem seed kernel (Azadirachta indica A. Juss).

Vu Van Do, Nguyen Tien ThangInstitute of Tropical Biology

The extraction and purification of azadir achtin from 3 years old’s neem seed kernelplanted at Ninh Thuan province consists of two steps. The first one was the crudeextraction azadirachtin with methanol and isolation lipid by n -hexan. The residue wasconcentrated with rotary vacuum evaporator and purified on flash columnchromatography. The results on IR and high performace liquid chromatography (HPLC)showed that the compound received was azadirachtin with 95% purity. Azadirachtincontents was determinded on Hypercil BDS - C18, 5 m, 125 x 4mm, column, reversedphase, eluting with MeOH/ H 2O, flow rate: 0,5ml/minute, detected at = 217nm. Theresults received as follow: Azadirachtin contents extracted with ethanol and methanolwere: 868,12 ppm and 969,8 ppm, respectively.


NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA Oligoglucosamine ĐẾNSINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA CÂY LẠC

(Arachis hypogea L.).

Nguyễn Anh Dũng, ĐH Tây NguyênNguyễn Tiến Thắng, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Oligoglucosamine là một oligomer của -1,4-glucosamine được chế tạo từ nguyênliệu vỏ tôm phế thải. Các nghi ên cứu công bố gần đây cho thấy oligoglucosamine l àchất có hoạt tính sinh học rất cao, l à nhóm kích thích sinh trưởng thực vật thế hệ mới.Hadwiger (2002) đã chứng minh oligoglucosamine l à tác nhân hoạt hóa promoter củahơn 20 gen liên quan đến tính kháng bệnh ở thực vật (pathogenesis -related genes) nhưARNase, chitinase, -glucanase và nhiều enzyme liên quan đến việc tăng cường tổnghợp phytoalexin, lignin, và quá trình trao đổi chất…[1]. Nhiều kết quả thực nghiệm c hothấy oligoglucosamine và chitosan có khả năng kháng các loại nấm gây bệnh cho thựcvật như Pythium, Slerotium, Fusarium,… [2, 3, 4]. Suwalee (2002) cũng khẳng định khiphun chitosan có tác dụng kháng bệnh cháy lá ngô (Downy mildew) tốt h ơn các loạithuốc kháng nấm trên thị trường [5].

Ngoài tăng cường khả năng kháng bệnh , oligoglucosamine còn có hiệu ứng kíchthích sinh trưởng, tăng cường quang hợp của lúa, đậu lạc [6,7]. Hirano (1996) khi xử lýcủ giống khoai tây với oligoglucosamine đ ã làm tăng năng suất từ 30-50% [8]. LêQuang Luân, Nawasawa, Kume (2002) c ũng khẳng định chitosan chiếu xạ l àm tăngchiều dài rễ, kích thích sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô tế b ào [9]. Trong các thínghiệm của chúng tôi trên đồng ruộng cũng cho thấy oligoglucosamine đã làm tăngnăng suất của cải xanh, su hào lên 20-25%, kháng bệnh gỉ sắt cho đậu tương, tăng sốlượng nốt sần và làm tăng năng suất 36,9% [10,11].

Bài báo này là những kết quả thử nghiệm chế phẩm oligolucosamine tr ên cây trồngdo nhóm chúng tôi chế tạo bằng công nghệ enzyme.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁPVật liệu hóa chất: - Oligoglucosamine (> 8 dp) đư ợc chế tạo từ nguyên liệu vỏ tôm phếthải bằng công nghệ enzyme theo qui tr ình của Nguyễn Anh Dũng và Nguyễn TiếnThắng [10]. Lạc trong thí nghiệm l à giống lạc Sẻ địa phương, được trồng khá phổ biếncó thời gian sinh trưởng là 90 ngày. Thí nghiệm tiến hành tại Trại thực nghiệm Nônglâm nghiệp, Đại học Tây Nguyên trên đất đỏ bazan có độ ph ì trung bình.


Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Oligoglucosamine đến sinh

trưởng và phát triển của cây lạc - Thí nghiệm thực hiện với 5 công thức nồng độ là0ppm, 20ppm, 30ppm, 40ppm và 50ppm, với 3 lần lặp lại, gồn 15 ô thí nghiệm,diện tích mỗi ô là 9m2.

Thí nghiệm 1: So sánh hiệu quả của việc phun oligoglucosamine với các sản phẩmSông Gianh và Komix - Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiênđầy đủ gồm 4 công thức: đối chứng (phun n ước lã), Sông Gianh, Komix vàOligoglucosamine, 3 lần lặp lại, diện tích mỗi ô thí nghiệm là 9m2. Nồng độ phuncủa Sông Gianh và Komix theo như hướng dẫn in trên bao bì, nồng độ củaoligoglucosamine là 40ppm.

Các chỉ tiêu theo dõi: - Tốc độ tăng trưởng (cm/ngày), số cành hữu hiệu, hàm lượngdiệp lục a-b, năng suất thực thu, số lượng nốt sần. Các chỉ tiêu theo dõi theo 5 điểmchéo góc, mỗi điểm đo đếm 5 cây.

Hàm lượng diệp lục trong lá được phân tích theo phương pháp quang phổ [12].

Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được phân tích theo phần mềm Excel 7.0 để t ìmra sự khác biệt có ý nghĩa thống k ê giữa các nghiệm thức.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Ảnh hưởng của chế phẩm Oligoglucosamine đến h àm lượng diệp lục trong lá lạc

Sau khi phun lên lá lần thứ 3, chúng tôi tiến hành lấy lá và phân tích hàm lượngdiệp lục trong lá lạc. Kết quả ghi nhận ở bảng 1 ch o thấy oligoglucosamine đã làm tănghàm lượng diệp lục trong lá lạc từ 16,59 -32,04% so với đối chứng, nồng độ làm gia tănghàm lượng diệp lục cao nhất là 30ppm. Hàm lượng diệp lục gia tăng là cơ sở để tăngcường độ, hiệu suất quang hợp của cây, từ đó l àm gia tăng sinh khối và năng suất.

Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ oligoglucosamine đến h àm lượng diệp lục trong lá lạc.

Công thức

Chỉ tiêu

0 ppm 20 ppm 30 ppm 40 ppm 50 ppm

Chlorophyll a (mg/g lá tươi) 3,325 4,164 4,429 3,950 3,866Chlorophyll b (mg/g lá tươi) 1,032 1,257 1,324 1,230 1,214Tổng Chlorophyll (mg/g lá) 4,357 5,421 5,753 5,180 5,080% Gia tăng 0,00 24,42 32,04 18,89 16,59

2. Ảnh hưởng của chế phẩm oligoglucosamine đến số l ượng nốt sần của lạc

Nốt sần là sự cộng sinh giữa vi khuẩn cố định N v à cây họ đậu. Theo nhiều kết quảnghiên cứu gần đây bằng N-15 tự nhiên đã chứng minh vi khuẩn Rhizobium có khảnăng cung cấp từ 46-60% N cho cây lạc và đậu tương, tương đương từ 106-205kg N/ha[13,14]. Vì vậy, nốt sần có vai trò rất lớn đối với sinh trưởng, phát triển của cây họ đậu.


Kết quả về ảnh hưởng của chế phẩm oligoglucosamine đến số lượng nốt sần của lạcđược ghi nhận trong bảng 2.

Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ glucosamine đến số l ượng nốt sần của cây lạc.

Công thứcLLL


I 177 189 229 354 322II 180 237 160 187 352III 259 158 203 384 339Trung bình (nốt sần/cây) 205,33 194,66 197,33 308,33 337,66

Kết quả ở bảng 2 cho thấy ở nồng độ 40 -50ppm đã làm gia tăng số lượng nốt sầncủa lạc từ 50,2-64,4% so với đối chứng. Riêng các ô thí nghiệm phun nồng độ thấp từ20-30ppm thì không hiệu quả. Qua xử lý thống kê thì sự khác biệt về số lượng nốt sầngiữa các công thức phun oligoglucosamine v à đối chứng là có ý nghĩa với xác suấtP=0.05 (Ft = 4,30 > Fb=3,47). Trong nghiên cứu cơ bản, Carlson R. W (1994), Madigan(2000) khẳng định các phân tử oligoglucosamine l à tín hiệu hoá học hoạt hoá gen Nodđiều hoà quá trình hình thành nốt sần ở cây họ đậu [15]. Kết quả của chúng tôi tr ên câyđậu tương cũng tương tự. Khi xử lý hạt giống với olicoglucosamine đã làm tăng gấp đôilượng nốt sần so với đối chứng [11].

3. Ảnh hưởng của chế phẩm Oligoglucosamine đến sinh tr ưởng của lạc

Các ô thí nghiệm được phun oligoglucosamine với nồng độ từ 0 -50ppm, với 4lần phun, cách nhau 10 ngày. Kết quả về sinh trưởng chiều cao cây của lạc ở các ô thínghiệm được trình bày trong bảng 3.

Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ oligoglucosamine đến sinh tr ưởng của lạc.

Công thứcChỉ tiêu quan trắc


Tốc độ tăng trưởng (cm/ngày) 0,630 0,709 0,715 0,808 0,739Sinh khối (g khô/cây) 72,89 76,99 95,49 97,21 82,13Số cành hữu hiệu/cây 7,68 8,20 8,30 8,20 7,71

Kết quả bảng 3 cho thấy oligoglucosamine có tác dụng r õ rệt đến sinh trưởng củalạc. Tất cả các ô thí nghiệm phun oligoglucos amine đều cho sinh trưởng mạnh hơn sovới đối chứng. Đặc biệt ở nồng độ 40 ppm có ảnh hưởng rõ rệt nhất, tốc độ tăng trưởnglà 0,808cm/ngày so với 0,630cm/ngày ở ô đối chứng phun nước lã. Sự khác biệt về sinhtrưởng chiều cao cây lạc ở các nồng độ l à có ý nghĩa thống kê với xác suất là P=0,05.

Về sinh khối, kết quả bảng 1 cũng cho thấy oligoglucosamine có tác dụng kíchthích sinh trưởng, làm tăng sinh khối của lạc từ 5,6-33,4% so với đối chứng. Trong thínghiệm của Nagasawa, Nguyễn Quốc Hiến (2000) khi bổ s ung chitosan chiếu xạ vàomôi trường thủy canh làm tăng sinh khối của lúa, lạc lên 40-60% [6,7].


Như vậy qua ảnh hưởng rõ rệt của oligoglucosamine đến hàm lượng diệp lục, số lượngnốt sần là hai nguồn cung cấp dinh dưỡng C và N chủ yếu cho cây thì việc kích thích sinhtrưởng của chế phẩm oligoglucosamine đối với lạc l à điều dễ hiểu. Các kết quả này cũngđược chúng tôi khẳng định trên cây rau cải, su hào, đậu tương, ngô [10,11]

4. Ảnh hưởng của chế phẩm Oligoglucosamine đến năng suất của lạc

Chế phẩm oligoglucosamine ảnh hưởng rõ nét đến hàm lượng diệp lục, sốlượng nốt sần do đó ảnh h ưởng đến sinh trưởng, tích luỹ sinh khối, số c ành hữuhiệu, vì vậy hệ quả dây chuyền kéo theo l à việc phun chế phẩm đ ã làm gia tăngđáng kể năng suất lạc như bảng 4. Kết quả cho thấy chế phẩm oligoglucosamine đ ãlàm tăng năng suất từ 19,34-40,65% so với đối chứng. Sự khác biệt n ày có ý nghĩathống kê (xác suất P=0,05) Ft=5,07 > Fb=3,47. Nồng độ cho năng suất cao nhất l à40 ppm, khi gia tăng đ ến 50 ppm th ì sự gia tăng năng suất lạ i giảm dần còn24,75%. Kết quả của chúng tôi tr ên cây đậu tương cũng làm gia tăng năng suất tới36,9 % [11].

Bảng 4: Ảnh hưởng của chế phẩm Oligoglucosamine đến năng suất lạc

Công thứcLLL

0ppm 20 ppm 30 ppm 40 ppm 50 ppm

I 3,31 3,64 3,42 4,14 4,08II 2,81 3,53 4,40 4,10 3,54III 3,05 3,85 3,41 4,64 3,80Trung bình (kg/ô TN) 3,05 3,64 3,74 4,29 3,81% Gia tăng 0,00 19,34 22,62 40,65 24,75

5. So sánh hiệu quả của Oligoglucosamine v à các chế phẩm phân bón lá

Để đánh giá hiệu quả của chế phẩm, chú ng tôi tiến hành thí nghiệm so sánh với cácchế phẩm thông dụng trên thị trường là Sông Gianh và Komix. Kết quả ở bảng 5 chothấy chế phẩm oligoglucosamine cho hiệu quả r õ rệt, tăng 47,98% trong khi đó Komixvà Sông Gianh chỉ gia tăng năng suất từ 2,82 -6,45%. Sự gia tăng năng suất của chếphẩm oligoglucosamine là hoàn toàn có ý nghĩa (P=0,001), Ft=14,06 > Fb=4,06. Trongkhi đó gia tăng năng suất của 2 chế phẩm Komix và Sông Giang với đối chứng là khôngcó ý nghĩa thống kê (NS).

Bảng 5: So sánh hiệu quả của chế phẩm oligoglucosamine với các chế phẩm bón lá.

Công thứcLLL

Đối chứng Komix Sông Gianh Oligoglucosamine

I 2,06 2,42 2,55 3,67II 2,12 2,53 2,60 3,32III 3,27 2,97 2,51 4,01Trung bình 2.48 2.64 2.55 3,67% Gia tăng 0,00 4,65 2,82 47,89


Hình: Ảnh hưởng của oligoglucosamine đến sinh tr ưởng và phát triển của lạc.(từ trái qua phải: 0 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm).

KẾT LUẬN

1. Chế phẩm oligoglucosamine có ảnh h ưởng tích cực đến hàm lượng diệp lục, sốlượng nốt sần của lạc. Chế phẩm có tác dụng kích thích sinh trưởng, gia tăng tíchluỹ sinh khối và làm tăng năng suất từ 19,34-40,65% so với đối chứng.

2. Nồng độ thích hợp của chế phẩm với cây lạc là 40ppm. Chế phẩm oligoglucosaminehiệu quả hơn hẳn các chế phẩm phân bón lá l à Komix và Sông Gianh.


1. Hadwiger, Klosterman, S. J and Choi, J. J (2002). Advances in Chitin Sience, Vol.V, pp. 452-457.

2. Kendra, D. F., Hadwiger, L. A. (1984). Experimental Mycology 8, 276 -281.

3. Flach, J., Jolles, P., and Pilet, P. E. (1993). Physiologi a Plantarum, 89: 399-404.

4. Ghaouth, A. E., Arul, J.; Grenier, J., Benhamou, N. (1994). Phytopathology, 84, 3, 313.

5. Suwalee Chandrkrachang, (2002). Advances in Chitin Sience, Vol.(V): 458-462.

6. Hien, N. Q., Nagasawa , N. (2000). Radiation Physics and Chemistr y (59): 97-101.

7. Tham, L. X., Nagasawa, N. (2001). Radiation Physics and Chemistry (61): 171-175.

8. Hirano, S. (1996). Biotechnology Annual Review, (2): 237-258.

9. Luan, L. Q, Nawasawa (2002). Advances in Chitin Sience, Vol.(V): 468-474.


10. Dzung, N. A and Thang (2001). Proceedings of Scientific Conference of TropicalBiological Institute 1999-2000, Agriculture publisher, HCMC, Viet nam, p. 162 -169.

11. Dzung, N. A, Thang, N. T (2002). Advances in Chitin Sience, Vol. V, 463 -467.

12. Yoshida, S., Forno, D (1976). Laboratory manual for Physiological studies of rice,IRRI, Philipin, pp. 43-45.

13. T.Y. Thao, P. Lieu (2003). Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Hạt nhân to àn quốc lần thứ5, Tp. HCM 27-28/4/2003.

14. T. T. L.Hoa, T. Y.Thao, Herridge, D. (2003). K ỷ yếu Hội nghị Công nghệ Hạt nhântoàn quốc lần thứ 5, Tp. HCM 27-28/4/2003.

15. Carlson, R. W., Prince, N. J. P. (1994). Mol. Plant Microb. Interact, 7, 684.

SUMMARYStudy on effects of Oligoglucosamine

on the growth and development of peanut ( Arachis hypogea L.)

Nguyen Anh Dung(1), Nguyễn Tien Thang(2)(1)Western Highland University, (2)Institute of Tropical Biology

Oligoglucosamine was prepared by enzyme degrading chitosan with averag e degreeof polymer being of 8 - 16 monomers. The effects of oligoglucosamine on chlorophyllcontents, amount of nitrogen fixing nods of peanut were investigated. The results showthat oligoglucosamine induces and enhances dramatically chlorophyll content, amountof nitrogen fixing nods. The results also show that oligoglucosamine promotes thegrowth of peanut and increases from 19,34 to 40,65% of crop yield compared with thecontrol. The concentration of oligoglucosamine is 40 ppm being optimal for the growthand development of peanut.


KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ SINH TR ƯỞNG MỘTSỐ LOÀI NẤM GÂY BỆNG CÂY CỦA SẢN PHẨM CHIẾT

XUẤT TỪ NHÂN HẠT XOAN CHỊU HẠN(Azadirachta indica A. Juss) TRỒNG TẠI VIỆT NAM

Vũ Đăng Khánh, Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến ThắngPhòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Vấn đề gây ô nhiễm và tác dụng gây độc của thuốc bảo vệ thực vật hóa học tổnghợp đối với môi trường sống đ• thúc đẩy việc nghiên cứu sử dụng các thuốc bảo vệthực vật có nguồn gốc từ thực vật [5, 7, 8]. Xoan chịu hạn (Azadirachta indicaA.Juss) là loài cây có nguồn gốc Ấn Độ, được du nhập vào nước ta cách đây khônglâu và hiện đang được trồng trên diện tích khá lớn tại các tỉnh Ninh Thuận, BìnhThuận [1,3,4]. Bên cạnh hoạt tính xua đuổi, tạo cảm giác ngán ăn v à gây chết đối vớinhiều loài côn trùng gây hại mùa màng, các sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạncòn ức chế sự sinh trưởng của một số loài nấm gây bệnh cây [6 -12 ]. Mục đích củanghiên cứu này là xác định hiệu quả ức chế của sản phẩm chiết xuất từ nhân hạtxoan chịu hạn trồng tại Việt Nam đối với 3 lo ài nấm gây bệnh cây: Fusariumoxysporum; Sclerotium rolfsii; Rhizoctonia solani.


1. Nấm gây bệnh cây [2]

Nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo v àng ở khoai tây; nấm Sclerotium rolfsiigây bệnh héo rũ gốc mốc trắng ở đậu phộng; nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễbông, đậu, dưa chuột. Các loài nấm này được duy trì trên môi trường PGA.

2. Chiết xuất hoạt chất từ nhân hạt xoan chịu hạn [5,7]

Hạt xoan chịu hạn được thu hái từ các cây xoan chịu (XCH) hạn 4 tuổi ở NinhThuận, được sấy khô trong 2 giờ ở 60 oC. Tách vỏ hạt để thu nhân hạt, rửa sạch nhân hạttrong nước cất vô trùng và sấy khô ở 60oC trong 24 giờ. Sau khi sấy khô, nhân hạt đượcnghiền thành bột ở điều kiện vô trùng.

Tiến hành chiết 50g bột nhân hạt xoan chịu hạn trong 250ml n ước cất vô trùngbằng phương pháp khuấy ngấm kiệt, lọc dịch chiết thô, loại dầu bằng petrolium ether,sau đó đông khô dịch chiết thô thu được 4,6g sản phẩm chiết trong nước. Tương tự tiếnhành chiết 50g bột nhân hạt xoan chịu hạn trong 250ml dung môi ethanol bằng phương


pháp khuấy ngấm kiệt, lọc dịch chiết thô, loại dầu bằng petrolium ether, sau đó cô quaychân không ở nhiệt độ 60oC để loại hết dung môi thu được 5,1g cao chiết trong ethanol.Tương tự đ• nhận được 4,9g cao chiết trong methanol từ 50g nhân hạt xoan chịu hạn.Các sản phẩm chiết nói trên được bảo quản vô trùng ở nhiệt độ 4oC.

3. Khảo sát tác dụng của sản phẩm chiết xu ất lên sự sinh trưởng của nấm [5,6,8]

Sử dụng môi trường PGA để nuôi cấy các loài nấm gây bệnh cây trên các đĩa petrivô trùng. Các sản phẩm chiết xuất thô từ nhân hạt xoan chịu hạn đ ược hòa tan trongnước cất vô trùng và bổ sung vào môi trường nuôi cấy chưa đông (đ• hấp khử trùng,để nguội ở nhiệt độ 45 oC) đạt nồng độ mong muốn là 0ppm (đối chứng); 250ppm; 500ppm; 1000ppm; 2000ppm; 4000ppm. Rót từng 15ml môi trường vào các đĩa petri vôtrùng và để đông. Dùng nút khoan có đường kính lỗ 5mm, đục lỗ giữa các đám tơ nấmsinh trưởng trên môi trường PGA trong các đĩa petri (giống gốc), đem cấy v ào giữađĩa petri (có môi trường và chất cần xác định hoạt tính) v à để chúng sinh trưởng. Thínghiệm được lặp lại 3 lần. Theo dõi và ghi nhận tốc độ sinh trưởng dạng tỏa tròn củacác loài nấm theo đường kính (mm) ở thời điểm t ơ nấm ở lô đối chứng mọc tỏa hết đĩathạch. Các dữ liệu được phân tích bằng phần mềm thống k ê Statgraphics 7.0. Từ cácgiá trị sinh trưởng trung bình có thể tính toán giá trị % ức chế so với đối chứng theocông thức:

% ức chế sinh trưởng =Trong đó:

DK1: đường kính tơ nấm trung bình ở lô đối chứng.DK1: đường kính tơ nấm trung bình ở lô thí nghiệm.


Các số liệu thô về đường kính tơ nấm ghi nhận được ở các lô thí nghiệm được xử lýthống kê bằng phần mềm Stagraphics 7.0, lấy giá trị trung b ình về đường kính tơ nấm (mm)với 3 lần lặp lại ở mỗi nồng độ ? độ lệch chuẩn (SE). Sau đó tính % ức chế t ơ nấm theocông thức ở mục I. 3. Kết quả được trình bày ở các bảng 1, 2 và 3 theo từng loại nấm.

Bảng 1. Đường kính tơ nấm và % ức chế sinh trưởng nấm Rhizoctonia solani khi xử lýbởi các sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt xoan chịu hạn

Loại sản phẩm Đối chứng 250 ppm 500 ppm 1000 ppm 2000 ppm 4000 ppmĐkính tơnấm (mm)

87,0 0,3 86,0 0,6 85,5 0,3 76,7 1,2 46,5 0.9 24,5 0,5Nhân XCHtrong nước

% ức chế 1,2 1,7 11,9 46,6 71,8

Đkính tơnấm (mm)

87,0 0,3 73,7 0,9 67,3 1,8 57,8 1,1 25,2 0,7 13,5 0,9Nhân XCHtrongethanol % ức chế 15,3 22,6 33,5 71,1 84,5


87,0 0,3 84,8 0,4 81,2 0,6 69,8 1,0 44,5 3,3 36,3 1,2Nhân XCHtrongmethanol % ức chế 2,5 6,7 19,7 48,9 58,2


Sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt X CH trong ethanol, ở nồng độ 250ppm đ• có tácđộng ức chế nấm Rhizoctonia solani so với đối c hứng. Dịch chiết nhân hạt XCH trongmethanol ở nồng độ 500ppm và dịch chiết nhân hạt XCH trong n ước ở nồng độ 1000ppm có tác động ức chế nấm nói trên. Nồng độ càng cao thì tác động ức chế càng rõ rệt.

Bảng 2. Đường kính tơ nấm và % ức chế sinh trưởng nấm Sclerotium rolfsii khi xử lýbởi các sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt xoan chịu hạn

Loại sản phẩm Loại sảnphẩm


Nhân XCHtrong nước

86,8 0,4 85,0 0,8 75,8 0,7 73,0 0,8 65,5 0,9 45,0 0,8Nhân XCHtrong nước

2,1 12,7 15,9 24,6 48,2Nhân XCHtrongethanol

86,8 0,4 73,2 0,4 58,5 0,3 43,0 0,8 39,3 0,6 34,7 0,7Nhân XCHtrongethanol

15,7 32,6 50,5 55,1 60,1Nhân XCHtrongmethanol

86,8 0,4 83,5 0,5 75,5 0,8 72,2 0,4 56,2 0,6 39,7 0,9Nhân XCHtrongmethanol

3,8 13,1 16,9 35,3 54,3

Sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt XCH trong ethanol v à methanol ở nồng độ 250ppm đ• thể hiện tác động ức chế nấm Sclerotium rolfsii so với đối chứng. Dịch chiếtnhân hạt XCH trong nước bắt đầu có tác động ức chế ở nồng độ 500 ppm. Nồng độcàng cao, tác động ức chế nấm càng rõ nét.

Sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt XCH trong ethanol v à methanol ở nồng độ 250ppm đ• thể hiện tác động ức chế nấm Fusarium oxysporum so với đối chứng. Dịch chiếtnhân hạt XCH trong nước bắt đầu có tác động ức chế ở nồng độ 500 ppm. Nồng độcàng cao, tác động ức chế nấm càng rõ rệt.

Bảng 3. Đường kính tơ nấm và % ức chế sinh trưởng nấm Fusarium oxysporum khi xửlý bởi các sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt xoan chịu

Loại sản phẩm Đốichứng



87,3 0,3

86,2 0,6 76,2 0,4

63,3 0,6 54,8 0,4 42,2 1,2Nhân XCHtrong nước

% ức chế 1,3 12,8 27,5 37,2 51,7Đkính tơnấm (mm)

86,8 0,2

77,3 0,9 73,8 0,2

62,3 0,6 54,5 0,9 40,8 0,8Nhân XCHtrongethanol

% ức chế 10,9 14,9 28,2 37,2 52,9Đkính tơnấm (mm)

86,8 0,2

65,8 1,0 62,2 0,6

56,3 0,7 52,7 0,6 46,7 0,6Nhân XCHtrongmethanol

% ức chế 24,2 28,4 35,1 39,3 46,2


§èi tîng nÊmLoạisảnphẩm Rhizoctonia solani Sclerotium rolfsii Fusarium oxysporum

NhânhạtXCHtrongnước

NhânhạtXCHtrongethanol

NhânhạtXCHtrongmethanol

KẾT LUẬN

1. Đã nhận được 3 dạng sản phẩm thô đã loại dầu từ nhân hạt XCH: sản phẩm chiếtxuất trong nước, ethanol và methanol.

2. Các sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt XCH đều có tác dụng ức chế sinh tr ưởng đốivới 3 loài nấm gây bệnh cây là Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii và Fusariumoxysporum. Trong đó, sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt XCH trong ethanol có tácđộng ức chế tốt nhất, tiếp theo l à sản phẩm chiết xuất trong methanol v à cuối cùnglà sản phẩm chiết trong nước.

3. Cần tiếp tục nghiên cứu tác động ức chế của các chế phẩm chiết xuất từ nhân hạt XCHtrên những đối tượng nấm gây bệnh cây khác, cũng cần tiến hành nghiên cứu phối chếcác sản phẩm trên với các chất nhũ hóa, chất chống oxy hóa, chất bảo quản, v.v... để tăngcường hoạt tính và thời gian bảo quản những sản phẩm chiết xuất n ày.


1. Lâm Công Định (1991). Giới thiệu cây xoan ch ịu hạn (Azadirachta indica A.Juss)nhập nội vào vùng cát nóng hạn Phan Thiết - Tuy Phong. Sở Nông - Lâm nghiệpThuận Hải.


2. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998). Giáo trình bệnh cây nông nghiệp. NXB Nôngnghiệp

3. Nguyễn Tiến Thắng, Vũ Văn Độ, Đỗ Thị Tuyến, L ê Thị Thanh Phượng, Vũ ĐăngKhánh (2003). Xây dựng quy trình chiết xuất hoạt chất sinh học từ hạt neem(Azadirachta indica A. Juss) trồng tại Việt Nam và khảo sát ảnh hưởng của dịchchiết lên sự sinh trưởng của vi nấm gây bệnh thực vật ( Fusarium oxysporum,Alternaria sp.) và Ngài gạo (Corcyra cephalonica St.). Báo cáo đề tài cấp cơ sở -Viện Sinh học Nhiệt đới.

4. Nguyễn Tiến Thắng và những người khác (2003). Nghiên cứu và sử dụng cây xoanchịu hạn (Azadirachta indica A. Juss) trồng tại Việt Nam. Báo cáo nghiệm thu đềtài cấp Nhà nước theo Nghị định thư.

5. Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Tiến Thắng, Akiko Hirano.Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của dầu xoan chịu hạn (Neem) l ên sự ký sinh củabọ hà (Cylas formicarius L.) trưởng thành trong củ khoai lang (Ipomoea batatasL.). Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học công nghệ, 1999 - 2000, Viện Sinhhọc Nhiệt đới.

6. Amadioha, A. C. (2000). Controlling rice blast in vitro and in vivo with axtracts ofAzadirachta indica. Crop protection 19, 287-290.

7. 7.Amadioha, A. C. (2002). Fungitoxic effects of extracts of Azadirachta indicaagainst Cochlibolus miyabeanus causing brown spot disease of rice.Arch.Phytopath.Pflanz., Vol.35, pp. 37 -42.

8. Coventry, E. & Allan, E. J. (2001). Microbiological and chemical analysis of n eem(Azadirachta indica) extracts: New data on antimicrobial activity. Phytoparasitica 29:5.

9. Govindachari, T. R., Suresh, G., Gopalakrishan Geetha, Banumathy, B. &Masilaman, S. (1998). Identification of antifungal compounds from seed oil ofAzadirachta indica. Phytoparasitica 26:2.

10. Narasimhan et al. (1998). Efficacy of neem EC formulation of neem oil andpungam oil for the management of sheath rot disease of rice. Phytoparasitica 26(4):301:306.

11. Rajappan etal. (2001). Management of grain discoloration of r ice with solvent - freeEC formulation of neem and pungam oils. Phytoparasitica 29:2.

12. Suresh, G. Narasimhan, N. S., Masilaman, S., Partho, P. D. & GopalakrishnanGeetha (1997). Antifungal fractions and compounds from uncrushed leveas ofAzadirachta indica. Phytoparasitica 25:1.


SUMMARYAntifungal activity of neem seed kernel extracts from neem tree(Azadirachta indica A.Juss) grown in vietnam on some plant

pathogens

Vu Đang Khanh, Vu Van Do, Nguyen Tien ThangInstitute of Tropical Biology

Three extracts: water extract, ethanolic extract and methanolic extract of deoiledneem seed kernel (NSK) powder at 250 -4000 ppm concentrations were evaluated asantifungal agents to plant pathogens such as Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii,Fusarium oxysporum. All extracts significantly reduced the in vitro radial growth ofthese fungi at? 2000 ppm concentrations. Ethanolic extract of deoiled NSK powderexhibited the best control of these pathogens followed by methanolic extract andwater extract. So, we should have some researches further to confirm the results inthe field test.


KHẢO SÁT TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA HOẠT CHẤT TRONGDẦU HẠT XOAN CHỊU HẠN (Azadirachta indica A. Juss)

THU ĐƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP ÉP NGUỘIDiệp Quỳnh Như, Nguyễn Tiến Thắng, Lê thị Thanh Phượng

Phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, cây neem còn có tên gọi khác là “ xoan chịu hạn”, đã được du nhập từkhá lâu và trồng trên diện tích khá lớn tại 2 tỉnh B ình Thuận và Ninh Thuận [8]. Khảnăng phòng trị nhiều loài dịch hại, đặc biệt là kháng côn trùng, của cây neem(Azadirachta indica A. Juss) đư ợc biết đến là do tác động phối hợp của một số hoạt chấtthuộc nhóm triterpenoid, là azadirachtin, nimbin, salannin. Các ho ạt chất này có nhiềutrong nhân hạt, vì thế sản phẩm hoạt chất chiết xuất từ nhân hạt neem l à nguyên liệu đầytriển vọng để sản xuất thuốc trừ sâu thảo mộc [2]. Hoạt chất chiết xuất từ thực vật nóichung và từ nhân hạt neem nói riêng thường không bền, dễ bị phân hủ y và mất hoạt tínhdưới tác động của tia UV, sự có mặt của oxy, nhiệt độ cao, pH thấp,… Dầu thực vật nóichung và dầu từ nhân hạt neem nói riêng có tính cản quang và chống oxy hóa tốt, và dovậy, có khả năng làm chất mang ổn định hoạt chất chiết xuất từ thực vật [3].

Mục đích của nghiên cứu là khảo sát tính ổn định của 3 hoạt chất chính trong dầuneem thu được bằng phương pháp ép nguội và sự thay đổi độc tính của dầu neem đốivới sâu xanh tuổi 2 theo thời gian bảo quản.


1. Vật liệu

Dầu neem thu được bằng cách ép nguội nhân hạt neem trồng tại Ninh Thuận tr ênmáy ép chuyên dụng Komet do Đức sản xuất

Chất chuẩn: Azadirachtin hãng Sigma, Mỹ; nimbin và salannin hãng Trifolio, Đức.

Tween 80, ethano l960, petroleum ether

Ấu trùng sâu xanh (Heliothis armigera) tuổi 2 nuôi trên thức ăn bán tổng hợp doPhòng Công nghệ sinh học động vật - Viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp.

2. Phương pháp định lượng các hoạt chất trong dầu neem bằng kỹ thuật HPLC

Chuẩn bị mẫu phân tích : Lấy 10ml dầu neem, loại lipid nhiều lần bằng petrol iumether, hòa tan mẫu trong 10ml ethanol, tiếp tục loại bỏ cặn bằng cách b ơm quamàng lọc có kích thước lỗ = 0,45µm và tiến hành phân tích mẫu trên thiết bịHPLC với các thông số sau:


- Lượng mẫu bơm vào cột: 0,5µl

- Cột bảo vệ: BondapakTM C18, 125A0, 10µm, 3,9 x 20mm

- Cột phân tích: BondapakTM C18, 125A0, 10µm, 3,9 x 300mm

- Dung môi rửa cột: CH3CN: H2O (55:45); Tốc độ dòng: 0,5ml/phút.

- Detector DAD, bước sóng 220nm.

Chất chuẩn azadirachtin, nimbin, salannin đ ược pha loãng ở 5 nồng độ khác nhauvà phân tích giống như mẫu thử. Dựng đường chuẩn tương quan tuyến tính giữa diệntích pick của từng chất chuẩn và nồng độ. Dựa vào đường chuẩn, nồng độ ppm của hoạtchất trong mẫu thử được tính bởi phần mềm Chemstation h ãng Aligent-Technology.

3. Phương pháp xác định độc tính của dầu neem thông qua chỉ số LC 50 trên sâu xanh.

Nguyên tắc: Sử dụng giá trị LD50 hoặc LC50 của các chất gây độc trên cùng một đốitượng sinh vật để so sánh độc tính của chúng.

Thử độc tính: dầu neem được nhũ hóa bằng tween 80, tỷ lệ tween/dầu l à1/10. Sauđó pha loãng bằng nước cất tạo hỗn hợp có nồng độ dầu neem nh ư mong muốn. Đểxác định giá trị LC50, hỗn hợp dầu neem được pha loãng thành dãy có 5 nồng độkhác nhau (tương ứng với 5 nghiệm thức), các nồng độ đưa ra đều được thăm dòtrước đảm bảo tỷ lệ chết của ấu tr ùng sâu xanh tuổi 2 sau 5 ngày nằm trong khoảng16-84% giúp cho việc xác định giá trị LC50 sau 5 ngày có độ tin cậy cao [6].

Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơnyếu tố, lặp lại 3 lần ở mỗi nghiệm thức. Mỗi ô c ơ sở gồm 20 ấu trùng sâu xanh tuổi2 được nuôi riêng trong các lọ nhỏ. Thức ăn được quét vào lọ, hỗn hợp thử nghiệmcó nồng độ xác định được quét lên bề mặt lớp thức ăn, để khô ráo. Gắp ấu tr ùng sâuxanh tuổi 2 vào lọ, phun nhẹ hỗn hợp thử nghiệm l ên thân sâu, đậy nắp có đục lỗvà theo dõi số sâu chết mỗi ngày.

Xử lý số liệu: Tính tỷ lệ chết tích lũy của sâu sau 5 ngày ở mỗi nghiệm thức. Từ đótính giá trị LC50 sau 5 ngày của hỗn hợp dầu neem bằng phương pháp phân tíchProbit, thao tác trên phần mềm Excel [6]


Hàm lượng azadirachtin, nimbin, salannin trong dầu neem thu đ ược bằng phươngpháp ép nguội trên máy ép chuyên dụng KOMET do Đức sản xuất tương ứng là930,685; 262,578; 1027,478 µg/ml (bảng 1, hình 1).

Bảng 1: Nồng độ hoạt chất trong dầu neem

TT Hoạt chất Nồng độ (ppm)123

AzadirachtinNimbin

Salannin

930,685262,578

1027,478


Hình 1: Sắc ký đồ hoạt chất trong dầu neem

Sự biến thiên hàm lượng của 3 hoạt chất của dầu neem bảo quản trong chai m àu, ởnhiệt độ phòng, được trình bày ở bảng 2.

Bảng 2. Sự biến động hàm lượng hoạt chất và giá trị pH của dầu neem theo thời gian

(%) Hoạt chất còn lại theo thời gian bảo quảnHoạt chất

0 tháng 1 tháng 4 tháng 6 thángAzadirachtinNimbinSalaninTotal

100100100100

99,4598,4598,9999,16

78,1541,2673,8471,81

49,5626,0227,1236,35

pH 5,73 5,65 4,56 3,92

Kết quả cho thấy hàm lượng azadirachtin, nimbin, salanin khá ổn định trong dầuneem. Sau tháng bảo quản đầu tiên hàm lượng của chúng hầu như không thay đổi.Trong đó azadirachtin có độ ổn định trong dầu neem ở điều kiện bảo quản b ình thườngcao hơn so với nimbin và salannin. Chu kỳ bán hủy của azadirachtin là 6 tháng (sau 6tháng bảo quản hàm lượng azadirachtin còn lại 49,56%), phù hợp với việc sản xuấtthuốc trừ sâu thảo mộc. Tính ổn định của các chất giảm c ùng với thời gian bảo quản kéodài. Trong quá trình bảo quản pH của dầu neem giảm dần từ 5,73 xuống c òn 3,92 sau 6tháng. Sự giảm độ pH đã ảnh hưởng đến tính ổn định của các hoạt chất trong dầu neem.pH càng thấp hoạt chất càng dễ bị phân hủy. Sự giảm pH trong dầu neem có thể l à do sựgia tăng quá trình oxy hóa hóa học và sinh học. Vì trong dầu neem có đường hòa tan,đạm, khoáng,... là nguồn dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật [7].


Kết quả thực nghiệm cho thấy ở c ùng một điều kiện bảo quản, azadirachtin ổn địnhtrong dầu neem tốt hơn so với trong methanol và nước. Chu kỳ bán hủy của azadirachtintrong dầu neem, methanol, nước tương ứng là 6 tháng; 50 ngày; 1,2 - 49,9 ngày [1,4].Bên cạnh việc khảo sát sự ổn định của hoạt chất trong dầu neem, cũng đ ã tiến hành khảosát giá trị LC50 theo thời gian bảo quản. Kết quả được trình bày ở bảng 3.

Bảng 3. Sự biến động giá trị LC 50 của dầu neem theo thời gian bảo quản

Thờigian

(tháng)

PT toán họcY = aX + b

Hệ sốtương quan (R)

LC50 (%)

01456

Y = 1,32 X + 3Y = 1,72 X + 2,38Y = 1,378 X + 2,685Y = 1,66 X + 2,15Y =1,50 X + 2,22

0,9850.9600.9950.9790.994

3,203,304,795,167,00

Kết quả cho thấy, theo thời gian bảo quản, giá trị LC 50 tăng dần, cùng với sự giảmdần độc tính của dầu neem. Trong tháng bảo quản đầu ti ên, độc tính của dầu neem hầunhư không thay đổi, trùng hợp với sự ổn định hàm lượng hoạt chất, như đã phân tích ởtrên. Như vậy sự giảm hàm lượng hoạt chất trong dầu neem ở những tháng bảo quảntiếp theo, đã làm giảm độc tính của nó.

KẾT LUẬN

1. Hàm lượng azadirachtin, nimbin, salannin trong dầu neem ổn định trong tháng bảo quảnđầu tiên, sau đó giảm dần theo thời gian bảo quản. So với bảo quản trong methanol vànước ở điều kiện bình thường, thì 3 hoạt chất nói trên trong dầu neem có độ ổn định caohơn. Chu kỳ bán hủy của azadirachtin trong dầu neem kéo d ài tới 6 tháng. Sự giảm pHtheo thời gian bảo quản làm giảm hàm lượng hoạt chất trong dầu neem.

2. Tổng hoạt tính gây độc của hoạt chất trong dầu neem giảm dần từ tháng thứ 2, li ênquan đến sự giảm hàm lượng của azadirachtin, nimbin, salannin. LC 50 của dầuneem đối với ấu trùng sâu xanh tuổi 2 thay đổi theo thời gian bảo quản trong 0, 1,4, 5, 6 tháng tương ứng là: 3,2% - 3,3% - 4,79% - 5,16% - 7% .


1. Jarvis Andrew P., Johnson Shaun & Morgan E. (1998). Stability of the naturalinsecticide azadirachtin in aqueous and organic solvent s. Pestc.Sci. 53, pp. 217-222.

2. Smchmutterer H., (1995). The neem tree Azadirachta indica A. Juss and othermeliaceous plants. 695p.

3. Office of Complementary Medicines, Therapeutic Goods Administration, (2002).Evaluation of Cold-Pressed Oil from the seed kernels of Azadirachta indica A.Juss., Meliacaea (Neem) for Use in Listable Therapeutic Goods.


4. <http://www.health.gov.au/tga/docs/pdf/cmec/cmecde27.pdf> posting November, 2002.

5. http://www.doc.govt.nz/Publications/004~Science -and-Research/Science-for-Conservation/PDF/sfc232.pdf

6. Phạm Văn Biên và cs (2000). Cẩm nang thuốc bảo vệ thực vật . NXB Nông nghiệp.

7. Nguyễn Ngọc Kiểng, (2000). Thống k ê học ứng dụng “Các kiểu mẫu thí nghiệm”.Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, trang 4-134.

8. Diệp Quỳnh Như, (2006). Khảo sát thành phần hoạt chất và tác động của dầu neem(Azadirachta indica A. Juss) đối với sâu xanh (Heliothis armigera). Luận văn thạcsĩ khoa học, ĐH Khoa học Tự nhi ên TPHCM, 83 trang.

9. Nguyễn Tiến Thắng và cộng sự, (2003). Nghiên cứu và sử dụng cây xoan chịu hạn(Azadirachta indica A. Juss) trồng tại Việt Nam . Báo cáo nghiệm thu đề tài cấpNhà nước theo Nghị định thư.

SUMMARYStudy on stability of bioactive substances in neem

(Azadirachta indica A.Juss) seed oil produced by cold -pressingmethod

Diep Quynh Nhu, Nguyen Tien Thang, Le thi Thanh PhuongInstitute of Tropical Biology

Cold-pressed oil of neem seed kernel was preserved at room temperature andprevented from the light. Three main biosubstances of neem oil: azadirachtin, nimbinand salannin were quantified at the time of expe rimental beginning, one month, fourmonths and six months later by HPLC. Toxicity of neem oil represented by LC 50 valuewas screened on the 2nd instar larvae of Heliothis armigera via Probit Analysis. As aresult of test, there was no decrease in content of three above biosubstances during thefisrt preserved month. However, significant reduction of them was determined duringfollowing preserved months. The half-life of azadirachtin was about six months, longerthan those of nimbin and salannin. LC 50 values of neem oil at the beginning, one month,four month and six month pres ervation were 3.2%, 3.3%, 4.79% , 5.16% and 7%,respectively. Thus, it was supposed that these biosubstances played important role intoxicity of neem oil agaisnt larvae of Heliothis armigera.

http://www.health.gov.au/tga/docs/pdf/cmec/cmecde27.pdf

http://www.doc.govt.nz/Publications/004~Science-and-Research/Science-for-


NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA neem(Azadirachta indica A. Juss)

ĐỐI VỚI MỘT SỐ LOÀI CÔN TRÙNG NÔNG NGHI ỆP

Lê Thị Thanh Phượng, Nguyễn Tiến Thắng, Trần Hạnh Phúc,Phùng Huy Huấn, Chu Tường Khanh, Trần Tuấn Đức

Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Cây neem (Azadirachta indica A. Juss) từ lâu được nhiều quốc gia nghiên cứu và pháttriển do những ưu điểm của nó về mặt kinh tế và môi trường [6]. Riêng tại nước ta, hàngnghìn hecta neem tập trung ở các tỉnh miền Trung, đặc biệt là Ninh Thuận và Bình Thuậnđã đóng vai trò quan trọng trong việc phủ xanh đất trống đồi trọc và hỗ trợ cây phi laophòng hộ tốt vùng ven biển. Với lượng hoạt chất sinh học dồi dào và đa dạng tập trung ởhạt và lá, cây neem có thể trở thành nguồn thuốc bảo vệ thực vật an toàn và hiệu quả nếuđược nghiên cứu và sử dụng hợp lý [1]. Trong đề tài này, một số chế phẩm từ hạt neemđược thử nghiệm trên một số loài côn trùng nông nghiệp phổ biến tại nước ta, đặc biệt lànhững loài đang kháng thuốc mạnh như mọt bột đỏ (Tribolium castaneum), ngài gạo(Corcyra cephalonica St), rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal), sâu tơ (Plutella xylostella).

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP1. Vật liệu Dầu neem thu được từ nhân hạt neem bằng phương pháp ép nguội. Dịch chiết bánh dầu: sản phẩm chiết xuất hoạt chất sinh học từ bánh dầu neem bằng

ethanol. Chế phẩm neem viên nén: có thành phần chính là bột hạt nem, dùng xông hơi

phòng trị côn trùng kho. Mọt bột đỏ, ngài gạo, rầy nâu, sâu tơ được nhân nuôi tại Viện Sinh học Nhiệt đới.

2. Phương pháp* Rầy nâu: phun dầu neem lên các chậu lúa ở 5 nồng độ 0,2 - 0,5 - 1,0 - 2,0 - 3,0%. Sau đóđặt chậu lúa vào các lồng lưới có chứa 50 rầy nâu (10 ngày tuổi hoặc thành trùng). Hiệu lựccủa các chế phẩm được đánh giá theo trị số LC50 dựa vào tỉ lệ rầy chết sau thí nghiệm. Sốrầy sống sót vẫn tiếp tục nuôi dưỡng để theo dõi tỉ lệ thành trùng và biến dạng [3] [5].

* Ngài gạo và mọt bột đỏ Phương thức tẩm độc thức ăn: Nhúng thức ăn nhân tạo của ngài gạo và mọt bột đỏ vào

dầu neem và dịch chiết bánh dầu ở dãy nồng độ 1,5 - 3,0 - 6,0- 12,5 - 25 - 50 -100%. Thínghiệm được thực hiện trong các đĩa petri chứa 10 ấu trùng tuổi 3. Dựa vào trọng lượngthức ăn côn trùng sử dụng trong 14 ngày, tính hiệu lực gây ngán ăn của các chế phẩm [4]


Phương thức xông hơi: thực hiện trong các lọ nhựa thể tích 1 lít chứa 300g gạo sạchvà 30 ấu trùng tuổi 3. Đặt chế phẩm viên nén lên mặt gạo, đậy kín lọ trong 3 ngày.Ghi nhận số ấu trùng chết sau xử lý. Số sống sót được nuôi dưỡng để theo dõi tácđộng của chế phẩm đối với sự sinh tr ưởng, phát triển và sinh sản của ngài gạo.

* Sâu tơ: Nhúng các mẫu lá cải (đường kính 8cm) vào các chế phẩm theo dãy nồng độ1 - 2,5 - 5 - 7,5 -10%, để ráo thuốc và đặt vào các đĩa petri. Mỗi đĩa bố trí 10 ấu tr ùngtuổi 3. Ghi nhận mức độ tiêu thụ thức ăn và số lượng sâu chết sau thí nghiệm để tính hệsố ngán ăn và trị số LC50.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN1. Rầy nâu

Kết quả cho thấy dầu neem gây chết rầy non 10 ng ày tuổi mạnh hơn so với thànhtrùng, trị số LC50 tương ứng là 2,20% và 6,87%. Khi theo dõi quá trình phát tri ển của sốrầy 10 ngày tuổi còn sống ở nghiệm thức dầu neem 1%, ghi nhận tỉ lệ rầy tr ưởng thànhlà 59,9%; trong đó 29,5% rầy bị biến dạng (Hình 1).

a b c d e f

Hình 1. Tác động gây biến dạng của neem đối với rầy nâua , b : Rầy nâu cánh dài và cánh ngắn bình thường. c, d, e, f: Các kiểu rầy biến dạng

Bảng 1. Độ độc (LC50) của dầu neem đối với rầy nâu

2. Ngài gạo và mọt bột đỏ* Phương thức tẩm độc thức ăn

Bảng 2 cho thấy ở dãy nồng độ 12,5 - 25 - 50 - 100%, dầu neem gây ngán ăn mạnh đốivới ngài gạo. Trong khi đó dịch chiết bánh dầu chỉ có hiệu lực mạnh ở nồng độ 50 - 100%.

Bảng 2: Tác động gây ngán ăn của dầu neem, dịch chiết bánh dầu đối với ng ài gạo

Nồng độ xử lý (%)Chế phẩm 100,0 50,0 25,0 12,5 6,0 3,0 1,5Dầu neem 188,9*** 180,6*** 174,4*** 160,3*** 146,7** 125,2** 106,8**

Dịch chiết BD 165,7*** 155,2*** 147,4** 130,1** 116,7** 98,3* 89,9*

Hiệu lực gây ngán ăn: (***):mạnh, (**): trung b ình, (*): yếu [4]

Tuổi rầy Phương trình tương quan Hệ số tương quan P LC50(%)

10 ngày tuổi Y = 3,8824 + 0,8273 X 0,9769 0,0042 2,20

Thành trùng Y = 3,8769 + 0,6103 X 0,9903 0,0011 6,87


Ngoài tác động gây ngán ăn, các chế phẩm c òn gây chết ngài gạo ở các mức độkhác nhau. Nhìn chung trong ph ạm vi thử nghiệm, hiệu lực gây chết của các chế phẩmgia tăng theo nồng độ xử lý. Kết quả phân tích Probit (Bảng 3) cho thấy dầu neem cóđộc tính cao, với giá trị LC 50 là 0,07 %. Dịch chiết bánh dầu có tác động gây chết thấphơn với giá trị LC50 là 0,23%.

Bảng 3. Độ độc (LC50) của các chế phẩm neem đối với ng ài gạo

Các chế phẩm neem có khả năng gây chết dần ng ài gạo ở nhiều giai đoạn phát triểnkhác nhau. Số ấu trùng mẫn cảm nhất sẽ chết ngay sau khi nhiễm thuốc. Số c òn lại cóthể chuyển qua giai đoạn nhộng v à vũ hóa, nhưng thành trùng thường bị biến dạng vàgiảm khả năng sinh sản. Quan sát cũng cho thấy một số ấu tr ùng và nhộng có biểu hiệnkhông bình thường (hình 2).

a b c d

e f g hHình 2. Tác động gây biến dạng của neem đối với ng ài gạo

a, b, e: Ấu trùng, nhộng, thành trùng bình thường.c, d: ấu trùng, nhộng dị dạng. f, g, h: Các kiểu biến dạng của th ành trùng

* Phương thức xông hơiSử dụng chế phẩm neem viên nén (NV) để xử lý ngài gạo và mọt bột đỏ theo

phương thức xông hơi cho thấy các chế phẩm có khả năng gây chết, ức chế sinh trưởngvà gây biến dạng thành trùng.

Bảng 4: Giá trị LD50 (mg/dm 3) của chế phẩm NV đối với ng ài gạo và mọt bột đỏ

Chế phẩm Phương trình tương quan Hệ sốtương quan P LC50(%)

Dầu neem Y = 5.6861 + 0.5999 X 0.985000926 5.24948E-05 0,07

Dịch chiết bánh dầu Y = 5,3948 + 0,6072 X 0.985180154 5.09456E-05 0,23

Ngày sau xử lýĐối tượng xử lý

Phương trìnhtương quan

Hệ sốtương quan P

LD50(mg/dm3)

Ngài gạo y = 3,8098 + 1,4838 x 0,9538 0,0118 6,343 ngàyMọt bột đỏ y = 3,5726 + 1,4984 x 0,9315 0,0212 8,96Ngài gạo y = 4,6161 + 1,3992 x 0,9330 0,0205 1,887 ngàyMọt bột đỏ y = 4,5693 + 1,4878 x 0,9312 0,0213 1,95


3. Sâu tơBảng 5: Tác động gây ngán ăn v à gây chết của chế phẩm neem đối với sâu t ơ

Kết quả bảng 5 cho thấy dầu neem và dịch chiết bánh dầu là chất gây ngán ăn mạnh đốivới sâu tơ với hệ số ngán ăn tương ứng là 196,2% và 173,1% (hình 3). Hai chế phẩm nàycũng có khả năng gây chết sâu tơ với trị số LC50 tương ứng là 0,7% và 0,42%.

Hình 4 cho thấy dầu neem và dịch chiết bánh dầu 5% gây chết 67 - 80% sâu và 13 -23% nhộng, kết quả có từ 7% - 10% thành trùng xuất hiện. Trong khi đó, ở nồng độ10%, dầu neem và dịch chiết bánh dầu gây chết to àn bộ đối tượng xử lý qua 2 giai đoạnsâu và nhộng, kết quả không xuất hiện th ành trùng.

a b c d e

Hình 3. Một số tác động của neem đối với sâu t ơa, b: Tác động gây ngán ăn (a là đối chứng, b là mẫu xử lý neem)

c, d: tác động làm biến dạng thành trùng; e: tác động gây chết nhộngDN (5% )

7%13%

80%

thaønhtruøngnhoäng

cheát

saâu cheát

DN (10% )

90%

0% 10%

nhoängcheát

saâu cheát

thaønhtruøng

DCH (5%)

23%

67%

10%

thaønhtruøng

nhoängcheát

saâu cheát

DCH (10%)

16%0%

84%

nhoängcheátthaønh

truøng

saâu cheát

Hình 4. Tác động của neem đối với quá tr ình phát triển của sâu tơ

KẾT LUẬN

Kết quả thử nghiệm cho thấy các chế phẩm neem tác động l ên rầy nâu, ngài gạo, mọtbột đỏ và sâu tơ theo nhiều phương thức khác nhau như gây chết, gây ngán ăn, làm biếndạng; qua đó có thể tiêu diệt ngay hoặc ức chế dần sự phát triển quần thể của chúng.

Loại chế phẩmChỉ tiêu

Dầu neem Dịch chiết bánh dầuHệ số ngán ăn (%) 196,2 173,1

LC50 (%) 0,42 0,61



1. Ahmed S., (1988). Potential of using neem tree ( Azadirachta indica) for pestcontrol and rural development. Neem Newsl. 5(4). pp. 49 - 55.

2. Gupta B. N. and Sharma K. K., (1994). Characteristics and uses of Azadirachtaindica A. Juss. In: Neem, a wonder tree. Indian Council of Forestry Research andEducation, Dehra Dun, India. pp. 1 - 7,

3. Mathur Y. K. and Nigram S., (1993). Insecticide, antifeedi ng and juvenilizingeffects of neem oil against Corcyra cephalonica St. and Epilachnavigintioctopunctata F. In:Neem and Environment. Volume 1. World NeemConference, Bangalore, India, 24 - 28 Feb. 1993. (Eds. Singh R.P, Chari M.S.,Raheja A. K. and Kraus W.). Science Publishers, Inc., USA. pp. 335 - 342.

4. Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, Nguyễn Công Hào và Nguyễn Ngọc Sương,(1998). Hiệu quả gây ngán ăn của một số cây mọc ở Việt Nam đối với mọt thóc tạp.Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học 1993-1998, Viện Sinh học Nhiệt đới,Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia. NXB Nông Nghiệp, trang333 - 338.

5. Saxena R. C., (1987). Neem seed derivative for management of rice insect pests - Areview of recent studies. In: Natural pesticides from the neem t ree (Azadirachtaindica A. Juss) and other tropical plants. Eschborn, pp: 81 - 93.

6. Seeni R., Nutan K., Jitendra K., Opender K. and Balraj S. P., (1993). Azadirachtincontent and Bioactivity of some neem ecotypes of India. In: Neem andEnvironment. Volume 1. World Neem Conference, Bangalore, India, 24 - 28 Feb.1993. (Eds. Singh R. P, Chari M. S., Raheja A. K. and Kraus W.). SciencePublishers, Inc., USA, pp207-217

SUMMARYAction modes of neem (Azadirachta indica A. Juss)

to some agricultural insects

Le thi Thanh Phuong, Nguyen Tien Thang, Tran Hanh Phuc,Phung Huy Huan, Chu tuong Khanh, Tran Tuan Duc

Institute of Tropical Biology

Neem seed oil, neem cake extract and neem pellet were prepared and screened fortheir effects on rice moth (Corcyra cephalonica), red flour beetle (Triboliumcastaneum), diamondback moth (Plutella xylostella) and brown plant hopper(Nilaparvata lugens Stal.). It was seen that all these neem -based products affected tesedinsects as antifeedant, insecticidal, metamorphosis deterri ng and fecundity inhibitingagents. By these ways, they controlled and inhibited development of the pests safely andeffectively.

Documents

Phan III. Cong Nghe Cac Chat Co Hoat Tinh Sinh Hoc