TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾKHOA CƠ KHÍ - CÔNG NGHỆ

ث

BÀI TIỂU LUẬN  

PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT. CHẤT KHÁNG SINH. CHẤT DIỆT KHUẨN.

ĐỘC TỐ VI NẤM.

I: PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT

a. Phương pháp hóa sinh

Phương pháp Enzym:

Nguyên tắc: người ta đã xây dựng các phương pháp xác định dư lượng thuốc BVTV trong thực phẩm với độ nhạy từ µ g –ng. phương pháp dựa trên cơ chế ức chế đặc hiệu giữa nhóm lân hữu cơ hoặc carbomat với ChE. Xác định sự giảm hoạt độ của ChE (% ức chế) khi có mặt của chất độc từ đó có thể tính được hàm lượng chất độc có trong mẫu.Cholinesteraza ( ChE ) là enzym thủy phân các Esteaxyl của cholin, nó đóng vai trò quan trọng trong hoạt động thông tin giữa các tế bào trong cơ thể sống, đặc biệt là các tế bào của hệ thần kinh. ChE bị kìm hãm  bởi các nhóm thuốc lân hữu cơ và carbamat.

Phương pháp GT-test Kit:

Nguyên tắc : dựa vào đặc tính ức chế axetylcholinestearaza của các loại thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu cơ và carbomat. phần Axetylcholinnesteraza tự do (không bị ức chế) sẽ thủy phân Axetylcholin tạo acid Axetic và cholin. dựa vào phản ứng tạo màu giữa Axetylcholin còn thừa với thuốc thử GT ta xác định lượng thuốc BVTV trong rau quả.

1. Các phương pháp tiến hành

b. Phương pháp sinh học

Đây là các phương pháp được sử dụng để kiểm tra độc tố và côn trùng. Trong phần lớn các trường hợp chúng được coi như các phép thử định tính. Các phương pháp này dược sử dụng khá phổ biến

c. Phương pháp hóa lý

- Phương pháp cực phổ: Đây là phương pháp có độ nhạy cao- Phương pháp quang phổ: Thường được sử dụng để nghiên cứu và định lượng các chất BVTV -Phương pháp so màu: cơ sở của phương pháp dựa vào phản ứng tạo phức màu đặc trưng cho các chất BVTV.- Phương pháp sắc ký: Các phương pháp hay dùng: sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng, sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Ứng dụng: đây là phương pháp định lượng mới, nó được ứng dụng cho nhiều loại hóa chất BVTV khác nhau. trong số đó được dùng phổ biến hơn cả là GC

2. Thực hành

xác định hàm lượng hóa chất BVTV thuộc nhóm lân hữu cơ

2.1 Nguyên tắc:  Khi được tách chiết, hóa chất bảo vệ thực vật photpho-nitơ hữu cơ được xác định bằng sắc ký khí (GC) trực tiếp với detector FPD.

2.2 Hóa chất:• Axeton, diclomtan,ete petrol tinh khiết phân tích• Natri sunfat khan tinh khiết• Chất chuẩn cho nhóm chất BVTV nhóm photpho hữu cơ.

2.3 Dụng cụ và hóa chất:• cân phân tích d=10-4g     • máy nghiền mẫu;• cân kỹ thuật d=10-2g        • máy cô quay chân không;• hệ thống sắc ký khí (GC) với detector FPD;phểu chiết.

2.4 Cách tiến hànhXây dựng đường chuẩn• Dung dịch chuẩn gốc 100 ppm.Cân 0,01g chất chuẩn cho vào bình định mất 100ml, thêm n-hexan đến vạch mức.• Dung dịch chuẩn làm việc• Hút 0,5; 1,0; 2,0ml chuẩn gốc ở trên cho vào bình dịnh mức 10ml và pha loãng tới vạch bằng n-hexan được các nồng độ chuẩn tương ứng là 5;10 và 20ppm.• Bơm vào máy, theo hướng dẩn của phần mềm để lập đường chuẩn và xác định thời gian lưu, diện tích pic.

Tiến hành chiết mẫu• mẫu được thái nhỏ và trộn điều cẩn thận. cần xác định 100g mẫu cho vào bình nón 250ml, thêm 200ml aceton nghiền đồng nhất trong 1 phút. lọc qua thiết bị lọc chân không, thu dịch chiết trong bình hút 500ml. Cho 800ml dịch lọc mẫu vào phễu chiết 1lit, thêm 100ml ete petrol và 100ml diclometan,lắc mạnh trong 1 phút. Lớp hữu cơ bên trong của phểu chiết ban đầu đê lam khô bằng cách cho chạy qua phểu lọc đường kính 10cm có chứa natri sunfat khan bên trên giấy lọc, thu dịch lọc vào bình cô quay.

Rửa lớp natri sunfat bằng 50ml diclometan. Cô đặc và bay hơi chậm bằng máy cô quay chân không ở 450C. Khi cô đặc còn khoảng 2ml, thêm 10ml axeton và lại cô đến còn khoảng 2ml. Lặp lại việc cô đặc 2 lần với 10ml axeton.  Không cô khô để tránh phân hủy mẫu.

Phân tích hổn hợp mẫu photpho hữu cơ và natri hữu cơ• Hòa tan cặn dịch khô đến 10ml bằng axeton• Bơm 1 µl dung dịch này vào máy sắc ký khí, sử dụng detector FPD với các điều kiện sau: cột SPB- 5 (30m x 0,25mm x 0,25µm ). Nhiệt độ cột: 500C (1 phút), tăng 200C/phút -1200C, tăng 500C/ngày-2500C. chế độ bơm: không chia dòng, tốc độ 1ml/phút. áp suất khi mang 100kpa.

Xi : Hàm lượng hóa chất BVTV “i” có trong 1kg mẫu (mg/kg)Si: diện tích pic tương ứng mẫu chất “i”m : khối lượng mẫu phân tíchV : thể tích dịch mẫu cuối cùng, mlSm : diện tích pic tương ứng của mẫu chuẩn có chất “i”m: khối lượng mẫu lấy phân tích, g

2.5 xử lý kết quả

So sánh thời gian lưu của mỗi đỉnh so với chất chuẩn để định tínhSo sánh diện tích hoặc chiều cao của mỗi pic với pic chuẩn để định lượngHàm lượng của từng loại hóa chất BVTV được tính theo công thức:

Xi = . ..

i i

m

C VSmS

II: PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG CHẤT KHÁNG SINH

1. Các phương pháp tiến hành

1.1. Phương pháp vi sinh

• Các phương pháptrong môi trường lỏngMẫu sau khi thanh trùng sẽ được cấy các chủng vi khuẩn nahyj với chất kháng sinh như (Bacillus, Streptococus…). Sau thời gian nuôi cấy nếu như có tạo ra axit lactic thì đó la bằng chứng cho việc không có mặt chất kháng sinh hoặc có ở một giới hạn nhất định. Việc xác định có thể tiến hành bằng cách đo PH hoặc đông tụ sữa. Sự tăng tế bào vi khuẩn có thể được xác định bằng đo độ đục.

Các phương pháp trong môi trường thạchCác chất kháng sinh khi tiếp xúc với môi trường thạch sẽ lan tỏa trong đó. Sự lan lỏa tuân theo hàm logarit của nồng độ kháng sinh. Sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường thạch sau thời gian nuôi cấy cho phép sự có mặt của chất kháng sinh.

1.2 Phương pháp điện di

• Mẫu được đưa vào các lỗ đục trên mặt thạch. Sau khi tiến hành điện di trên tấm thạch các chất kháng sinh sẽ được phân tách và nhờ đó định tính được, ngoài ra loại trừ được ảnh hưởng của các chất khác. Tấm thạch thứ 2 được cấy một hay nhiều chủng vi sinh vật khác nhau tùy từng loại kháng sinh. Sau khi nuôi cấy tiến hành đo đường kính kháng khuẩn từ đó có thể định lượng được loại kháng sinh có trong mẫu.Phương pháp này có các ưu điểm: loại trừ được ảnh hưởng của các chất khác; Xác định được các loại chất kháng sinh; Định lượng kháng sinh.

1.3 Phương pháp hóa lý

• Phương pháp phóng xạ - enzym: Dựa trên phản ứng sinh hóa giữa chất kháng sinh và một cofacter có gắn đồng vị C14. Quá trình định lượng được tiến hành 10-15 phút, giới hạn phát hiện đạt 0,05UI/ml đối với penicilinPhương pháp phóng xạ-miễn nhiễm• Phương pháp phóng xạ - miễn nhiễm: Cơ sở phương pháp dựa trên đo sự thay đổi hoạt độ của một enzym dưới ảnh hưởng của một kháng thể thích hợp. Phương pháp này có thuận lợ là không phải sử dụng chất đồng vị phóng xạ và có độ nhạy gần với các phương pháp hiện hành.

• Phương pháp huỳnh quang: Phương pháp dựa trên việc gắn chất phát quang lên phân tử chất kháng sinh và tiến hành đo bởi máy huỳnh quang dùng ánh sáng phân cực hoặc không phân cực. phương pháp này dùng xác định tetracylin, sau khi đun nóng trông môi trường trung tính hoặc kiềm tạo thành phức chất phát quang. Giới han phát hiện của phương pháp 2g/g. • Phương pháp quang sinh học : ATP tạo ra bởi vi khuẩn được chuyển thành ADP Luciferza, kèm theo đó là quá trình phát quang và được đo bằng trắc quang kế.• Phương pháp quang phổ: Dùng thiết bị quang phổ UV-Vis và RI cho phép xác định và định lượng penicilin, steptomycin, tetracylin…• Phương pháp sắc kí: Sắc kí lớp mỏng: dùng xác định dư lượng kháng sinh trong sữa. Định lượng có thể dùng phương pháp huỳnh quang. Giới hạn phát hiện của phương pháp: tetracylin 0,025 g/ml; Choloramphenicol 1g/ml; neomycin 15 g/ml; treptomycin 0,5 g/ml.Sắc kí khí: áp dụng trong sữa. Giới hạn phát hiện: Tetracylin 0,5 – 10 g/ml; Choloramphenicol 0,01 g/ml; penicilin 0,005UI/ml. Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) đây là phương pháp hiện nay được dùng rất phổ biến để định tính và định lượng chất kháng sinh.

2. Thực hành: phân tích dư lượng kháng sinh trong streptomycin

2.1 Nguyên tắc: Thuỷ phân streptomycin bằng kiềm cho maltol là Methyl-3-hydroxy- 7pyron. Sự tạo thành maltol xảy ra hoàn toàn định lượng cho phép xác định được streptomycin Maltol sinh ra được tách khỏi hỗn hợp thủy phân bằng cách dùng clorofooc để chiết khỏi dung dịch mẫu trong môi trường axit, sau đó giải chiết maltol bằng dung dịch kiềm trong nước. Cho maltol tác dụng với phèn sắt (III) amonium, dung dịch 2% sẽ sinh ra phức màu đỏ tía đặc trưng và đo mật độ quang của phức màu này ở sóng 525 nm để xác định streptomycin. Nồng độ của streptomycin được xác định theo phương pháp đường chuẩn

Lấy mẫu: - Nên lấy mẫu ở dạng còn nguyên bao gói- Nếu phải lấy mẫu một phần:• Dụng cụ chứa mẫu phải sạch, khô, không có lỗ rò, miệng rộng có nắp đậy, vô trùng, có kích thước phù hợp với mẫu cần lấy.• Tốt nhất là dụng cụ chứa mẫu bằng nhựa hay kim loại, hạn chế sử dụng dụng cụ bằng thủy tinh.• Dùng các dụng cụ vô trùng để lấy mẫu vào dụng cụ chứa, không dùng tay tiếp xúc với mẫu.• Sản phẩm khô, có thể dùng hộp kim loại hay bao PE có thể bịt kín được.• Lấy ít nhất 100g cho mỗi mẫu, không được lấy mẫu đầy bình chứa• Đối với mẫu lỏng phải phải kiểm soát nhiệt độ tại thời điểm lấy mẫu.

2.2 Dụng cụ và thiết bị:

Máy ly tâm Pipet các loạiMáy ly tâm Pipet các loạiMáy ly tâm

Máy xay sinh tố Bình định mức

Máy trắc quang UV-VIS Phễu chiếtMáy trắc quang UV-VIS Phễu chiếtMáy trắc quang UV-VIS

2.3 Hóa chất:Dùng hoá chất có độ tinh khiết phân tích- Axit clohydric, dung dịch 1M- Natrihydroxyt, dung dịch 1N- Thuốc thử: phèn sắt (III) amonium, dung dịch 2% trongaxit sunfuric 1N- Clorofooc- Dung dịch gốc tiêu chuẩn streptomycin sunphat nồng độ 1mg/ml- Nước cất 2 lần2.4 Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu phân tích• Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghiền mịn, trộn đều và cân 1 lượng a = 20g cho vào máy xay sinh tố. Thêm 10 ml nước cất vào và cho máy chạy trong 5 phút. Cho 5 ml axit clohydric 1 M vào và định mức đến 50 ml bằng nước cất. Đun trong bếp cách thuỷ sôi trong 10 phút. Để nguội, ly tâm lắng cặn, lấy dung dịch nước trong cho vào phễu chiết, thêm 10 ml clorofooc, lắc trong 10 phút sau đó để yên trong 15 phút cho phân lớp hoàn toàn trong phễu chiết rồi tách lấy tướng hữu cơ vào phễu chiết khác, thêm 2 ml natrihydroxyt 1N và 4 ml thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2% trong axit và nước cất đến 20 ml. Lắc mạnh trong 30 phút, sau đó để yên trong 20 phút rồi tách lấy phần dung dịch nước. Dung dịch này dùng để đo mật độ quang, xác định streptomycin ở bước sóng 525 nm.

• Pha dãy chuẩn: Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn của streptomycin sunphat nồng độ 1mg/ml, tính toán lượng phù hợp để pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1- 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 - 2,5 μg/ml trong các bình định mức có thể tích 20 ml sau đó thuỷ phân bằng kiềm, đun cách thuỷ cho sôi 10 phút, để nguội rồi cho 2 ml dung dịch thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2%, định mức bằng nước cất đến 20 ml rồi để sau 20 phút mới tiến hành đo .

• Tiến hành thử: + Đặt sóng đo và bật máy chạy cho ổn định (5 phút); + Đo mật độ quang của mẫu chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 525 nm bằng Cuvét có chiều dày 2 cm. Dùng mẫu trắng ở kênh so sánh làm mẫu so sánh và đo mỗi mẫu 3 lần; + Lập đồ thị đường chuẩn theo hệ toạ độ D-C. Trong đó D là mật độ quang của dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ C tương ứng ; + Xác định nồng độ Cx của chất phân tích theo đường chuẩn đã dựng được.

• Mẫu trắng:Mẫu trắng phải được chuẩn bị cùng một điều kiện như mẫu phân tích nhưng thay mẫu phân tích trên bằng nước cất sao cho có cùng thể tích

2.5 Xử lý kết quả:

Hàm lượng của streptomycin trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:

Co= (Cx.V) / a Tính bằng g/g

Trong đó:

- a là lượng mẫu cân (ở đây a = 20 g)

- V là thể tích pha mẫu (V = 20 ml)

- Cx là nồng độ streptomycin xác định được theo đường chuẩn

III : CHẤT DIỆT KHUẨN

1. Các phương pháp phân tích:

a. Phương pháp biến đổi sự chuyển hóa của nấm menPhương pháp thường dùng là test quá trình lên men.Thực phẩm được đưa đi lên men có bổ sung một lượng chuẩn nấm men saccharomyces cerevisiae rất hoạt động. Sau khi nuôi cấy kiểm tra thể tích khí CO2 tạo thành cho phép kết luận có hay không có mặt chất diệt khuẩn.

2.1. Phương pháp vi sinh:

b. Phương pháp phát triển trong môi trường thạchCơ sở của phương pháp là cho mẫu vào trong môi trường thạch. Nếu mẫu có chất diệt khuẩn sẽ ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt thạch. Được so sánh với mẫu kiểm chứng tiến hành trong cùng điều kiện. phương pháp hay dùng: phương pháp Drieux và Thierry áp dụng cho tất cả các sản phẩm ngoại trừ bơ. Phương pháp Mossel và Eijgelaar áp dụng cho phân tích bơ.

2.2 Phương pháp hóa lý:

• Acid sorbic và sorbat    Các phương pháp hay dùng: phương pháp so màu, phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại, phương pháp sắc kí khí (GC), phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)• Acid Benzoic dẫn xuất Dẫn xuất của benzoic có nhiều loại: axit orthoclorobenzoic, paraclorobenzoic, salicylic, parahydroxybenzoic và các ester metyl, propyl, butyl của axit parahydroxybenzoic.Phương pháp thường dùng : sắc kí giấy, sắc kí bản mỏng, phương pháp HPLC• Anhydric sunfurơ và sunfit Anhydric sunfurơ được đưa vào thực phẩm lỏng dưới dạng khí sunfurơ, nó sẽ kết hợp với đường, etanol và các chất màu. Nó thường tồn tại một phần dưới dạng SO2 tự do có mùi đặc trưng và có tính diệt khuẩn.Sau khi đốt nóng mẫu và bổ sung nước, axit photphoric, có thể xác định anhydric sunfurơ theo 2 cách: + Nhận biết mùi   + Con đường hóa học: dùng băng giấy amidon có tẩm kali, khi có mặt SO2 , băng giấy sẽ hiện màu xanh. Có nhiều phương pháp kỹ thuật dùng định lượng

• Biphenyl và orthophenyl-phenol Các hợp chất này được sử dụng trong xử lý bề mặt cam quýt … Chúng được xác định theo phương pháp Gunther,Blinn va Barkley: Nghiền quả, xử lý bằng hơi nước thu phần chưng bằng xyclohexan. Orthophenyl-phenol được chiết bằng dung dịch xút loãng, biphenyl vẫn còn trong xyclohexan. Tiến hành so màu ở 248nm• Dẫn xuất halogen của axit axetic Công thức chung  CH2XCOOH.Trong đó axit monobromaxetic được dùng nhiều hơn cả. Có nhiều phương pháp được dùng:Phương pháp Florentin-Munch,Cristol-Benezech,Jaulnes,Vivario.• Axit boric Có nhiều phương pháp xác định axit boric trong thực phẩm, ta có thể kể tới 2 phương pháp chính:Phương pháp chuẩn độ,Phương pháp so màu• Fomrmaldehyt và dẩn xuất Diemair và Postel đưa ra phương pháp kiềm hóa formol bằng phản ứng với axit cromotropic với sự có mặt của H2SO4.Nếu có formol sẽ xuất hiện màu tím.Censi và Cremonini đưa ra phương pháp định lượng formol bằng cách dùng 2,4-dinitrophenylhydrazin.

• Axit formic Phương pháp Lecoq:Chiết bằng ete petrol, sau đó phần chiết ete được kiềm hóa bằng dung dịch xút 0,1N.Tách pha nước và tiến hành axit hóa bằng H2SO4 1N, sau đó chưng cất đến khi chỉ còn khoảng vài ml dịch chiết.Gia nhiệt phần nước chưng 15 phút bằng đun cách thủy, bổ sung vài hạt tinh thể HgCl2.Nếu có mặt axit formic, se tạo kết tủa trắng.Giới hạn kiểm tra của phương pháp hàm lượng axit ≥ 300mg/l .• Hợp chất flo Phương pháp Truhaut: sau khi tro hóa, chuyển toàn bộ flo thành axit hydroflosilic bằng cách cho tác dụng với H2SO4 với sự có mặt của silic.Chưng cất cuốn hơi nước, thu axit flohydric (do thủy phân axit hydroflosilic). Chuẩn độ flo bằng đun dịch thori nitrat với chỉ thị natri alizarin-sulfonat hoặc parasulfophenyl-azo-dihydroxynaphtalen-disulfonic(SPADN3).• Hợp chất amonium Phương pháp Diemair-Postel: chiết amoni bằng hỗn hợp nước-axeton,tiếp theo bằng dicloetan , thu bằng bromophenol.Các hợp chất amoni tạo phức màu xanh với bromophenol và được định lượng bằng cách so màu ở bước sóng 608nm(xây dựng đường chuẩn ).Phương pháp Miller-Wildbrett:cải tiến từ phương pháp trên, hợp chất amoni tạo phức màu với eosin và so màu ở 542nm

• HydroperoxytĐược áp dụng nhiều trong công nghiệp sữa. + Phương pháp hóa học: Phương pháp Pien, Desirant và Lafontaine; Phương pháp Rouquette; Phương pháp Amin và Olson; Phương pháp Ferrier;Phương pháp Gupta.      +  Phương pháp enzym: Có độ nhạy cao hơn phương pháp hóa học • Hypoclorit và cloramin + Phương pháp hồ tinh bột: Hypoclorit phân giải iodua tạo iod có màu xanh với hồ tinh bột + Phương pháp huỳnh quang: trộn 3ml mẫu với hỗn hợp H2SO4 (3+1) chứa 0,025% clorua thiếc,giữ ở nhiệt độ 0-5 0C.Ly tâm 3 phút tốc độ 2500 vòng/phút.Thu kết tủa soi đền ngoại tử(365nm), nếu thấy màu lục nhạt thì mẫu có hypoclorit hoặc cloramin.

2. Thực hành:2.1 Nguyên tắc:

Làm đồng nhất hóa sản phẩm, sau đó pha loãng và axit hóa phần mẫu thử, chiết axit benzoic bằng dietyl ete, sau đó chiết lại axit này bằng kiềm và tinh chế bằng cách oxy hóa kalidicromat đã được axit hóa . Xác định bằng cách đo quang phổ của axit benzoic tinh khiết được hòa tan trong dietylete.

2.2 Hóa chất:Tất cả các thuốc thử phải thuộc loại tinh khiết phân tích .Phải sử dụng nước cất hoặc nước tinh khiết tương đươngAxit tactaric tinh thể NaOH 1N ; Axit sufuric(2+1) Kali dicromat 33-34ml dietyl ete mới được cất Axit benzoic, dung dịch chuẩn 0,1g/l trong dietyl ete

2.3 Dụng cụ và thiết bị:• Bình định mức 50ml• Phiễu chiết 500ml• Pipe 20ml• Máy làm đồng chất• Cân phân tích• Bếp cách thủy• Bình cầu 200ml có nút gài, được làm bằng thủy tinh• Máy đô quang phổ xác định trong phạm vi tia cực tím.

3.4 Cách tiến hành:

 Các sản phẩm lỏng( dịch quả, các sản phảm có thịt quả,xiro)và các sản phẩm đặc(mứt cam,mứt nhuyễn) : Làm đồng nhất mẫu thí nghiệm sau khi trộnSản phẩm rắn(rau, quả) : Cắt mẫu thí nghiệm ra thành nhiều miếng nhỏ, bỏ hạt, khoang lá noãn nếu cần  và nghiền trộn đồng nhất một cách cẩn thận khoảng 40g mẩu.Để sản phẩm đông lạnh tan giá trong một bính kín  và cho dịch tan chảy vào sản phẩm trước khi nghiền trộn mẫu.

3.4.1 Chuẩn bị mẫu thử

Các sản phẩm lỏng:Dùng pipet lấy 20ml mẫu thử, không có các chất ở dạng huyền phù, pha loãng với khoảng 50ml nước và chuyển vào một phiễu chiết dung tích 500ml(phiễu chiết A)Các sản phẩm lỏng chứa thịt quả : Lấy 20ml mẫu thử cho vào cối và nghiền với 200ml nước. Lọc chất lỏng sau khi gạn. Làm 2 lần liên tiếp, cho bã vào 200ml nước rồi gạn, lọc lấy chất lỏng.Thu toàn bộ dịch lọc trực tiếp vào phiễu chiết dung tích 500ml( phiễu chiết A)Các sản phẩm rắn hoặc đặc : Cân khoảng 10g mẫu thử chính xác đến 0,01g, và dùng 30 – 40ml nước, chuyển mẫu vào bình cầu 250ml. Thêm khoảng 50ml natrihydrocacbonat.Lắc, rồi đặt lên nồi cách thủy, điều chỉnh nhiệt độ 70 – 80 0C và để trong 5 – 30 phút.Lọc phần chứa trong bình cầu và tráng 2 lần bằng nước, mỗi lần dùng 15-20ml.Thu toàn bộ dịch lọc vào phiễu chiết dung tích 500ml(phiễu chiết A).Để cho nguội

3.4.2 Phần mẫu thử

3.4.3 Chiết axit benzoic

Cho 1 g axit tartaric vào phiễu chiết(A) chứa phần mẫu thử đã được pha loãng, thêm 60ml dietyl ete và lắc kĩ. Để cho tách lớp, rồi hứng lớp ete vào phiễu chiết thứ hai dung tích 500ml(phiễu chiết B).Sau đó rửa phần dịch trong phiễu chiết thứ nhất (A) bằng 60ml dietyl ete.Để tách lớp, rồi hứng ete vào phiễu chiết (B) có chứa lớp ete thu được lần thứ nhất.Tiếp tục tương tự lần chiết thứ ba bằng 30ml dietyl ete và dồn lớp ete thu được vào cùng hai lần đầu trong phiễu chiết (B).Chiết axit benzoic từ dung dịch ete bằng cách thêm tiếp 10ml và tiếp 5ml dung dịch natrihydroxit, và sau đó 2 lần,mỗi lần 10ml nước. Sau mỗi lần cho thêm lắc, rồi để cho tách lớp và hứng lấy phần dung dịch.Hứng dịch vào một đĩa.Đặt đĩa lên nồi cách thủy,điều chỉnh nhiệt độ 70-80oC, và để đó cho đến khi thể tích dung dịch kiềm giảm khoảng một nửa,lấy phần dietyl ete đã hòa tan còn sót lại.

3.4.4 Tinh chế axit benzoic

Sau khi để nguội,rót dịch ở đĩa vào một bình cầu dung tích 250ml có chứa hỗn hợp 20ml dung dịch axit sunfuricvà 20ml dung dịch kali dicromat.Đậy nắp bình cầu,lắc và để đó ít nhất 1 giờ

3.4.5 Chiết axit benzoic tinh khiết

Chiết axit benzoic bằng cách xử lí dung dịch trên (3.4)hai lần với 20-25ml dietyl ete, thu lấy dung dịch ete.Rửa dung dịch ete 2 lần bằng một vài mililit nước. Sau khi gạn rất cẩn thận, lọc qua giấy lọc khô và thu dịch lọc vào bình định mức dung tích 50ml.Sau đó rửa giấy lọc bằng một vài mililit dietyl ete, thêm đủ dung môi rửa này vào dịch lọc để pha loãng tới vạch.

3.4.6 Xác định

Dùng máy đo quang phổ, đo độ hấp thụ của dung dịch ete (3.5) liên quan đến độ hấp thụ của dietyl ete tinh khiết ở bước sóng 267,5nm đến 272nm và 276,5nm. Độ hấp thụ do axit benzoic được tính bằng công thức chung đo sự chênh lệch xuất hiện ở bước sóng 272nm

1 32 2

A AA

Trong đó : A1: độ hấp thụ ở 267,5nm                  A2: độ hấp thụ ở 272 nm                  A3:độ hấp thụ ở 276,5nm

3.4.7 Số lần xác định

Tiến hành hai lần xác định trên cùng một mẫu thử

3.4.8 Dựng đường chuẩn

Lấy một loạt 6 bình định mức dung tích 50ml, lần lượt cho vào từng bình  5-7, 5-10, 5-15-20ml dung dịch chuẩn axit benzoic. Pha loãng tới vạch bằng dietyl ete.Các dung dịch thu được chứa tuần tự10-15-20-25-30-40mg axit benzoic/lit.Tiến hành đo sự chênh lêch độ hấp thụ của các dung dịch này theo trình tự được mô tả ở 3.6.Vẽ đường cong biểu thị các lần đo sự chênh lệch liên quan đến số miligam axit benzoic/lit nêu trên

3.5 Xử lí kết quả

2 2

502,5

20m m

Trong đó: m2 là lượng axit benzoic đọc trên đồ thị chuẩn tính bằng miligam

• Phần mẫu thử được lấy bằng cách dùng pipet

Hàm lượng axit benzoic sản phẩm tính bằng miligam/lit theo công thức:

• Phần mẫu thử được lấy bằng cách cân

Hàm lượng axit benzoic tính bằng miligam trên kilogam sản phẩm theo công thức:

21

50m

m

Trong đó: m1- khối lượng của phần mẩu thử (g)                m2- khối lương axit benzoic đọc trên đồ thị chuẩn(mg)

IV : ĐỘC TỐ VI NẤM

4.1 Các phương pháp phân tích:

4.1.1 phân tích aflatoxin

• Phương pháp nhanh sử dụng cột nhồi áp dụng cho sản phẩm rau quả

• Phương pháp sắc kí bản mỏng

• Phương pháp HPLC

4.1.2 Phân tích epoxy-tricotexen:

• Kỹ thuật ROMER, BOLING và Mc DONALD

• Phân tích deoxynivalenol (DON)

4.1.3 Phân tích zearalenon:

• Phương pháp RIA

• Phương pháp ELISA

• Sắc ký ái lực miễn nhiễm

4.3 Thực hành

Xác định hàm lượng aflatoxin

4..3.1 Nguyên tắc:

Aflatoxin được chiết từ mẫu thử  bằng các hệ dung môi hữu cơ khác nhau. Dịch chiết được lọc, một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen (florisil, SPE). Làm bay hơi dung dịch rửa giải và hòa tan cặn với dung môi pha động rồi bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

4.3.2 Hóa chất,thuốc thử

• Tất cả hóa chất đều phải là  loại tinh khiết phân tích sắc ký nếu không có  các chỉ dẫn riêng nào khác.Các chuẩn aflatoxin B1, B2, G1, G2  Metanol, hexan, clorofooc, ete etylic, axetonitric, toluene, natrisunfat khan, celit 545, khí N2 tinh khiết4.3.3 Dụng cụ,thiết bị- HPLC với đầu dò UV - Các loại pipet - Cân phân tích 10-4g - Giấy lọc - Máy li tâm - Xylanh-Bơm hút chân không - Bộ phễu hút chân không - Cột sắc ký thủy tinh

Máy khuấy từ Máy cất quay chân không

Máy nghiền

4.4 Cách tiến hành:Chuẩn bị mẫu:Cân 50g mẫu đã nghiền nhỏ cho vào bình nút mài 500ml. Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 250ml clorofooc, đậy nút chặt. Lắc trong 30 phút bằng máy lắc quay tròn hay máy khuấy từ, rồi lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ 10ml dung dịch lọc tiếp theo. Nếu tốc  đọ dịch lọc xuống chậm, chuyễn sang phễu Buchner chứa một lớp celite 545 dày 5mm trên giấy lọc và dùng hút chân không.Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký:Chuẩn bị cột sắc ký, cho một  ít bôn vào đáy cột sắc ký, them 5g natrisunfat khan. Đổ clorofooc đến 2/3 cột, sau đó cho 10g silicagen lắng đều, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí. Mở khóa cho clorofooc chảy xuống từ từ. Khi tốc độ lắng của silicagen chậm lại, rút hết clorofooc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagen. Thêm từ từ 15g natrisunfat khan, sau đó rút bớt clorofooc đến gần sát lớp natrisunfat khan trên. Trộn 50ml dịch lọc trên với 150ml n-hexan, đỏ cẩn thận vào cột sắc ký đã chuẩn bị như trên, loại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tiếp 150ml ete etylic khan, loại bỏ dung dịch chảy ra, không đẻ cột bị khô, lưu lượng dòng chảy: 8-12ml/phút.Rửa giải aflatoxin bằng 150ml hỗn hợp methanol-clorofooc. Lấy toàn bộ dịch chảy ra, lưu lượng dòng chảy như trên. Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân không cho đến khi chỉ còn khoảng 2-3ml ở nhiệt độ thấp hơn 500C, tốt nhất dưới luồng khí N2 nhẹ. Hòa tan cặn bằng 1ml dung môi pha động và bơm vào HPLC.

4.5 Xử lý kết quả:

So sánh thời gian lưu của mỗi đỉnh so với đỉnh chất chuẩn để định tínhSo sánh chiều cao (h) hoặc diện tích của mỗi pic (Si) với pic chất chuẩn tương ứng (Sm) để tính định lượng.Hàm lượng aflatoxin từng loại trong mẫu (mg/kg) được tính theo công thức:

. ..

i ii

m

S C VX

S m

Trong đó:Si : diện tích pic tương ứng mẫu chất “i”Sm : diện tích pic tương ứng của mẫu chuẩn có chất “i”Ci : nồng đọ chất “i” có trong mẫu chuẩn, mg/mlV : thể tích dịch mẫu cuối cùng, mlm : khối lượng mẫu phân tích