Pharmacologie Moléculaire 2Pharmacologie Moléculaire 2

Magali Waelbroeckmawaelbr@ulb.ac.be

E1.6.207

43 SLIDES 2

But du cours:But du cours:

•Vous permettre de comprendre, au vu des figures dans un article, pourquoi l’expérience a été faite et quelle conclusion on peut en tirer.

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Moyens:Moyens:

•Apprendre à traduire une description (phrase) en modèle (équation stoechiométrique), en déduire les prévisions vérifiables, et en vérifier la validité thermodynamique.

•Chercher vous-mêmes la réponse à quelques questions…

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Outils utilisés dans ce cours:Outils utilisés dans ce cours:

• Programmes:o Graph Pad: utilisation et interprétation des données

expérimentales ou simulées. Commentaires: voir http://www.graphpad.com/index.cfm?cmd=library.index

o Spdbv ou Deep View: visualisation des structures protéiques téléchargées de la Protein Data Bank. Utilisation: voir le “tutorial” de Gale Rhodes http://www.usm.maine.edu/~rhodes/SPVTut/index.html

o Excell: simulation de résultats attendus

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Voici quatre représentations d’une Voici quatre représentations d’une même protéine. Sur lesquelles même protéine. Sur lesquelles

peut on voir:peut on voir:• Le tracé de la chaine polypeptidique?• Les liens Hydrogènes qui stabilisent la structure?• Le volume occupé réellement par la protéine?• Les chaines latérales des acides aminés?• Le type d’acide aminé (Basique, acide,

hdrophobe, polaire)?• La structure primaire? Secondaire? Tertiaire?

Quaternaire?• La position du ou des ligands?

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A B

C D

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Quelles sont les relations Quelles sont les relations entre affinité et cinétiques?entre affinité et cinétiques?

•Définition du terme “affinité”o Qu’est-ce qui permet ou explique une liaison

de forte affinité?•Définition du terme “spécificité”

o Pourquoi dit-on qu’un enzyme, un récepteur, un ligand est très spécifique de…

•Définition du terme “cinétique”o Qu’est-ce qui explique une liaison rapide ou

lente? Une dissociation rapide ou lente?

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Chemin réactionnelR.DR+D

0G

Ener

gie

Libr

e

Thermodynamique:Thermodynamique:

10

/0

00

1.3

ln( ) 1.3log( )D DKcal mol

GGRTK e

G RT K K

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R.DR+D

*offG

Thermodynamique:Thermodynamique:*

*

ou .

ou .

on

off

GRT

on

GRT

off

k k Ae

k k Ae

D-+

D--

=

=

*onG

Chemin réactionnel

Ener

gie

Libr

e

0 * *

off onG G G

* * 0on off

off

on

G G GRT RT

D

Dk

k

K e e

K

D - D D=

=

=

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Collisions:Collisions:Phase aqueuse, T° pièce :Collisions: 1010 M-1sec-1

≈1011M-1min-1

kon typiques: petites molécules:

106-108 M-1min-1

protéine-protéine:105 M-1min-1

Protéines: peu de collisions productives:

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Relations vitesse - affinité?Relations vitesse - affinité?

Hypothèse: association reflète probabilité collisions ligand -récepteuroVitesse association constante,oDissociation lente haute affinité;

dissociation rapide basse affinitéoKD proportionnelle à koff

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Vérification: mesure du kVérification: mesure du konon de de différents couples ligand - différents couples ligand -

récepteursrécepteurskon récepteurs muscariniques,

adrénergiques

0

10

20

30

ligands

k on

(M-1

min

-1)

Trop petits: pas visibles. Échelle log?

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kkonon : comparaison de différents : comparaison de différents ligands, différents récepteursligands, différents récepteurs

kon récepteurs muscariniques,adrénergiques

-2

-1

0

1

2

log

k on

(M-1

min

-1)

3 logs: 1000 x

Conclusion: kon très variable: notre hypothèse était fausse. Pourquoi?

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R β-adrenergique kon (108M-1min-1)

koff (min-1)

pKD t1/2 (min)

(-) pindolol 6.9 0.546 9.10 1.27(+) pindolol 6.6 18.97 7.54 0.4(-)CGP 12177 2.2 0.024 9.97 28.9(+)CGP 12177 4.2 0.57 7.86 0.12(-)ICYP 14.0 0.0025 11.75 277.3(+)ICYP 17.0 0.488 9.54 1.4(-)carazolol 7.4 0.0025 11.47 277(+)carasolol 3.4 0.085 9.6 8.2(-)IHYP 11.0 0.0021 11.72 330(+)IHYP 5.8 0.042 10.14 16.5

Premier indice: comparaison Premier indice: comparaison de la vitesse d’association de la vitesse d’association

d’énantiomèresd’énantiomères

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Muscarinique (M2) kon (108M-1min-1)

koff (min-1)

pKD t1/2 (min)

(R)-QNB 1.0 0.0092 10.0 75(S)-QNB 1.1 0.6 8.3 1.2(R)-Met QNB 2.6 0.11 9.4 6.3(S)-Met QNB 5.8 0.25 9.4 2.8

Muscarinique (M3)

(R)-QNB 0.11 <<0.0009 <<10.0 >>360(S)-QNB 0.10 0.11 8.0 6.3(R)-Met QNB 0.23 0.015 9.2 46(S)-Met QNB 0.50 0.2 8.4 3.5

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Données à expliquer:Données à expliquer:

•kon dépend (un peu) du ligand,•kon dépend (beaucoup) du récepteur,•kon presque identique si énantiomères,•koff détermine l’affinité relative des

énantiomères…

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Kinetic Tuning of the EF-Hand Calcium Binding Motif: The Gateway Residue Independently Adjusts (i) Barrier Height and (ii) Equilibrium  

Steven K. Drake and Joseph J. Falke*

Department of Chemistry and Biochemistry, University of Colorado, Boulder, Colorado 80309-0215

Biochemistry, 35 (6), 1753 -1760, 1996.  

Abstract:In EF-hand calcium binding sites of known structure, the side chain provided by the ninth EF-loop position lies at the entrance of the shortest pathway connecting the metal binding cavity to solvent. The location of this residue suggests that it could serve as a "gateway", providing steric and electrostatic control over the kinetics of Ca2+ binding and dissociation.

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Galactose Binding Protein:Galactose Binding Protein:

Galactose

Ca2+

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Galactose binding protein: E-F Hand (« main E-F »)

Ca+2

Asp

Asp

Asn

Asn

Lys (groupe C=O chaine

polypeptidique)

Ca+2

« pouce »« index »

« paume »

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To test this hypothesis, the present study has engineered the putative gateway side chain of a model EF-hand site and determined the resulting effects on metal ion affinity and dissociation kinetics. The model site chosen was that of the Escherichia coli galactose binding protein (GBP), in which the putative gateway is a Gln side chain.

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Calcium binding E-F Hand (gate closed)

Calcium binding E-F Hand (gate open)

Gln « gate keeper »

« Gate »

Gln « gate keeper »

« Gate »

Galactose binding protein: Calcium binding site

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Two control substitutions at the fourth EF-loop position, a noncoordinating surface residue, had no significant effect on either the equilibrium or the kinetics of the model site. The remaining seven proteins, which possessed unique substitutions at the ninth EF-loop position (Glu, Asn, Asp, Thr, Ser, Gly, Ala), in each case significantly altered the affinity or dissociation kinetics of the site for Tb3+, used as a probe metal ion.

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1 Einstein = 1 mol de photons1 kcal = 4,1868 kJ

Fluorescence? Lumière = Fluorescence? Lumière = Énergie:Énergie:

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Rappel: orbitales liantes et Rappel: orbitales liantes et antiliantesantiliantes“liantes” “antiliantes”

( ou )

2s 2s*2

2*

1p 1p*1

1*

Ener

gie

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Fluorescence, phosphorescenceFluorescence, phosphorescence

•Fluorescence: réémission de lumière immédiate;

•Phosphorescence: isomérisation du spin des e-: réémission lente.

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FRETFRET

L’énergie dégagée par le donneur est absorbée directement par l’accepteur, puis réémise sous forme de photons de plus longue λ

λ (nm)

Excitation - - - - Emission ________

Donneur Accepteur

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3 Tryptophanes (accepteurs)(fluorescents)à 10-20 Å du Tb3+

Terbium (donneur)phosphorescent

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“GATE”: KD (µM) koff

(sec-1)kon

(µM-1sec-1)Glutamate: -CH2-CH2-COO-

0.06 0.0002 0.003

Aspartate:-CH2-COO-

0.13 0.0019 0.014

Glutamine-(wt)

-CH2-CH2-CONH2

2.00 0.0064 0.003

Serine: -CH2OH

0.80 0.6500 0.810

Threonine: -CHOH-CH3

2.30 0.9100 0.400

Asparagine:-CH2-CONH2

1.90 1.0200 0.540

Glycine:-H

1.40 2.0000 1.430

Alanine:-CH3

2.80 3.7900 1.350

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Ca2+ + EF-hand EF-hand-Ca2+

N,G,A

S,T

Q

Chemin réactionnel Chemin réactionnel

Ca2+ + EF-hand EF-hand-Ca2+

D

D

Liaison

association

Q

Q

dissociation

E

E

Ener

gie

Libre

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Comment pourrait-on traduire par Comment pourrait-on traduire par un modèle stoechiométrique les un modèle stoechiométrique les

expressions suivantes?expressions suivantes?• Le ligand reconnaît le récepteur.• L’agoniste reconnaît le récepteur, qui s’active (laisse

passer les ions Na+, Ca2+, ou Cl- )• Les benzodiazépines reconnaissent un site accessoire

sur le récepteur du GABA, facilitent la reconnaissance de ce dernier, et permettent l’ouverture du canal Cl-

• L’agoniste reconnaît le récepteur, qui recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité.o Pourrait-il favoriser la formation d’un complexe de basse

affinité?o Ensuite, le récepteur est reconnu par l’arrestine et internalisé.

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Rappel: Liaison à un site:Rappel: Liaison à un site:

* *offkL R L R

Peut-être suivie immédiatement par sa re-dissociation:

L’association du radioligand : * *onkL R L R

* *on

off

kk

L R L R

A l’équilibre, les deux réactions se compensent exactement :

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Cinétique de dissociation:Cinétique de dissociation:

•Beaucoup plus simple à étudier: une seule réaction doit être considérée:

offkB R F

0off

off

k t

dB k BdtB B e

0 60 120 180 240

1

0

1

2

Time (min)

log

(B)

-koff

0 60 120 180 2400

50

100

Time (min)

% In

itial

Bin

ding

Sur une échelle log:Sur une échelle linéaire:

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Cinétique d’association (1):Cinétique d’association (1):

( ) ( ) ( )( ) ( ) ( ) on off

d B d R d F k R F k Bd t d t d t

=- =- = ´ -

La réaction d’association:

Integration difficile puisque R, F et B varient simultanément:

0 0on off on on off

d Bk R B F k B k R F k F k B

dt

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• Il est plus facile de calculer la vitesse de diminution de R en F constant:

• R disparaît donc avec une constante de vitesse apparente: kobs=konF+koff

Cinétique d’association : (2)Cinétique d’association : (2)

( )( )

( )( ) on off

on off

off on off

d R k R F k Bd t

k R F k R R

k R k F k R

=- ´ +

=- ´ + -

= - + ´0

0

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Cinétique d’association : (3)Cinétique d’association : (3)

•Que se pase-t-il si la [Traceur] augmente?

Liaison du (-)carazolol

0 25 50 75 1000

25

50

75

100

125 1.0 nM (-)carazolol10 nM (-)carazolol

0.1 nM (-)carazolol

Temps (minutes)

% s

ites

occu

pés

43 SLIDES 36

ln e

e t

BB B

ì üï ïï ïí ýï ï-ï ïî þ

0 50 100 150 200 250 3000

1

2

3

Time (min)

( )obs on offk k F k= ´ +

Cinétique d’association : (4)Cinétique d’association : (4)linéarisationlinéarisation

43 SLIDES 37

Cinétique d’association : (5)Cinétique d’association : (5)évaluation de kévaluation de konon, k, koffoff

• La “constante de vitesse d’association” apparente, kobs, augmente proportionnellement à F

0 100 200 3000

0.02

0.04

F (nM)

koff

kon

obsk

43 SLIDES 38

Que se passe-t-il si deux ligands Que se passe-t-il si deux ligands entrent en compétition pour le entrent en compétition pour le

récepteur?récepteur?1

1

2 2

k

kR A RA

L

k k

RL

43 SLIDES 39

0 25 50 75 1000

25

50

75

100

125

Temps (minutes)

% s

ites

occu

pés

Cinétique de liaison: traceur lent Cinétique de liaison: traceur lent et compétiteur rapideet compétiteur rapide

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Liaison du (-)carazolol*en présence de (+) carazolol

0 25 50 75 1000

25

50

75

100

125

+ 1.0 nM (+)carazolol+10 nM (+)carazolol

+ 0 nM (+)carazolol

Temps (minutes)

% s

ites

occu

pés

0 100 200 300 400 500 600 70010

100

Temps (minutes)

%Li

aiso

n ré

sidu

elle

Cinétique de liaison: deux Cinétique de liaison: deux énantiomères: traceur lent et énantiomères: traceur lent et

compétiteur très rapidecompétiteur très rapide

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Liaison du (+)carazolol*en présence de (-) carazolol

0 25 50 75 1000

10

20

30

0 (-)carazolol0.1nM (-)carazolol1.0 nM (-)carazolol

Temps (minutes)

% s

ites

occu

pés

0 100 200 300 400 500 600 70010

100

Temps (minutes)

%Li

aiso

n ré

sidu

elle

Cinétique de liaison: traceur très Cinétique de liaison: traceur très rapide et compétiteur lentrapide et compétiteur lent

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Liaison du (+/-)carazolol

0 25 50 75 100 125 1500

25

50

75

100

125

Temps (minutes)

% s

ites

occu

pés

0 100 200 300 400 500 600 70010

100

Temps (minutes)

log(

%Li

aiso

n ré

sidu

elle

)

1.0 nM carazolol10 nM carazolol

0.1 nM carazolol

Cinétique de liaison: traceur Cinétique de liaison: traceur racémiqueracémique

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Le complexe Agoniste-Récepteur recrute une Le complexe Agoniste-Récepteur recrute une protéine G pour former un complexe de haute protéine G pour former un complexe de haute

affinité.affinité.Ensuite,Ensuite, le récepteur est reconnu par le récepteur est reconnu par

l’arrestine et internalisé. l’arrestine et internalisé. 1

1

2 2

k

kAgoR G AgoRG

Arrestine

k k

AgoRArrestine

Il suffit que k-2 soit <<k-1…