Upload
grzegorz-kiebowicz-phd
View
545
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Zastosowanie Hydrolizy Enzymatycznej do Ustalania Struktury Naturalnych Fosfolipidów
Grzegorz KiełbowiczPraca doktorska wykonana
w Katedrze Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiupod kierunkiem prof. dr. hab. Czesława Wawrzeńczyka
Cele pracy
1.05.2023 2Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Opracowanie metod izolowania fosfolipidów o wysokiej czystości z żółtka jaja kurzego oraz
pełna analiza frakcji lipidowej żółtka, ze szczególnym uwzględnieniem fosfolipidów.
Plan prezentacji
1.05.2023 3Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Analiza frakcji
lipidowej
Analiza pozycyjna
fosfolipidów
Migracja reszt
acylowych
IzolowaniefosfolipidówWstęp
Lipidy – ogólna definicja
1.05.2023 4Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Grupa związków organicznych nierozpuszczalnych w wodzie, ale rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych m.in. takich jak chloroform, eter, toluen
1.05.2023 5Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Kwasy tłuszczowe i ich pochodne
PrenoleSacharolipidy Poliketydy
Klasyfikacja lipidów
Lipidy – ogólna definicja
1.05.2023 6Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Kwasy tłuszczowe i ich pochodne
GlicerolipidyGlicerofosfolipidy
Prenole
Sfingolipidy SteroidySacharolipidy Poliketydy
Lipidy
Klasyfikacja lipidów
„Cegiełki budulcowe” lipidów
1.05.2023 7Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Ketoacylowe Izoprenowa
LIPIDY – hydrofobowe lub amfifilowe cząsteczki otrzymane w całości lub częściowo poprzez kondensację karboanionu ketoacylotioestrów lub poprzez karbokationową kondensację jednostek izoprenowych
„Cegiełki budulcowe” lipidów
1.05.2023 8Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Ketoacylowe Izoprenowa
GlicerolipidyGlicerofosfolipidy
SfingolipidySacharolipidy
Poliketydy
SteroidyPrenole
Glicerofosfolipidy
1.05.2023 9Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Fosfatydylocholina (PC) Fosfatydyloetanoloamina (PE) Fosfatydyloseryna (PS)
Fosfatydyloinozytol (PI)Fosfatydyloglicerol (PG)
Difosfatydyloglicerol (DPG, kardiolipin) Kwas fosfatydowy (PA)
O
O
O
O
O
R2
R1
P
O
O-
O X
Sfingolipidy
1.05.2023 10Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
CH3OH
NH2
OH
Sfingozyna
CH3O
NH
OH
PO
O
O-
N+
CH3
CH3
CH3
R
O
Sfingomielina (SM)
Ceramidy Glikosfingolipidy
Sfingomieliny należą do fosfolipidów !!!
Fosfolipidy
1.05.2023 11Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Polarna „głowa”Kwas fosforowy (V)Gliceryna
Kwasy tłuszczowe
Część hydrofilowa
Część hydrofobowa
Micele Liposomy Dwuwarstwa fosfolipidowa
Amfifilowość
Fosfolipidy - funkcje biologiczne
1.05.2023 12Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
1. Zapewniają strukturalną integralność i funkcjonalność błon biologicznych
2. Funkcje sygnałowe (m.in. produkty hydrolizy fosfatydyloinozytoli)
3. Zapasowy materiał energetyczny
Źródła fosfolipidów
1.05.2023 13Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
LECYTYNA (E322): złożona mieszanina
Fosfolipidów (49%)Triacylogliceroli (39%)
Glikolipidów (5%)Cukrów (4%)
Steroli i tokoferoli (3%)
Zastosowanie fosfolipidów
1.05.2023 14Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Przemysł spożywczy
emulgatory
nawilżanie
nośniki leków
Przemysł kosmetyczny
Przemysł farmaceutyczny
proleki
czynniki przeciwrozpryskowe
nośniki związków aktywnych
suplementy diety
Plan prezentacji
1.05.2023 15Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Analiza pozycyjna
fosfolipidów
Migracja reszt
acylowych
Izolowaniefosfolipidów
Analiza frakcji
lipidowejWstęp
Ekstrakcja lipidów
1.05.2023 16Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Folch (1957 r.) Bligh-Dyer (1958 r.) Radin (1981 r.)
chloroform : metanol(2:1 v/v)
modyfikacje metody Folcha heksan : izopropanol (3:2 v/v)
Podstawowe etapy :
ekstrakcja z matrycy
usunięcie nielipidowych zanieczyszczeń
rozdział lipidów na grupy
Żółtko jaja kurzego
1.05.2023 17Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
50%
32%
16%2%
Woda Lipidy Białka Inne
LDL
Granule
Cholesterol
Fosfolipidy
Apo-proteina
Triacyloglicerole
HDL lub lipowitelina
Foswityna
Lipidy silnie związane z matrycą •błony•kompleksy białkowo-lipidowe
Ekstrakcja metodą Folcha
1.05.2023 18Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Woda z próbki + 0.05M NaCl
Metanol
Chloroform
3
4
8
1 g 20 ml CHCl3:MeOH (2:1)
chloroform
Ekstrakcja metodą Folcha
1.05.2023 19Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
40%
60%
Lipidy kwasowe NaCl:woda:metanol
chloroform
1. Lipidy kwasowe w postaci soli Na, K, Mg, Ca.2. NaCl powoduje cofnięcie procesu dysocjacji oraz transfer
lipidów kwasowych do dolnej niepolarnej fazy układu
Analiza lipidów za pomocą HPLC
1.05.2023 20Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Zróżnicowane właściwości fizyko-chemiczne
Niestabilność (migracja reszt acylowy)
Technika detekcji (brak grup
chromoforowych)
Różnorodność strukturalna (około 8000 struktur fosfolipidów)
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 21
Układ faz a podział lipidów
Faza stacjonarna
Faza ruchoma
C18 Diol Krzemionka niemodyfikowana
woda izopropanol heksanacetonitryl metanol woda
NPRP HILIC
Podział klas fosfolipidów
Podziałze względu
na skład reszt acylowych
Detektor Corona CAD
1.05.2023 22Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
http://coronacad.com
• Odpowiedź niezależna od budowy chemicznej związku• Wykrywanie substancji o prężności par < 10-5hPa
Detektor: CORONA™ Charge Aerosol Detector Kolumna: Waters Spherisorb® S5 W 5µm (150 x 4.6 mm) Temperatura kolumny: 30°C
Analiza frakcji lipidowej za pomocą HPLC Metoda 1
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 24
Woda a polarna faza stacjonarna
Niestabilność linii podstawowej
„Krwawienie”kolumny
Niecałkowite odparowywanie rozpuszczalnika
w detektorze
Długi czas stabilizacji fazy stacjonarnej
Silna adsorpcja wody
Adsorpcja wody jest wyższa gdy stosunek wody do rozpuszczalnika organicznego maleje
?Metoda 1
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 25
Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) Metoda 2
Odzysk:
10 – 2,5 mg wzorca
Cholesterol 97,8 – 99,9% Tripalmitynian 95,5 – 100,1%
%RSD < 3,52
100 – 10 mg próbki
PE 62,6 – 80,1%PC 35,8 – 51,4%
SM 41,3 – 57,8%
%RSD < 5,97
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 26
?
Analiza fosfolipidów za pomocą HPLC Metoda 2
Poprawa geometrii piku
Zmiana właściwości aerozolu I°(np. zmiana napięcia powierzchniowego)
Zmiana właściwości aerozolu III°(np. zmiana kształtu cząstek)
„Wzmacniacze” masy
Szybsze kondycjonowanie kolumny
Kolumna: Waters Spherisorb® S5W 5 µm (150 x 4,6 mm)Eluent: A: bufor (1% HCOOH, 0,1% TEA), B: izopropanol, C: heksanDetektor: Corona CAD
HCOOH TEA
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 27
Przykładowy chromatogram Metoda 2
Frakcje LPC uzyskane za pomocą chromatografii kolumnowej
LPC, SM, LPE podział na
submolekularne pochodne różniące się składem kwasów tłuszczowych
Elucja fosfolipidów przy stężeniu wody > 8%
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 28
Walidacja - model odpowiedzi, liniowość Metoda 2
Liniowosć (wg ICH) - to przedział zakresu pomiarowego, w którym wyniki danego testu (sygnał wyjściowy) są proporcjonalne do stężenia (ilości) danego analitu
sygnał wyjściowy
ilość
R2 > 0,999b – mniejsze niż kilka procent z odpowiedzi uzyskanej dla docelowej ilości analitu
Kryteria akceptacji dla testu liniowości:
Liniowość nie jest warunkiem koniecznym !!!
Minimum5 stężeń x 3 powtórzenia
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 29
y = axb vs y = ax + b Metoda 2
Model potęgowy lepiej opisuje odpowiedź detektora CAD
PLs Zakres (µg) Model potęgowy(y=axb)
Model liniowy(y=bx+a)
Równanie R2 AICCRównanie R2 AICC
PE 0,03-1,05 54,661(±0,27)x0,966(±0,01) 0,9998 -47,174 54,510 (±0,39)x+0,389(±0,17) 0,9996 -30,138
LPE 0,03-1,42 62,466(±0,14)x0,976(±0,01) 0,9943 41,709 62,409 (±0,51)x-0,092(±0,18) 0,9941 42,481
PC 0,03-1,44 37,067(±0,69)x0,968 (±0,02) 0,9989 -14,166 36,572(±0,59)x+0,363(±0,21) 0,9987 -10,826
LPC 0,03-1,28 38,098(±0,51)x0,873 (±0,04) 0,9947 13,077 36,477 (±1,38)x+1,499(±0,60) 0,9916 22,995
SM 0,03-1,33 65,444(±1,06)x0,922(±0,01) 0,9982 14,795 63,694(±0,93)x+1,533(±0,69) 0,9970 25,959
AICC - skorygowane kryterium informacyjne Akaikiego\R2 - współczynnik korelacji
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 30
S, LOD, LOQ Metoda 2
Funkcja liniowa(y = ax + b)
S = aCzułość niezależna od stężenia
Czułość (S)
Funkcja potęgowa(y = axb)
S = dy/dx = abxb-1
Czułość zmienia się wraz ze stężeniem
Czułość (S)
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 31
S, LOD, LOQ Metoda 2
Związek S (mV/µg) LOD (ng) LOQ (ng)
PE 59,8 14,9 45,3
LPE 66,0 6,9 21,0
PC 39,9 57,4 174,0
LPC 51,5 32,7 99,0
SM 65,8 53,3 161,4
S = abxb-1
LOD = 3,3 x σ/S LOQ = 10 x σ/S
Precyzja Metoda 2
Związek Ilość(µg)
Powierzchnia piku(mV/min)
Czas retencji(min)
Średnia SD RSD% Średnia SD RSD%
PE 0,16 9,172 0,161 1,757 7,587 0,020 0,263
LPE 0,21 8,898 0,181 2,090 9,655 0,010 0,159
PC 0,22 8,367 0,681 8,09 11,228 0,020 0,161
LPC 0,19 8,936 0,675 7,554 15,078 0,095 0,630
SM 0,20 14,557 0,967 6,647 11,727 0,024 0,216
Precyzja metody analitycznej jest to stopień zgodności pomiędzy pojedynczymi wynikami analizy, gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtarzanych niezależnych oznaczeń jednorodnej próbki.
Elucja przy wysokim stężeniu wody
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 33
Analiza fosfolipidów za pomocą HPLC Metoda 2
Kolumna: Thermo Betasil Diol 5 µm (150 x 4,6 mm)Eluent: A: bufor (1% HCOOH, 0,1% TEA), B: izopropanol, C: heksanDetektor: Corona CAD
Kolumna diolowa
Cel: poprawa precyzji procesu
Przepływ 1,5 ml/min
Krótszy czas analizy
Pojedyncze piki
Stabilność w wodnej fazie ruchomej
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 34
Analiza fosfolipidów za pomocą HPLC Metoda 2
Związek Ilość(µg)
Powierzchnia piku(mV/min)
Czas retencji(min)
Średnia SD RSD% Średnia SD RSD%PE 0,16 9,172 0,161 1,757 7,587 0,020 0,263LPE 0,21 8,898 0,181 2,090 9,655 0,010 0,159PC 0,22 8,367 0,681 8,09 11,228 0,020 0,161LPC 0,19 8,936 0,675 7,554 15,078 0,095 0,630SM 0,20 14,557 0,967 6,647 11,727 0,024 0,216
Związek Ilość(µg)
Powierzchnia piku(mV/min)
Czas retencji(min)
Średnia SD RSD% Średnia SD RSD%PE 0,25 7,802 0,067 0,854 3,821 0,022 0,566LPE 0,43 17,822 0,097 0,546 5,399 0,031 0,582PC 0,39 16,736 0,250 1,497 6,682 0,032 0,477LPC 0,32 12,151 0,191 1,573 7,920 0,025 0,315SM 0,29 12,926 0,077 0,596 7,080 0,019 0,276
Kolumnaz niemodyfikowaną
krzemionką
Kolumnadiolowa
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 35
Analiza lipidów niepolarnych za pomocą HPLC Metoda 2
Kolumna: Thermo Betasil Diol 5 µm (150 x 4,6 mm)Eluent: B: izopropanol, C: heksan (10:90 v/v)Detektor: Corona CAD
Związek S (mV/µg) (abxb-1)
LOD (ng)(3,3 x σ/S)
LOQ (ng)(10 x σ/S)
TriPal 51,3 35,7 108,1
Chol 62,9 102,3 310,0
Lut 55,0 5,4 16,5
Związek Ilość(µg)
Powierzchnia piku(mV/min)
Czas retencji(min)
Średnia SD RSD% Średnia SD RSD%
TriPal 0,38 17,694 0,139 0,790 1,958 0,019 0,962
Chol 0,18 11,988 0,040 0,346 3,026 0,031 0,927
Lut 0,28 15,394 0,052 0,341 5,157 0,068 1,329
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 36
Profil lipidowy żółtka jaja kurzego Metoda 2
% SD %RSD
Lipidya 30,57 0,45 1,47
Lipidy niepolarneb 48,06 0,85 1,77
Triacyloglicerole 44,0 1,03 2,27
Cholesterol 4,06 0,31 7,39
Luteina - - -
Lipidy polarneb 51,94 0,85 1,64
Fosfatydyloetanoloamina (PE) 6,50 0,18 2,78
Lizofosfatydyloetanoloamina (LPE) - - -
Fosfatydylocholina (PC) 43,78 0,66 1,52
Lizofosfatydylocholina (LPC) 0,79 0,06 7,24
Sfingomielina (SM) 0,93 0,02 2,59 a w odniesieniu do masy surowego żółtka; b w odniesieniu do całkowitej zawartości lipidów
Mleko
1.05.2023 37Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
84,8%
3,7% 3,4% 2,8%4,6% 0,7%
Woda Tłuszcz Białka KazeinaLaktoza Inne
MFGM
Niewielka zawartość fosfolipidów (około 0,8% frakcji lipidowej) !!!!
Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)
1.05.2023 38Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
PS PE PI PC SM
Bezpośre
dnia
analiza
Średnia 10,81 68,21 7,98 50,56 28,25
SD 0,50 0,91 0,42 0,46 1,12
%RSD 4,60 1,34 5,23 0,91 3,98
Oczyszcz
anie za
pomocą
SPE
Średnia 10,30 66,37 8,19 50,83 28,19
SD 0,34 0,87 0,30 1,07 0,77
%RSD 3,26 1,30 3,71 2,10 2,74
Odzysk 95,3% 97,3% 102,6% 100,5% 99,8%
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 39
Fosfolipidy z mleka – analiza HPLC
Metoda stosowana do oznaczania fosfolipidów w żółtku jaja kurzego
Fosfolipidy syntetyczne
Niemodyfikowana krzemionka
Zamiana wody na 13% HCOOH
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 40
Fosfolipidy z mleka – analiza HPLC
Wpływ temperatury na stabilność linii podstawowej
Wpływ zmiany przepływu eluentu oraz dodatku HCOOH
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 41
Fosfolipidy z mleka – analiza HPLC
Potęgowy model odpowiedziLOD: 4,4 – 20,7 ngLOQ: 13,4 – 62,6 ngPrecyzja (%RSD): Pole powierzchni: 0,27 – 0,61 Czas retencji: 0,13 – 0,77
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 42
Fosfolipidy z mleka – analiza HPLC
Próbka 1 2 3 4
Średnia SD %RSD Średnia SD %RSD Średnia SD %RSD Średnia SD %RSD
PLs (mg/100ml
mleka24.35 1.00 4.11 22.74 0.67 2.95 25.04 1.97 7.87 31.34 0.94 2.97
PS (%)a 8.60 0.20 2.32 8.19 0.30 3.66 8.46 0.73 8.63 8.06 0.61 7.87
PE (%)a 34.19 0.37 1.08 29.93 1.89 6.31 32.99 0.93 2.82 33.41 0.61 1.82
PI (%)a 7.69 0.35 4.55 11.49 0.52 4.52 7.91 0.07 0.88 10.28 0.21 2.04
PC (%)a 45.46 0.32 0.70 46.36 1.51 3.26 46.17 1.15 2.49 43.19 0.64 1.48
SM (%)a 4.06 0.48 11.82 4.02 0.28 6.96 4.46 0.05 1.12 5.06 0.13 2.57
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 43
Analiza kwasów tłuszczowych - SPE
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 44
Analiza kwasów tłuszczowych - SPE
Frakcjalipidowa
(mg)
Frakcja lipidówniepolarnychb
(mg)SD %RSD PC (mg) SD %RSD PE (mg) SD %RSD
Odzyskcałkowitylipidów
(%)
SD %RSD
50 23,30(46,67%)a
1,15 4,95 10,1(22,20%)a
0,17 1,71 2,03(4,07%)a
0,06 2,84 70,9 2,39 3,36
100 44,00(44,00%)a
1,73 3,94 15,67(15,67%)a
0,58 3,68 4,83(4,83%)a
0,29 5,97 64,5 2,29 3,55
a procentowy udział poszczególnych grup lipidów uzyskanych za pomocą SPE w stosunku do całkowitej ilości wyjściowej frakcji lipidowej
b cholesterol oraz triacyloglicerole
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 45
Analiza kwasów tłuszczowych- detekcja
1. Chromatografia gazowa(GC) Derywatyzacja !!!• FID – najczęściej stosowany detektor
2. Chromatografia cieczowa (LC)• UV Derywatyzacja !!!
• Detektory aerozolowe (ELSD, CAD, CNLSD)• Spektrometry mas• Detektor refraktometryczny (RI)• Detektory elektrochemiczne (ECD) …
np. estry metylowe
grupy chromoforowe
Derywatyzacja
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 46
Analiza kwasów tłuszczowych- detekcja
DERYWATYZACJA
Skomplikowaneprocedury
Pracochłonność Czasochłonność
Utlenianie
Izomeryzacja
Zużycie rozpuszczalnikówi odczynników
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 47
Równoważnik długości łańcucha (ECL)
wyższa wartość ECL = wyższa siła retencji
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Liniowa zależność między logk a ilością atomów węgla w łańcuchu
48
Równoważnik długości łańcucha (ECL)
ECL=(logk-b)/a
Jak wyznaczyć „rzeczywistą” wartość współczynnika ECL kwasów nienasyconych ?
13 14 15 16 17 18 19 20 210
0.5
1
1.5
2
2.5 MeOH 90%/30st.CLinear (MeOH 90%/30st.C)ACN 90%/30st.CLinear (ACN 90%/30st.C)MeOH 80%/30st.CLinear (MeOH 80%/30st.C)ACN 80%/30st.CLinear (ACN 80%/30st.C)MeOH 90%/10st.CLinear (MeOH 90%/10st.C)ACN 90%/10st.CLinear (ACN 90%/10st.C)
Ilosć węgli
log
k
a – współczynnik kierunkowyb – wyraz wolny
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 49
Kwas tłuszczowy Teoretyczny współczynnik ECL ECL wyznaczony doświadczalnie
Dokozaheksaenowy 22:6 (DHA) 10 13,3
Eikozapentaenowy 20:5 (EPA) 10 12,8
Linolenowy 18:3 12 13,2
Arachidonowy 20:4 12 14,0
Mirystynowy 14:0 14 14,0
Palmitooleinowy 16:1 14 14,0
Linolowy18:2 14 14,5
Palmitynowy 16:0 16 16,0
Oleinowy 18:1 16 15,9
Stearynowy 18:0 18 18,0
Równoważnik długości łańcucha (ECL)
Wielonienasycone kwasy tłuszczowe z trzema lub więcej wiązaniami podwójnymi nie podlegają zasadzie ECL
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 50
75 80 85 900
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
14:0
16:0
16:1
18:1
18:2
18:3
20:4
DHA
EPA
% MeOH
log
k
70 75 80 85 90 95-0.2
-1.66533453693773E-16
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
14:00
16:00
16:01
18:01
18:02
18:03
20:04
DHA
EPA
% ACN
log
k
Wpływ rozpuszczalnika organicznego (1)
Wzrost ilości rozpuszczalnika organicznego powodując liniowe obniżanie wartości współczynnika retencji
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 51
Wpływ rozpuszczalnika organicznego (2)
alog k = a(%ACN) + balog k = a(%MeOH) + b
Kwas tłuszczowyWartości
przecięcia osi rzędnych (b)a
Współczynnik kierunkowy prostej (a)a
Stosunek współczynnika k
dla 80% i 90% ACN
14:0 3,01 -0,0295 1,92
16:0 3,69 -0,0342 2,16
16:1 3,22 -0,0319 2,06
18:0 4,60 -0,0415 2,44
18:1 3,85 -0,0363 2,29
18:2 3,46 -0,0343 2,19
18:3 2,98 -0,0306 2,01
20:0 5,09 -0,0439 2,82
20:4 3,47 -0,0356 2,28
20:5 2,99 -0,0316 2,09
22:6 3,34 -0,0350 2,22
Kwas tłuszczowyWartości
przecięcia osi rzędnych (b)a
Współczynnik kierunkowy prostej (a)a
Stosunek współczynnika k
dla 80% i 90% MeOH
14:0 1,69 -0,3271 4,96
16:0 2,11 -0,3611 5,71
16:1 1,77 -0,3411 5,14
18:0 2,54 -0,4100 7,79
18:1 2,16 -0,3722 6,04
18:2 1,94 -0,3670 5,70
18:3 1,65 -0,3224 5,32
20:0 2,96 -0,4551 8,99
20:4 1,86 -0,3584 5,99
20:5 1,61 -0,3181 5,29
22:6 1,83 -0,3517 5,70
Wraz ze wzrostem siły elucji fazy ruchomej, czas retencji dla kwasów o niższej hydrofobowości będzie malał znacznie szybciej
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 52
75 80 85 90 9513
14
15
16
17
16:0118:118:0218:0320:04DHAEPA
MeOH (%)
ECL
70 75 80 85 90 9511
12
13
14
15
16
17
16:01
18:01
18:02
18:03
20:04
DHA
EPA
ACN (%)
ECL
Wpływ rozpuszczalnika organicznego (3)
Wartości ECL oraz rozdzielczość dla kwasów nienasyconych wzrastają wraz ze zmniejszaniem się ilości rozpuszczalnika organicznego
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 53
Wpływ temperatury – równanie Van’t Hoffa (1)
lnk = - ∆H/RT + ∆S/R + ln 𝛷
współczynnik retencji
zmiana entalpii procesu chromatograficznego
zmiana entalpii procesu chromatograficznego
stała gazowatemperatura bezwzględna
objętościowy stosunekpomiędzy fazą ruchomą i stacjonarną
Liniowy przebieg zależności lnk od odwrotności temperatury bezwzględnej świadczy o stałym machanizmie retencji w zakresie badanych temperatur.
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 54
0.00315 0.0032 0.00325 0.0033 0.00335 0.0034 0.00345 0.0035 0.00355 0.00360
0.5
1
1.5
2
2.5
3
1/T (K-1)
ln k
0.00310 0.00320 0.00330 0.00340 0.00350 0.003600
0.5
11.5
22.5
33.5
44.5
14:0016:0016:0118:0018:0118:0218:0320:0020:04EPADHA
1/T (K-1)
ln k
ACN:H2O 90:10MeOH:H2O 90:10
Wpływ temperatury – równanie Van’t Hoffa (2)
Wysoka liniowość w zakresie temperatur od 10 do 40°C (R2>0,99) świadczy o tym, iż ∆H i ∆S są zasadniczo niezależne od temperatury w stosowanym zakresie
25°C – „przejście fazowe” fazy stałej z formy przypominającej ciecz do formy bardziej uporządkowanej (struktura szczotkowa)
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 55
10 15 20 25 30 35 4013
14
15
16
17
Temperature (°C)
ECL
10 15 20 25 30 35 4011
12
13
14
15
16
16:0118:0118:0218:0320:04EPADHA
Temperature (°C)
ECL
MeOH ACN
Wpływ temperatury – równanie Van’t Hoffa (3)
Spadek wartości ECL wraz z obniżaniem temperatury
25°C – optymalna temperatura – ciśnienie wsteczne kolumny vs rozdzielczość pików
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 56
„Programowanie” metody
Detektor: Corona™ CAD™Columna: Thermo Betasil C18
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 57
Profil kwasów tłuszczowych lipidów żółtka jaja kurzego
FA TAG (%)
SD %RSD PE (%)
SD %RSD PC (%)
SD %RSD
Kwas mirystynowy(14:0) 0,45 0,02 4,44 - - - - - -
Kwas eikozapentaenowy (EPA) (20:5) - - - - - - - - -
Kwas linolenowy(18:3) 1,02 0,04 3,72 - - - - - -
Kwas dokozaheksaenowy
(DHA)(22:6)0,1 0,01 5,97 6,96 0,17 2,44 2,24 0,14 6,37
Kwas palmitynowy(16:1) 5,98 0,02 0,35 - - - 1,2 0,09 7,26
Kwas arachidonowy(20:4) 0,38 0,01 2,63 14,86 0,08 1,24 5,13 0,14 2,83
Kwas linolowy(18:2) 17,43 0,20 1,16 14,2 0,19 1,34 15,4 0,04 0,23
Kwas palmitynowy(16:0) 24,09 0,13 0,52 17,52 0,66 3,75 33,64 0,43 1,27
Kwas oleinowy(18:1) 46,24 0,15 0,32 18,37 0,68 3,69 27,14 0,80 2,96
Kwas stearynowy(18:0) 4,31 0,16 3,62 27,82 1,52 5,47 15,25 0,39 2,59
Plan prezentacji
1.05.2023 58Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Migracja reszt
acylowych
IzolowaniefosfolipidówWstęp
Analiza pozycyjna
fosfolipidów
Analiza frakcji
lipidowej
Hydroliza enzymatyczna fosfolipidów
1.05.2023 59Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
C (CH2)16CH2
CH
CH2
O
O
OCCH(CH2)7
O
O
P
O
O
O CH2
CH3
CH2 N+
CH3
CH3
CH3
CH3(CH2)7CH
sn-1 sn-3sn-2
Fosfolipaza A2
Lipazy sn-1,3-specyficzneFosfolipaza A1 Fosfolipaza D
Fosfolipaza C
Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 1)
O
O
O
O
O
R2
R1
P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
PLA2Lipaza lub PLA1
OH
O
O
O
R1
P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
O
OH
O
O
R2
P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
sn-1sn-2
Hydroliza chemiczna
Kwasy tłuszczowe z sn-2 Kwasy tłuszczowe z sn-1
GC/HPLC
O
O
O
O
O
R2
R1
P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
Lipaza, 95% EtOH
O
OH
O
O
R2
P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
sn-1sn-2
GC/HPLC
O
OH
R1
Ekstrakcja woda/heksan !!!
Hydroliza chemiczna
Kwasy tłuszczowe z sn-2 Kwasy tłuszczowe z sn-1
Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 2)
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 62
Przykładowe wyniki analizy pozycyjnej fosfatydylocholiny z żółtka jaja kurzego (Zielononóżka kuropatwiana)
Metoda 1 Metoda 2
Skład całkowity sn-1 sn-2 sn-1 sn-2
16:0 37.0±0.07 62.8±1.7 1.1±0.6 62.9±2.3 0.5±0.3
16:1 0.4±0.09 2.9±0.2 0.2±0.08 2.5±0.1 0.3±0.1
18:0 14.1±0.03 31.1±1.2 0.5±0.9 32.2±1.9 nd
18:1 22.1±0.05 2.2±0.5 42.9±0.8 1.8±0.5 43.1±1.5
18:2 21.2±0.07 1.0±0.2 44.0±0.7 0.5±0.1 45±1.2
18:3 - - - - -
20:4 3.9±0.1 - 8.1±1.1 - 7.9±0.9
22:6 1.3±0.02 - 3.2±0.8 - 3.2±0.3
Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 1 i 2)
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 63
Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 3)
O
O
O
O
O
R2
R1
P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
PLA2
sn-1sn-2
HPLC
SPE
Hydroliza chemiczna
Kwasy tłuszczowe z sn-2Kwasy tłuszczowe z sn-1
10min !!!
O
OH
R2
OH
O
O
O
R1
P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 64
Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 3)
Czas analizy 60 próbek fosfatydylocholina:Metoda 2: ok. 90 dni Metoda 3: ok. 10 dni
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 65
Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 3)
PC PE
Kwasy tłuszczowe
ogółemsn-1 sn-2
Kwasy tłuszczowe
ogółemsn-1 sn-2
16:0 33,6±0,43 68,3±0,67 3,8±0,09 17,5±0,66 37,1±1,7 7,5±0,04
16:1 1,2±0,09 - 0,7±0,05 - - -
18:0 15,3±0,39 26,0±0,2 - 27,8±1,5 59,6±1,1 -
18:1 27,1±0,8 3,9±0,04 44,9±0,09 18,4±0,7 3,3±0,7 24,4±0,4
18:2 15,4±0,04 0,9±0,02 34,1±0,23 14,2±0,2 - 23,6±0,2
20:4 5,1±0,14 - 10,9±0,05 14,9±0,2 - 29,2±0,08
22:6 2,2±0,14 0,5 5,42±0,06 6,9±0,2 - 15,2±0,6
Plan prezentacji
1.05.2023 66Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
IzolowaniefosfolipidówWstęp
Analiza pozycyjna
fosfolipidów
Analiza frakcji
lipidowej
Migracja reszt
acylowych
1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 67
Metoda HPLC analizy produktów hydrolizy PC oraz procesu migracji reszt acylowych w lizoglicerofosfatydylocholinie
OH
O
O
O
R
P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
O
OH
O
O
R
P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
O
O
O
O
O
R2
R1
P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
OH
OH
O P
O
O-
O CH2CH2N+
CH3
CH3
CH3
O
OH
R1
O
OH
R2
90:10
Analiza produktów hydrolizy fosfatydylocholiny
1.05.2023 68Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Różnice polarności
Niestabilność (migracja reszt acylowy)
Brak substancji wzorcowych
Różnorodność strukturalna (podklasy)
Detektor: CORONA™ Charge Aerosol Detector Kolumna: Dionex Acclaim®Mixed-Mode HILIC-1Temperatura kolumny: 30°C
Czas (godz.)
Związek(%) Rozpuszczalnik
Bufor pH 8.0 (0.3M)
Bufor pH 8.0 (2.0M)
Bufor pH 7.4 (0.3M)
Bufor pH 5.6 (0.3M)
Bufor pH 5.6 (2.0M)
Woda dejonizowan
a
Metanol
Etanol bezwo
dny
96% Etanol
2-Propamol
Chloroform
Chloroform:
metanol (2:1, v/v)
ToluenEter
dietylowy
Dichlorometa
n
Acetonitryl Aceton
0 1-palmitoilo LPC2-palmitoilo LPC
GPC
97.3±0.71.4±0.21.2±0.1
97.5±0.71.6±0.20.9±0.1
96.2±0.92.2±0.41.6±0.2
97.2±1.01.4±0.31.4±0.3
97.2±0.91.8±0.50.9±0.1
96.7±1.21.5±0.11.8±0.2
96.8±0.31.3±0.11.9±0.3
97.0±0.71.6±0.51.4±0.2
96.3±0.52.2±0.31.5±0.3
96.8±0.61.6±0.21.5±0.3
98.4±0.81.6±0.3
Nsa
96.4±0.72.4±0.31.2±0.1
98.2±0.61.8±0.4
Ns
98.5±0.41.5±0.2
Ns
97.8±0.52.2±0.2
Ns
98.0±0.72.0±0.3
Ns
96.9±1.03.1±0.7
Ns
24 1-palmitoilo LPC2-palmitoilo LPC
GPC
92.5±1.02.7±0.41.8±0.4
91.7±0.67.1±0.51.3±0.2
92.8±0.75.2±0.31.9±0.3
96.9±0.81.8±0.41.3±0.2
96.4±1.02.4±0.41.2±0.7
96.8±1.32.9±0.2
0.3±0.07
96.5±0.41.8±0.11.6±0.3
97.0±0.91.5±0.41.5±0.1
96.6±0.82.1±0.21.3±0.1
96.6±0.71.9±0.11.4±0.2
97.6±0.72.4±0.2
Ns
96.3±0.62.2±0.21.5±0.3
98.1±0.71.9±0.5
Ns
98.4±0.71.6±0.1
Ns
97.8±0.92.2±0.1
Ns
98.0±0.82.0±0.3
Ns
96.9±0.93.1±0.8
Ns
48 1-palmitoilo LPC2-palmitoilo LPC
GPC
92.5±1.16.0±0.21.8±0.3
91.9±0.86.6±0.31.4±0.2
92.6±1.05.6±0.21.8±0.1
96.3±0.92.1±0.21.6±0.6
96.6±0.82.7±0.20.6±0.1
94.9±1.03.5±0.31.7±0.7
95.8±0.62.1±0.22.0±0.2
96.6±0.31.9±0.21.5±0.1
96.6±0.82.1±0.3
1.3±0.08
97.0±0.51.6±0.11.4±0.2
97.5±0.62.5±0.2
Ns
96.0±0.72.4±0.1
1.6±0.09
98.5±0.91.5±0.4
Ns
98.5±0.91.5±0.3
Ns
97.6±0.72.4±0.3
Ns
96.8±0.93.2±0.5
Ns
96.9±1.13.1±0.7
Ns
72 1-palmitoilo LPC2-palmitoilo LPC
GPC
91.8±0.96.4±0.11.7±0.2
91.1±1.16.7±0.32.2±0.4
92.2±0.96.1±0.41.7±0.2
96.0±0.62.3±0.41.7±0.4
95.8±0.93.3±0.1
0.8±0.09
95.4±1.14.1±0.30.5±0.1
95.9±0.32.1±0.11.9±0.4
96.7±0.51.8±0.2
1.5±0.09
95.8±0.32.5±0.11.7±0.1
96.7±0.71.9±0.21.4±0.1
97.4±0.32.6±0.1
Ns
95.8±0.52.4±0.21.8±0.2
98.1±0.91.9±0.3
Ns
98.2±0.71.8±0.4
Ns
97.4±0.92.6±0.4
Ns
93.2±0.86.8±0.6
Ns
96.8±0.83.2±0.5
Ns
96 1-palmitoilo LPC2-palmitoilo LPC
GPC
89.3±1.47.5±0.23.2±0.4
91.1±0.96.7±0.42.2±0.3
92.1±0.76.0±0.51.9±0.3
94.9±1.12.9±0.32.2±0.2
95.9±1.03.7±0.10.4±0.0
94.4±0.95.0±0.20.6±0.1
96.3±0.21.8±0.21.8±0.4
96.2±0.22.2±0.41.6±0.2
95.2±0.52.5±0.22.3±0.3
96.1±0.82.4±0.2
1.5±0.08
97.4±0.32.6±0.1
Ns
94.6±0.62.7±0.22.7±0.4
98.2±0.81.8±0.4
Ns
98.3±0.91.7±0.3
Ns
97.6±0.72.4±0.4
Ns
91.7±1.08.3±0.8
Ns
96.6±0.93.4±0.6
Ns
BuforyRozpuszczalniki
polarneRozpuszczalniki
niepolarne
pH>7 pH<7 ?
Czas (godz.)
Związek (%) Rozpuszczalnik
Bufor pH 8.0 (0.3M)
Bufor pH 8.0 (2.0M)
Bufor pH 7.4 (0.3M)
Bufor pH 5.6 (0.3M)
Bufor pH 5.6 (2.0M)
Woda dejonizowan
a
Metanol
Etanol bezwo
dny
96% Etanol
2-Propamol
Chloroform
Chloroform:
metanol (2:1)
ToluenEter
dietylowy
Dichlorometa
n
Acetonitryl Aceton
02-palmitoilo LPC1-palmitoilo LPC
GPC
90.7±0.36.0±0.2
3.3±0.09
91.3±0.57.0±0.61.7±0.1
88.6±0.38.3±0.43.1±0.2
94.2±0.32.6±0.23.2±0.3
93.7±1.04.7±0.11.6±0.2
96.3±0.65.0±0.50.7±0.1
89.9±0.66.8±0.23.3±0.2
90.4±0.87.1±0.42.5±0.3
90.7±1.07.1±0.72.2±0.1
90.2±0.57.3±0.22.5±0.3
93.7±1.06.3±0.8
Nsa
89.1±0.38.4±0.23.7±0.1
92.9±2.07.1±1.1
Ns
89.6±1.910.4±1.3
Ns
92.5±1.77.5±0.6
Ns
92.2±1.57.8±0.7
Ns
92.4±2.37.6±1.2
Ns
242-palmitoilo LPC1-palmitoilo LPC
GPC
7.9±0.388.5±0.83.6±0.1
7.0±0.591.1±0.81.9±0.2
13.7±0.782.8±1.43.5±0.3
85.7±1.011.0±0.73.3±0.2
81.1±1.618.2±1.01.7±0.5
63.6±1.235.6±0.60.8±0.2
88.6±0.97.5±0.53.9±0.4
88.7±0.88.3±0.23.0±0.1
87.7±0.98.7±0.83.6±0.3
89.4±0.77.8±0.52.8±0.1
91.7±1.48.3±0.6
Ns
87.5±0.28.7±0.13.7±0.1
89.9±1.910.1±1.2
Ns
86.0±2.114.0±1.3
Ns
90.5±1.59.5±0.4
Ns
91.8±1.38.2±0.4
Ns
90.4±2.09.6±1.3
Ns
482-palmitoilo LPC1-palmitoilo LPC
GPC
8.0±0.287.6±1.14.5±0.08
6.0±0.691.9±1.12.1±0.4
8.0±0.688.3±0.83.7±0.4
81.1±2.015.7±1.23.1±0.3
75.2±0.922.5±0.72.2±0.2
56.4±1.442.9±1.60.8±0.1
82.6±1.113.4±0.44.0±0.3
88.0±1.08.6±0.23.4±0.1
83.7±1.113.5±0.62.7±0.3
88.4±1.18.6±0.33.0±0.1
90.6±0.69.4±0.2
Ns
84.9±0.611.3±0.33.8±0.2
91.4±1.18.6±0.8
Ns
82.3±1.717.7±1.1
Ns
87.1±1.812.9±0.8
Ns
89.6±1.110.4±0.5
Ns
89.1±2.210.9±1.5
Ns
722-palmitoilo LPC1-palmitoilo LPC
GPC
6.6±0.389.6±0.93.8±0.2
6.3±0.791.4±1.02.2±0.08
4.2±0.391.6±0.84.2±0.2
77.6±1.118.7±0.63.7±0.0
67.7±2.230.0±1.32.3±0.6
27.7±1.071.6±2.00.8±0.1
82.4±1.214.7±0.74.1±0.5
87.6±0.68.8±0.33.6±0.2
79.4±1.216.7±0.53.9±0.3
88.5±1.28.4±0.53.1±0.2
89.5±0.810.5±0.4
Ns
81.6±0.914.6±0.53.8±0.1
85.5±2.114.5±0.9
Ns
73.5±1.526.5±1.2
Ns
84.4±2.015.6±1.2
Ns
89.3±1.210.7±0.8
Ns
88.0±1.912.0±0.9
Ns
962-palmitoilo LPC1-palmitoilo LPC
GPC
6.4±0.389.7±1.03.9±0.1
6.1±0.591.5±0.92.3±0.1
4.0±0.191.5±1.24.5±0.09
72.1±2.023.4±1.04.5±0.4
67.1±1.430.2±1.02.6±0.3
18.6±0.780.5±1.90.9±0.2
76.3±1.819.2±1.14.5±0.1
87.1±0.39.4±0.23.5±0.2
76.0±1.420.5±0.73.5±0.1
88.2±0.98.6±0.13.2±0.2
86.5±1.013.5±0.3
Ns
77.6±1.018.5±0.63.9±0.4
80.6±2.219.3±1.0
Ns
60.5±2.239.5±0.9
Ns
83.8±1.416.2±0.9
Ns
89.1±0.910.9±0.2
Ns
87.2±2.012.8±1.0
Ns
BuforyRozpuszczalniki
polarneRozpuszczalniki
niepolarne
pH>7 pH<7 Wysoka stabilność
Plan prezentacji
1.05.2023 72Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
IzolowaniefosfolipidówWstęp
Analiza pozycyjna
fosfolipidów
Analiza frakcji
lipidowej
Migracja reszt
acylowych
Izolowanie fosfolipidów z żółtek jaj świeżych i liofilizowanych
1.05.2023 73Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Wzrost wielkości granul lipoproteinowych –zwiększona dostępność fosfolipidów
Metanol, Etanol lub Propan-2-ol
Wytrącenie lipidów polarnych w zmrożonym acetonie
Izolowanie fosfolipidów z żółtek jaj świeżych i liofilizowanych
1.05.2023 74Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Skład frakcji fosfolipidowych izolowanych z żółtek jaj kurzych świeżych oraz liofilizowanych (n=3)
Ekstrahent Etanol Metanol Propan-2-ol
Rodzaj żółtka świeże liofilizowane świeże liofilizowane świeże liofilizowane
Wydajnośća, % 6,7±0,3b 7,6±0,5 7,8±0,4 7,7±0,3 5,7±0,8 2,9±0,5
Fosfolipidy ogółem, % 86,3±0,5 93,8±0,5 91,9±0,4 97,6±0,4 97,1±0,3 97,5±0,2
PC, % 70,4±0,2 73,7±0,3 71,5±0,4 75,3±0,6 74,0±0,7 77,3±0,8
PE, % 15,9±0,7 20,1±0,2 20,4±0,4 22,3±0,6 23,1±0,7 20,0±0,5
Cholesterol, % 0,35±0,12 0,19±0,08 0,26±0,13 0,15±0,07 0,28±0,04 0,17±0,05
a w stosunku do masy całego żółtka; b wartość średnia ± odchylenie standardowe
1. Wydajność malała wraz ze zmniejszaniem polarności alkoholu
2. Wzrost zawartości fosfolipidów we frakcjach otrzymanych z żółtek liofilizowanych
3. Dwukrotny spadek zawartości cholesterolu w ekstraktach z żółtek liofilizowanych w porównaniu z żółtkami świeżymi
Izolowanie fosfolipidów z żółtek jaj świeżych i liofilizowanych
1.05.2023 75Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Ekstrahent Etanol Metanol Propan-2-ol
Frakcja fosfolipidowa surowa oczyszczona surowa oczyszczona surowa oczyszczona
Fosfolipidy ogółem, % 68,6±0,5 93,8±0,5 73,9±0,7 97,6±0,4 70,9±0,4 97,5±0,2
Cholesterol, % 0,86±0,22 0,19±0,08 0,91±0,1 0,15±0,07 1,2±0,13 0,17±0,05
Zawartość fosfolipidów i cholesterolu w surowych i oczyszczonych frakcjach fosfolipidowych (n=3)
4. Proces wytrącania fosfolipidów w zmrożonym acetonie w najwyższym stopniu wpływał na końcową zawartość cholesterolu
Podsumowanie
1.05.2023 76Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
SPE HPLC
Izolowaniefosfolipidów
Analiza pozycyjna
1. Lipidy polarne i niepolarne2. Klasy fosfolipidów (żółtko jaja
kurzego)3. Klasy fosfolipidów (mleko)4. Produkty hydrolizy enzymatycznej
fosfolipidów
1. Jednoczesna analiza lipidów polarnych i niepolarnych2. Fosfolipidy (żółtko jaja kurzego)3. Fosfolipidy (mleko, soja)4. Lipidy niepolarne5. Kwasy tłuszczowe6. Produkty hydrolizy fosfatydylocholiny – migracja reszt acylowych
1. Cztery metody analizy pozycyjnej2. Regioselektywna hydroliza
enzymatyczna 1. Liofilizacja2. Wytrącanie ze zmrożonego acetonu3. Czystość ~ 98%
Dziękuję za uwagę !!!