77
Zastosowanie Hydrolizy Enzymatycznej do Ustalania Struktury Naturalnych Fosfolipidów Grzegorz Kiełbowicz Praca doktorska wykonana w Katedrze Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu pod kierunkiem prof. dr. hab. Czesława Wawrzeńczyka

PhD Thesis Defense

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: PhD Thesis Defense

Zastosowanie Hydrolizy Enzymatycznej do Ustalania Struktury Naturalnych Fosfolipidów

Grzegorz KiełbowiczPraca doktorska wykonana

w Katedrze Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiupod kierunkiem prof. dr. hab. Czesława Wawrzeńczyka

Page 2: PhD Thesis Defense

Cele pracy

1.05.2023 2Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Opracowanie metod izolowania fosfolipidów o wysokiej czystości z żółtka jaja kurzego oraz

pełna analiza frakcji lipidowej żółtka, ze szczególnym uwzględnieniem fosfolipidów.

Page 3: PhD Thesis Defense

Plan prezentacji

1.05.2023 3Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Analiza frakcji

lipidowej

Analiza pozycyjna

fosfolipidów

Migracja reszt

acylowych

IzolowaniefosfolipidówWstęp

Page 4: PhD Thesis Defense

Lipidy – ogólna definicja

1.05.2023 4Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Grupa związków organicznych nierozpuszczalnych w wodzie, ale rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych m.in. takich jak chloroform, eter, toluen

Page 5: PhD Thesis Defense

1.05.2023 5Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Kwasy tłuszczowe i ich pochodne

PrenoleSacharolipidy Poliketydy

Klasyfikacja lipidów

Page 6: PhD Thesis Defense

Lipidy – ogólna definicja

1.05.2023 6Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Kwasy tłuszczowe i ich pochodne

GlicerolipidyGlicerofosfolipidy

Prenole

Sfingolipidy SteroidySacharolipidy Poliketydy

Lipidy

Klasyfikacja lipidów

Page 7: PhD Thesis Defense

„Cegiełki budulcowe” lipidów

1.05.2023 7Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Ketoacylowe Izoprenowa

LIPIDY – hydrofobowe lub amfifilowe cząsteczki otrzymane w całości lub częściowo poprzez kondensację karboanionu ketoacylotioestrów lub poprzez karbokationową kondensację jednostek izoprenowych

Page 8: PhD Thesis Defense

„Cegiełki budulcowe” lipidów

1.05.2023 8Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Ketoacylowe Izoprenowa

GlicerolipidyGlicerofosfolipidy

SfingolipidySacharolipidy

Poliketydy

SteroidyPrenole

Page 9: PhD Thesis Defense

Glicerofosfolipidy

1.05.2023 9Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Fosfatydylocholina (PC) Fosfatydyloetanoloamina (PE) Fosfatydyloseryna (PS)

Fosfatydyloinozytol (PI)Fosfatydyloglicerol (PG)

Difosfatydyloglicerol (DPG, kardiolipin) Kwas fosfatydowy (PA)

O

O

O

O

O

R2

R1

P

O

O-

O X

Page 10: PhD Thesis Defense

Sfingolipidy

1.05.2023 10Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

CH3OH

NH2

OH

Sfingozyna

CH3O

NH

OH

PO

O

O-

N+

CH3

CH3

CH3

R

O

Sfingomielina (SM)

Ceramidy Glikosfingolipidy

Sfingomieliny należą do fosfolipidów !!!

Page 11: PhD Thesis Defense

Fosfolipidy

1.05.2023 11Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Polarna „głowa”Kwas fosforowy (V)Gliceryna

Kwasy tłuszczowe

Część hydrofilowa

Część hydrofobowa

Micele Liposomy Dwuwarstwa fosfolipidowa

Amfifilowość

Page 12: PhD Thesis Defense

Fosfolipidy - funkcje biologiczne

1.05.2023 12Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

1. Zapewniają strukturalną integralność i funkcjonalność błon biologicznych

2. Funkcje sygnałowe (m.in. produkty hydrolizy fosfatydyloinozytoli)

3. Zapasowy materiał energetyczny

Page 13: PhD Thesis Defense

Źródła fosfolipidów

1.05.2023 13Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

LECYTYNA (E322): złożona mieszanina

Fosfolipidów (49%)Triacylogliceroli (39%)

Glikolipidów (5%)Cukrów (4%)

Steroli i tokoferoli (3%)

Page 14: PhD Thesis Defense

Zastosowanie fosfolipidów

1.05.2023 14Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Przemysł spożywczy

emulgatory

nawilżanie

nośniki leków

Przemysł kosmetyczny

Przemysł farmaceutyczny

proleki

czynniki przeciwrozpryskowe

nośniki związków aktywnych

suplementy diety

Page 15: PhD Thesis Defense

Plan prezentacji

1.05.2023 15Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Analiza pozycyjna

fosfolipidów

Migracja reszt

acylowych

Izolowaniefosfolipidów

Analiza frakcji

lipidowejWstęp

Page 16: PhD Thesis Defense

Ekstrakcja lipidów

1.05.2023 16Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Folch (1957 r.) Bligh-Dyer (1958 r.) Radin (1981 r.)

chloroform : metanol(2:1 v/v)

modyfikacje metody Folcha heksan : izopropanol (3:2 v/v)

Podstawowe etapy :

ekstrakcja z matrycy

usunięcie nielipidowych zanieczyszczeń

rozdział lipidów na grupy

Page 17: PhD Thesis Defense

Żółtko jaja kurzego

1.05.2023 17Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

50%

32%

16%2%

Woda Lipidy Białka Inne

LDL

Granule

Cholesterol

Fosfolipidy

Apo-proteina

Triacyloglicerole

HDL lub lipowitelina

Foswityna

Lipidy silnie związane z matrycą •błony•kompleksy białkowo-lipidowe

Page 18: PhD Thesis Defense

Ekstrakcja metodą Folcha

1.05.2023 18Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Woda z próbki + 0.05M NaCl

Metanol

Chloroform

3

4

8

1 g 20 ml CHCl3:MeOH (2:1)

chloroform

Page 19: PhD Thesis Defense

Ekstrakcja metodą Folcha

1.05.2023 19Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

40%

60%

Lipidy kwasowe NaCl:woda:metanol

chloroform

1. Lipidy kwasowe w postaci soli Na, K, Mg, Ca.2. NaCl powoduje cofnięcie procesu dysocjacji oraz transfer

lipidów kwasowych do dolnej niepolarnej fazy układu

Page 20: PhD Thesis Defense

Analiza lipidów za pomocą HPLC

1.05.2023 20Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Zróżnicowane właściwości fizyko-chemiczne

Niestabilność (migracja reszt acylowy)

Technika detekcji (brak grup

chromoforowych)

Różnorodność strukturalna (około 8000 struktur fosfolipidów)

Page 21: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 21

Układ faz a podział lipidów

Faza stacjonarna

Faza ruchoma

C18 Diol Krzemionka niemodyfikowana

woda izopropanol heksanacetonitryl metanol woda

NPRP HILIC

Podział klas fosfolipidów

Podziałze względu

na skład reszt acylowych

Page 22: PhD Thesis Defense

Detektor Corona CAD

1.05.2023 22Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

http://coronacad.com

• Odpowiedź niezależna od budowy chemicznej związku• Wykrywanie substancji o prężności par < 10-5hPa

Page 23: PhD Thesis Defense

Detektor: CORONA™ Charge Aerosol Detector Kolumna: Waters Spherisorb® S5 W 5µm (150 x 4.6 mm) Temperatura kolumny: 30°C

Analiza frakcji lipidowej za pomocą HPLC Metoda 1

Page 24: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 24

Woda a polarna faza stacjonarna

Niestabilność linii podstawowej

„Krwawienie”kolumny

Niecałkowite odparowywanie rozpuszczalnika

w detektorze

Długi czas stabilizacji fazy stacjonarnej

Silna adsorpcja wody

Adsorpcja wody jest wyższa gdy stosunek wody do rozpuszczalnika organicznego maleje

?Metoda 1

Page 25: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 25

Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) Metoda 2

Odzysk:

10 – 2,5 mg wzorca

Cholesterol 97,8 – 99,9% Tripalmitynian 95,5 – 100,1%

%RSD < 3,52

100 – 10 mg próbki

PE 62,6 – 80,1%PC 35,8 – 51,4%

SM 41,3 – 57,8%

%RSD < 5,97

Page 26: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 26

?

Analiza fosfolipidów za pomocą HPLC Metoda 2

Poprawa geometrii piku

Zmiana właściwości aerozolu I°(np. zmiana napięcia powierzchniowego)

Zmiana właściwości aerozolu III°(np. zmiana kształtu cząstek)

„Wzmacniacze” masy

Szybsze kondycjonowanie kolumny

Kolumna: Waters Spherisorb® S5W 5 µm (150 x 4,6 mm)Eluent: A: bufor (1% HCOOH, 0,1% TEA), B: izopropanol, C: heksanDetektor: Corona CAD

HCOOH TEA

Page 27: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 27

Przykładowy chromatogram Metoda 2

Frakcje LPC uzyskane za pomocą chromatografii kolumnowej

LPC, SM, LPE podział na

submolekularne pochodne różniące się składem kwasów tłuszczowych

Elucja fosfolipidów przy stężeniu wody > 8%

Page 28: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 28

Walidacja - model odpowiedzi, liniowość Metoda 2

Liniowosć (wg ICH) - to przedział zakresu pomiarowego, w którym wyniki danego testu (sygnał wyjściowy) są proporcjonalne do stężenia (ilości) danego analitu

sygnał wyjściowy

ilość

R2 > 0,999b – mniejsze niż kilka procent z odpowiedzi uzyskanej dla docelowej ilości analitu

Kryteria akceptacji dla testu liniowości:

Liniowość nie jest warunkiem koniecznym !!!

Minimum5 stężeń x 3 powtórzenia

Page 29: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 29

y = axb vs y = ax + b Metoda 2

Model potęgowy lepiej opisuje odpowiedź detektora CAD

PLs Zakres (µg) Model potęgowy(y=axb)

Model liniowy(y=bx+a)

Równanie R2 AICCRównanie R2 AICC

PE 0,03-1,05 54,661(±0,27)x0,966(±0,01) 0,9998 -47,174 54,510 (±0,39)x+0,389(±0,17) 0,9996 -30,138

LPE 0,03-1,42 62,466(±0,14)x0,976(±0,01) 0,9943 41,709 62,409 (±0,51)x-0,092(±0,18) 0,9941 42,481

PC 0,03-1,44 37,067(±0,69)x0,968 (±0,02) 0,9989 -14,166 36,572(±0,59)x+0,363(±0,21) 0,9987 -10,826

LPC 0,03-1,28 38,098(±0,51)x0,873 (±0,04) 0,9947 13,077 36,477 (±1,38)x+1,499(±0,60) 0,9916 22,995

SM 0,03-1,33 65,444(±1,06)x0,922(±0,01) 0,9982 14,795 63,694(±0,93)x+1,533(±0,69) 0,9970 25,959

AICC - skorygowane kryterium informacyjne Akaikiego\R2 - współczynnik korelacji

Page 30: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 30

S, LOD, LOQ Metoda 2

Funkcja liniowa(y = ax + b)

S = aCzułość niezależna od stężenia

Czułość (S)

Funkcja potęgowa(y = axb)

S = dy/dx = abxb-1

Czułość zmienia się wraz ze stężeniem

Czułość (S)

Page 31: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 31

S, LOD, LOQ Metoda 2

Związek S (mV/µg) LOD (ng) LOQ (ng)

PE 59,8 14,9 45,3

LPE 66,0 6,9 21,0

PC 39,9 57,4 174,0

LPC 51,5 32,7 99,0

SM 65,8 53,3 161,4

S = abxb-1

LOD = 3,3 x σ/S LOQ = 10 x σ/S

Page 32: PhD Thesis Defense

Precyzja Metoda 2

Związek Ilość(µg)

Powierzchnia piku(mV/min)

Czas retencji(min)

Średnia SD RSD% Średnia SD RSD%

PE 0,16 9,172 0,161 1,757 7,587 0,020 0,263

LPE 0,21 8,898 0,181 2,090 9,655 0,010 0,159

PC 0,22 8,367 0,681 8,09 11,228 0,020 0,161

LPC 0,19 8,936 0,675 7,554 15,078 0,095 0,630

SM 0,20 14,557 0,967 6,647 11,727 0,024 0,216

Precyzja metody analitycznej jest to stopień zgodności pomiędzy pojedynczymi wynikami analizy, gdy dana procedura jest stosowana dla wielokrotnie powtarzanych niezależnych oznaczeń jednorodnej próbki.

Elucja przy wysokim stężeniu wody

Page 33: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 33

Analiza fosfolipidów za pomocą HPLC Metoda 2

Kolumna: Thermo Betasil Diol 5 µm (150 x 4,6 mm)Eluent: A: bufor (1% HCOOH, 0,1% TEA), B: izopropanol, C: heksanDetektor: Corona CAD

Kolumna diolowa

Cel: poprawa precyzji procesu

Przepływ 1,5 ml/min

Krótszy czas analizy

Pojedyncze piki

Stabilność w wodnej fazie ruchomej

Page 34: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 34

Analiza fosfolipidów za pomocą HPLC Metoda 2

Związek Ilość(µg)

Powierzchnia piku(mV/min)

Czas retencji(min)

Średnia SD RSD% Średnia SD RSD%PE 0,16 9,172 0,161 1,757 7,587 0,020 0,263LPE 0,21 8,898 0,181 2,090 9,655 0,010 0,159PC 0,22 8,367 0,681 8,09 11,228 0,020 0,161LPC 0,19 8,936 0,675 7,554 15,078 0,095 0,630SM 0,20 14,557 0,967 6,647 11,727 0,024 0,216

Związek Ilość(µg)

Powierzchnia piku(mV/min)

Czas retencji(min)

Średnia SD RSD% Średnia SD RSD%PE 0,25 7,802 0,067 0,854 3,821 0,022 0,566LPE 0,43 17,822 0,097 0,546 5,399 0,031 0,582PC 0,39 16,736 0,250 1,497 6,682 0,032 0,477LPC 0,32 12,151 0,191 1,573 7,920 0,025 0,315SM 0,29 12,926 0,077 0,596 7,080 0,019 0,276

Kolumnaz niemodyfikowaną

krzemionką

Kolumnadiolowa

Page 35: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 35

Analiza lipidów niepolarnych za pomocą HPLC Metoda 2

Kolumna: Thermo Betasil Diol 5 µm (150 x 4,6 mm)Eluent: B: izopropanol, C: heksan (10:90 v/v)Detektor: Corona CAD

Związek S (mV/µg) (abxb-1)

LOD (ng)(3,3 x σ/S)

LOQ (ng)(10 x σ/S)

TriPal 51,3 35,7 108,1

Chol 62,9 102,3 310,0

Lut 55,0 5,4 16,5

Związek Ilość(µg)

Powierzchnia piku(mV/min)

Czas retencji(min)

Średnia SD RSD% Średnia SD RSD%

TriPal 0,38 17,694 0,139 0,790 1,958 0,019 0,962

Chol 0,18 11,988 0,040 0,346 3,026 0,031 0,927

Lut 0,28 15,394 0,052 0,341 5,157 0,068 1,329

Page 36: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 36

Profil lipidowy żółtka jaja kurzego Metoda 2

% SD %RSD

Lipidya 30,57 0,45 1,47

Lipidy niepolarneb 48,06 0,85 1,77

Triacyloglicerole 44,0 1,03 2,27

Cholesterol 4,06 0,31 7,39

Luteina - - -

Lipidy polarneb 51,94 0,85 1,64

Fosfatydyloetanoloamina (PE) 6,50 0,18 2,78

Lizofosfatydyloetanoloamina (LPE) - - -

Fosfatydylocholina (PC) 43,78 0,66 1,52

Lizofosfatydylocholina (LPC) 0,79 0,06 7,24

Sfingomielina (SM) 0,93 0,02 2,59 a w odniesieniu do masy surowego żółtka; b w odniesieniu do całkowitej zawartości lipidów

Page 37: PhD Thesis Defense

Mleko

1.05.2023 37Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

84,8%

3,7% 3,4% 2,8%4,6% 0,7%

Woda Tłuszcz Białka KazeinaLaktoza Inne

MFGM

Niewielka zawartość fosfolipidów (około 0,8% frakcji lipidowej) !!!!

Page 38: PhD Thesis Defense

Ekstrakcja do fazy stałej (SPE)

1.05.2023 38Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

PS PE PI PC SM

Bezpośre

dnia

analiza

Średnia 10,81 68,21 7,98 50,56 28,25

SD 0,50 0,91 0,42 0,46 1,12

%RSD 4,60 1,34 5,23 0,91 3,98

Oczyszcz

anie za

pomocą

SPE

Średnia 10,30 66,37 8,19 50,83 28,19

SD 0,34 0,87 0,30 1,07 0,77

%RSD 3,26 1,30 3,71 2,10 2,74

Odzysk 95,3% 97,3% 102,6% 100,5% 99,8%

Page 39: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 39

Fosfolipidy z mleka – analiza HPLC

Metoda stosowana do oznaczania fosfolipidów w żółtku jaja kurzego

Fosfolipidy syntetyczne

Niemodyfikowana krzemionka

Zamiana wody na 13% HCOOH

Page 40: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 40

Fosfolipidy z mleka – analiza HPLC

Wpływ temperatury na stabilność linii podstawowej

Wpływ zmiany przepływu eluentu oraz dodatku HCOOH

Page 41: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 41

Fosfolipidy z mleka – analiza HPLC

Potęgowy model odpowiedziLOD: 4,4 – 20,7 ngLOQ: 13,4 – 62,6 ngPrecyzja (%RSD): Pole powierzchni: 0,27 – 0,61 Czas retencji: 0,13 – 0,77

Page 42: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 42

Fosfolipidy z mleka – analiza HPLC

Próbka 1 2 3 4

Średnia SD %RSD Średnia SD %RSD Średnia SD %RSD Średnia SD %RSD

PLs (mg/100ml

mleka24.35 1.00 4.11 22.74 0.67 2.95 25.04 1.97 7.87 31.34 0.94 2.97

PS (%)a 8.60 0.20 2.32 8.19 0.30 3.66 8.46 0.73 8.63 8.06 0.61 7.87

PE (%)a 34.19 0.37 1.08 29.93 1.89 6.31 32.99 0.93 2.82 33.41 0.61 1.82

PI (%)a 7.69 0.35 4.55 11.49 0.52 4.52 7.91 0.07 0.88 10.28 0.21 2.04

PC (%)a 45.46 0.32 0.70 46.36 1.51 3.26 46.17 1.15 2.49 43.19 0.64 1.48

SM (%)a 4.06 0.48 11.82 4.02 0.28 6.96 4.46 0.05 1.12 5.06 0.13 2.57

Page 43: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 43

Analiza kwasów tłuszczowych - SPE

Page 44: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 44

Analiza kwasów tłuszczowych - SPE

Frakcjalipidowa

(mg)

Frakcja lipidówniepolarnychb

(mg)SD %RSD PC (mg) SD %RSD PE (mg) SD %RSD

Odzyskcałkowitylipidów

(%)

SD %RSD

50 23,30(46,67%)a

1,15 4,95 10,1(22,20%)a

0,17 1,71 2,03(4,07%)a

0,06 2,84 70,9 2,39 3,36

100 44,00(44,00%)a

1,73 3,94 15,67(15,67%)a

0,58 3,68 4,83(4,83%)a

0,29 5,97 64,5 2,29 3,55

a procentowy udział poszczególnych grup lipidów uzyskanych za pomocą SPE w stosunku do całkowitej ilości wyjściowej frakcji lipidowej

b cholesterol oraz triacyloglicerole

Page 45: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 45

Analiza kwasów tłuszczowych- detekcja

1. Chromatografia gazowa(GC) Derywatyzacja !!!• FID – najczęściej stosowany detektor

2. Chromatografia cieczowa (LC)• UV Derywatyzacja !!!

• Detektory aerozolowe (ELSD, CAD, CNLSD)• Spektrometry mas• Detektor refraktometryczny (RI)• Detektory elektrochemiczne (ECD) …

np. estry metylowe

grupy chromoforowe

Derywatyzacja

Page 46: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 46

Analiza kwasów tłuszczowych- detekcja

DERYWATYZACJA

Skomplikowaneprocedury

Pracochłonność Czasochłonność

Utlenianie

Izomeryzacja

Zużycie rozpuszczalnikówi odczynników

Page 47: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 47

Równoważnik długości łańcucha (ECL)

wyższa wartość ECL = wyższa siła retencji

Page 48: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Liniowa zależność między logk a ilością atomów węgla w łańcuchu

48

Równoważnik długości łańcucha (ECL)

ECL=(logk-b)/a

Jak wyznaczyć „rzeczywistą” wartość współczynnika ECL kwasów nienasyconych ?

13 14 15 16 17 18 19 20 210

0.5

1

1.5

2

2.5 MeOH 90%/30st.CLinear (MeOH 90%/30st.C)ACN 90%/30st.CLinear (ACN 90%/30st.C)MeOH 80%/30st.CLinear (MeOH 80%/30st.C)ACN 80%/30st.CLinear (ACN 80%/30st.C)MeOH 90%/10st.CLinear (MeOH 90%/10st.C)ACN 90%/10st.CLinear (ACN 90%/10st.C)

Ilosć węgli

log

k

a – współczynnik kierunkowyb – wyraz wolny

Page 49: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 49

Kwas tłuszczowy Teoretyczny współczynnik ECL ECL wyznaczony doświadczalnie

Dokozaheksaenowy 22:6 (DHA) 10 13,3

Eikozapentaenowy 20:5 (EPA) 10 12,8

Linolenowy 18:3 12 13,2

Arachidonowy 20:4 12 14,0

Mirystynowy 14:0 14 14,0

Palmitooleinowy 16:1 14 14,0

Linolowy18:2 14 14,5

Palmitynowy 16:0 16 16,0

Oleinowy 18:1 16 15,9

Stearynowy 18:0 18 18,0

Równoważnik długości łańcucha (ECL)

Wielonienasycone kwasy tłuszczowe z trzema lub więcej wiązaniami podwójnymi nie podlegają zasadzie ECL

Page 50: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 50

75 80 85 900

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

14:0

16:0

16:1

18:1

18:2

18:3

20:4

DHA

EPA

% MeOH

log

k

70 75 80 85 90 95-0.2

-1.66533453693773E-16

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

14:00

16:00

16:01

18:01

18:02

18:03

20:04

DHA

EPA

% ACN

log

k

Wpływ rozpuszczalnika organicznego (1)

Wzrost ilości rozpuszczalnika organicznego powodując liniowe obniżanie wartości współczynnika retencji

Page 51: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 51

Wpływ rozpuszczalnika organicznego (2)

alog k = a(%ACN) + balog k = a(%MeOH) + b

Kwas tłuszczowyWartości

przecięcia osi rzędnych (b)a

Współczynnik kierunkowy prostej (a)a

Stosunek współczynnika k

dla 80% i 90% ACN

14:0 3,01 -0,0295 1,92

16:0 3,69 -0,0342 2,16

16:1 3,22 -0,0319 2,06

18:0 4,60 -0,0415 2,44

18:1 3,85 -0,0363 2,29

18:2 3,46 -0,0343 2,19

18:3 2,98 -0,0306 2,01

20:0 5,09 -0,0439 2,82

20:4 3,47 -0,0356 2,28

20:5 2,99 -0,0316 2,09

22:6 3,34 -0,0350 2,22

Kwas tłuszczowyWartości

przecięcia osi rzędnych (b)a

Współczynnik kierunkowy prostej (a)a

Stosunek współczynnika k

dla 80% i 90% MeOH

14:0 1,69 -0,3271 4,96

16:0 2,11 -0,3611 5,71

16:1 1,77 -0,3411 5,14

18:0 2,54 -0,4100 7,79

18:1 2,16 -0,3722 6,04

18:2 1,94 -0,3670 5,70

18:3 1,65 -0,3224 5,32

20:0 2,96 -0,4551 8,99

20:4 1,86 -0,3584 5,99

20:5 1,61 -0,3181 5,29

22:6 1,83 -0,3517 5,70

Wraz ze wzrostem siły elucji fazy ruchomej, czas retencji dla kwasów o niższej hydrofobowości będzie malał znacznie szybciej

Page 52: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 52

75 80 85 90 9513

14

15

16

17

16:0118:118:0218:0320:04DHAEPA

MeOH (%)

ECL

70 75 80 85 90 9511

12

13

14

15

16

17

16:01

18:01

18:02

18:03

20:04

DHA

EPA

ACN (%)

ECL

Wpływ rozpuszczalnika organicznego (3)

Wartości ECL oraz rozdzielczość dla kwasów nienasyconych wzrastają wraz ze zmniejszaniem się ilości rozpuszczalnika organicznego

Page 53: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 53

Wpływ temperatury – równanie Van’t Hoffa (1)

lnk = - ∆H/RT + ∆S/R + ln 𝛷

współczynnik retencji

zmiana entalpii procesu chromatograficznego

zmiana entalpii procesu chromatograficznego

stała gazowatemperatura bezwzględna

objętościowy stosunekpomiędzy fazą ruchomą i stacjonarną

Liniowy przebieg zależności lnk od odwrotności temperatury bezwzględnej świadczy o stałym machanizmie retencji w zakresie badanych temperatur.

Page 54: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 54

0.00315 0.0032 0.00325 0.0033 0.00335 0.0034 0.00345 0.0035 0.00355 0.00360

0.5

1

1.5

2

2.5

3

1/T (K-1)

ln k

0.00310 0.00320 0.00330 0.00340 0.00350 0.003600

0.5

11.5

22.5

33.5

44.5

14:0016:0016:0118:0018:0118:0218:0320:0020:04EPADHA

1/T (K-1)

ln k

ACN:H2O 90:10MeOH:H2O 90:10

Wpływ temperatury – równanie Van’t Hoffa (2)

Wysoka liniowość w zakresie temperatur od 10 do 40°C (R2>0,99) świadczy o tym, iż ∆H i ∆S są zasadniczo niezależne od temperatury w stosowanym zakresie

25°C – „przejście fazowe” fazy stałej z formy przypominającej ciecz do formy bardziej uporządkowanej (struktura szczotkowa)

Page 55: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 55

10 15 20 25 30 35 4013

14

15

16

17

Temperature (°C)

ECL

10 15 20 25 30 35 4011

12

13

14

15

16

16:0118:0118:0218:0320:04EPADHA

Temperature (°C)

ECL

MeOH ACN

Wpływ temperatury – równanie Van’t Hoffa (3)

Spadek wartości ECL wraz z obniżaniem temperatury

25°C – optymalna temperatura – ciśnienie wsteczne kolumny vs rozdzielczość pików

Page 56: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 56

„Programowanie” metody

Detektor: Corona™ CAD™Columna: Thermo Betasil C18

Page 57: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 57

Profil kwasów tłuszczowych lipidów żółtka jaja kurzego

FA TAG (%)

SD %RSD PE (%)

SD %RSD PC (%)

SD %RSD

Kwas mirystynowy(14:0) 0,45 0,02 4,44 - - - - - -

Kwas eikozapentaenowy (EPA) (20:5) - - - - - - - - -

Kwas linolenowy(18:3) 1,02 0,04 3,72 - - - - - -

Kwas dokozaheksaenowy

(DHA)(22:6)0,1 0,01 5,97 6,96 0,17 2,44 2,24 0,14 6,37

Kwas palmitynowy(16:1) 5,98 0,02 0,35 - - - 1,2 0,09 7,26

Kwas arachidonowy(20:4) 0,38 0,01 2,63 14,86 0,08 1,24 5,13 0,14 2,83

Kwas linolowy(18:2) 17,43 0,20 1,16 14,2 0,19 1,34 15,4 0,04 0,23

Kwas palmitynowy(16:0) 24,09 0,13 0,52 17,52 0,66 3,75 33,64 0,43 1,27

Kwas oleinowy(18:1) 46,24 0,15 0,32 18,37 0,68 3,69 27,14 0,80 2,96

Kwas stearynowy(18:0) 4,31 0,16 3,62 27,82 1,52 5,47 15,25 0,39 2,59

Page 58: PhD Thesis Defense

Plan prezentacji

1.05.2023 58Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Migracja reszt

acylowych

IzolowaniefosfolipidówWstęp

Analiza pozycyjna

fosfolipidów

Analiza frakcji

lipidowej

Page 59: PhD Thesis Defense

Hydroliza enzymatyczna fosfolipidów

1.05.2023 59Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

C (CH2)16CH2

CH

CH2

O

O

OCCH(CH2)7

O

O

P

O

O

O CH2

CH3

CH2 N+

CH3

CH3

CH3

CH3(CH2)7CH

sn-1 sn-3sn-2

Fosfolipaza A2

Lipazy sn-1,3-specyficzneFosfolipaza A1 Fosfolipaza D

Fosfolipaza C

Page 60: PhD Thesis Defense

Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 1)

O

O

O

O

O

R2

R1

P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

PLA2Lipaza lub PLA1

OH

O

O

O

R1

P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

O

OH

O

O

R2

P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

sn-1sn-2

Hydroliza chemiczna

Kwasy tłuszczowe z sn-2 Kwasy tłuszczowe z sn-1

GC/HPLC

Page 61: PhD Thesis Defense

O

O

O

O

O

R2

R1

P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

Lipaza, 95% EtOH

O

OH

O

O

R2

P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

sn-1sn-2

GC/HPLC

O

OH

R1

Ekstrakcja woda/heksan !!!

Hydroliza chemiczna

Kwasy tłuszczowe z sn-2 Kwasy tłuszczowe z sn-1

Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 2)

Page 62: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 62

Przykładowe wyniki analizy pozycyjnej fosfatydylocholiny z żółtka jaja kurzego (Zielononóżka kuropatwiana)

Metoda 1 Metoda 2

Skład całkowity sn-1 sn-2 sn-1 sn-2

16:0 37.0±0.07 62.8±1.7 1.1±0.6 62.9±2.3 0.5±0.3

16:1 0.4±0.09 2.9±0.2 0.2±0.08 2.5±0.1 0.3±0.1

18:0 14.1±0.03 31.1±1.2 0.5±0.9 32.2±1.9 nd

18:1 22.1±0.05 2.2±0.5 42.9±0.8 1.8±0.5 43.1±1.5

18:2 21.2±0.07 1.0±0.2 44.0±0.7 0.5±0.1 45±1.2

18:3 - - - - -

20:4 3.9±0.1 - 8.1±1.1 - 7.9±0.9

22:6 1.3±0.02 - 3.2±0.8 - 3.2±0.3

Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 1 i 2)

Page 63: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 63

Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 3)

O

O

O

O

O

R2

R1

P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

PLA2

sn-1sn-2

HPLC

SPE

Hydroliza chemiczna

Kwasy tłuszczowe z sn-2Kwasy tłuszczowe z sn-1

10min !!!

O

OH

R2

OH

O

O

O

R1

P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

Page 64: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 64

Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 3)

Czas analizy 60 próbek fosfatydylocholina:Metoda 2: ok. 90 dni Metoda 3: ok. 10 dni

Page 65: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 65

Analiza pozycyjna fosfolipidów żółtka jaja kurzego (metoda 3)

PC PE

Kwasy tłuszczowe

ogółemsn-1 sn-2

Kwasy tłuszczowe

ogółemsn-1 sn-2

16:0 33,6±0,43 68,3±0,67 3,8±0,09 17,5±0,66 37,1±1,7 7,5±0,04

16:1 1,2±0,09 - 0,7±0,05 - - -

18:0 15,3±0,39 26,0±0,2 - 27,8±1,5 59,6±1,1 -

18:1 27,1±0,8 3,9±0,04 44,9±0,09 18,4±0,7 3,3±0,7 24,4±0,4

18:2 15,4±0,04 0,9±0,02 34,1±0,23 14,2±0,2 - 23,6±0,2

20:4 5,1±0,14 - 10,9±0,05 14,9±0,2 - 29,2±0,08

22:6 2,2±0,14 0,5 5,42±0,06 6,9±0,2 - 15,2±0,6

Page 66: PhD Thesis Defense

Plan prezentacji

1.05.2023 66Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

IzolowaniefosfolipidówWstęp

Analiza pozycyjna

fosfolipidów

Analiza frakcji

lipidowej

Migracja reszt

acylowych

Page 67: PhD Thesis Defense

1.05.2023 Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu 67

Metoda HPLC analizy produktów hydrolizy PC oraz procesu migracji reszt acylowych w lizoglicerofosfatydylocholinie

OH

O

O

O

R

P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

O

OH

O

O

R

P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

O

O

O

O

O

R2

R1

P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

OH

OH

O P

O

O-

O CH2CH2N+

CH3

CH3

CH3

O

OH

R1

O

OH

R2

90:10

Page 68: PhD Thesis Defense

Analiza produktów hydrolizy fosfatydylocholiny

1.05.2023 68Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Różnice polarności

Niestabilność (migracja reszt acylowy)

Brak substancji wzorcowych

Różnorodność strukturalna (podklasy)

Page 69: PhD Thesis Defense

Detektor: CORONA™ Charge Aerosol Detector Kolumna: Dionex Acclaim®Mixed-Mode HILIC-1Temperatura kolumny: 30°C

Page 70: PhD Thesis Defense

Czas (godz.)

Związek(%) Rozpuszczalnik

Bufor pH 8.0 (0.3M)

Bufor pH 8.0 (2.0M)

Bufor pH 7.4 (0.3M)

Bufor pH 5.6 (0.3M)

Bufor pH 5.6 (2.0M)

Woda dejonizowan

a

Metanol

Etanol bezwo

dny

96% Etanol

2-Propamol

Chloroform

Chloroform:

metanol (2:1, v/v)

ToluenEter

dietylowy

Dichlorometa

n

Acetonitryl Aceton

0 1-palmitoilo LPC2-palmitoilo LPC

GPC

97.3±0.71.4±0.21.2±0.1

97.5±0.71.6±0.20.9±0.1

96.2±0.92.2±0.41.6±0.2

97.2±1.01.4±0.31.4±0.3

97.2±0.91.8±0.50.9±0.1

96.7±1.21.5±0.11.8±0.2

96.8±0.31.3±0.11.9±0.3

97.0±0.71.6±0.51.4±0.2

96.3±0.52.2±0.31.5±0.3

96.8±0.61.6±0.21.5±0.3

98.4±0.81.6±0.3

Nsa

96.4±0.72.4±0.31.2±0.1

98.2±0.61.8±0.4

Ns

98.5±0.41.5±0.2

Ns

97.8±0.52.2±0.2

Ns

98.0±0.72.0±0.3

Ns

96.9±1.03.1±0.7

Ns

24 1-palmitoilo LPC2-palmitoilo LPC

GPC

92.5±1.02.7±0.41.8±0.4

91.7±0.67.1±0.51.3±0.2

92.8±0.75.2±0.31.9±0.3

96.9±0.81.8±0.41.3±0.2

96.4±1.02.4±0.41.2±0.7

96.8±1.32.9±0.2

0.3±0.07

96.5±0.41.8±0.11.6±0.3

97.0±0.91.5±0.41.5±0.1

96.6±0.82.1±0.21.3±0.1

96.6±0.71.9±0.11.4±0.2

97.6±0.72.4±0.2

Ns

96.3±0.62.2±0.21.5±0.3

98.1±0.71.9±0.5

Ns

98.4±0.71.6±0.1

Ns

97.8±0.92.2±0.1

Ns

98.0±0.82.0±0.3

Ns

96.9±0.93.1±0.8

Ns

48 1-palmitoilo LPC2-palmitoilo LPC

GPC

92.5±1.16.0±0.21.8±0.3

91.9±0.86.6±0.31.4±0.2

92.6±1.05.6±0.21.8±0.1

96.3±0.92.1±0.21.6±0.6

96.6±0.82.7±0.20.6±0.1

94.9±1.03.5±0.31.7±0.7

95.8±0.62.1±0.22.0±0.2

96.6±0.31.9±0.21.5±0.1

96.6±0.82.1±0.3

1.3±0.08

97.0±0.51.6±0.11.4±0.2

97.5±0.62.5±0.2

Ns

96.0±0.72.4±0.1

1.6±0.09

98.5±0.91.5±0.4

Ns

98.5±0.91.5±0.3

Ns

97.6±0.72.4±0.3

Ns

96.8±0.93.2±0.5

Ns

96.9±1.13.1±0.7

Ns

72 1-palmitoilo LPC2-palmitoilo LPC

GPC

91.8±0.96.4±0.11.7±0.2

91.1±1.16.7±0.32.2±0.4

92.2±0.96.1±0.41.7±0.2

96.0±0.62.3±0.41.7±0.4

95.8±0.93.3±0.1

0.8±0.09

95.4±1.14.1±0.30.5±0.1

95.9±0.32.1±0.11.9±0.4

96.7±0.51.8±0.2

1.5±0.09

95.8±0.32.5±0.11.7±0.1

96.7±0.71.9±0.21.4±0.1

97.4±0.32.6±0.1

Ns

95.8±0.52.4±0.21.8±0.2

98.1±0.91.9±0.3

Ns

98.2±0.71.8±0.4

Ns

97.4±0.92.6±0.4

Ns

93.2±0.86.8±0.6

Ns

96.8±0.83.2±0.5

Ns

96 1-palmitoilo LPC2-palmitoilo LPC

GPC

89.3±1.47.5±0.23.2±0.4

91.1±0.96.7±0.42.2±0.3

92.1±0.76.0±0.51.9±0.3

94.9±1.12.9±0.32.2±0.2

95.9±1.03.7±0.10.4±0.0

94.4±0.95.0±0.20.6±0.1

96.3±0.21.8±0.21.8±0.4

96.2±0.22.2±0.41.6±0.2

95.2±0.52.5±0.22.3±0.3

96.1±0.82.4±0.2

1.5±0.08

97.4±0.32.6±0.1

Ns

94.6±0.62.7±0.22.7±0.4

98.2±0.81.8±0.4

Ns

98.3±0.91.7±0.3

Ns

97.6±0.72.4±0.4

Ns

91.7±1.08.3±0.8

Ns

96.6±0.93.4±0.6

Ns

BuforyRozpuszczalniki

polarneRozpuszczalniki

niepolarne

pH>7 pH<7 ?

Page 71: PhD Thesis Defense

Czas (godz.)

Związek (%) Rozpuszczalnik

Bufor pH 8.0 (0.3M)

Bufor pH 8.0 (2.0M)

Bufor pH 7.4 (0.3M)

Bufor pH 5.6 (0.3M)

Bufor pH 5.6 (2.0M)

Woda dejonizowan

a

Metanol

Etanol bezwo

dny

96% Etanol

2-Propamol

Chloroform

Chloroform:

metanol (2:1)

ToluenEter

dietylowy

Dichlorometa

n

Acetonitryl Aceton

02-palmitoilo LPC1-palmitoilo LPC

GPC

90.7±0.36.0±0.2

3.3±0.09

91.3±0.57.0±0.61.7±0.1

88.6±0.38.3±0.43.1±0.2

94.2±0.32.6±0.23.2±0.3

93.7±1.04.7±0.11.6±0.2

96.3±0.65.0±0.50.7±0.1

89.9±0.66.8±0.23.3±0.2

90.4±0.87.1±0.42.5±0.3

90.7±1.07.1±0.72.2±0.1

90.2±0.57.3±0.22.5±0.3

93.7±1.06.3±0.8

Nsa

89.1±0.38.4±0.23.7±0.1

92.9±2.07.1±1.1

Ns

89.6±1.910.4±1.3

Ns

92.5±1.77.5±0.6

Ns

92.2±1.57.8±0.7

Ns

92.4±2.37.6±1.2

Ns

242-palmitoilo LPC1-palmitoilo LPC

GPC

7.9±0.388.5±0.83.6±0.1

7.0±0.591.1±0.81.9±0.2

13.7±0.782.8±1.43.5±0.3

85.7±1.011.0±0.73.3±0.2

81.1±1.618.2±1.01.7±0.5

63.6±1.235.6±0.60.8±0.2

88.6±0.97.5±0.53.9±0.4

88.7±0.88.3±0.23.0±0.1

87.7±0.98.7±0.83.6±0.3

89.4±0.77.8±0.52.8±0.1

91.7±1.48.3±0.6

Ns

87.5±0.28.7±0.13.7±0.1

89.9±1.910.1±1.2

Ns

86.0±2.114.0±1.3

Ns

90.5±1.59.5±0.4

Ns

91.8±1.38.2±0.4

Ns

90.4±2.09.6±1.3

Ns

482-palmitoilo LPC1-palmitoilo LPC

GPC

8.0±0.287.6±1.14.5±0.08

6.0±0.691.9±1.12.1±0.4

8.0±0.688.3±0.83.7±0.4

81.1±2.015.7±1.23.1±0.3

75.2±0.922.5±0.72.2±0.2

56.4±1.442.9±1.60.8±0.1

82.6±1.113.4±0.44.0±0.3

88.0±1.08.6±0.23.4±0.1

83.7±1.113.5±0.62.7±0.3

88.4±1.18.6±0.33.0±0.1

90.6±0.69.4±0.2

Ns

84.9±0.611.3±0.33.8±0.2

91.4±1.18.6±0.8

Ns

82.3±1.717.7±1.1

Ns

87.1±1.812.9±0.8

Ns

89.6±1.110.4±0.5

Ns

89.1±2.210.9±1.5

Ns

722-palmitoilo LPC1-palmitoilo LPC

GPC

6.6±0.389.6±0.93.8±0.2

6.3±0.791.4±1.02.2±0.08

4.2±0.391.6±0.84.2±0.2

77.6±1.118.7±0.63.7±0.0

67.7±2.230.0±1.32.3±0.6

27.7±1.071.6±2.00.8±0.1

82.4±1.214.7±0.74.1±0.5

87.6±0.68.8±0.33.6±0.2

79.4±1.216.7±0.53.9±0.3

88.5±1.28.4±0.53.1±0.2

89.5±0.810.5±0.4

Ns

81.6±0.914.6±0.53.8±0.1

85.5±2.114.5±0.9

Ns

73.5±1.526.5±1.2

Ns

84.4±2.015.6±1.2

Ns

89.3±1.210.7±0.8

Ns

88.0±1.912.0±0.9

Ns

962-palmitoilo LPC1-palmitoilo LPC

GPC

6.4±0.389.7±1.03.9±0.1

6.1±0.591.5±0.92.3±0.1

4.0±0.191.5±1.24.5±0.09

72.1±2.023.4±1.04.5±0.4

67.1±1.430.2±1.02.6±0.3

18.6±0.780.5±1.90.9±0.2

76.3±1.819.2±1.14.5±0.1

87.1±0.39.4±0.23.5±0.2

76.0±1.420.5±0.73.5±0.1

88.2±0.98.6±0.13.2±0.2

86.5±1.013.5±0.3

Ns

77.6±1.018.5±0.63.9±0.4

80.6±2.219.3±1.0

Ns

60.5±2.239.5±0.9

Ns

83.8±1.416.2±0.9

Ns

89.1±0.910.9±0.2

Ns

87.2±2.012.8±1.0

Ns

BuforyRozpuszczalniki

polarneRozpuszczalniki

niepolarne

pH>7 pH<7 Wysoka stabilność

Page 72: PhD Thesis Defense

Plan prezentacji

1.05.2023 72Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

IzolowaniefosfolipidówWstęp

Analiza pozycyjna

fosfolipidów

Analiza frakcji

lipidowej

Migracja reszt

acylowych

Page 73: PhD Thesis Defense

Izolowanie fosfolipidów z żółtek jaj świeżych i liofilizowanych

1.05.2023 73Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Wzrost wielkości granul lipoproteinowych –zwiększona dostępność fosfolipidów

Metanol, Etanol lub Propan-2-ol

Wytrącenie lipidów polarnych w zmrożonym acetonie

Page 74: PhD Thesis Defense

Izolowanie fosfolipidów z żółtek jaj świeżych i liofilizowanych

1.05.2023 74Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Skład frakcji fosfolipidowych izolowanych z żółtek jaj kurzych świeżych oraz liofilizowanych (n=3)

Ekstrahent Etanol Metanol Propan-2-ol

Rodzaj żółtka świeże liofilizowane świeże liofilizowane świeże liofilizowane

Wydajnośća, % 6,7±0,3b 7,6±0,5 7,8±0,4 7,7±0,3 5,7±0,8 2,9±0,5

Fosfolipidy ogółem, % 86,3±0,5 93,8±0,5 91,9±0,4 97,6±0,4 97,1±0,3 97,5±0,2

PC, % 70,4±0,2 73,7±0,3 71,5±0,4 75,3±0,6 74,0±0,7 77,3±0,8

PE, % 15,9±0,7 20,1±0,2 20,4±0,4 22,3±0,6 23,1±0,7 20,0±0,5

Cholesterol, % 0,35±0,12 0,19±0,08 0,26±0,13 0,15±0,07 0,28±0,04 0,17±0,05

a w stosunku do masy całego żółtka; b wartość średnia ± odchylenie standardowe

1. Wydajność malała wraz ze zmniejszaniem polarności alkoholu

2. Wzrost zawartości fosfolipidów we frakcjach otrzymanych z żółtek liofilizowanych

3. Dwukrotny spadek zawartości cholesterolu w ekstraktach z żółtek liofilizowanych w porównaniu z żółtkami świeżymi

Page 75: PhD Thesis Defense

Izolowanie fosfolipidów z żółtek jaj świeżych i liofilizowanych

1.05.2023 75Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Ekstrahent Etanol Metanol Propan-2-ol

Frakcja fosfolipidowa surowa oczyszczona surowa oczyszczona surowa oczyszczona

Fosfolipidy ogółem, % 68,6±0,5 93,8±0,5 73,9±0,7 97,6±0,4 70,9±0,4 97,5±0,2

Cholesterol, % 0,86±0,22 0,19±0,08 0,91±0,1 0,15±0,07 1,2±0,13 0,17±0,05

Zawartość fosfolipidów i cholesterolu w surowych i oczyszczonych frakcjach fosfolipidowych (n=3)

4. Proces wytrącania fosfolipidów w zmrożonym acetonie w najwyższym stopniu wpływał na końcową zawartość cholesterolu

Page 76: PhD Thesis Defense

Podsumowanie

1.05.2023 76Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

SPE HPLC

Izolowaniefosfolipidów

Analiza pozycyjna

1. Lipidy polarne i niepolarne2. Klasy fosfolipidów (żółtko jaja

kurzego)3. Klasy fosfolipidów (mleko)4. Produkty hydrolizy enzymatycznej

fosfolipidów

1. Jednoczesna analiza lipidów polarnych i niepolarnych2. Fosfolipidy (żółtko jaja kurzego)3. Fosfolipidy (mleko, soja)4. Lipidy niepolarne5. Kwasy tłuszczowe6. Produkty hydrolizy fosfatydylocholiny – migracja reszt acylowych

1. Cztery metody analizy pozycyjnej2. Regioselektywna hydroliza

enzymatyczna 1. Liofilizacja2. Wytrącanie ze zmrożonego acetonu3. Czystość ~ 98%

Page 77: PhD Thesis Defense

Dziękuję za uwagę !!!